CN1986830A - 用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，该基因芯片包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中该寡聚核苷酸探针包括从志贺氏菌16S rRNA序列中选取的DNA片段和从一种或几种不同血清型的志贺氏菌O－抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因中选取的DNA片段。利用设计的引物将待检测样品基因组DNA扩增并标记后，用上述基因芯片进行杂交，根据杂交信号，可检测出志贺氏菌的不同血清型。利用本发明的基因芯片可达到检测志贺氏菌血清型的目的，操作简便，准确性高，重复性强，并且可更准确的指导医疗用药。

Description

用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒

技术领域

本发明涉及一种基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒，特别涉及一种用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒。

背景技术

志贺氏菌属(Shigella)是随着人类进化而发展起来的人类致病菌，是引起细菌性痢疾(以下简称菌痢)的病原菌。志贺氏菌属为革兰氏阴性杆菌，为兼性厌氧菌，能分解乳糖，一般产酸不产气。其依据抗原结构不同，分为A、B、C、D四群，即A群——痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)、B群——福氏志贺氏菌(S.flexneri)、C群——鲍氏志贺氏菌(S.boydii)及D群——宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)。痢疾菌群构成比例，随地区、年龄、年代的不同而不同。欧美及日本以D群为主，亚洲及非洲以B群为主。我国目前仍以B群为主(占62.8～77.3％)，D群次之，近年局部地区A群有增多趋势；成人及1岁以下婴儿均以B群为主，1岁以上儿童以D群为主；早在30年代，全世界均以A群I型为主，40年代开始减少，60年代初近乎绝迹，代之而起者，欧美以D群为优势菌，我国及整个亚洲以B群为主，其次为D群。

人类对志贺氏菌有较高的敏感性，只需少于十个菌就可以引起人的感染，因此其传染性强，危害性极大。1988年国外曾报道，全世界菌痢年发病数为几千万例，死亡数约60万，其主要在发展中国家广为流行。我国1990年前的统计，年发病为200万-300万例，实际病例数据流行病专家推测还应高2-3倍。当前在发展中国家的血性腹泻患者中，50％的病原菌仍为痢疾杆菌，而且菌痢的死亡率比霍乱高10倍，其目前仍然是发展中国家儿童死亡的一个主要原因。在野外大型作业的群体或有军事行动的部队里，菌痢发病率要比平时高2-4倍，因菌痢流行影响施工进程和军事任务的事例在国内外均有所见。由此可见对菌痢的深入研究比其它肠道菌更有紧迫性。因此对快速鉴定此菌的产品的需求也是巨大的。

近年来流行病调查显示，目前中国最常见且分型意义较大的33型志贺氏菌如下：福氏志贺氏菌(Shigella Flexneri)2a型(O-抗原基因簇序列来自：gb/AY900451)、福氏志贺氏菌(Shigella Flexneri)6型(O-抗原基因簇同大肠杆菌O147，序列来自：专利申请号200310117866.2)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)1型(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF294823)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O1(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03100357.1)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O2(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200310107158.0)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O3(O-抗原基因簇同大肠杆菌O167，序列来自：专利申请号200410019187.6)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O4(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF402312)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O5(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF402313)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O6(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF402314)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O7(O-抗原基因簇序列来自：专利号2003100536.5)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O8(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03100356.7)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O9(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF402315)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O10(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200310107160.8)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O11(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03100535.7)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O12(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019048.3)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O13(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03100537.3)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O14(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019049.8)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O15(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03100538.1)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O16(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019049.8)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O17(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019050.0)、鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019051.5)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1(O-抗原基因簇序列来自：gb/AF585348.1，rfpB基因序列来自：gb/S73325.1)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O3(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03109587.9)、痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)O4(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019052.X)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O5(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019047.9)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O6(O-抗原基因簇同大肠杆菌O130，序列来自：专利申请号200410019039.4)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O7(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号03100358.3)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O8(O-抗原基因簇序列来自：专利号03100539.X)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O9(O-抗原基因簇序列参见如本申请序列表中的SEQ ID NO：180所示的序列)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O10(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号200410019186.1)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O11(O-抗原基因簇同大肠杆菌O29，序列来自：专利申请号200410019023.3)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O12(O-抗原基因簇序列来自：专利申请号02158726.4)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O13(O-抗原基因簇同大肠杆菌O150，序列来自：专利申请号03109586.0)。志贺氏菌属的分型对掌握菌痢的流行动态，调查传染源、传播途径、判定复发与再感染以及开展菌痢防治工作均有重要意义。

