CN103207278A - 肾上腺皮质刺激激素的检测方法及吸附剂 - Google Patents

肾上腺皮质刺激激素的检测方法及吸附剂 Download PDF

Info

Publication number
CN103207278A
CN103207278A CN2013100101737A CN201310010173A CN103207278A CN 103207278 A CN103207278 A CN 103207278A CN 2013100101737 A CN2013100101737 A CN 2013100101737A CN 201310010173 A CN201310010173 A CN 201310010173A CN 103207278 A CN103207278 A CN 103207278A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gelation
casein
acth
sample
hormone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013100101737A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103207278B (zh
Inventor
鹤冈礼奈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corp filed Critical Sysmex Corp
Publication of CN103207278A publication Critical patent/CN103207278A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103207278B publication Critical patent/CN103207278B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/665—Assays involving proteins derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • G01N2333/695—Corticotropin [ACTH]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及肾上腺皮质刺激激素的检测方法，其包括：使含肾上腺皮质刺激激素的液体样品和凝胶化酪蛋白接触，使肾上腺皮质刺激激素吸附到凝胶化酪蛋白的步骤，以及检测上述吸附到凝胶化酪蛋白的肾上腺皮质刺激激素的步骤。本发明还涉及肾上腺皮质刺激激素的吸附剂，其含凝胶化酪蛋白。

Description

肾上腺皮质刺激激素的检测方法及吸附剂
【技术领域】
本发明涉及肾上腺皮质刺激激素（ACTH）的检测方法及ACTH的吸附剂。
【背景技术】
在血液中含各种各样的肽，但在其中，在处于特定的病态的活体中，存在示与健康时不同的血中浓度的肽。那样的肽在临床检查的领域中，作为疾病的标志物而被关注。例如，由垂体激素的分泌降低而发生的西蒙斯病、席汉综合征等可通过以ACTH作为标志物肽检测来进行临床检查。但是，有临床检查中使用的活体样品中含的杂质给ACTH的检测带来影响的情况。因此，期望可抑制活体样品中的杂质的影响的ACTH的检测方法。
本发明旨在提供可选择性地吸附ACTH的新颖材料。另外，本发明旨在提供使用此新颖材料检测液体样品中的ACTH的方法。
【发明内容】
本发明的范围仅由随附的权利要求定义，且不受本发明内容部分的任何局限。
本发明人令人惊讶地发现，由酪蛋白得到的凝胶可选择性地吸附ACTH，从而完成本发明。
从而，本发明提供：
【1】肾上腺皮质刺激激素的检测方法，其包括：
使含肾上腺皮质刺激激素的液体样品和凝胶化酪蛋白接触，使肾上腺皮质刺激激素吸附到凝胶化酪蛋白的步骤，以及
检测上述吸附到凝胶化酪蛋白的肾上腺皮质刺激激素的步骤；
【2】上述【1】所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素吸附步骤通过使液体样品和凝胶化酪蛋白在pH6.5以上的条件下接触来进行；
【3】上述【1】或上述【2】所述的方法，其还包括：
回收使与液体样品接触的凝胶化酪蛋白的步骤，以及
使回收的吸附到凝胶化酪蛋白的肾上腺皮质刺激激素游离的步骤；
【4】上述【3】所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素的游离步骤通过使回收的凝胶化酪蛋白和水系介质在pH5.5以下接触，使吸附到凝胶化酪蛋白的肾上腺皮质刺激激素游离到上述水系介质中来进行；
【5】上述【1】或上述【2】所述的方法，其中凝胶化酪蛋白是由交联剂凝胶化的酪蛋白；
【6】上述【5】所述的方法，其中交联剂是水溶性碳二亚胺；
【7】上述【1】或上述【2】所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素是具有至少肾上腺皮质刺激激素的1～24位的氨基酸序列的多肽；
【8】上述【1】或上述【2】所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素与白蛋白形成复合物；
【9】上述【1】或上述【2】所述的方法，其中液体样品是血液、血浆、血清或尿；
【10】肾上腺皮质刺激激素的吸附剂，其含凝胶化酪蛋白；
【11】上述【10】所述的吸附剂，其中凝胶化酪蛋白是由交联剂凝胶化的酪蛋白；
【12】上述【11】所述的吸附剂，其中交联剂是水溶性碳二亚胺；
【13】上述【10】～【12】之任一项所述的吸附剂，其中肾上腺皮质刺激激素是具有至少肾上腺皮质刺激激素的第1～24的氨基酸序列的多肽；
【14】上述【10】～【12】之任一项所述的吸附剂，其中肾上腺皮质刺激激素与白蛋白形成复合物。
本发明的ACTH的吸附剂中含的凝胶化酪蛋白可选择性地吸附液体样品中的ACTH。因此，本发明的ACTH的检测方法，通过将液体样品中的ACTH选择性地吸附到凝胶化酪蛋白，可在抑制其他杂质的影响的状态下检测ACTH。
【附图说明】
图1是示对于由各种材料制备的凝胶载体的ACTH的吸附能的坐标图。
图2是示对于凝胶化酪蛋白的各种肽的吸附能的坐标图。
图3是示凝胶化酪蛋白与在用四甲基若丹明（TMR）标记的ACTH中肽部分吸附的坐标图。
图4是将吸附到凝胶化酪蛋白的ACTH由SDS-PAGE法及其后的银染色法检测之时的照片。
图5是将吸附到凝胶化酪蛋白的，与白蛋白形成复合物的ACTH由SDS-PAGE法及其后的荧光成像法检测之时的照片。
图6是将凝胶化酪蛋白不吸附白蛋白由SDS-PAGE法及其后的银染色法确认之时的照片。
图7是示凝胶化酪蛋白和ACTH的亲和性随pH变化的坐标图。
图8是由SDS-PAGE法及其后的银染色法及荧光成像法示由本发明的ACTH的检测方法，可检测血清中的ACTH的照片。
图9是由SDS-PAGE法及其后的银染色法及荧光成像法示由本发明的ACTH的检测方法，可检测尿中的ACTH的照片。
【实施方式】
［1］ACTH的检测方法
本发明的ACTH的检测方法（以下，也称之为“检测方法”）中，首先进行使含ACTH的液体样品和凝胶化酪蛋白接触，将ACTH吸附到凝胶化酪蛋白的步骤。
ACTH是由39个氨基酸构成的激素，由脑之垂体分泌，作用于肾上腺皮质而促进肾上腺皮质激素的分泌。
在本发明的实施方式中，成为检测对象的ACTH，除了在活体内产生的天然的ACTH之外，是由导入编码ACTH的基因的哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌等的细胞产生的肽也可，是由化学合成制备的肽也可。另外，由于ACTH在生物种之间氨基酸序列的相同性高，ACTH的来源只要是产生ACTH的生物种，就不特别限定，可举出哺乳类（例如，人、小鼠、大鼠、狗、兔）、鸟类（例如鸵鸟）、鱼类（例如白斑星鲨）等。
