CN1986834B - Zo-1基因启动子区dna甲基化检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于检测细胞ZO-1基因启动子区甲基化状态的引物及试剂盒，引物为一对甲基化引物或为一对甲基化引物和一对非甲基化引物。本试剂盒首次选用ZO-1基因作为目标基因，该基因是本发明人应用RLGS技术筛选出的在白血病细胞中启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。利用本发明所述引物及试剂盒检测白血病细胞的特异性好，可达61.7％；灵敏度高，达到0.5％，即1000个细胞中有5个白血病细胞就能够被检测出。应用本发明试剂盒来检测ZO-1基因启动子区高甲基化状态可作为急性白血病诊断、疗效观察、预后判断、微小残留病检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。

Description

ZO-1基因启动子区DNA甲基化检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测ZO-1基因启动子区甲基化状态的甲基化引物对，进一步包括非甲基化引物对，同时，本发明还涉及含有所述引物对的试剂盒。

背景技术

白血病是一种造血系统恶性疾病，严重危害人类的健康，早期诊断与治疗至关重要，治疗后残留的白血病细胞是导致疾病复发及死亡的根源。当前，针对于白血病的检测手段，尤其是白血病早期诊断及微小残留病的检测方法仍然十分有限，是目前迫切需要解决的问题。

白血病细胞的检测方法经过了形态学(morphology，M)、免疫学(immunology，I)、细胞遗传学(cytogenetics，C)、分子生物学(molecular biology，M)检查的漫长过程，目前已发展为综合这4大类检查结果将白血病按MICM进行分型时代。MICM分型不仅对白血病的诊断具有重要意义，而且对白血病的治疗、预后判断等都具有重要的价值。

细胞形态学检查仍是目前诊断白血病的基础。1976年法、美、英三国的白血病专家依据于对白血病细胞的形态学观察和细胞化学反应，制订了FAB分类法，其确诊急淋(ALL)和急非淋(ANLL)的符合率可达95％以上。而各亚型的诊断符合率仅60％-80％，因而难以预测预后和危险因素，并且有少数病例由于细胞形态学表现不典型，细胞发育幼稚等而难以明确诊断和分型，且此诊断方法受人为因素影响较大，检出率较低。

免疫分型(immunophenotyping)已是当今白血病诊断、分型、预后判断和残留病检测的一个有力手段，特别是在①仅根据形态不能确定白血病系列特异性(髓系还是淋系)；②区分B细胞和T细胞白血病；③双表型白血病确诊等方面，免疫分型尤显重要性。免疫表型分析的方法主要有两类：一、免疫酶标法二、免疫荧光法。近十年来，在早期免疫分型研究中，一般选用流式细胞术(FCM)，该技术是继电子显微镜技术后细胞学研究手段的重大进展，这种技术能高度自动分析单个细胞的多个生物学特征或多种细胞生化成分的含量，一般在1-2分钟内就能完成对细胞大群体(几万个单细胞)的定量分析测定，这种细胞大群体的分析数据具有高度统计学精度的特点，同时同一单细胞多参数相关分析可获得更多更精确的信息。这是以往任何细胞分析术不可比拟的。FCM还可以在对样品细胞多参数分析测定的基础上，结合多种细胞生物学参数特性，将样品中特定的细胞亚群高纯度分选纯化出来，单独收集以供进一步研究。FCM白血病细胞免疫表型分析可以快速精确分析白血病异常细胞的系来源及其分化阶段，这称为FCM白血病细胞免疫表型诊断，它与细胞形态学检查、细胞遗传学检查以及分子生物学检查结合在一起，可以较准确的各类各型白血病进行诊断，以便正确选择治疗方案，以获得更高的缓解率和更好的临床治疗效果。此方法也存在一定的缺点，如因标本不能长期保存导致无法利用该方法进行回顾性分析；原始细胞比例较低则结果难以分析等。