现在对志贺氏菌通用检测方法是对O抗原和H抗原(主要是O抗原)的抗血清凝集反应。此方法需要对待测样品进行先培养再分离单菌落，最后用生化鉴定和血清学反应鉴定所感染的细菌种类。此法的缺点在于灵敏性低、耗时长、漏检率高。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性细菌的主要表面成分，在细胞外膜维持其结构及行使其生物学功能上有着不可缺少的作用，在细菌和外部环境的相互作用中也扮演着非常重要的角色。脂多糖是动物免疫系统对入侵的革兰氏阴性菌的首要识别及攻击目标，同时也在致病性细菌侵染宿主细胞过程中从黏附、侵染到躲避宿主细胞的免疫攻击中起着重要的作用。典型的LPS分子由三个部分共价连接而成：O特异性多糖链、核心多糖、类脂A。O特异性多糖链游离于菌体表面，其基部与核心多糖相连，位于脂多糖分子的最外层。其中O特异性多糖链是引起宿主特异抗体反应的主要表面抗原，又被称为O抗原。O抗原由寡糖重复单位(≤50)组成，每个重复单位通常由三到八个单糖组成，O抗原结构由于构成重复单位的单糖种类、排列顺序、结合方式及多糖链的空间结构不同而不同。这种高度多样性决定了O抗原与宿主之间的特异性。根据O抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。例如，常见的致病菌大肠杆菌E.coli(包括志贺氏菌Shigella)被分为187个O抗原血清型。

王磊教授和Reeves教授在1998年提出了糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因为O-抗原特异基因理论(PCT国际申请WO 98-AU315和WO99-AU385)。根据以上研究理论，可针对O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理酶基因设计引物，再通过PCR方法筛选出高度特异的基因和寡核苷酸片段，以此达到检测致病菌的目的。PCR技术本身的优越性无可厚非，自1989年开始被应用于临床检验以来，以其快速、简便、灵敏等优点很快地成为临床实验诊断学的一个技术热点。

但如果PCR反应条件控制不好也容易出现假阴性及交叉污染，然而基因芯片技术的出现解决了这一难题。1997年7月Affymetric，Inc.(SantaClara，CA)公司的Thomas R.等人公布了以生物芯片技术对微生物进行定种和表型分析的方法(参见第6,228,575号美国专利)。从二十世纪九十年代开始，基因芯片技术作为一种全新的分析检测技术建立了起来，并随着人类基因组计划的开展逐步发展起来。该技术综合运用了分子生物学技术、集成电路制造技术、计算机技术、半导体技术、共聚焦激光扫描技术、荧光标记技术，使检测过程具有敏感性高、特异性强、大规模集成化、自动化、操作简便快捷、效率高等特点，受到科研人员的青睐，并在基因表达相关研究和生物制药研究等方面得到普遍应用。因此，如果将基因芯片技术用于细菌血清型鉴定，不仅可以大大简化技术平台，而且有望实现高准确性、高灵敏度、高通量、可重复性强等优点。

综上所述，有必要发明出一种能够快速、准确、可靠的对志贺氏菌进行血清型检测的产品及其方法。

发明内容

鉴于上述情况，本发明的一个目的是提供一种用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片，以弥补传统志贺氏菌分型检测技术存在的不足，实现志贺氏菌血清型检测的快速、准确和可靠。