在本发明的实施方式中，液体样品只要是有含ACTH的可能性的液体样品，就不特别限定，是例如活体样品也可。作为那样的活体样品，可举出体液。作为体液，例如，血液、血浆、血清、尿等是优选的。液体样品是上述的活体样品时，在所述样品中，包括活体来源的，可与ACTH结合的物质，但在本发明的实施方式中，液体样品中的ACTH与那样的可与ACTH结合的物质形成复合物也可。作为可结合ACTH的物质，可举出例如白蛋白等。
另外，液体样品中含的ACTH是全长的多肽也可，是其片段也可。作为ACTH的片段，有至少ACTH的1～24位的氨基酸序列的多肽是优选的。
在本发明的检测方法中，为了吸附ACTH而使用的凝胶化酪蛋白可通过凝胶化酪蛋白而得到。其中，酪蛋白是指作为乳蛋白质的主成分被知的磷酸蛋白质。另外，已知酪蛋白大分为由αs、β及κ的3种酪蛋白成分组成。
在本发明的实施方式中，成为凝胶化酪蛋白的原料的酪蛋白的种类不特别限定，可举出例如，酸酪蛋白、酪蛋白钠、αs-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等。另外，酪蛋白的来源不特别限定，可使用例如，由牛、山羊等的哺乳动物的乳得到的酪蛋白。
得到凝胶化酪蛋白的方法只要是可凝胶化酪蛋白的方法，就不特别限定，可举出例如，通过使酪蛋白的溶液和交联剂反应而得到凝胶化酪蛋白的方法。作为那样的交联剂，水溶性碳二亚胺（WSC、化学名：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）是优选的。
使用WSC时，凝胶化酪蛋白例如可如下得到。首先，将0.1～20%（w/v）的酪蛋白溶液，和0.1～50%（w/v）的WSC溶液以体积比表示1:0.2～50的比例混合。将得到的混合液于65～200℃加热5～120分钟，通过返回室温，在该混合液中形成凝胶化酪蛋白。然后，通过将凝胶化酪蛋白离心分离等来从混合液回收，用水或适宜的缓冲液清洗，可得到凝胶化酪蛋白。
在本发明的实施方式中，凝胶化酪蛋白的形状不特别限定，所以将如上述一样得到的凝胶化酪蛋白适宜加工成粒状、膜状等的形状也可。
在本发明的实施方式中，使凝胶化酪蛋白和液体样品接触的操作不特别限定。例如，向液体样品添加凝胶化酪蛋白而使接触也可，将上述的粒状的凝胶化酪蛋白的分散液和液体样品混合而使接触也可。
对于凝胶化酪蛋白和液体样品的接触的条件，从升高ACTH的吸附效率的观点而言，在凝胶化酪蛋白和液体样品的混合物中的pH在6.5以上、优选成为6.5～10的条件下，使两者接触是优选的。这基于，本发明人发现凝胶化酪蛋白和ACTH的亲和性随pH而变化。再有，调节pH的手段不特别限定，可由所述技术中公知的方法适宜选择。例如，可通过将在pH6.5以上有缓冲作用的缓冲剂预先添加到凝胶化酪蛋白及/或液体样品，或者添加到凝胶化酪蛋白和液体样品的混合物来调节pH。
在凝胶化酪蛋白和液体样品的接触中的pH以外的条件不特别限定，例如，凝胶化酪蛋白和液体样品的量的比是以体积比表示1:2～1000、优选是1:10～200。另外，周围温度是4～60℃、优选为4℃～室温，接触时间是5秒钟～60分钟、优选是30秒钟～1分钟。
在本发明的检测方法中，如上述一样使凝胶化酪蛋白和液体样品接触之后，进行检测吸附到凝胶化酪蛋白的ACTH的步骤。
在所述步骤中，检测吸附到凝胶化酪蛋白的ACTH的手段不特别限定。例如，回收吸附ACTH的凝胶化酪蛋白，可直接检测回收的吸附到凝胶化酪蛋白的ACTH。另外，回收吸附ACTH的凝胶化酪蛋白，从回收的凝胶化酪蛋白游离ACTH，检测游离的ACTH也可。即，本发明的检测方法还包括回收使与液体样品接触的凝胶化酪蛋白的步骤，以及使回收的吸附到凝胶化酪蛋白的ACTH游离的步骤也可。
回收凝胶化酪蛋白的手段根据使用的凝胶化酪蛋白的形状，由所述技术中公知的手段适宜选择即可。例如，离心分离凝胶化酪蛋白和液体样品的混合物之后，可通过除去上清来回收凝胶化酪蛋白。
从凝胶化酪蛋白游离ACTH的手段不特别限定，例如，可通过将所述技术中公知的蛋白质变性剂添加到回收的凝胶化酪蛋白，从该凝胶化酪蛋白溶出ACTH。作为那样的蛋白质变性剂，可举出例如，十二烷基硫酸钠（SDS）等的表面活性剂、尿素、胍等。
另外，如上所述，本发明人得知凝胶化酪蛋白和ACTH的亲和性随pH变化。即，在本发明的实施方式中，可通过使回收的凝胶化酪蛋白和水系介质在pH5.5以下接触，使吸附到凝胶化酪蛋白的ACTH游离到该水系介质中。再有，调节pH的手段只要是不妨碍其后进行的ACTH的检测的手段，就不特别限定，可从所述技术中公知的方法适宜选择。另外，水系介质不特别限定，从使操作更简便的观点而言，可使在凝胶化酪蛋白和水系介质的混合物中pH在5.5以下的水系介质是优选的。作为那样的水系介质，可适宜地使用所述技术中公知的无机酸（例如，稀盐酸、稀硫酸等）、有机酸（例如，醋酸水溶液等）及在pH5.5以下有缓冲作用的缓冲液（例如，磷酸缓冲液、Good缓冲液等）。
检测游离的ACTH的手段只要是可将ACTH与其他物质区别检测的手段，就不特别限定，可由所述技术中公知的肽检测方法适宜选择。作为那样的检测手段，可举出例如，SDS-PAGE法及其后的凝胶染色法或蛋白印迹法、ELISA法、层析法、质谱分析法等。
如上所述，在本发明的实施方式中，可将液体样品中含的ACTH由凝胶化酪蛋白选择性地吸附之后，使游离到适宜的水系统溶剂中。即，本发明的检测方法在要从液体样品选择性地回收ACTH时，和/或在要从液体样品纯化ACTH时也可利用。从而，在本发明的范围内，也包括从液体样品选择性地回收ACTH的方法、及从液体样品纯化ACTH的方法。
［2］ACTH的吸附剂
本发明的ACTH的吸附剂（以下，也称之为“吸附剂”）以含上述的凝胶化酪蛋白为特征，可在上述的本发明的检测方法中适宜地使用。即，本发明的吸附剂，通过与在本发明的检测方法中所述的凝胶化酪蛋白同样地使用，可选择性地吸附液体样品中的ACTH。再有，吸附的ACTH只要是有至少ACTH的1～24位的氨基酸序列的多肽即可。另外，ACTH与白蛋白等的可与ACTH结合的物质形成复合物也可。
本发明的吸附剂中含的凝胶化酪蛋白自体可与本发明的检测方法中所述的同样地制备。即，通过使酪蛋白的溶液和交联剂反应而可得到凝胶化酪蛋白。作为那样的交联剂，水溶性碳二亚胺（WSC、化学名：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）是优选的。
本发明的吸附剂中含的凝胶化酪蛋白的形状不特别限定，从容易处理的观点而言，粒状是优选的。此时，本发明的吸附剂可为分散到水或适当的缓冲液中而成的分散液的形态。或者，本发明的吸附剂是包括由冷冻干燥法等的公知的方法干燥的凝胶化酪蛋白粒子，和在用时用于将其分散的水或适当的缓冲液的2试剂系统的形态也可。再有，分散液中的凝胶化酪蛋白粒子的浓度可由本领域技术人员适宜设定，通常是1～100mg/ml、优选是5～50mg/ml。
本发明的吸附剂，除了凝胶化酪蛋白之外，可含所述技术中公知的添加物。作为那样的添加物，可举出缓冲液（例如，磷酸缓冲液、Good缓冲液等）、蛋白质稳定化剂（例如，BSA等）及防腐剂（例如，叠氮化钠等）。在本发明中，如上所述，由于凝胶化酪蛋白和ACTH的亲和性随pH而变化，所以包括在pH6.5以上有缓冲作用的缓冲液是优选的。
本发明的吸附剂中含的凝胶化酪蛋白的保存方法不特别限定，例如以4℃～室温保存即可。
本发明的吸附剂只要含与本发明的检测方法中所述的同样地制备的凝胶化酪蛋白，有选择性地吸附ACTH的性能，其性能的确认可由上述的本发明的检测方法进行。或者，ACTH的吸附能如以下一样确认也可。首先，将浓度已知的合成ACTH肽的溶液和制备的吸附剂混合。从得到的混合液回收吸附剂中含的凝胶化酪蛋白。然后，测定其余的液中含的合成ACTH肽的浓度，与混合前的浓度比较。比较结果，只要混合后的浓度充分地低，则判断制备的吸附剂有作为本发明的吸附剂的性能。
接下来，通过实施例详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
【实施例】
【实施例1：对于凝胶化酪蛋白的ACTH（1-24）的吸附能的评价】
（1）各种凝胶载体的分散液的制备
<凝胶化酪蛋白载体分散液的制备>