细胞遗传学检查对急性白血病的分型和判断预后很有价值。应用先进的染色体分辩技术，80％～85％的急性白血病可检出染色体异常。染色体的制备方法包括骨髓细胞直接法和骨髓细胞短期培养法。目前认为ANLL以采用培养法较好，因其不但分裂相数量增加、质量改善，而且异常分裂相检出率高。ALL因白血病细胞培养后分裂较少，故更多采用直接法。染色体显带技术分为G显带(胰酶G显带，GTG)和R显带(热变性吉姆萨R显带，RHG)。苏州医学院薛永权等根据十多年对6000余例恶性血液病开展细胞遗传学分析认为，联合骨髓直接法和短期培养法，以及采用R显带为主，G显带为辅的核型分析技术有助于提高染色体制备的成功率和核型异常的检出率，但细胞遗传学技术难于掌握，并且仅能显示大体的染色体异常。

白血病的基因改变已经通过细胞遗传学分析证实，分子生物学进展所产生的一些技术，包括荧光原位杂交、DNA印迹分析和逆转录-PCR(RT-PCR)，这些技术比细胞遗传学检查有更高的敏感性和特异性，可以对细胞遗传学改变不明显和不可见的亚微结构改变进行基因分析。另外，髓系白血病细胞的免疫表型在临床分型上的特异性较低，因而其分子表型的应用价值相对更大些。

随着后基因组时代的到来，表观遗传学(Epigenetics)已成为生命学科的研究前沿。表观遗传学是针对遗传学而言的，是指研究DNA序列不发生改变的可遗传的基因表达变化的科学，它可以解释一些经典遗传学所不能解释的问题，例如：单卵双生的兄弟具有完全相同的基因型，并在同样的环境下成长，但仅其中一人患白血病，而另外一人身体健康，因此表观遗传信息提供了何时、何地以何种方式去应用遗传信息的指令。在血液肿瘤领域中，表观遗传学研究主要集中DNA甲基化及组蛋白乙酰化上。DNA甲基化修饰是基因组表观遗传调控中主要的方式，人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，基因启动子区CpG岛高甲基化可导致抑癌基因表达沉默进而导致肿瘤发生。DNA甲基化是指在甲基化转移酶的作用下，以s-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到CG二核苷酸胞嘧啶的5号碳原子上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化异常是细胞癌变过程中早期、频发事件，因此特异基因的甲基化可作为癌症早期诊断的分子标志物、治疗靶点和判断预后手段。随着技术的进步，检测甲基化的手段也丰富起来，不仅可探测某段DNA序列的甲基化分布，而且还能大通量的了解整个基因组的甲基化程度。目前主要方法有两类：一是亚硫酸氢钠法(Sodium Bisulfite)，包括亚硫酸氢钠法依赖的基因测序法、亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法{COBRA}、甲基化特异性PCR(MS-PCR)、甲基化敏感的单核苷酸扩增法(Ms-SNuE)等；另一类是甲基化敏感的限制性内切酶法，包括Southern法、甲基化敏感的限制性图谱(MSRF)、限制性标记基因组扫描技术(RLGS)、差异性甲基化杂交分析(DMH)、甲基化CpG岛扩增子分析(MCA)等。值得一提的是MS-PCR，自1996年Herman发明了此项技术后，大大简化了DNA甲基化的检测方法，使得表观遗传学研究更加迅速的向前发展，其突出的优点在于高特异性、高灵敏度、操作简便、费用及耗时均较少、不受限制性内切酶的限制，目前MS-PCR已成为用以研究基因甲基化状态的应用最为广泛的方法，尤其对于大批的临床标本甲基化状态的研究更是首选方法。MS-PCR的基本原理是：DNA经过亚硫酸盐硫化修饰后，CpG岛上没有发生甲基化的CG二核苷酸中的胞嘧啶就转化为尿嘧啶，最后转化为胸腺嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶则保持不变，因此针对上述区别分别设计甲基化引物及非甲基化引物，分别进行PCR扩增，扩增产物行凝胶电泳照相观察结果，得出是否为甲基化的结论。

