CN202033370U - 人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒 - Google Patents
人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本实用新型公开了一种人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体、包被层和封闭层，所述固相载体上设置有多个微孔，所述微孔内表面依次附着有所述包被层和封闭层，所述包被层是由与卵清蛋白偶联的人促肾上腺皮质激素涂布在微孔内表面上形成的，所述封闭层由牛血清白蛋白涂布在所述包被层上形成。利用本试剂盒检测人血清中的人促肾上腺皮质激素，敏感性高、稳定性好、操作简便，且成本较低。
Description
技术领域
本实用新型涉及一种人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒。
背景技术
促肾上腺皮质激素（ACTH），是由腺垂体细胞分泌的一种含39个氨基酸的多肽激素，并受促肾上腺激素释放激素（CRH）和精氨酸加压素（AVP）的调节。它具有刺激肾上腺皮质束状带及网状带的增生，以及调节糖皮质激素和醛固酮分泌的作用。它在正常人血清中含量低于100pg/mL，其含量增高常见于垂体ACTH细胞瘤、异源性ACTH分泌综合征、原发性肾上腺皮质减退症、Nelson综合征、各种应激反应等。若降低则常见于垂体或鞍旁肿瘤、垂体前叶受损(如席汉病)和肾上腺皮质肿瘤等。临床上一般采用放射免疫法定量检测。
放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）是基于抗原与抗体特异性结合的分析方法，其竞争结合原理与ELISA分析相似。通常先将抗原与一定量的抗体反应，然后加入一定量的标记抗原竞争反应，待反应平衡后，离心分离去除未结合的部分，测定结合部分放射性，根据标准曲线从结合率推算样品中待测抗原的量。虽然该技术特异性较高，灵敏度也较高，但其局限性也很显著，主要有以下几点：
原料来源：采用的抗体多为多克隆抗体或单克隆抗体。多克隆抗体虽然产量大，但是特异性相对较低，均一性较差（不同动物个体被免疫后生成的抗体有个体差异），且纯化过程中需要高纯度的抗原；而单克隆抗体虽然可以克服上述的缺点，但是亦有一定的局限性。首先是单克隆抗体的反应强度不如多克隆抗体，并且制备技术复杂，而且费时费工，价格也较高。
稳定性差：放射性同位素易衰减，不易保存。
采用放射性同位素不可避免地存在同位素试剂有效期短、放射性污染和操作受限等弊端。
酶联免疫吸附测定（ELISA）检测技术是利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。由于其特异性强、灵敏度、操作简便及不需大型仪器等优点，现广泛用于生物样本的定量检测实验中。ELISA试剂盒中的关键因素是获得高特异性、高亲和力的抗体，但由于ACTH分子只含有39个氨基酸残基，分子量仅为4.5kD，免疫原性较弱，通过传统的免疫方法不易产生特异性的抗体，而利用偶联载体来增加其免疫原性的方法操作复杂，并且存在着偶联效率低且不稳定的情况，很难获得高质量的抗体。
实用新型内容
为了解决上述技术问题，本实用新型不采用传统的免疫方法获取抗体，，而直接用噬菌体展示技术获得特异性和亲和力高的抗体。本实用新型提供一种检测人促肾上腺皮质激素的ELISA试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，适合于血清、血浆及其它生物液体中促肾上腺皮质激素的检测。
本实用新型提供的人促肾上腺皮质激素（ACTH）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体、包被层和封闭层，所述固相载体上设置有多个微孔，所述微孔内表面依次附着有所述包被层和封闭层，所述包被层是由与卵清蛋白（OVA）偶联的人促肾上腺皮质激素涂布在微孔内表面上形成的，所述封闭层由牛血清白蛋白涂布在所述包被层上形成。
优选地，上述固相载体为96孔聚苯乙烯试剂板，或60孔聚苯乙烯试剂板，或48孔聚苯乙烯试剂板。
本试剂盒是利用ELISA方法来检测人促肾上腺皮质激素，与传统方法相比，ELISA法敏感性高、稳定性好、操作简便，且成本较低。本实用新型利用噬菌体抗体展示技术来筛选获得高亲和力的ACTH抗体，然后将其应用于ELISA试剂盒的制备和生产中。与传统方法相比，该方法能在短期内获得特异性高、亲和力高的抗体，且经筛选获得的噬菌体可以长期保存，在传代中亦可保持基因结构的稳定性。抗体是ELISA试剂盒的重要原料，高质量的抗体可以保证试剂盒的高品质，尤其是试剂盒的特异性、灵敏度等方面会有很大的改善。