将酪蛋白钠（和光纯药株式会社制）溶解于MilliQ（注册商标）水（以下，简单称之为“超纯水”；Millipore公司），制备50g/L（5%）的酪蛋白钠溶液。向此酪蛋白钠溶液（1mL）添加5%水溶性碳二亚胺（WSC（株）同仁化学研究所制）溶液（1mL）和超纯水（3mL），制备酪蛋白钠的终浓度是1%，WSC的终浓度是1%的酪蛋白钠-WSC混合溶液（5mL）。将此混合溶液于80℃加热10分钟之后，返回室温，从而在该混合溶液中形成凝胶。从含凝胶的液通过移液器吸吐除去上清，取得凝胶化酪蛋白。向取得的凝胶化酪蛋白加超纯水，通过使用离心分离装置（日立工机制CF15RXII）以22200G离心10分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白，将上清通过移液器吸吐除去。将此操作重复2次，清洗凝胶化酪蛋白。将清洗后的凝胶化酪蛋白通过涡旋及移液器吸吐而使成为细的凝胶载体，在超纯水（5mL）中分散。将得到的分散液作为1%凝胶化酪蛋白载体分散液。
<白蛋白凝胶载体分散液的制备>
代替酪蛋白钠，使用牛血清白蛋白（以下，称之为“BSA”：SIGMA-ALDRICH公司制），通过进行与上述的凝胶化酪蛋白载体分散液的制备同样的操作，制备1%白蛋白凝胶载体分散液。
<明胶凝胶载体分散液的制备>
将明胶（和光纯药株式会社制）溶解于超纯水，通过加热至80℃，制备10%明胶水溶液（0.5mL）。将此溶液于4℃冷却2小时，得到明胶凝胶。向得到的明胶凝胶加4℃的超纯水（4.5mL），通过移液器吸吐使成为细的明胶凝胶载体，制备1%明胶凝胶载体分散液。
（2）对于各种凝胶载体的ACTH（1-24）的吸附能的评价
将上述（1）中制备的1%凝胶化酪蛋白载体分散液（50μL），和用四甲基若丹明（TMR）标记的，有ACTH的1～24位的氨基酸序列的多肽（以下，称之为“ACTH（1-24）”）的水溶液（300μM、5μL、BIOLOGICA株式会社制）混合，加1M的Bicine/NaOH缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（35μL），制备混合液（100μL）。此混合液的凝胶化酪蛋白载体的终浓度调节为0.5%、TMR标记ACTH（1-24）的终浓度调节为15μM。同样地，代替1%凝胶化酪蛋白载体分散液而使用1%白蛋白凝胶载体分散液、及1%明胶凝胶载体分散液，调节各自的混合液。再有，明胶凝胶载体的操作冷却着进行，以使得明胶凝胶不溶解于液中。
通过将这些的混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和沉淀物。离心分离后，由分光荧光光度计（日立HighTech制F-7000），在激发波长540nm荧光波长580nm测定上清的荧光强度，算出不吸附到各凝胶载体的残留在上清中的TMR量、即ACTH（1-24）量。再有，以不含凝胶载体的15μM的TMR标记ACTH（1-24）的溶液作为参照。结果示于图1。
从图1得知，凝胶化酪蛋白载体相比白蛋白凝胶载体及明胶凝胶载体，对于TMR标记ACTH（1-24）有高的吸附能。
【实施例2：对于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的吸附能的选择性的评价1】
（1）凝胶化酪蛋白载体和样品的混合液的制备
各自混合1000μM的ACTH（1-24）（BIOLOGICA株式会社制）水溶液、1000μM的ITIH4片段（BIOLOGICA株式会社制）水溶液、1000μM的纤维蛋白原α片段（BIOLOGICA株式会社制）水溶液、1000μM的因子XIII片段（BIOLOGICA株式会社制）水溶液各10μL，加实施例1（1）中制备的1%凝胶化酪蛋白载体分散液（50μL）和1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(3μL）及超纯水（7μL），制备肽混合液（100μL）。将此肽混合液的凝胶化酪蛋白载体的终浓度调节为0.5%、各肽的终浓度调节为100μM。将制备的肽混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离为上清和沉淀物，取得上清。向取得的上清（1μL）添加超纯水（99μL）而制备100倍稀释的上清。对于此上清，作为用于MS的浓度换算的指标样品添加1μM的TMR标记ACTH（1-24）水溶液（1μL），制备肽吸附能测定用样品。再有，作为肽吸附能测定用样品的比较对象，代替1%凝胶化酪蛋白载体分散液而使用超纯水，通过与上述相同的操作制备对照样品。
（2）由混合液的MALDI-TOF/MS测定的对于ACTH（1-24）的吸附能选择性的评价
预先，作为基质溶液，调配10mg/mL的αCHCA溶液。再有，作为溶剂使用0.1%鸟氟醋酸/50%腈水溶液。向MS的样品台滴下上述（1）中调配的肽吸附能测定用样品（1μL），在减压下干燥之后，滴下基质溶液（1μL）而使自然干燥，确认基质的结晶可能。然后，进行m/z为800～5000的区域的MALDI-TOF/MS测定（AppliedBiosystems公司制Voyager-DE（商标）PRO）。另外，通过与肽吸附能测定用样品的MALDI-MS同样的操作，代替肽吸附能测定用样品而使用对照样品，进行对照样品的MALDI-TOF/MS测定。将这些的测定结果用指标样品的强度调节，算出各肽的上清中含的肽浓度。对于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）、ITIH4片段、纤维蛋白原α片段及因子XIII片段的吸附能的结果示于图2。另外，各肽的性质示于表1。再有，在图2中，100μM的实线示不混合凝胶化酪蛋白载体时的肽溶液中存在的肽浓度。
【表1】
Figure BDA00002725344400111
从图2得知，对于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的吸附能相比对于ITIH4、纤维蛋白原α及因子XIII的吸附能显著地高。因此，凝胶化酪蛋白载体不是依赖于被称之为酸性、中性、碱性肽的等电点而吸附，而是选择性地吸附ACTH（1-24）。
【实施例3：对于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的吸附能的选择性的评价2】
（1）凝胶化酪蛋白载体分散液的制备
与实施例1（1）的凝胶化酪蛋白载体分散液的制备同样地，制备1%凝胶化酪蛋白载体分散液。
（2）凝胶化酪蛋白载体和样品的混合液的制备
<凝胶化酪蛋白载体和TMR标记ACTH（1-24）的混合液的制备>
将上述（1）中制备的1%凝胶化酪蛋白载体分散液（50μL）和300μM的TMR标记ACTH（1-24）的水溶液（10μL）混合，再加1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（30μL），制备混合液（100μL）。此混合液的凝胶化酪蛋白载体的终浓度调节为0.5%、TMR标记ACTH（1-24）的终浓度调节为30μM。将此混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和沉淀物。再有，作为凝胶化酪蛋白载体和TMR标记ACTH（1-24）的混合液的比较对象、具体而言不含凝胶化酪蛋白载体的混合液，代替1%凝胶化酪蛋白载体分散液而使用超纯水，通过与上述相同的操作制备比较对象的混合液。
<凝胶化酪蛋白载体和TMR的混合液的制备>
代替TMR标记ACTH（1-24），使用TMR，进行与上述的凝胶化酪蛋白载体和TMR标记ACTH（1-24）的制备同样的操作，从而制备凝胶化酪蛋白载体和TMR的混合液。再有，作为凝胶化酪蛋白载体和TMR的混合液的比较对象、具体而言不含凝胶化酪蛋白载体的混合液，代替1%凝胶化酪蛋白载体分散液而使用超纯水而通过与上述相同的操作制备比较对象的混合液。
（3）由混合液的荧光强度测定的对于ACTH（1-24）的吸附能选择性的评价
<由凝胶化酪蛋白载体和TMR标记ACTH（1-24）的混合液的荧光强度测定的对于ACTH（1-24）的吸附能选择性的评价>