ZO-1是1986年应用特异性单克隆抗体从小鼠的肝细胞紧密连接结构中鉴定出来的，它是第一个被发现的紧密连接蛋白，并且被认为是一种重要的紧密连接骨架结构(Stevenson，B.R.，and D.A.Goodenough.Zonulae occludentes in junctionalcomplex-enriched fractions from mouse liver：preliminary morphological and biochemicalcharacterization.J.Cell Biol.98：1209-1221，1984；Stevenson，B.R.，J.D.Silicano，M.S.Mooseker，and D.A.Goodenough.Identification of ZO-1：a high molecular weightpolypeptide associated with the tight junction(zona occluden)in a variety of epithelia.J.CellBiol.103：755-766，1986)。ZO-1基因大小为122351bp，位于人15号染色体长臂1区三带，即15q13 chr15：27779648-27901998，外显子数：28，CDS外显子数：27，与小鼠tjp-1基因具有高度的同源性。下面简述ZO-1基因的结构与功能：

ZO-1在紧密连接中起中介作用，它把闭锁蛋白和细胞内骨架系统连接在一起，构成稳定的连接系统。ZO-1是与紧密连接和细胞内骨架系统有密切关系的胞膜下蛋白(Itoh.M，NagafuchiA，Yone mura S et al.J Cell Biol，1993；121：491-502；Jesaitis LA，Goode nough DA.J Cell Biol，1994；124：949)，ZO-1与ZO-2相互结合在一起，并都与另一个130kD的蛋白质相结合形成蛋白复合体(Bal da MS.Gozales-Mariscal Matter K et al.J Cell Biol，1993；123：293-302)。现已证明ZO-1与闭锁蛋白羧基末端结合；研究提示ZO-1也与细胞骨架的血影蛋白(Spectrin)结合，它还被发现存在于某些以钙粘附分子为基础的细胞间连接中，如心肌细胞的润盘。ZO-1多肽链羧基末端富含脯氨酸残基，氨基酸序列分析发现此种蛋白质含有与膜结合鸟苷酸激酶的同源结构域(Bryant PJ，Watson KL，Justice RW et al.DevBiol，1993(suppl)；239-249)；ZO-1中还含有SH3(Srchomology3)结构域，这种结构在许多骨架蛋白和信号传递蛋白质中均存在，在亚细胞水平直接介导蛋白质与蛋白质相结合形成多蛋白复合物，这些结果预示ZO-1参与细胞间通过紧密连接进行的信号转导。

ZO-1是人的膜相关鸟苷酸激酶家族成员之一。MAGUK家族成员均含有几个保守结构域：包括一个SH3结构域，鸟苷酸激酶结构域和PDZ结构域。ZO-1的PDZ结构域与Dlg同源，Dlg是果蝇lethal(1)discs-large-1抑癌基因的编码产物，这表明ZO-1在细胞增殖的调控中起重要作用(Elizabeth W，Maria.S.B.，Alan S.The tight junction protein ZO-1 ishomologous to the Drosophila discs-large tumor suppressor protein of septate junctions.J.Cell Biol，1993；Vol.90，pp.7834-7838)。除与跨膜蛋白occludin及ZO-2直接作用外，有研究表明，在急性髓细胞白血病中ZO-1还与AF-6(ras癌基因的作用靶点)相互作用(Yamamoto T，Harada N，Kano K，Taya S，Canaani E，Matsuura Y，Mizoguchi A，Ide C，Kaibuchi K：The Ras target AF-6 interacts with ZO-1 and serves as a peripheral component oftight junctions in epithelial cells.J Cell Biol 1997，139：785-795)，这表明ZO-1可能在白血病的发生、发展中起作用。