本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片来快速、准确、灵敏地检测志贺氏菌血清型的方法。

本发明的再一目的是提供一种至少包括上述基因芯片的用来检测志贺氏菌血清型的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提出一种用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，该寡聚核苷酸探针包括从志贺氏菌16S rRNA序列中选取的DNA片段和从一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因中选取的DNA片段。

在本发明的较佳实施例中，上述一种或几种不同血清型的志贺氏菌例如选自福氏志贺氏菌2a型、福氏志贺氏菌6型、宋内氏志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌O1、鲍氏志贺氏菌O2、鲍氏志贺氏菌O3、鲍氏志贺氏菌O4、鲍氏志贺氏菌O5、鲍氏志贺氏菌O6、鲍氏志贺氏菌O7、鲍氏志贺氏菌O8、鲍氏志贺氏菌O9、鲍氏志贺氏菌O10、鲍氏志贺氏菌O11、鲍氏志贺氏菌O12、鲍氏志贺氏菌O13、鲍氏志贺氏菌O14、鲍氏志贺氏菌O15、鲍氏志贺氏菌O16、鲍氏志贺氏菌O17、鲍氏志贺氏菌O18、痢疾志贺氏菌O1、痢疾志贺氏菌O3、痢疾志贺氏菌O4、痢疾志贺氏菌O5、痢疾志贺氏菌O6、痢疾志贺氏菌O7、痢疾志贺氏菌O8、痢疾志贺氏菌O9、痢疾志贺氏菌O10、痢疾志贺氏菌O11、痢疾志贺氏菌O12和痢疾志贺氏菌O13。

在本发明的较佳实施例中，从上述一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因中选取的DNA片段例如选自具有如SEQ ID NO：3-NO：113所示的碱基序列的DNA片段。从志贺氏菌16S rRNA序列中选取的DNA片段例如具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

本发明还提出一种检测志贺氏菌血清型的方法，包括以下步骤：

(1)根据志贺氏菌16S rRNA序列和一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；

(2)按常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化扩增得到靶序列；

(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；

(4)将标记后的靶序列与本发明提出的上述基因芯片杂交；

(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(1)中一种或几种不同血清型的志贺氏菌例如选自福氏志贺氏菌2a型、福氏志贺氏菌6型、宋内氏志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌O1、鲍氏志贺氏菌O2、鲍氏志贺氏菌O3、鲍氏志贺氏菌O4、鲍氏志贺氏菌O5、鲍氏志贺氏菌O6、鲍氏志贺氏菌O7、鲍氏志贺氏菌O8、鲍氏志贺氏菌O9、鲍氏志贺氏菌O10、鲍氏志贺氏菌O11、鲍氏志贺氏菌O12、鲍氏志贺氏菌O13、鲍氏志贺氏菌O14、鲍氏志贺氏菌O15、鲍氏志贺氏菌O16、鲍氏志贺氏菌O17、鲍氏志贺氏菌O18、痢疾志贺氏菌O1、痢疾志贺氏菌O3、痢疾志贺氏菌O4、痢疾志贺氏菌O5、痢疾志贺氏菌O6、痢疾志贺氏菌O7、痢疾志贺氏菌O8、痢疾志贺氏菌O9、痢疾志贺氏菌O10、痢疾志贺氏菌O11、痢疾志贺氏菌O12和痢疾志贺氏菌O13。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(1)中根据志贺氏菌16S rRNA序列设计的上游引物序列例如为5’-CACGGGTGAGTAATGTCTGG-3’，下游引物序列为5’-ATCCACGATTACTAGCGATTCC-3’。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(1)中根据一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因序列设计的引物例如选自具有如SEQ ID NO：114-NO：179所示的碱基序列的寡核苷酸片段。