将上述（2）中制备的凝胶化酪蛋白载体和TMR标记ACTH（1-24）的混合液的，在激发波长540nm荧光波长580nm的上清的荧光强度用分光荧光光度计（日立HighTech制F-7000）测定。另外，作为其比较对象测定上述（1）中制备的不含凝胶化酪蛋白载体的混合液的荧光强度。通过将比较对象的荧光强度换算为30μM的TMR标记ACTH（1-24），算出不吸附于凝胶化酪蛋白载体而残留在上清中的TMR标记ACTH（1-24）量。
<由凝胶化酪蛋白载体和TMR的混合液的荧光强度测定的对于ACTH（1-24）的吸附能选择性的评价>
将上述（2）中制备的凝胶化酪蛋白载体和TMR的混合液的，在激发波长540nm荧光波长580nm的上清的荧光强度用分光荧光光度计（日立HighTech制F-7000）测定。另外，作为其比较对象测定上述（1）中制备的不含凝胶化酪蛋白载体的混合液的荧光强度。通过将比较对象的荧光强度换算为30μM的TMR，算出不吸附于凝胶化酪蛋白载体而残留在上清中的TMR量。它们的结果示于图3。
<结果>
从图3得知，凝胶化酪蛋白载体几乎不吸附TMR。因此示，在TMR标记ACTH（1-24）中的ACTH（1-24）的部分和凝胶化酪蛋白载体选择性地吸附。
【实施例4：吸附于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的检测】
（1）样品的制备
<样品A的制备>
加300μM TMR标记ACTH（1-24）的水溶液（10μL）、1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（80μL），制备混合液（100μL）。制备的混合液作为样品A而取得。
<样品B的制备>
向实施例1中制备的1%凝胶化酪蛋白载体分散液（50μL）加1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（40μL），制备混合液（100μL）。将此混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离为上清和沉淀物，将得到的沉淀物作为样品B而取得。
<样品C及D>
将实施例1中制备的1%凝胶化酪蛋白载体分散液（50μL）和300μM TMR标记ACTH（1-24）的水溶液（10μL）混合，再加1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（30μL），制备混合液（100μL）。此混合液的凝胶化酪蛋白载体的终浓度调节为0.5%、ACTH（1-24）的终浓度调节为30μM。将此混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和沉淀物。再有，将此上清作为样品C而取得。接下来，向其沉淀物添加超纯水（100μL），通过涡旋搅拌沉淀物和超纯水，将此混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和沉淀物。此沉淀物作为在图4中示的SDS-PAGE中的样品D而取得。
（2）由SDS-PAGE的ACTH（1-24）的检测
预先，将NuPAGE LDS样品缓冲液（4×）（Invitrogen公司制）（50μL）、NuPAGE样品还原试剂（10×）（Invitrogen公司制）（20μL）、超纯水（30μL）混合，调配2倍浓缩样品缓冲液（100μL）。向上述（1）中取得的样品D加超纯水（20μL）及2倍浓缩样品缓冲液(20μL），于70℃加热10分钟。加热后，将得到的样品通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和沉淀物。对于通过离心分离得到的上清（10μL）进行SDS-PAGE。上述（1）中取得的样品B也与上述的样品D进行同样的操作，进行SDS-PAGE。另外，对于上述（1）中取得的样品A，对于5μL加2倍浓缩样品缓冲液（5μL），于70℃加热10分钟。对于其10μL进行SDS-PAGE。上述（1）中取得的样品C与上述的样品A进行同样的操作，进行SDS-PAGE。
再有，作为SDS-PAGE的电泳装置，使用垂直型小电泳系统（Invitrogen公司制），作为电泳凝胶使用NuPAGE4-12%Bis-TrisGels，1.0mm，10孔（Invitrogen公司制），作为电泳缓冲液使用将NuPAGE MES SDS电泳缓冲液（20×）（Invitrogen公司制）稀释20倍的溶液。电泳时的电压恒定为200V。在SDS-PAGE后，使用EzStainSilver（ATTO公司）进行凝胶的银染色。结果示于图4。
从图4的结果，ACTH（1-24）几乎吸附于凝胶化酪蛋白载体，在上清大致不存在，另外吸附于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）直接可通过SDS-PAGE检测。再有，一般而言，在碱性存在下，ACTH成为聚合物，所以预想TMR-ACTH之上存在的条带是ACTH的聚合物。可知凝胶化酪蛋白载体也吸附ACTH（1-24）的聚合物。
【实施例5：以白蛋白与ACTH（1-24）结合的复合物（以下，称之为“BSA-ACTH（1-24）复合物”）作为对象的白蛋白除去及ACTH（1-24）的回收】
（1）凝胶化酪蛋白载体分散液的制备
将酪蛋白钠溶解于超纯水，制备酪蛋白钠溶液50g/L（5%）。向此酪蛋白钠溶液（1mL）添加5%水溶性碳二亚胺（WSC）溶液（1mL）和超纯水（3mL），制备酪蛋白钠的终浓度是1%，并且WSC的终浓度是1%的酪蛋白钠-WSC混合溶液（5mL）。通过将此混合溶液于80℃加热10分钟返回室温，在混合溶液中形成凝胶。从含凝胶的混合溶液，将液体部分通过移液器吸吐除去而将凝胶沉淀作为凝胶化酪蛋白载体而取得。向取得的凝胶化酪蛋白载体加超纯水，通过离心分离装置以22200G离心10分钟，将上清和凝胶载体分离，将上清用移液器吸吐分离。通过将此操作重复进行2次，清洗凝胶化酪蛋白载体。将清洗后的凝胶载体通过涡旋及移液器吸吐使成为细的凝胶载体，分散到超纯水（3mL）。将此分散液作为1.6%的凝胶化酪蛋白载体的分散液。
（2）BSA-ACTH（1-24）复合物的制备
将2400μM的BSA溶液（40μL），200μM的TMR标记ACTH（1-24）（8μL）和超纯水（32μL）混合，制备BSA-ACTH（1-24）复合物溶液（80μL）。再有，此溶液的BSA浓度是1200μM，TMR标记ACTH（1-24）浓度调节为20μM。另外，将BSA和TMR标记ACTH（1-24）之间的平衡的解离常数（Kd）用荧光滴定法测量时，Kd值是12μM。即，将制备的复合物溶液稀释2倍时，即BSA浓度是600μM，TMR标记ACTH（1-24）浓度的10μM的情况是，98.0%的TMR标记ACTH（1-24）与BSA形成复合物。
（3）凝胶化酪蛋白载体和样品的混合液的调节
<凝胶化酪蛋白载体和BSA-ACTH（1-24）复合物的混合液的制备>
将上述（2）中制备的溶液（80μL）和上述（1）中制备的1.6%的凝胶化酪蛋白载体分散液（50μL）混合之后，加1M的Bicine/NaOH缓冲溶液（pH9）(16μL）及超纯水（14μL），制备混合液（160μL）。将此混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。再有，使得此凝胶化酪蛋白载体经历下述（4）的操作，另外上清作为有BSA的样品“上清A”。另外，作为比较对象，加不含凝胶化酪蛋白载体的混合液、BSA-ACTH（1-24）复合物的溶液（80μL）、1M的Bicine/NaOH缓冲溶液(pH9）(16μL）及超纯水（64μL）而制备混合液（160μL）。此溶液作为有BSA的参照（REF.）样品。
<凝胶化酪蛋白载体和ACTH（1-24）的混合液的制备>
代替BSA-ACTH（1-24）复合物的溶液，使用20μM TMR标记ACTH（1-24）溶液，与上述的凝胶化酪蛋白载体和BSA-ACTH（1-24）复合物的混合液的制备同样地制备混合液。再有，使得到的凝胶化酪蛋白载体经历下述（4）的操作，另外上清作为无BSA的样品“上清A”。另外，作为比较对象，加不含凝胶化酪蛋白载体的混合液、20mM TMR标记ACTH（1-24）（80μL）、1M的Bicine/NaOH缓冲溶液（pH9、16μL）及超纯水（64μL）而制备混合液（160μL）。此溶液作为无BSA的REF.样品。