ZO-1功能紊乱与人类多种疾病密切相关。ZO-1功能异常，导致紧密连接缺陷，失去其正常的保护及屏障功能，导致疾病的发生。例如：保护功能丧失，导致细胞极性异常，因此可出现肿瘤、致癌乳头瘤病毒感染等；屏障功能的丧失则与水肿、黄疸、细菌性肠炎等疾病相关(Norimasa S·Masaki M·Keisuke K：Tight junctions and human diseases.Med Electron Microsc(2003)36：147-156)。

目前，ZO-1与肿瘤之间关系的研究是学术界关注的热点。研究资料表明，ZO-1不仅参与肿瘤的发生机制，同时与肿瘤的进展也关系密切。在结肠癌中，癌组织中ZO-1的表达明显减少或缺如，而在正常结肠组织中，则该基因为高表达的；在侵袭性强、早期发生转移的病例中，ZO-1的表达也是缺乏的，这主要与该基因表达沉默所致的紧密连接功能缺陷有关。在正常乳腺中ZO-1也是高强度表达的，但在乳腺癌中，ZO-1表达减少或缺失的病例占69％，其中分化良好的病例中ZO-1表达减少或缺如的占42％，在中等程度分化的比例中占83％，而分化类型较差的病例中占93％，与疾病的恶性程度及进展相关；在此项研究中还表明在23％的乳腺癌患者中ZO-1基因发生杂合性缺失，并且推测肿瘤组织中ZO-1表达下调的机制可能是杂合性缺失、点突变和高甲基化(Kevin B.Hoover，Shu-Yuan Liao，

 and Peter J.Bryant.Loss of the tight junction MAGUK ZO-1 in breastcancer relationship to glandular differentiation and loss of heterozygosity AJP December1998，Vol.153，No.6：1767-1773)。但也有学者研究表明，在胰腺癌、滑膜肉瘤的病人中zo-1高表达，并且这种过表达导致了肿瘤转移特性(Kleeff J，Shi X，Bode HP，Hoover K，Shrikhande S，Altered Expression and Localization of the Tight Junction Protein ZO-1 inPrimary and Metastatic Pancreatic Cancer.Pancreas.2001 Oct；23(3)：259-65；Billings SD，Walsh SV，Fisher C，Nusrat A，Weiss SW，Folpe AL.，Aberrant expression of tightjunction-related proteins ZO-1，claudin-1 and occludin in synovial sarcoma：animmunohistochemical study with ultrastructural correlation.Mod Pathol.2004 Feb；17(2)：141-9)。上述两种完全相反的现象可能用ZO-1基因的组织特异性来解释。一瑞士学者研究表明，ZO-1与Y-box转录因子(ZONAB)相互作用可下调原癌基因ErbB-2的表达与功能，这说明ZO-1直接参与基因的表达与细胞分化的调控(Maria S.Balda.Thetight junction protein ZO-1 and an interacting transcription factor regulate ErbB-2 expression.The EMBO Journal Vol.19 NO.9 pp.2024-2033，2000)。

本发明人应用限制性标记基因组扫描技术(RLGS)对白血病小鼠、白血病前期及正常小鼠基因组进行检测，首次发现仅在白血病小鼠中ZO-1基因呈高甲基化状态，并且小鼠与人的ZO-1基因高度同源，该研究成果已发表在《nature genetics》上(Yu L，LiuC，Vandeusen J，et al.Global assessment of promoter methylation in a mouse model ofcancer identifies ID4 as a putative tumor-suppressor gene in human leukemia[J].NatGenet，2005，37：265-274)，因此推断该基因的启动子区高甲基化状态可能是一个新的白血病分子标记物，ZO-1基因可能是一个白血病相关抑癌候选基因。以此为坚实的理论依据，本发明人应用MS-PCR的方法对大量临床急性白血病及正常骨髓标本进行检测，以明确其ZO-1基因启动子区甲基化状态。