在本发明的较佳实施例中，上述步骤(5)中例如使用判读软件Bactarray Analyzer按下列步骤分析鉴定杂交结果：

(1)杂交信号的有效性验证

对上述基因芯片上每条特异探针的多个重复点的信号强度进行置信度检验，剔除异常的信号强度，取正常的信号强度的平均值作为该特异探针的信号强度；

(2)归一化

使用上述基因芯片上全部特异探针的总信号强度值作为归一化标准，然后用每个探针点的信号强度除以该归一化标准，将每个探针点的绝对信号强度变为相对信号强度；

(3)对每条特异探针打分

针对每条特异探针给出一个分值，代表待测的DNA片段序列和该特异探针序列的相似程度；

(4)应用模式对待测样品中可能含有的血清型进行打分；

(5)判断样品中可能含有的血清型。

经过上述步骤的处理，程序给样品中所有可能的志贺氏菌血清型均给出一个分值，分值最高的即为最有可能存在的血清型，分值低于阈值的血清型不可能存在。

本发明还提出一种用于志贺氏菌血清型检测的试剂盒，其至少包括：

基因芯片，其包含固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从志贺氏菌16S rRNA序列中选取的DNA片段和从一种或几种不同血清型志贺氏菌O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因中选取的DNA片段；

PCR扩增引物，根据志贺氏菌16S rRNA序列和上述一种或几种不同血清型志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因序列设计。

在本发明的一个实施例中，该试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件Bactarray Analyzer。

由上述的技术方案可见，本发明弥补了根据O-抗原多糖基因簇专一序列设计探针来制备基因芯片并检测志贺氏菌领域的空白，提供了一种快速、灵敏、准确性高、重复性强的全新的志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法。目前国内针对致病菌检测方面的基因芯片均为对细菌种的鉴别(CN 1536090A)，本发明可鉴别到具体的血清型，从而可更准确的指导医疗用药。此外由于本发明具备很高的灵敏度和特异性，且其检测和分析方法高效快捷，所以可被广泛用于生命科学、医学检验、食品安全、环境监督、进出口检验检疫、生物恐怖防范、流行病学监控等领域。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。

附图说明

图1为本发明基因芯片的一个实施例的外形示意图。

图2为本发明基因芯片的一个实施例上113条探针的排布示意图。

图3表示利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为鲍氏志贺氏菌O12时的杂交结果。

图4表示利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为宋内氏志贺氏菌1型时的杂交结果。

图5表示利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为痢疾志贺氏菌O9时的杂交结果。

图6表示利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为痢疾志贺氏菌O12时的杂交结果。

图7表示利用本发明基因芯片的一个实施例检测样品为痢疾志贺氏菌O8时的杂交结果。

具体实施方式

为进一步说明本发明的用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例进行说明，这些实施例是为了说明而不是以任何方式限制本发明。

实施例一：探针的设计和制备

1.序列获得：用Artemis软件整理前述的中国最常见且分型意义较大的33型志贺氏菌的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因wzx及wzy序列(鲍氏志贺氏菌O6/O10为核糖转移酶基因orf8，鲍氏志贺氏菌O16为核糖转移酶基因orf5，痢疾志贺氏菌O1为wzy和rfpB基因)(其序列来源已在背景技术中说明，这里不再赘述)和从GenBank公共数据库下载的志贺氏菌16S rRNA序列。

2.探针设计：将上述序列导入OligoArray2.0软件中，设定参数为长度40bp±5bp、Tm80℃±2℃，然后运行程序在线设计探针。

3.探针筛选：从输出结果中选择长度在40bp±5bp、Tm80℃±2℃的探针，并通过下述实施例四提供的方法利用杂交实验进行探针筛选，最终得到用于制备本发明基因芯片所需的特异、灵敏的探针。