（4）凝胶化酪蛋白载体的清洗
<使与BSA-ACTH（1-24）复合物混合的凝胶化酪蛋白载体的清洗>
向以上述（3）凝胶化酪蛋白载体和BSA-ACTH（1-24）复合物的混合液的制备分离的凝胶化酪蛋白载体，添加20mM Bicine/NaOH缓冲溶液（160μL）之后，进行移液器吸吐，以便凝胶化酪蛋白载体在溶液中均一地分散。移液器吸吐后，通过离心分离装置以22200G离心5分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。再有，使此凝胶化酪蛋白载体经历下述（5）的操作，上清作为有BSA的样品“上清B”。
<使与ACTH（1-24）混合的凝胶化酪蛋白载体的清洗>
向以上述的（3）凝胶化酪蛋白载体和ACTH（1-24）的混合液的制备分离的凝胶化酪蛋白载体添加20mM Bicine/NaOH缓冲溶液（160μL）之后，进行移液器吸吐，以便凝胶化酪蛋白载体在溶液中均一地分散。移液器吸吐后，通过离心分离装置以22200G离心5分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。再有，使此凝胶化酪蛋白载体经历下述（5）的操作，上清作为无BSA的样品“上清B”。
（5）吸附于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的游离
<从使与BSA-ACTH（1-24）复合物接触的凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的游离>
向上述（4）使与BSA-ACTH（1-24）复合物混合的凝胶化酪蛋白载体的清洗的清洗后凝胶化酪蛋白载体添加100mM MES/NaOH缓冲溶液（pH5）（160μL）之后，进行移液器吸吐，以便凝胶化酪蛋白载体在溶液中均一地分散。移液器吸吐后，将混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。此上清作为有BSA的样品“上清C”。
<吸附于使与ACTH（1-24）混合的凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的游离>
向上述（4）使与ACTH（1-24）混合的凝胶化酪蛋白载体的清洗的清洗后凝胶化酪蛋白载体添加100mM MES/NaOH缓冲溶液(pH5）（160μL）之后，进行移液器吸吐，以便凝胶化酪蛋白载体在溶液中均一地分散。移液器吸吐后，将混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。此上清作为无BSA的样品“上清C”。
（6）由SDS-PAGE确认由凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的回收的样式
预先，制备将10×装载缓冲液（10μL、TAKARA公司制）、60%甘油水溶液（5μL）及超纯水（85μL）混合的溶液，将其作为样品缓冲液。然后，采集上述的有BSA的REF.样品、有BSA的样品上清A～C、无BSA的REF.样品、无BSA的样品上清A～C的各20μL，与样品缓冲液（2μL）混合，进行SDS-PAGE。再有，SDS-PAGE作为电泳装置使用垂直型小电泳系统（Invitrogen公司制），作为电泳凝胶使用NuPAGE4-12%Bis-Tris Gels，1.0mm,10孔（Invitrogen公司制），作为电泳缓冲液使用将NuPAGE MES SDS电泳缓冲液（20×）（Invitrogen公司制）稀释20倍的溶液。另外，电泳时的电压恒定为200V。如此，进行SDS-PAGE之后，在荧光成像仪（Pharos FX（商标）Molecular Imager:BIO-RAD公司）的TAMRA用波长（激发波长532nm）的High Sample Intensity模式取得电泳凝胶的图像数据（图5）之后，使用EzStain Silver（ATTO公司），依顺序进行电泳凝胶的银染色（图6）。
<SDS-PAGE的结果>
从图5可确认TMR标记ACTH（1-24）的条带，从图6可确认BSA的条带。在将凝胶化酪蛋白载体和BSA-ACTH（1-24）复合物混合的系统（有BSA的系统）中，从图6的REF.样品和样品“上清A”的结果知，在Bicine/NaOH缓冲溶液（pH9）存在下，BSA不吸附到凝胶化酪蛋白载体。但是，在图5中确认TMR标记ACTH（1-24）的涂抹式的条带，从其条带的浓度变薄，想到一部分的TMR-ACTH（1-24）从BSA脱离，吸附于凝胶化酪蛋白载体。推测此凝胶化酪蛋白载体从BSA夺TMR-ACTH（1-24）的比例通过BSA和ACTH（1-24）的平衡反应兼凝胶化酪蛋白载体和ACTH（1-24）的平衡反应而决定。即，要从BSA夺更多的TMR-ACTH（1-24）时，只要增加凝胶化酪蛋白载体的添加量即可。再者，在样品“上清B”中，由于几乎无法确认TMR标记ACTH（1-24）的条带，预计在清洗步骤中，凝胶化酪蛋白载体上也吸附着TMR标记ACTH（1-24）。然后得知，在样品“上清C”中，由于可确认TMR标记ACTH（1-24）的浓的条带，在MES/NaOH缓冲溶液（pH5）存在下，TMR标记ACTH（1-24）从凝胶化酪蛋白载体游离。
从以上的结果示，即便是结合到BSA的ACTH（1-24），可吸附于凝胶化酪蛋白载体。从此结果提示，可使用凝胶化酪蛋白，从BSA-ACTH（1-24）复合物，除去BSA而回收ACTH（1-24）。
【实施例6：从凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的解离条件的检查】
（1）凝胶化酪蛋白载体分散液的制备
与实施例1（1）的凝胶化酪蛋白载体分散液的制备同样地，制备1%凝胶化酪蛋白载体分散液。
（2）凝胶化酪蛋白载体和样品与ACTH（1-24）的混合液的制备
将上述（1）中制备的1%凝胶化酪蛋白载体分散液（50μL）和300μM的TMR标记ACTH（1-24）的水溶液（10μL）混合，加1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（30μL），制备混合液（100μL）。此混合液的凝胶化酪蛋白载体的终浓度调节为0.5%、TMR标记ACTH（1-24）的终浓度调节为30μM。将此混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。
（3）使与ACTH（1-24）混合的凝胶化酪蛋白载体的清洗
向上述（2）中分离的凝胶化酪蛋白载体添加20mM Bicine/NaOH缓冲溶液（160μL），将凝胶化酪蛋白载体移液器吸吐。移液器吸吐之后，通过离心分离装置以22200G离心5分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。
（4）与凝胶化酪蛋白载体结合的ACTH（1-24）的解离
向上述（3）中清洗的凝胶化酪蛋白载体添加各溶液至成为表2所示的pH之后，进行移液器吸吐至凝胶化酪蛋白载体在溶液中变得均一。移液器吸吐后，将混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。为了算出分离的上清中残留的ACTH（1-24）的浓度，通过与实施例3的（3）所述的分光荧光光度测量定同样的操作测定上清的荧光强度。另外，作为它们的比较对象，调配添加各溶液至成为表2所示的pH的不含凝胶化酪蛋白载体的30μM的TMR标记ACTH（1-24）溶液，也同样地算出其溶液的荧光强度。比较对象的荧光强度换算为TMR标记ACTH（1-24）30μM，算出分离凝胶化酪蛋白载体的上清中残留的ACTH（1-24）浓度。其测定结果示于表2及图7。
【表2】
Figure BDA00002725344400201