发明内容

本发明的目的是提供检测细胞ZO-1基因启动子区甲基化状态的引物，即用于检测ZO-1基因启动子区甲基化状态的引物，同时，本发明还涉及含有所述引物的试剂盒。经过反复的试验与推敲，本发明人选出一对特异性很好的甲基化引物对及非甲基化引物对，并且建立了一个稳定的反应体系，摸索出理想的反应条件，应用敏感度较高的丙烯酰胺凝胶电泳技术作为结果的检出手段，因此得出可靠的实验结果，结果表明：ZO-1基因启动子区的高甲基化状态在人类急性白血病中具有较高的特异性。利用所述引物对及试剂盒检测ZO-1基因甲基化状态的灵敏度高，解决了上述检出率低、结果难以分析、仅能显示大体染色体异常等一系列技术问题，因此，本发明所述的引物及试剂盒可用于白血病早期诊断、疗效判定、微小残留病检测等。

本发明提供的技术方案是：用于检测细胞ZO-1基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物对和非甲基化引物对，其中：所述甲基化引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，即：5’-AAAATAAATAGGAAGATTCGTACGG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即：5’-GAAACTAAACGAAACGAAACGAA-3’。利用该甲基化引物对，以硫化修饰后的DNA为模板进行MS-PCR扩增，如果ZO-1基因启动子区存在甲基化，则会得到171bp大小的片段；如果ZO-1基因正常即未甲基化，则不产生扩增产物。基于此，本申请将该引物对称为甲基化引物。所述非甲基化引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即：5’-GGATAAAAATAAATAGGAAGATTTGTATG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述，即：5’-AACAAAACTAAACAAAACAAAACAA-3’。利用该非甲基化引物对，以硫化修饰后的DNA为模板进行MS-PCR扩增，如果ZO-1基因正常即未甲基化，则会得到179bp大小的片段。基于此，本申请将该引物对称为非甲基化引物。

所述甲基化引物对，其上游引物的Tm 58.27，GC含量48％，’C’s 4，下游引物的Tm59.71，GC含量78.26％，’C’s 10。

所述非甲基化引物对，其上游引物的Tm 57.54，GC含量44.83％，’C’s 4，下游引物的Tm56.44，GC含量80％，’C’s 11。

进一步地，利用本发明的引物对进行MS-PCR的方法，其理想的反应条件如下：

95℃下预变性15min，接着进入循环，在94℃下变性50s，在56℃下退火40s，在72℃下延伸1min，共35个循环，之后，继续在72℃下延伸10min。

进一步地，利用本发明的引物对检测白血病细胞的MS-PCR反应体系，以总体25ul计，其包括：

(1)模板：2ul；

(1)模板：2ul；

(2)浓度为10pmol/ul的所述甲基化引物对或非甲基化引物对，其中，上游引物与下游引物各为3ul；

(3)10×Herman’s buffer缓冲液：2.5ul；

(4)25mMdNTP：1.25ul；

(5)Hotstar taq酶：0.15ul；

(6)去离子水：13.1ul；

其中，所述模板为硫化修饰后的待测细胞DNA，或硫化修饰后的ZO-1基因启动子区为100％甲基化的白血病细胞DNA，或硫化修饰后的ZO-1基因启动子区为100％非甲基化的正常骨髓细胞DNA。

本发明提供一种用于检测白血病细胞的试剂盒，该试剂盒包含上述的甲基化引物对。

进一步地，本发明试剂盒还包含上述的非甲基化引物对。

进一步地，本发明的试剂盒还包含甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的ZO-1基因启动子区为100％甲基化的白血病细胞DNA。

进一步地，本发明的试剂盒还包含非甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的ZO-1基因启动子区为100％非甲基化的正常骨髓细胞DNA。

进一步，本发明的试剂盒还包含MS-PCR反应所需的下列成分：10×Herman’s buffer缓冲液，25mMdNTP，Hotstar taq酶，去离子水。

本发明中，用甲基化引物进行扩增，有扩增产物，而用非甲基化引物进行扩增则无扩增产物为完全甲基化；用甲基化及非甲基化引物进行扩增，均有扩增产物，为部分甲基化；用非甲基化引物进行扩增，有扩增产物，用甲基化引物进行扩增，无扩增产物，为无甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定为甲基化。