在本发明的较佳实施例中，选择了273条长度在40bp±5bp、Tm80℃±2℃的探针，并通过大量杂交实验进行探针筛选后，最终得到如表1所示的探针。其中，编号为NO.1(SEQ ID NO：1)和NO.2(SEQ IDNO：2)的探针序列选自志贺氏菌的16S rRNA序列，作为阳性对照用来检测志贺氏菌种，编号为NO.3的探针作为荧光探针，编号为NO.4的探针为多聚T片段，用作阴性对照，编号为NO.5-NO.115的111条探针序列(SEQ ID NO：3-NO：113)分别选自不同常见致病血清型的福氏志贺氏菌2a型、福氏志贺氏菌6型、宋内氏志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌O1、鲍氏志贺氏菌O2、鲍氏志贺氏菌O3、鲍氏志贺氏菌O4、鲍氏志贺氏菌O5、鲍氏志贺氏菌O6、鲍氏志贺氏菌O7、鲍氏志贺氏菌O8、鲍氏志贺氏菌O9、鲍氏志贺氏菌O10、鲍氏志贺氏菌O11、鲍氏志贺氏菌O12、鲍氏志贺氏菌O13、鲍氏志贺氏菌O14、鲍氏志贺氏菌O15、鲍氏志贺氏菌O16、鲍氏志贺氏菌O17、鲍氏志贺氏菌O18、痢疾志贺氏菌O1、痢疾志贺氏菌O3、痢疾志贺氏菌O4、痢疾志贺氏菌O5、痢疾志贺氏菌O6、痢疾志贺氏菌O7、痢疾志贺氏菌O8、痢疾志贺氏菌O9、痢疾志贺氏菌O10、痢疾志贺氏菌O11、痢疾志贺氏菌O12和痢疾志贺氏菌O13的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因。

表1：本发明一基因芯片实施例中选用的探针序列、来源及其可检测出的志贺氏菌血清型

探针编号	SEQ ID	探针序列(5’-3’)	序列来源	可检测出的志贺氏菌血清型
					NO.1	NO：1	CGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAG	志贺氏菌的16S rRNA序列	志贺氏菌
NO.2	NO：2	CGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAA
			NO.3		TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_Cy3	荧光探针	荧光探针
NO.4		TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT						阴性对照	阴性对照
			NO.5	NO：3	TTGGCTACTTTAACGCTGCTAATACAATTAGAAATGCAGC	鲍氏志贺氏菌O2的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O2
NO.6	NO：4	AGCCCAGAGTCTAATGAATCCTATTTATCAAGCTGTTTAT
			NO.7	NO：5	TCAGGTTCATTACTCCTGTGCATACTTTCTCCAATAATAA
NO.8	NO：6	GCAATTACTGATTCATTAAGATTTGGAGGCGTGTTTTCTG						鲍氏志贺氏菌O1的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O1
			NO.9	NO：7	CGGTGCAAAGTTAATTCCGCTAACGATAATATGTTGTTTT
NO.10	NO：8	ATCAAGGTTTCTTTATATTCTTTCATGACAGAATGCCTG
			NO.11	NO：9	GGCGGTAATTTACTTGACAAATCAGATATGGCTAATGTTG
NO.12	NO：10	ATGCCGAATGAAAATACAATGTTGTTAGGTGATGGG				鲍氏志贺氏菌O3的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O3
			NO.13	NO：11	GAGTTGAAGGGAGAGTCATTTATATCATTTTCGGCAA
NO.14	NO：12	TCAGTTTACAAGTCATTCGACAAATGATTTATCCAGCATG
			NO.15	NO：13	TCAATGATGAACGCCACATAGACGAAGCCC			鲍氏志贺氏菌O6/O10的O-抗原基因簇中糖基转移酶基因	鲍氏志贺氏菌O6/O10
NO.16	NO：14	CCCAGATTGTTTGAATGGAATATACTCAATCACAGCATCA
			NO.17	NO：15	GCTGGATTAGATATTTATATACGTCATGTTTCTCACCCCA
NO.18	NO：16	CGTCATGTTTCTCACCCCAGATTGTTTGAATGGAATATAC
			NO.19	NO：17	TTGGTGTTGGAACCTAAAAGTTTCGTTGTCTTTTCAACTG	鲍氏志贺氏菌O4的O-抗原基因簇	鲍氏志贺氏菌O4
NO.20	NO：18	CATGCCTGTATTTAGTAAACTGTATCACCTGCATGGC