※30mM MES溶液的pH用HCl及NaOH调节
从此表2及图7得知，无关于溶液的种类，通过使用pH5以下的溶液，可将与凝胶化酪蛋白载体结合的ACTH（1-24）从凝胶化酪蛋白载体解离。另外知，作为pH调节剂使用的10mM的醋酸溶液及30mM碳酸氢铵溶液是挥发性的，HPLC测定或MS测定之时无脱盐步骤，可直接测定。即，可将此解离后的溶液根据测定的方法选适宜的溶剂。例如，只要用生物化学方法检测ACTH（1-24），使用作为Good缓冲液的甘氨酸/NaOH缓冲溶液或MES/NaOH缓冲溶液即可。另外，如上述的质谱分析法一样的必要处理前脱盐步骤的方法的情况中，可使用如醋酸水溶液一样的挥发性的pH调节试剂解离ACTH（1-24）。
【实施例7：以含TMR标记ACTH（1-24）的血清作为对象的白蛋白除去及ACTH（1-24）的回收】
（1）凝胶化酪蛋白载体分散液的制备
与实施例1（1）的凝胶化酪蛋白载体分散液的制备同样地，制备1%凝胶化酪蛋白载体分散液。
（2）凝胶化酪蛋白载体和样品的混合液的制备
<凝胶化酪蛋白载体和含TMR标记ACTH（1-24）的血清的混合液的制备>
预先，将从健康的女性（22岁）得到的血清（100μL、PROMEDDX公司“Normal Serum Pool”）和300μM TMR标记ACTH（1-24)(10μL）混合，制备含TMR标记ACTH（1-24）的血清。向别的容器离心分离上述（1）中制备的1%凝胶化酪蛋白载体分散液（100μL），分为上清和沉淀。将该上清用移液器吸吐除去，仅取得沉淀。接下来，向取得的沉淀加上述中制备的含TMR标记ACTH（1-24）的血清（110μL）、1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(20μL）及超纯水（20μL），制备凝胶化酪蛋白载体和样品的混合液（150μL）。此混合液的凝胶化酪蛋白载体的终浓度调节为0.75%、TMR标记ACTH（1-24）的终浓度调节为20μM、血清的稀释率调节为1.5倍。将此混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。另外，作为不含凝胶化酪蛋白载体的回收前的参照样品，加上述含TMR标记ACTH（1-24）的血清（110μL）、1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(20μL）及超纯水（20μL），制备混合液（150μL）。
<制备仅凝胶化酪蛋白载体的溶液>
代替含TMR标记ACTH（1-24）的血清而使用超纯水，由与上述的凝胶化酪蛋白载体和含TMR标记ACTH（1-24）的血清的混合液的制备同样的操作，制备凝胶化酪蛋白载体溶液。再有，将此液作为对照样品A。另外，作为不含凝胶化酪蛋白载体的回收前的参照样品，加1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(20μL）及超纯水（130μL），制备混合液（150μL）。
<凝胶化酪蛋白载体和血清溶液的混合液的制备>
代替TMR标记ACTH（1-24）而使用超纯水，由与上述的凝胶化酪蛋白载体和含TMR标记ACTH（1-24）的血清的混合液的制备同样的操作，制备凝胶化酪蛋白载体和血清的混合液。再有，将此液作为对照样品B。另外，作为不含凝胶化酪蛋白载体的回收前的参照样品，加血清（100μL）、1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(20μL）及超纯水（30μL），制备混合液（150μL）。
（3）凝胶化酪蛋白载体的清洗
将用上述（2）的混合液的制备分离的上清用移液器吸吐除去，取得凝胶化酪蛋白载体。向此凝胶化酪蛋白载体添加20mMBicine/NaOH缓冲溶液（150μL），进行凝胶化酪蛋白载体移液器吸吐，通过离心分离装置以22200G离心5分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。将此作业重复进行2次。再有，对于上述（2）中制备的对照A及B也进行同样的操作。
（4）吸附于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的游离
向上述（3）的清洗后凝胶化酪蛋白载体添加100mM MES/NaOH缓冲溶液（pH5）（50μL），进行移液器吸吐，将混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。将此上清用移液器吸吐回收，将其作为回收后的样品。再有，对照A及B的样品也进行同样的操作。
（5）由SDS-PAGE的血清成分的除去及ACTH（1-24）的回收的确认
预先，将NuPAGE LDS样品缓冲液（4×）（Invitrogen公司制）（50μL）、NuPAGE样品还原试剂（10×）（Invitrogen公司制）（20mL）、超纯水（30μmL）混合，调配2倍浓缩样品缓冲液（100μL）。向上述（2）中取得的回收前的参照样品加超纯水（5μL）及2倍浓缩样品缓冲液（5μL），于70℃加热10分钟。另外，对于上述（2）中取得的对照A及B样品的回收前的参照样品、另外上述（4）中取得的回收后样品、及对照A及B样品的回收后样品也同样地，加2倍浓缩样品缓冲液（5μL），于70℃加热10分钟，制备各样品。对于得到的各样品1μL进行SDS-PAGE。再有，SDS-PAGE的电泳装置、电泳凝胶、电泳缓冲液与实施例4（2）同样。电泳时的电压恒定为200V。SDS-PAGE后，荧光像和银染色像与实施例5（6）同样的操作而取得。结果示于图8。
从图8的结果可确认，血清中的蛋白质几乎不吸附到凝胶化酪蛋白载体，从血清中可选择性地回收ACTH（1-24）。
【实施例8：以含TMR标记ACTH（1-24）的尿作为对象的蛋白质除去及ACTH（1-24）的回收】
（1）凝胶化酪蛋白载体浓缩液的制备
与实施例1（1）的凝胶化酪蛋白载体浓缩液的制备同样地，制备1%凝胶化酪蛋白载体浓缩液。
（2）凝胶化酪蛋白载体和样品的混合液的制备
<凝胶化酪蛋白载体和含TMR标记ACTH（1-24）的尿的混合液的制备>
预先，将从单供体得到的正常尿（100μL、ProMedDx公司）和300μM TMR标记ACTH（1-24）（10μL）混合，制备含TMR标记ACTH（1-24）的尿。向别的容器离心分离上述（1）中制备的1%凝胶化酪蛋白载体浓缩液（60μL），分为上清和沉淀。将该上清用移液器吸吐除去，仅取得沉淀。接下来，向取得的沉淀加上述中制备的含TMR标记ACTH（1-24）的尿（110μL）和1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL），制备凝胶化酪蛋白载体和样品的混合液（120μL）。此混合液的凝胶化酪蛋白载体的终浓度调节为0.5%、TMR标记ACTH（1-24）的终浓度调节为25μM、尿的稀释率调节为1.2倍。由此将混合液用离心分离装置以22200G离心3分钟，分离上清和凝胶化酪蛋白载体。另外，作为不含凝胶化酪蛋白载体的回收前的参照样品，加上述含TMR标记ACTH（1-24）的尿（110μL），和1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL），制备混合液（120μL）。
<制备仅凝胶化酪蛋白载体的液>
代替含TMR标记ACTH（1-24）的尿而使用超纯水，由与上述的凝胶化酪蛋白载体和含TMR标记ACTH（1-24）的尿的混合液的制备同样的操作，制备凝胶化酪蛋白载体溶液。再有，将此液作为对照样品A。另外，作为不含凝胶化酪蛋白载体的回收前的参照样品，加1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（110μL），制备混合液（120μL）。
<凝胶化酪蛋白载体和尿的混合液的制备>
代替TMR标记ACTH（1-24）而使用超纯水，由与上述的凝胶化酪蛋白载体和含TMR标记ACTH（1-24）的尿的混合液的制备同样的操作，制备凝胶化酪蛋白载体和尿的混合液。再有，将此液作为对照样品B。另外，作为不含凝胶化酪蛋白载体的回收前的参照样品，加尿（100μL）、1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（10μL），制备混合液（120μL）。