附图说明
图1为本实用新型一具体实施例试剂盒的酶标板沿着一列微孔的纵剖示意图。
1固相载体，2包被层，3 封闭层，4 微孔。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。
本实用新型试剂盒的酶标板包括固相载体、包被层和封闭层。如图1所示，固相载体1上有多个微孔4，包被层2附着在微孔4的内表面，封闭层3附着在包被层2上。包被层2是由OVA载体偶联的ACTH涂布在微孔4内表面上形成的，封闭层3由牛血清白蛋白涂布在包被层2上形成。固相载体采用96孔聚苯乙烯试剂板（PS）。当然也可采用60或48孔聚苯乙烯试剂板（PS）或其他材料的试剂板。
该具体实施例的试剂盒制备方法是：
1、抗人ACTH特异性抗体的筛选：
传统的抗体包括2条重链和2条轻链，但是抗体的有效部位是重链和轻链的可变区，为此只需制备抗体的scFv片段即可。通过购买商业化构建好的噬菌体抗体库，并进行菌液培养进行噬菌体表面呈现。以目的抗原，即人ACTH对抗体库进行筛选，经过3轮“吸附－洗脱－扩增”的过程筛选并富集该蛋白的特异性抗体，即抗ACTH scFv抗体。
2、抗人ACTH抗体scFv的改造：
筛选获得的scFv只有一个抗原结合区，抗原结合力较完整的单克隆抗体低。为此，我们通过基因工程技术将抗人ACTH的cDNA和p53四聚功能域基因融合，其表达产物会自动组装成四聚体，使得该抗体具有四个功能区，可明显的提高对抗原的结合力。将含融合基因的质粒转染至中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中，扩增培养后采用亲和层析法纯化目的抗体，并通过Western-Blot和ELISA等方法对其亲和性和特异性进行鉴定。
3、ELISA试剂盒的制备：
本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中ACTH的水平。制备过程如下：使用聚苯乙烯试剂板（PS）作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的与OVA载体偶联的ACTH，4℃过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。由此可见，该酶标板微量孔内主要有2层：2，包被层；3，封闭层。
检测时，依次加入待测标本及上述步骤2得到的生物素化的ACTH抗体，形成酶标板上包被的ACTH和标本中的ACTH竞争结合抗ACTH抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶（HRP)放大信号，以3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）及硫酸分别作为底物及终止液，完成人ACTH的ELISA试剂盒的制备。
技术效果
噬菌体抗体展示技术相较传统的单克隆或多克隆抗体技术有许多优点，可以快速高效的获得高质量的抗体（见表1）。
表1 传统免疫技术和本实用新型噬菌体展示技术制备抗体的对比
| 单克隆或多克隆抗体技术 | 噬菌体抗体展示技术 | |
| 抗体库容量 | 10^3 | 10^7-10^9 |
| 时间 | 2-4个月 | 几周 |
| 抗原改造 | 需偶联大分子载体 | 无需改造 |
| 免疫 | 需多次免疫动物 | 无需免疫 |
| 操作 | 繁杂 | 相对简单 |
| 费用 | 高 | 低 |
| 生产量 | 有限 | 无限 |
经本实用新型噬菌体抗体展示技术获得抗体后，将其用于制备ELISA试剂盒，该试剂盒可以特异性的检测人血清及血浆标本中ACTH分子含量，并且由于试剂盒采用了生物素-亲和素放大系统，使得其最低检测限为4.83 pg/mL, 与放射受体法的灵敏度不相上下，可以达到样本的检测要求。ELISA试剂盒可直接保存于４℃，有效期为６个月，较放射受体法有很大的改善。其次，在使用过程中不需特殊防护措施，产生的生物垃圾毒性小，易于处理。
为此，我们对比了本实用新型的ELISA试剂盒和Phoenix Pharmaceuticals, Inc.生产的RIA试剂盒（见表2），可见ELISA试剂盒有保质期长，操作简单、快捷的特点。
表2 本实施例的ELISA试剂盒和RIA试剂盒比较
| ELISA试剂盒 | RIA试剂盒 | |