NO.21	NO：19	CTGAAAGAATCGTGAAGGTGTTATCGATTACAACAACGC	中寡糖单位处理酶基因
					NO.22	NO：20	CATATTCATTTAATCAATGGATGGAAAAGGATTTTAATAC	鲍氏志贺氏菌O9的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O9
NO.23	NO：21	AAGTATATGGTCATCATTCATAGGAACTGTTGCTTGTTGG
			NO.24	NO：22	TGGTCTAGATATCCGGCATTTTCATTTGAGCCATTT	鲍氏志贺氏菌O17的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O17
NO.25	NO：23	GGAGTGATAGCAGCATTAATTATACTATTTGCTTCTGTGC
			NO.26	NO：24	TGGCACGTTGCTTTCATTATTTAGAGATACCTTATCACCA			鲍氏志贺氏菌O5的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O5
NO.27	NO：25	ACATGGTGTTTTATTCTTGACATAGTATTCACGACAGCAT
			NO.28	NO：26	GCGATTGTATCTCCTTTTGTTTGGGAAGACACAA
NO.29	NO：27	CTTTTCTCTCCCATACCTGTATTAGCTGCACGAATAAGTC				鲍氏志贺氏菌O11的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O11
			NO.30	NO：28	TTTATCTGCATGATTTTACTCAAATTAGAGCTGGCTTAGC
NO.31	NO：29	CTTTTGTTTTCGCAAATTTCATGGTTCCTTTTCTCTCCCA
			NO.32	NO：30	ATTTCATGGTTCCTTTTCTCTCCCATACCTGTATTAGCTG
NO.33	NO：31	GATTTTTGGTGTTTTATTTTAGGAAATGAATTTGTTGAT						鲍氏志贺氏菌O7的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O7
			NO.34	NO：32	CAATTAGATCGAGTTTTGATATATAGCCGTTTTTCTGCTT
NO.35	NO：33	TAGGGGGCTATTCTGCTGCATTTCAAATAGCCTCAGTTCT
			NO.36	NO：34	TGGTGAAGGTTATGATGGTATCTGGCTCCATAATATGTTA	鲍氏志贺氏菌O12的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O12
NO.37	NO：35	ATCCATGGGGAGGTTTAATTGTTCATGGTGAAGGTTATGA
			NO.38	NO：36	GGTTTAATTGTTCATGGTGAAGGTTATGATGGTATCTGGC
NO.39	NO：37	GGGTATCAGGTTACTATACTATGTTTGTATGGCTGTTCA
			NO.40	NO：38	GCATCAGGGGATTAGGTATATCAGGTTCTGTTGCC			鲍氏志贺氏菌O8的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O8
NO.41	NO：39	GCATTATTCAGCTCTGTTATAATTGCGTCGCATTTAATCC
			NO.42	NO：40	TTGCGTCGCATTTAATCCAGCATAACAATGATAATGTGTT
NO.43	NO：41	GCTTAAAGTCCTTATGGGAAGCTTTGTTCTGTATACTGTT				鲍氏志贺氏菌O15的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O15
			NO.44	NO：42	GTTAAGCTTGAGAATGCATACGTGCTTGTAGTAATGATGG
NO.45	NO：43	CGAGACGGTATAAATTGAAGTTTAGTGTGCTTAAAGTCC
			NO.46	NO：44	TTCCTTATGGGAAGCTTTGTTCTGTATACTGTTCCTTTA
NO.47	NO：45	GTGCTGCTTGCACTTTACCAGGGCTTCATGGCCAT						鲍氏志贺氏菌O13的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O13
			NO.48	NO：46	CTGCAGCATCGCTATTAGGTATCATTTATATTTATCCA
NO.49	NO：47	CTCATGTATATTTACGCTGCGGGGAATAGAAATAAGAATC
			NO.50	NO：48	TATGAAACTGCAATAGAGGCCGGCGTTATATCAT	鲍氏志贺氏菌O16的O-	鲍氏志贺氏菌O16
NO.51	NO：49	GCTCCTGACAATGTCACATTTGAGAGTGACATTGAG