<凝胶化酪蛋白载体和TMR标记ACTH（1-24）的混合液的制备>
代替尿而使用超纯水，由与上述的凝胶化酪蛋白载体和含TMR标记ACTH（1-24）的尿的混合液的制备同样的操作，制备凝胶化酪蛋白载体和TMR标记ACTH（1-24）的混合液。再有，将此液作为对照样品C。另外，作为不含凝胶化酪蛋白载体的回收前的参照样品，加300μM TMR标记ACTH（1-24）（10μL）、1M的Bicine缓冲溶液（pH9）(10μL）及超纯水（100μL），制备混合液（120μL）。
（3）凝胶化酪蛋白载体的清洗
将用上述（2）的混合液的制备分离的上清用移液器吸吐除去，取得凝胶化酪蛋白载体。向此凝胶化酪蛋白载体添加20mMBicine/NaOH缓冲溶液（120μL），进行凝胶化酪蛋白载体移液器吸吐，使用离心分离装置以22200G离心5分钟，分离为上清和凝胶化酪蛋白载体。将此作业重复进行2次。再有，对于上述（2）中制备的对照样品A～C也进行同样的操作。
（4）吸附于凝胶化酪蛋白载体的ACTH（1-24）的游离
向上述（3）的清洗后凝胶化酪蛋白载体添加100mM甘氨酸/NaOH缓冲溶液（pH2.5）（60μL），进行移液器吸吐，将混合液通过离心分离装置以22200G离心3分钟，分离为上清和凝胶化酪蛋白载体。将此上清用移液器吸吐回收，将其作为回收后的样品。再有，对照样品A～C也进行同样的操作。
（5）由SDS-PAGE的尿成分的除去及ACTH（1-24）的回收的确认
预先，将NuPAGE LDS样品缓冲液（4×）（Invitrogen公司制）（50μL）、NuPAGE样品还原试剂（10×）（Invitrogen公司制）（20μL）、超纯水（30μL）混合，调配2倍浓缩样品缓冲液（100μL）。向上述（2）中取得的回收前的参照样品加超纯水（5μL）及2倍浓缩样品缓冲液（5μL），于70℃加热10分钟。另外，对于上述（2）中取得的对照A～C的样品的回收前的参照样品、另外上述（4）中取得的回收后样品、及对照A～C的样品的回收后样品也同样地，加2倍浓缩样品缓冲液（5μL），于70℃加热10分钟，制备各样品。对于得到的各样品（10μL）进行SDS-PAGE。
再有，SDS-PAGE的电泳装置、电泳凝胶、电泳缓冲液与实施例4（2）同样。电泳时的电压恒定为200V。SDS-PAGE后，由与实施例5（6）同样的操作取得荧光像及银染色像。结果示于图9。从图9的结果可确认，凝胶化酪蛋白载体上几乎不吸附尿中的蛋白质，从尿中可选择性地回收ACTH（1-24）。

Claims (14)

1.肾上腺皮质刺激激素的检测方法，其包括：
使含肾上腺皮质刺激激素的液体样品和凝胶化酪蛋白接触，使肾上腺皮质刺激激素吸附到凝胶化酪蛋白的步骤，以及
检测上述吸附到凝胶化酪蛋白的肾上腺皮质刺激激素的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素吸附步骤通过使液体样品和凝胶化酪蛋白在pH6.5以上的条件下接触来进行。
3.权利要求1或2所述的方法，其还包括：
回收使与液体样品接触的凝胶化酪蛋白的步骤，以及
使回收的吸附到凝胶化酪蛋白的肾上腺皮质刺激激素游离的步骤。
4.权利要求3所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素的游离步骤通过使回收的凝胶化酪蛋白和水系介质在pH5.5以下接触，使吸附到凝胶化酪蛋白的肾上腺皮质刺激激素游离到上述水系介质中来进行。
5.权利要求1或2所述的方法，其中凝胶化酪蛋白是由交联剂凝胶化的酪蛋白。
6.权利要求5所述的方法，其中交联剂是水溶性碳二亚胺。
7.权利要求1或2所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素是具有至少肾上腺皮质刺激激素的1～24位的氨基酸序列的多肽。
8.权利要求1或2所述的方法，其中肾上腺皮质刺激激素与白蛋白形成复合物。
9.权利要求1或2所述的方法，其中液体样品是血液、血浆、血清或尿。
10.肾上腺皮质刺激激素的吸附剂，其含凝胶化酪蛋白。
11.权利要求10所述的吸附剂，其中凝胶化酪蛋白是由交联剂凝胶化的酪蛋白。
12.权利要求11所述的吸附剂，其中交联剂是水溶性碳二亚胺。
13.权利要求10～12之任一项所述的吸附剂，其中肾上腺皮质刺激激素是具有至少肾上腺皮质刺激激素的第1～24的氨基酸序列的多肽。
14.权利要求10～12之任一项所述的吸附剂，其中肾上腺皮质刺激激素与白蛋白形成复合物。
CN201310010173.7A 2012-01-13 2013-01-11 肾上腺皮质刺激激素的检测方法及吸附剂 Active CN103207278B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2012005547A JP5717658B2 (ja) 2012-01-13 2012-01-13 副腎皮質刺激ホルモンの検出方法および吸着剤
JP2012-005547 2012-01-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103207278A true CN103207278A (zh) 2013-07-17
CN103207278B CN103207278B (zh) 2015-01-21

Family

ID=47471651

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310010173.7A Active CN103207278B (zh) 2012-01-13 2013-01-11 肾上腺皮质刺激激素的检测方法及吸附剂

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9952228B2 (zh)
EP (1) EP2615103B1 (zh)
JP (1) JP5717658B2 (zh)
CN (1) CN103207278B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7242599B2 (ja) * 2020-03-17 2023-03-20 株式会社東芝 分子検出装置及び分子検出方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN87107982A (zh) * 1986-11-26 1988-06-15 伯伦格·曼海姆有限公司 可特异结合的物质的测定方法
WO1999001166A1 (en) * 1997-07-02 1999-01-14 Coloplast A/S A method for preparing a non-fibrous porous material
CN1216464A (zh) * 1996-02-27 1999-05-12 帝人株式会社 鼻腔给药的粉剂组合物
CN1776426A (zh) * 2005-11-29 2006-05-24 天津理工大学 半湿蛋白质阵列及其制备方法
CN202033370U (zh) * 2011-04-06 2011-11-09 武汉优尔生科技股份有限公司 人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒
CN102667487A (zh) * 2009-12-10 2012-09-12 希森美康株式会社 碱性肽的检测方法及碱性肽检测用试剂

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3758324A (en) * 1971-12-23 1973-09-11 Allied Chem Cross linking agents for paper binders and paper coated therewith