本发明具有如下优点：利用本发明所述引物及试剂盒检测骨髓细胞，在白血病细胞中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态，甲基化率约为61.7％，而在正常骨髓细胞中，ZO-1基因启动子区呈非甲基化状态，表明该基因启动子区的甲基化状态对于白血病细胞具有特异性；同时应用本发明所述引物及试剂盒、反应体系及反应条件可使检测白血病细胞的灵敏度达到0.5％，即1000个细胞中有5个白血病细胞就能够被检测出，这说明ZO-1基因启动子区甲基化状态可作为急性白血病一个新的分子标志。本试剂盒首次选用ZO-1基因作为目标基因，该基因是本发明人应用RLGS技术筛选出的在白血病细胞中启动子区呈高甲基化状态的基因，具有首创性。因此，应用本发明引物及试剂盒来检测ZO-1基因启动子区高甲基化状态可作为急性白血病诊断、疗效观察、预后判断、微小残留病检测等的有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1以硫化修饰后的正常骨髓细胞DNA、硫化修饰后的白血病细胞DNA、去离子水(阴性对照)为模板，分别用甲基化引物及非甲基化引物进行MS-PCR，扩增产物丙烯酰胺凝胶电泳结果(分别扩增，混合点样)。

1 DNA标记(DL2000)

2、4、6、8、10、12、14、16为甲基化引物扩增的产物；

3、5、7、9、11、13、15、17为非甲基化引物扩增的产物；

2、3为正常骨髓a；6、7为正常骨髓b；4、5为急性白血病(1)；8、9为急性白血病(2)；10、11为急性白血病(3)；12、13为急性白血病(4)；14、15为急性白血病(5)；16、17为阴性对照(去离子水)。

图2将白血病细胞系HL60的DNA(zo-1基因启动子区100％甲基化)与正常细胞的DNA(ZO-1基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰，此后用甲基化引物进行扩增，扩增产物的丙烯酰胺凝胶电泳结果(分别扩增，混合点样)。

第1组：100％HL60细胞DNA+0％正常细胞DNA；

第2组：50％HL60细胞DNA+50％正常细胞DNA；

第3组：5％HL60细胞DNA+95％正常细胞DNA；

第4组：1％HL60细胞DNA+99％正常细胞DNA；

第5组：0.5％HL60细胞DNA+99.5％正常细胞DNA；

第6组：0％HL60细胞DNA+100％正常细胞DNA。

具体实施方式

为更详细地了解本发明，以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

实施例一

1、模板的制备(基因组DNA的提取及硫化修饰过程)

DNA的制备：获取白血病骨髓标本及正常骨髓标本。在本实施例中取5个急性白血病患者的骨髓标本(1)、(2)、(3)、(4)、(5)，2个正常骨髓标本a、b。每个标本各取2ml，应用酚-氯仿抽提的方法分别提取基因组DNA，紫外分光光度仪测定吸光度(A)值确定其含量及纯度。

亚硫酸盐修饰：参考herman(J.G.Herman，J.R.Graff，S.Myohanen，B.D.Nelkin andS.B.Baylin，Methylation-specific PCR：a novel PCR assay for methylation status of CpGislands，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)，9821-9826.)等报道的方法加以改进。取上述制备的基因组DNA，经稀释后，在液氮中反复冻融2次，再用26G注射器抽吸40次，应用紫外分光光度计测定DNA浓度，并精确取1ugDNA，加去离子水至终体积50ul，加入新鲜配制的3M的NaOH 5ul，37℃孵育25min。之后加入新鲜配制的10mM的氢醌30ul及3M亚硫酸氢钠520ul混合均匀(其内已加入新鲜配制的3M的NaOH，计算方法：10ml3M亚硫酸氢钠中加入3M的NaOH 740ul)，50℃孵育16h，此后应用DNA纯化试剂盒(AXYGEN公司产品)纯化并回收DNA，应用50ul去离子水洗脱DNA，向其内加入5ul3M的NaOH以终止硫化修饰，用3倍体积的无水乙醇沉淀DNA，最终硫化修饰后的DNA重新溶解在20ul去离子水中，得到DNA模板，立即使用或-20℃保存。

2、MS-PCR扩增

以甲基化引物进行扩增的PCR反应体系，以总体积25ul计，包括：

模板(硫化修饰后的DNA)：2ul；

甲基化引物(10pmol/ul)：

上游引物(5’-AAAATAAATAGGAAGATTCGTACGG-3’)：3ul，

下游引物(5’-GAAACTAAACGAAACGAAACGAA-3’)：3ul；

10×Herman’s buffer(缓冲液)2.5ul；

25mMdNTP：1.25ul；

Hotstar taq酶：0.15ul；

去离子水：13.1ul

以非甲基化引物进行扩增的PCR反应体系，以总体积25ul计，包括：

与甲基化引物进行扩增的PCR反应体系所不同的是：引物不同，在该体系中为非甲基化引物(10pmol/ul)：

上游引物(5’-GGATAAAAATAAATAGGAAGATTTGTATG-3’)：3ul，

下游引物(5’-AACAAAACTAAACAAAACAAAACAA-3’)：3ul；

其余均与甲基化引物进行扩增的PCR反应体系中的相同。

利用上面建立的MS-PCR反应体系对制备的7个DNA模板(急性白血病细胞(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、正常骨髓a、b)分别进行扩增，并以去离子水作为阴性对照，扩增程序为：95℃下预变性15min，接着进入循环，在94℃下变性50s，在56℃下退火40s，在72℃下延伸1min，共35个循环，之后，继续在72℃下延伸10min。

3.PCR反应产物的检测

PCR产物进行8％丙烯酰胺凝胶电泳，紫外透射分析仪检测并照相。

4.结果

结果见图1，用甲基化引物进行扩增，急性白血病(1)、(3)、(4)有扩增产物，急性白血病(2)、(5)、正常骨髓a、b无扩增产物，而用非甲基化引物进行扩增，急性白血病(1)、(2)、(3)、(5)、正常骨髓a、b有扩增产物，急性白血病(4)无扩增产物。因此，急性白血病(1)、(3)为部分甲基化，急性白血病(4)为完全甲基化，急性白血病(2)、(5)、正常骨髓a、b无甲基化。部分甲基化及完全甲基化均判定为甲基化。

实施例二：临床标本检测

取临床标本60例急性白血病病人骨髓标本，其中，初治急性白血病42例(AML 23例，ALL型12例，未分型7例)、复发急性白血病5例、缓解的急性白血病13例，33例正常骨髓，进行MS-PCR扩增，模板制备、PCR扩增体系及条件、扩增产物的检测均与实施一中的相同，检测结果请见下表：

	例数	M(甲基化)例数	U(无甲基化)例数	甲基化阳性率
					初治急性白血病	AML    23  ALL    12  未分型  7	16    10    3	7    2    4	69.6％    83.3％    42.9％
合计	42	29	13	69.0％
					复发急性白血病	5	4	1	80.0％
缓解的急性白血病	13	4	9	31.0％
					总合计	60	37	23	61.7％
正常骨髓	33	0	33	0.0％

实施例三：敏感度实验

将白血病细胞系HL60的DNA(ZO-1基因启动子区100％甲基化)与正常细胞的DNA(ZO-1基因启动子区100％非甲基化)按比例混合，进行硫化修饰(方法同实施例一)，再进行MS-PCR。PCR产物进行8％丙烯酰胺电泳，紫外透射分析仪测定并照相。

分组：第1组：100％HL60细胞DNA+0％正常细胞DNA

第2组：50％HL60细胞DNA+50％正常细胞DNA

第3组：5％HL60细胞DNA+95％正常细胞DNA

第4组：1％HL60细胞DNA+99％正常细胞DNA

第5组：0.5％HL60细胞DNA+99.5％正常细胞DNA

第6组：0％HL60细胞DNA+100％正常细胞DNA

结果请见图2：在1000个正常细胞中有5个白血病细胞就可以被检测出，即用本发明引物及反应体系、条件检测急性白血病细胞ZO-1基因启动子区的甲基化状态其灵敏度可达到0.5％，灵敏度较高，可用来监测白血病微小残留病变。

实施例四：检测白血细胞的试剂盒组成

检测白血细胞的试剂盒包括以下成分，其中，进行1次MS-PCR的用量为：

1、甲基化引物：上游引物核苷酸序列为SEQ ID No.1，下游引物核苷酸序列为SEQ ID No.2，各为3ul。

2、非甲基化引物：上游引物核苷酸序列为SEQ ID No.3，下游引物核苷酸序列为SEQ IDNo.4，各为3ul。

3、反应液2份，每份反应液包括：

(1)Herman’s buffer(缓冲液)2.5ul；

(2)25mMdNTP：1.25ul；

(3)Hotstar taq酶：0.15ul；

(4)去离子水：13.1ul。

一个试剂盒可以包括上述各成分进行多次MS-PCR的用量，如25次、50次、100次等，各成分的具体量视情况需要而定。

为防止出现MS-PCR扩增产物的假阳性，试剂盒还可包括下述a、b中的一项或两项：

a、甲基化阳性对照PCR模板：硫化修饰后的ZO-1基因启动子区为100％甲基化的白血病细胞DNA，进行1次MS-PCR其用量为：2ul。

b、非甲基化阳性对照PCR模板：硫化修饰后的ZO-1基因启动子区为100％非甲基化的正常骨髓细胞DNA，进行1次MS-PCR其用量为：2ul。

核苷酸序列表

<110>中国人民解放军总医院

<120>检测白血病细胞的引物及试剂盒

<160>4

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>1

AAAATAAATA GGAAGATTCG TACGG            25

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>2

GAAACTAAAC GAAACGAAAC GAA              23

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>3

GGATAAAAAT AAATAGGAAG ATTTGTATG                 29

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：人工合成的序列

<400>4

AACAAAACTA AACAAAACAA AACAA                    25

Claims (6)

1.一种用于检测细胞ZO-1基因启动子区甲基化状态的引物对，包括甲基化引物对和非甲基化引物对，其中所述甲基化引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，5’-AAAATAAATAGGAAGATTCGTACGG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，即：5’-GAAACTAAACGAAACGAAACGAA-3’，所述非甲基化引物对，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所述，即：5’-GGATAAAAATAAATAGGAAGATTTGTATG-3’，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所述，即：5’-AACAAAACTAAACAAAACAAAACAA-3’。

2.一种检测白血病细胞的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包含甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的ZO-1基因启动子区100％甲基化的白血病细胞DNA。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：还包含非甲基化阳性对照PCR模板，该模板为硫化修饰后的ZO-1基因启动子区100％非甲基化的正常骨髓细胞DNA。

5.根据权利要求2至4任一项所述的试剂盒，其特征在于：还包含MS-PCR反应所需的下列成分：10×Herman’s buffer缓冲液，25mMdNTP，Hotstar taq酶，去离子水。

6.一种用于检测白血病细胞的MS-PCR反应体系，以总体积25ul计，其包括：

(1)模板：2ul；

(2)浓度为10pmol/ul的权利要求1中所述的甲基化引物对或非甲基化引物对，其中，上游引物与下游引物各为3ul；

(3)10×Herman’s buffer缓冲液：2.5ul；

(4)25mMdNTP：1.25ul；

(5)Hotstar taq酶：0.15ul；

(6)去离子水：13.1ul。