| 保质期 | 6个月 | 6周 |
| 检测限 | 12.3-1000 pg/mL | 10-1280 pg/mL |
| 灵敏度 | 4.83 pg/mL | 63.5pg/mL |
| 操作时间 | 4.5小时 | 2-3天 |
| 防护措施 | 普通实验服，手套 | 放射人员防护服，防护眼镜，手套 |
| 实验室条件 | 普通实验室 | 放射性同位素实验室 |
| 实验废物 | 毒性小，无需特殊处理 | 对环境影响大，需特殊处理 |
实施例
1. 线性实验：
将两试剂盒标准液稀释成不同浓度后做线性实验，结果显示RIA试剂盒线性范围在40-900pg/mL,本实施例的ELISA试剂盒在12.3-1000pg/mL范围内呈良好的线性关系，其拟合系数R值分别为0.986和0.997，相较之下，ELISA方法所得曲线线性较好，浓度-OD值成良好相关性。
2. 精密度实验：
用两法对高、中、低值质控品分别进行精密度实验，实验方法为分别用这两个试剂盒测定三个定值样本72.9pg/mL、286.4pg/mL、647.3pg/mL，每个样本重复测定20次，表3中结果可见本实用新型的试剂盒采用ELISA方法精密度较好。
表3 ELISA试剂盒和RIA试剂盒精密度测试
3. 回收实验：
取不同浓度的标准品溶液（ACTH浓度为100pg/mL、300pg/mL、600g/mL），分别加入定值血清（167.8pg/mL），用RIA法和ELISA法检测，并比较测定值和预期值得到回收率（见表4）。
表4 ELISA试剂盒和RIA试剂盒回收率测试
| ELISA法 | RIA法 | |
| 100pg/mL | 93% | 89% |
| 300pg/mL | 91% | 82% |
| 600pg/mL | 102% | 88% |
结论：
本实用新型制备的ACTH的ELISA试剂盒。通过于RIA试剂盒的比较，可以看出ELISA试剂盒的线性范围较RIA试剂盒略宽，且精密度、准确性和试剂盒有效期等方面均优于放射免疫法。且由于ELISA法采用TMB作为显色底物，所以其试剂盒具有稳定性高和低毒性的优点，且实验操作较RIA法简单、不需特殊防护、周期短，可以满足普通实验室的要求。
以上所述实施例仅是为充分说明本实用新型而所举的较佳的实施例，本实用新型的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本实用新型基础上所作的等同替代或变换，均在本实用新型的保护范围之内。本实用新型的保护范围以权利要求书为准。
Claims (4)
1.一种人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，其特征在于，所述酶标板包括固相载体、包被层和封闭层，所述固相载体上设置有多个微孔，所述微孔内表面依次附着有所述包被层和封闭层，所述包被层是由与卵清蛋白偶联的人促肾上腺皮质激素涂布在微孔内表面上形成的，所述封闭层由牛血清白蛋白涂布在所述包被层上形成。
2.如权利要求1所述的人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述固相载体为96孔聚苯乙烯试剂板。
3.如权利要求1所述的人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述固相载体为60孔聚苯乙烯试剂板。
4.如权利要求1所述的人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述固相载体为48孔聚苯乙烯试剂板。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103207278A (zh) * | 2012-01-13 | 2013-07-17 | 希森美康株式会社 | 肾上腺皮质刺激激素的检测方法及吸附剂 |
| CN108548930A (zh) * | 2018-03-30 | 2018-09-18 | 迈克生物股份有限公司 | 促肾上腺皮质激素化学发光检测试剂盒 |
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- 2011-04-06 CN CN2011200977545U patent/CN202033370U/zh not_active Expired - Fee Related
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