JPS60231167A (ja) * 1984-05-01 1985-11-16 Nitsusui Seiyaku Kk 診断用スクリ−ニング試薬及びその調製法
SE0300791D0 (sv) 2003-03-20 2003-03-20 Amersham Biosciences Ab Use of ph-responsive polymers
US20070178308A1 (en) * 2006-01-27 2007-08-02 Konica Minolta Medical & Graphic, Inc. Germanium nanoparticles and biosubstance labeling agent by use thereof
JP5038407B2 (ja) 2006-06-14 2012-10-03 ジョンズ ホプキンズ ユニバーシティー 疾患のバイオマーカーとしてのアルブミン結合性タンパク質／ペプチド複合体
JPWO2008072379A1 (ja) * 2006-12-13 2010-03-25 富士フイルム株式会社 修飾された生体高分子の製造方法及び生体高分子の架橋方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN87107982A (zh) * 1986-11-26 1988-06-15 伯伦格·曼海姆有限公司 可特异结合的物质的测定方法
CN1216464A (zh) * 1996-02-27 1999-05-12 帝人株式会社 鼻腔给药的粉剂组合物
WO1999001166A1 (en) * 1997-07-02 1999-01-14 Coloplast A/S A method for preparing a non-fibrous porous material
CN1776426A (zh) * 2005-11-29 2006-05-24 天津理工大学 半湿蛋白质阵列及其制备方法
CN102667487A (zh) * 2009-12-10 2012-09-12 希森美康株式会社 碱性肽的检测方法及碱性肽检测用试剂
CN202033370U (zh) * 2011-04-06 2011-11-09 武汉优尔生科技股份有限公司 人促肾上腺皮质激素的酶联免疫吸附测定试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J.H. LIVESEY ET AL: "Prevention of adsorption losses during radioimmunoassay of polypeptide hormones: effectiveness of albumins, gelatin, caseins, tween 20 and plasma", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2615103B1 (en) 2015-04-22
JP5717658B2 (ja) 2015-05-13
EP2615103A1 (en) 2013-07-17
US20130183762A1 (en) 2013-07-18
US9952228B2 (en) 2018-04-24
JP2013145172A (ja) 2013-07-25
CN103207278B (zh) 2015-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kašička Recent advances in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography of peptides
EP2312308B1 (en) Apparatus and method for analysis by capillary electrophoretic method
Huang et al. Enrichment of low‐abundant serum proteins by albumin/immunoglobulin G immunoaffinity depletion under partly denaturing conditions
JP5977269B2 (ja) 試料の分析方法及びそれに用いる溶液
JP2020111614A (ja) 溶存酸素レベルが低減されたヒトアルブミンの調製方法
Lee et al. Free solution capillary electrophoresis of proteins using untreated fused-silica capillaries
Louis et al. The proteins of rabbit skeletal muscle sarcoplasmic reticulum
CN111868531A (zh) 用于质谱分析的多肽的依序消化
CN103207278A (zh) 肾上腺皮质刺激激素的检测方法及吸附剂
Payne Clinically significant effect of protein concentration on ion-selective electrode measurements of ionised calcium
Antonini et al. VIII The Proteins of the Perilymph
CN110174456A (zh) 一种测定肺表面活性物质蛋白的方法及其应用
CN104807692B (zh) 肽的回收方法、肽的检测方法及试剂
EP0339531B1 (en) Physiological active liquid allergenic composition from biological raw materials
Kaya et al. Recent biopharmaceutical applications of capillary electrophoresis methods on recombinant DNA technology‐based products
US4351711A (en) Electrophoresis method for detecting glycosylated hemoglobin in blood
JP4094776B2 (ja) 溶血試薬及びこれを用いたヘモグロビン類の測定方法
Shang et al. Simultaneous enrichment and sequential separation of glycopeptides and phosphopeptides with poly-histidine functionalized microspheres
JP5963984B2 (ja) 甲状腺刺激抗体測定における試料の前処理方法
EP3135683B1 (en) Method of liberating peptide, method of recovering peptide, using a peptide liberating agent
Amini et al. A protocol for the quality assessment of illegally distributed human growth hormones with respect to identity, purity, endotoxin level and microorganism content
CN115541686A (zh) 乳制品鉴别方法
Cantrell A method of solubilizing human erythrocyte membrane proteins using mersalyl
CN103193865B (zh) 一种仙台病毒抗原肽及其在仙台病毒感染检测中的应用
CN113740524A (zh) 一种蛋白印记膜再生液的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant