CN205506684U - 用于实时荧光定量pcr的多荧光通道检测系统 - Google Patents

Abstract

本实用新型揭示了一种用于实时荧光定量PCR的多荧光通道检测系统，包括荧光检测单元、光纤盘和转盘，所述荧光检测单元包括光源、激发滤光片、二向色镜、光纤耦合透镜、光纤、检测滤光片和光电传感器，二向色镜将现有的激发单元和检测单元合并为一个整体，光源发出的光依次经激发滤光片过滤、光纤耦合透镜耦合，最后经光纤射入试管中激发试管中样本的荧光物质产生荧光，一部分荧光从光纤依次返回到光纤耦合透镜被准直、检测滤光片过滤出纯净的荧光，荧光最后入射到光电传感器进行光电转换；光纤盘上插入多根光纤，转盘上分布有多个荧光检测单元，转盘绕光纤盘圆心转动一圈，即可依次检测多个试管孔位多个荧光通道的荧光信号。

Description

用于实时荧光定量PCR的多荧光通道检测系统

技术领域

本实用新型涉及一种实时荧光定量PCR的检测系统，尤其是涉及一种采用由激发单元和检测单元合并后的荧光检测单元进行实时荧光定量PCR检测的多荧光通道检测系统。

背景技术

1996年美国的Applied Biosystem公司在聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)的基础上提出了实时荧光定量PCR(real-time qPCR)。该方法在PCR反应体系中加入特异性的DNA荧光探针，在每一次温度循环过程中通过采集反应液的荧光强度来实时的监控目标DNA扩增情况。之后又有人提出多重PCR(Multiplex PCR)，即利用引物、荧光探针与目标DNA结合的特异性，在反应体系中针对多个目标DNA加入多对引物和多个荧光探针，通过一次实时荧光定量PCR来检测多个目标DNA。此方法克服了普通PCR操作繁琐、难以定量、容易污染的缺点，提高了检测通量和可靠性，使得实时荧光定量PCR开始走向实用。

在多重PCR中，为了避免不同的荧光探针的荧光相互混杂无法分辨，会选用不同激发波长和检测波长的荧光报告基团来合成荧光探针。这也就对实时荧光定量PCR仪的荧光检测系统提出多荧光通道的需求。

现有实时荧光定量PCR的荧光检测实现方案有如图1所示，底部有反应液8的试管6插入温块7中，温块7对反应液8进行温控以实现PCR循环。在温块上开有孔，激发光纤5和检测光纤9分别插入对准反应液8，激发光纤5和检测光纤9为直径1mm的塑料光纤，玻璃或者石英光纤束。光源1发出宽谱光，经准直透镜2准直后通过激发滤光片3过滤为该通道 所需波长，再经过光纤耦合透镜4将激发光耦合入激发光纤5。激发光通过激发光纤5传导至样本处。所激发出荧光的一部分经由检测光纤9传导至光纤耦合透镜4准直后通过检测滤光片11将激发光完全过滤掉。荧光再通过汇聚透镜12汇聚至光电传感器13上形成光电信号。

现有实现方案需要激发单元、检测单元2个部分和2根光纤或光纤束完成对一个荧光通道的检测，多荧光通道则需要多个激发和检测单元。

如图2所示，以2荧光通道48试管孔位为例。光纤盘1为俯视图，光纤盘15上两个直径不同的圆周，分别为激发圆周和检测圆周，在激发圆周和检测圆周上均匀垂直的插入48根激发光纤或激发光纤束和48根检测光纤或检测光纤束，在一个圆周上相邻两根光纤或光纤束之间夹角360°÷48＝7.5°。在激发圆周上的每个光纤或光纤束为与检测圆周上与其夹角90°的光纤或光纤束为一组，插入温块7的一个试管孔位。图2中S1试管孔位对应EX1和EM1两根光纤或光纤束，S2对应EX2和EM2两根光纤或光纤束，以此类推。在EX1端放置激发单元，同时在EM1端放置检测单元即可完成对S1试管孔位的荧光检测。只要沿着光纤盘1的圆心转动激发单元和检测单元一周，即可实现对48个试管孔位的荧光检测。

图3为转盘16的俯视图，上面同样有激发圆周和检测圆周。在激发圆周上均布着2个通道的激发单元CH1EX，CH2EX，检测圆周上均布检测单元CH1EM，CH2EM。每一个通道的激发单元与检测单元与圆心的夹角也为90°，这样激发单元对准光纤盘15上的任意一个试管孔位的光纤或光纤束时，该通道检测单元也对准该试管孔位的另一个光纤或光纤束。

图4为将光纤盘15和转盘16通过机械结构装在同一个轴上的水平视图。用电机18驱动转盘16绕光纤盘15圆心转动一圈，即可依次检测48个试管孔位2个荧光通道的荧光信号。

如若检测4个荧光通道，需在转盘上布置4个激发单元和4个检测单元，并根据布置方案调整光纤盘15上每个试管孔位所插入的光纤对或光纤束对的角度间隔。同样的原理也可以扩展到更多试管孔位的系统中。

上述现有方案的缺点在于：

1、每一个试管孔位需要2根光纤，光学系统的成本比较高。

2、在温块上每一个试管孔位都需要加工2个孔来插入光纤，当温块的试管孔位较多时(如96孔)，温块的机械结构设计和加工非常困难。很难设计出体积小，还能加工这么多光纤插孔的温块。

3、若扩展至多荧光通道，需要2倍的荧光激发和检测单元布置在转盘上，激发和检测单元的体积限制使得转盘的激发圆周和检测圆周的直径必须增大才可布置得下更多的单元。这样会大幅增加整个转动部分的转动惯量和质量，导致电机负载增加，转动速度不得不降低，荧光检测周期变长。

4、激发单元与检测单元必须同时对正激发光纤与检测光纤，这对整个机械零件的加工和装配精度提出了很高的要求。微小的加工与装配误差就会导致荧光激发与检测的差异，最终导致各个试管孔位之间的荧光信号一致性差。

上述现有方案的一个变形方案如图5所示，一分二的Y型光纤束代替了原有的激发光纤和检测光纤，Y型光纤束内包含多根玻璃或石英光纤，每根光纤直径为30um或50um。在公共端17，激发端5和检测端9光纤的截面如图5中放大视图所示。激发端5，检测端9的光纤数量相等，在公共端17来自激发端5的光纤和检测端9的光纤被规则或随机的排列成直径1mm的光纤束。在Y型光纤束分叉处，所有的激发光纤和检测光纤被分至各自的激发端5和检测端9形成两束单独的光纤束。当激发单元对准激发端5，检测单元对准检测端9时，激发光和检测光分别通过各自的光纤在Y型光纤束内传输，互不干扰。变形方案的其他转盘部分结构不变，检测荧光的方式也一样。

上述变形方案的缺点：

1、Y型光纤束的成本要高于2根独立的光纤。

2、由于温块结构限制，公共端光纤束的直径与现有方案需保持一致。那么激发端和发射端光纤的有效截面积变为现有方案的一半，对激发光的耦合效率与荧光的接收效率也会随之下降一半，导致最终的荧光信号强度降为现有方案的四分之一，这会严重降低荧光信号的信噪比。

4、无法避免现有方案扩展至多个荧光通道所带来的转盘直径增大，荧光检测周期变长的问题。

5、无法避免现有方案不同试管孔位的荧光信号一致性差的问题。

综上所示，上述现有的两种方案仍然无法根本性的解决以下问题：

1、单个试管孔位对应的光纤数量与荧光信号信噪比之间的矛盾。

2、荧光通道数量与检测速度之间的矛盾。

3、荧光信号一致性差的问题。

这些缺点使得现有技术方案在实时荧光定量PCR领域应用受到极大限制。

实用新型内容

本实用新型的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种缩短荧光检测周期、机械加工与调试的精度要求降低、试管孔位之间的一致性得到提高、检测效率高、荧光信号信噪比高、易加工、生产成本低的用于实时荧光定量PCR的多荧光通道检测系统。

为实现上述目的，本实用新型提出如下技术方案：一种用于实时荧光定量PCR的多荧光通道检测系统，包括：

温块，所述温块上具有一个或多个试管孔位；

荧光检测单元，所述荧光检测单元包括光源、激发滤光片、二向色镜、光纤耦合透镜、光纤、检测滤光片和光电传感器，所述激发滤光片设置在光源的出方向上，所述二向色镜与光源射出的光呈倾斜设置，所述光纤插 入试管孔位中，光源发出的光经激发滤光片过滤为相应波长的激发光，再通过二向色镜进入光纤耦合透镜耦合，最后经光纤射入样本中，激发样本中的荧光物质产生荧光，一部分荧光从光纤返回到光纤耦合透镜被准直，再通过二向色镜入射给检测滤光片过滤出纯净的荧光，过滤出的荧光最后入射到光电传感器形成光电信号；

光纤盘，所述光纤盘的圆周方向上均匀的垂直插入有n根所述光纤；

转盘，所述转盘上分布有m个荧光通道的所述荧光检测单元，且所述转盘和光纤盘同轴安装，所述转盘绕光纤盘圆心转动一圈，即可依次检测n个试管孔位m个荧光通道的荧光信号，其中，n，m均为大于等于1的整数。

优选地，所述温块上开设有一个或多个光纤接入孔，每根光纤通过所述光纤接入孔插入温块的一个试管孔内。

优选地，所述光纤接入孔开设于所述温块的底部。

优选地，所述二向色镜为长通二向色镜，激发光经所述长通二向色镜反射90°进入光纤耦合透镜耦合，激发出的一部分荧光直接透过所述长通二向色镜入射给检测滤光片。

优选地，所述二向色镜为短通二向色镜，激发光直接透过所述短通二向色镜进入光纤耦合透镜耦合，激发出的一部分荧光经所述长通二向色镜反射90°入射给检测滤光片。

优选地，所述二向色镜与光源射出的光或与激发出的荧光呈45°倾斜设置。

优选地，所述荧光检测单元还包括位于光源和激发滤光片之间的准直透镜，用于对光源射出的光进行准直。

优选地，所述荧光检测单元还包括位于检测滤光片和光电传感器之间的汇聚透镜，用于对激发出的荧光进行汇聚。

优选地，所述光纤盘上相邻两根光纤之间的夹角＝360°/n。

优选地，所述系统还包括与转盘连接的驱动电机，用于驱动绕光纤盘圆心转动。

本实用新型采用二向色镜将现有的激发单元和检测单元合并为一个整体的荧光检测单元，共用光纤和光纤耦合透镜/光纤耦合透镜组。同时通过二向色镜来分离激发光和荧光，使两者之间互不干扰，这样对每一个试管孔位即可只使用一根光纤或光纤束来传导激发光和荧光，光纤或光纤束无分叉或分束。可扩展到多个荧光通道、多个试管孔位的检测。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果是：

1、减少了一半的光纤或光纤束的数量，光纤束也无需分叉，大幅降低成本。

2、温块上每个试管孔位只需要一个或不需要开设光纤插孔，温块的设计加工更为容易，温块可实现大检测样本通量(如96样本)。

3、光纤盘和温块的光纤数量减少一半，所需的装配时间和装配复杂度大大降低，提高了生产效率，降低了生产成本。

4、相比于原有2根光纤的方案，因激发光和荧光的通光孔径并没有减小，因此荧光信号不会降低，信号信噪比不会下降。

5、相比于现有方案，转盘上的单元数量少了一半，光纤盘上的光纤数量也少了一半，因此可缩小转盘和光纤盘的直径来降低转动惯量，提高转盘转速，缩短荧光检测周期。

6、相比于现有方案，不需增大转盘和光纤盘直径即可扩展到多荧光通道和多试管孔位，不会大幅增加整个转动部分的转动惯量和质量，荧光检测周期可保持不变。

7、在转盘旋转过程中只要光纤耦合透镜对准光纤即可检测到荧光信号的峰值，降低了机械加工与调试的精度要求，试管孔位之间的一致性得到了很大的提高。

附图说明

图1是现有实时荧光定量PCR的荧光检测单元的结构示意图；

图2是现有实施例光纤盘的俯视示意图；

图3是现有实施例转盘的俯视示意图；

图4是现有光纤盘和转盘组装后的结构示意图；

图5是现有另一实时荧光定量PCR的荧光检测单元的结构示意图；

图6是本实用新型实施例1采用长通二向色镜的荧光检测单元的结构示意图；

图7是本实用新型实施例1采用短通二向色镜时荧光检测单元的结构示意图；

图8是本实用新型激发滤光片、检测滤光片和长通二向色镜的透过率光谱示意图；

图9是本实用新型长通二向色镜的光路原理示意图；

图10是本实用新型激发滤光片、检测滤光片和短通二向色镜的透过率光谱示意图；

图11是本实用新型短通二向色镜的光路原理示意图；

图12是本实用新型光纤盘的俯视示意图；

图13是本实用新型转盘的俯视示意图；

图14是本实用新型光纤盘和转盘组装后的结构示意图；

图15是本实用新型实施例2荧光检测单元的结构示意图；

图16是本实用新型实施例3荧光检测单元的结构示意图；

图17是本实用新型在温块底部开孔的荧光检测单元的结构示意图；

图18是本实用新型光纤从样本顶部激发反应液的荧光检测单元的结构示意图；

附图标记：

1、光源，2、准直透镜，3、激发滤光片，4、光纤耦合透镜，5、激发光纤，6、试管，7、温块，8、反应液，9、检测光纤，11、检测滤光片， 12、汇聚透镜，13、光电传感器，14、二向色镜，15、光纤盘，16、转盘，17、光纤，18、驱动电机。

具体实施方式

下面将结合本实用新型的附图，对本实用新型实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。

本实用新型所揭示的一种用于实时荧光定量PCR的多荧光通道检测系统，采用二向色镜使得现有方案的激发单元和检测单元合二为一成为一个荧光检测单元，并通过单根光纤完成对一个荧光通道的、一个试管孔位的荧光检测，多荧光通道、多试管孔位则需要多个荧光检测单元和多根光纤。

实施例1

本实用新型实施例1所揭示的一种用于实时荧光定量PCR的多荧光通道检测系统，包括：温块7、荧光检测单元、光纤盘15和转盘16，其中：

温块7，用于容纳检测样本6，即检测样本6插入到温块7中，检测样本6的底部装有反应液8，本实施例的温块7会对反应液8进行温控以实现PCR循环，温块7上具有一个或多个试管孔位。

荧光检测单元，如图6所示，包括光源1、准直透镜/准直透镜组2、激发滤光片3、二向色镜14、光纤耦合透镜/光纤耦合透镜组4、光纤17、检测滤光片11、汇聚透镜/汇聚透镜组12和光电传感器13，这里的二向色镜14可以为长通二向色镜，也可以为短通二向色镜。

当二向色镜14为长通二向色镜时，如图6所示，光源1发出的宽谱段光经过准直透镜或准直透镜组2准直后，经过激发滤光片3过滤为该通道所需波长的激发光。后经过45°倾斜放置的长通二向色镜14反射90°，进入光纤耦合透镜或透镜组14耦合进入光纤17并最终照射试管孔位的反应液8。所激发出的荧光的一部分从光纤17原路返回达到光纤耦合透镜或透镜组4被准直，入射长通二向色镜14。由于荧光波长长于激发光波长，荧光可直接透过长通二向色镜14，再经过检测滤光片11过滤出纯净的荧光。 荧光再经过汇聚透镜或汇聚透镜12组入射光电传感器13进行光电转换，输出电信号至后续硬件系统分析。

当二向色镜14为短通二向色镜时，如图7所示，光源1发出的宽谱段光经过准直透镜或准直透镜组2准直后，经过激发滤光片3过滤为该通道所需波长的激发光。后经过45°倾斜放置的短通二向色镜14直接透射，进入光纤耦合透镜或透镜组4耦合进入光纤17并最终照射试管孔位的反应液8。所激发出的荧光的一部分从光纤17原路返回达到光纤耦合透镜或透镜组4被准直，入射长通二向色镜14。由于荧光波长长于激发光波长，荧光经短通二向色镜14反射90°，再经过检测滤光片11过滤出纯净的荧光。荧光再经过汇聚透镜或汇聚透镜组12入射光电传感器13进行光电转换，输出电信号至后续硬件系统分析。

本实用新型使用二向色镜14使得激发光和荧光共用光纤17和光纤耦合透镜/透镜组4，激发光和荧光在光纤17和光纤耦合透镜或透镜组4里的传播方向相反，互不干扰，最终通过二向色镜14将二者分离。

长通二向色镜14分离激发光和荧光的原理如图8和图9所示。图8为激发滤光片3，检测滤光片11和长通二向色镜14的透过率光谱T。三个元件均为光学镀膜的干涉滤光片，根据能量守恒，未画出的反射率光谱R与透射光谱T的关系为R+T＝100％。图9为长通二向色镜的光路原理图，当光线以45°入射长通二向色镜时，短波长的光反射，长波长的光透射。

短通二向色镜分离激发光和荧光的原理如图10和图11所示。图10为激发滤光片，检测滤光片和短通二向色镜的透过率光谱T。三个元件均为光学镀膜的干涉滤光片，根据能量守恒，未画出的反射率光谱R与透射光谱T的关系为R+T＝100％。图11为短通二向色镜的光路原理图，当光线以45°入射短通二向色镜时，短波长的光透射，长波长的光反射。

若需要更换荧光检测通道，只要将激发滤光片，检测滤光片和短通/长通二色镜更换为与该荧光通道波长对应的元器件即可，光路尺寸结构不需要变化。

光纤盘15，其圆周方向上均匀的垂直插入有n根光纤17，如图12所示，以2荧光通道48试管孔位为例。光纤盘15上均匀的垂直插入48根光纤或光纤束，相邻两根光纤或光纤束之间夹角360÷48＝7.5°。光纤或光纤束的数量减少了一倍，使得光纤盘的光纤或光纤束密度降低。每根光纤或光纤束插入温块的一个试管孔位中。图中样本S1对应光纤或光纤束F1，样本S2对应光纤或光纤束F2，以此类推。在F1端放置荧光检测单元即可对S1试管孔位进行荧光检测，将荧光检测单元绕光纤盘一圈即可检测48个试管孔位的荧光。

如图13所示，转盘16上分布有m个荧光通道的荧光检测单元，以2荧光通道48试管孔位为例，即转盘16上分布有2个荧光通道的荧光检测单元CH1，CH2，图中2个荧光通道的荧光检测单元对称分布在转盘16上，当然，具体实施时，两个独立的荧光检测单元并不需要非常严格的对称。这里的n，m均为大于等于1的整数。

如图14所示，光纤盘15和转盘16通过机械结构装在同一个轴上，驱动电机18与转盘16相连，用驱动电机18驱动转盘16绕光纤盘15圆心转动一圈，即可依次检测48个试管孔位2个荧光通道的荧光信号。

如若检测4个荧光通道，需在转盘16上布置4个荧光检测单元，并根据布置方案调整光纤盘15上每个试管孔位所插入的光纤或光纤束间的角度间隔。同样的原理也可以扩展到更多试管孔位的系统中。

实施例2

当光源1使用某些准直光源或发散角不大的光源时，如高亮度LED时。荧光检测单元中可不需要准直透镜/准直透镜组2，光源1发出的准直光束直接入射激发滤光片3，如图15所示，即实施例2中的荧光检测单元，包 括光源1、激发滤光片3、二向色镜14、光纤耦合透镜/光纤耦合透镜组4、光纤17、检测滤光片11、汇聚透镜/汇聚透镜组12和光电传感器13，其他结构和原理与实施例1相同，可参见实施例1中的具体描述。

实施例3

当使用的光电传感器13的感光面较大，可完全收集从光纤耦合透镜4输出准直的荧光光束时，可不使用汇聚透镜12。荧光光束通过长通二向色镜和检测滤光片11过滤后直接入射光电传感器。即实施例3中的荧光检测单元，包括光源1、准直透镜/准直透镜组2、激发滤光片3、二向色镜14、光纤耦合透镜/光纤耦合透镜组4、光纤17、检测滤光片11和光电传感器13，如图16所示，其他结构和原理与实施例1相同。

当然作为又一可替换的实施例，当光源1使用某些准直光源或发散角不大的光源，同时使用的光电传感器13的感光面较大时，则可不使用准直透镜和汇聚透镜，即此时荧光检测单元，包括光源1、激发滤光片3、二向色镜14、光纤耦合透镜/光纤耦合透镜组4、光纤17、检测滤光片11和光电传感器13。其他结构和原理与实施例1相同。

上述几个实施例中，光纤照射试管孔位的位置可以改变，主要有以下两种，一种如图17所示，可以在温块7底部开孔，光纤17从样本底部激发检测反应液8。另一种如图18所示，不在温块7上开孔，光纤从样本顶部激发检测反应液8，这样，温块7的设计加工更为容易，也可实现大检测样本通量。

以上实施例的方案以及方案的组合均在本实用新型的保护范围之内。

本实用新型的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本实用新型的教示及揭示而作种种不背离本实用新型精神的替换及修饰，因此，本实用新型保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本实用新型的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种用于实时荧光定量PCR的多荧光通道检测系统，其特征在于，包括：

温块，所述温块上具有一个或多个试管孔位；

荧光检测单元，所述荧光检测单元包括光源、激发滤光片、二向色镜、光纤耦合透镜、光纤、检测滤光片和光电传感器，所述激发滤光片设置在光源的出方向上，所述二向色镜与光源射出的光呈倾斜设置，所述光纤插入试管孔位中，光源发出的光经激发滤光片过滤为相应波长的激发光，再通过二向色镜进入光纤耦合透镜耦合，最后经光纤射入试管中，激发试管中样本的荧光物质产生荧光，一部分荧光从光纤返回到光纤耦合透镜被准直，再通过二向色镜入射给检测滤光片过滤出纯净的荧光，过滤出的荧光最后入射到光电传感器进行光电转换；

光纤盘，所述光纤盘的圆周方向上均匀的垂直插入有n根所述光纤；

转盘，所述转盘上分布有m个荧光通道的所述荧光检测单元，且所述转盘和光纤盘同轴安装，所述转盘绕光纤盘圆心转动一圈，即可依次检测n个试管孔位m个荧光通道的荧光信号，其中，n，m均为大于等于1的整数。

2.根据权利要求1所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述温块上开设有一个或多个光纤接入孔，每根光纤通过所述光纤接入孔插入温块的一个试管孔位内。

3.根据权利要求2所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述光纤接入孔开设于所述温块的底部。

4.根据权利要求1所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述二向色镜为长通二向色镜，激发光经所述长通二向色镜反射90°进入光纤耦合透镜耦合，激发出的一部分荧光直接透过所述长通二向色镜入射给检测滤光片。

5.根据权利要求4所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述二向色镜为短通二向色镜，激发光直接透过所述短通二向色镜进入光纤耦合透镜耦合，激发出的一部分荧光经所述长通二向色镜反射90°入射给检测滤光片。

6.根据权利要求1或4或5所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述二向色镜与光源射出的光或与激发出的荧光呈45°倾斜设置。

7.根据权利要求1所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述荧光检测单元还包括位于光源和激发滤光片之间的准直透镜，用于对光源射出的光进行准直。

8.根据权利要求1或7所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述荧光检测单元还包括位于检测滤光片和光电传感器之间的汇聚透镜，用于对激发出的荧光进行汇聚。

9.根据权利要求1所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述光纤盘上相邻两根光纤之间的夹角＝360°/n。

10.根据权利要求1所述的多荧光通道检测系统，其特征在于，所述系统还包括与转盘连接的驱动电机，用于驱动绕光纤盘圆心转动。