NO.52	NO：50	GCTGAGGCTTTGAGCTATGGTTTGTATGTAATCGCAAATA	抗原基因簇中糖基转移酶基因
					NO.53	NO：51	AGCCGAGAAGACAAAGATATTATTTACAAATCACTTCATG
NO.54	NO：52	ACTATTGCTGAGTTGGAATTATCTTTCCTCTACTGGTC						鲍氏志贺氏菌O14的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O14
			NO.55	NO：53	GGAACAGGAGGAGATAACAGTTCAAATGAACGTTT
NO.56	NO：54	TTCAGGATTAATTGATTTCTTATCAGGAACAGGAGGAGAT
			NO.57	NO：55	CGTCTGAAGGTATACAACGCTTAACGATATTACCAAGTG	福氏志贺氏菌6型的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	福氏志贺氏菌6型
NO.58	NO：56	CATGGAGGATTACTAAGTGCTATATATGGTTTAGTTATGGCA
			NO.59	NO：57	TATTTCAGCTACCATACCCTTATACTTGTTAAACCAAGTCTG
NO.60	NO：58	GGTTTAGTTATGGCAAGAGTCTTATCACTTATAGTGACCT
			NO.61	NO：59	CGGGCAATGGTGGCTAATTACCACTAATAGGAC			鲍氏志贺氏菌O18的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	鲍氏志贺氏菌O18
NO.62	NO：60	CATTGGAGTTCCATTATCCGAGTGGTATTTTGGTAACAAT
			NO.63	NO：61	GGGAGTAACTCTTTTGGCATATATGCAATGATACTTGCTG
NO.64	NO：62	CCAAAACTGATATTTTGCCTTGGATCAACATTGGTGTATG				痢疾志贺氏菌O1的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O1
			NO.65	NO：63	TGGAGTGTTTGTATTTGGACTGTTCGCTTTATCAAGTATT
NO.66	NO：64	GACCCTGAAGGCAAGATTATTTCAGCAATATTTGATACGT
			NO.67	NO：65	TCAAGTATTATCTTGGGTAAGTTCTCTTCAGACCCTGAAG
NO.68	NO：66	GCAATTCATCGTGATAATCATCATGAAAGAACCAAGGT						福氏志贺氏菌2a型的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	福氏志贺氏菌2a型
			NO.69	NO：67	CTGACTCGCTCTGTTATTAGAGAAATTGCAATTCATCGTG
NO.70	NO：68	GTTATTTCTTATCCCGGATTTGTTTCTAATGTGGCTGATTGGAT				痢疾志贺氏菌O1的rfpB基因	痢疾志贺氏菌O1
			NO.71	NO：69	GGAGGGTTATCTGAATCTGACGTAGATACTTTAATTAAATCAGG
NO.72	NO：70	TGAATTTATTATACTTGGCGCTATAGATAAGGAAAACCCCGGAG
			NO.73	NO：71	ATCCGTATCAACATTGGGTATTTATTCGCTAGCTATGCA			痢疾志贺氏菌O6的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O6
NO.74	NO：72	CTGTCCCTTGGATATGTTCTTAACGATAGATACCATGAG
			NO.75	NO：73	ATAGCATGTGTATTTTCATCAGTAGTTATGCCTCTGTCCC
NO.76	NO：74	CGATGGTGTTAGCATACGAGAAAATGTCATTTTACGCATA				痢疾志贺氏菌O3的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O3
			NO.77	NO：75	CTGTAATTCTATGTGCGGATGAGTTGTTAAAGATATGGCT
NO.78	NO：76	ATACACTTACGCAATCATTAATTACAGCATTAAGGCCTCA
			NO.79	NO：77	CCAGATTATACAGTTGAATTTGTGAGGTTGGTCATTGTTG
NO.80	NO：78	CGTTATTTGGGTTGGGAAAATATCTACTTTCCGATGGTT						痢疾志贺氏菌O9的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O9
			NO.81	NO：79	AGATCTGATATTGGATACTATAGACAAATGGGAGTCGGT
NO.82	NO：80	GCGCACTTCCTTTAGTAATTATTGCCGTCCATAACATAAT
			NO.83	NO：81	AACTATCCATATAACATCGCTTTTACAATTGCATT	痢疾志贺氏	痢疾志贺氏

NO.84	NO：82	TGCTGGTGGAGGACCACGCATGGAATTAAATAAGGATGAT	菌O4的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	菌O4
					NO.85	NO：83	GATAAGTCTCAGTGATAATCTTATATTTGGGGGAGGAATA
NO.86	NO：84	GCTGCATTATGTGGGATATTGCTTCCAGCTATATATCTA
					NO.87	NO：85	CTGTCGAATTGGAAAGAACAGGAGTTAAAAGCTGTCTTA	痢疾志贺氏菌O10的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O10
NO.88	NO：86	GCCTCTACTTTACCGACAAAGAAAGTGAGTTATATCATCA
			NO.89	NO：87	ATGTTAATTCCCCTACTCAATTCATCTGTCACGTCAGTTT
NO.90	NO：88	GTAAGCGAGGTCAATAAAATGCTAATGACTGGTGAGT				痢疾志贺氏菌O5的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O5
			NO.91	NO：89	GCTATGGTACCTATAGTTCTTATCTTTTGGGACCTCTT
NO.92	NO：90	GCTCTAAAGCTTCGCTCATATTAATTTTGATGAGTGGTGT
			NO.93	NO：91	GGACCTCTTGATTTAGCTGTTCAATTAGCAGAAGAACTAT
NO.94	NO：92	AACACAAACAAGGTGTGAGTCGTTTCATATTCTTCTT						痢疾志贺氏菌O11的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O11
			NO.95	NO：93	TTTATCTTGGTAGGTTTGGTACTATTAGCACCAGGCT
NO.96	NO：94	TGATATTCATGGACGTTTATCTTGGTAGGTTTGGTAC
			NO.97	NO：95	TCGGCCATTTAGCGTTGATATATGAAAATGCAGATGATAT	痢疾志贺氏菌O7的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O7
NO.98	NO：96	TCCTTATGTTCTCTATTGCTTCTTTTCTCCATTTTGCCTG
			NO.99	NO：97	GGCATAAACTATCTGTTAAATAGATTTCAACATGTCGGCC
NO.100	NO：98	TGCTGGTTCCTTATTATGTAGTTAGTAGATTTGCTGGTAA
			NO.101	NO：99	TCAGGCCAATTATAATGATG ATTTAGGTGGCATTGGTATT			痢疾志贺氏菌O12的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O12
NO.102	NO：100	GTACCCATTTATTTTATTGCGCGATTTAGAGTCCGTAGTT
			NO.103	NO：101	AATCTTAATATTCTATTGTGGATGTCTGTTGGATGTGTGC
NO.104	NO：102	TAAGTTTATTGCTATTCCTGGGTAGTGGATTAAATGCACT
			NO.105	NO：103	GTGCCTTTTTTGTATTTAATGTATAATGTGTCTTTAGGG	痢疾志贺氏菌O8的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O8
NO.106	NO：104	GGGAACGATAAATTCACACGTTTGCCGTTAAATTATA
			NO.107	NO：105	AATGTGTCTTTAGGGAATAACATGTTTACTTTCCTAAA
NO.108	NO：106	CATTACAGTTGTAAATATATGCTTTATTATAATGATAGG
			NO.109	NO：107	CGAAAGTCTTGGTATGTCTCATCTGTATTGTACTCTCTGT			宋内氏志贺氏菌1型的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	宋内氏志贺氏菌1型
NO.110	NO：108	TGCTGTCTTCGTCACAGGTTATATTCTCTGGTGGTAACA
			NO.111	NO：109	CAGATGTTGTTGTTATCAGCGGATATATCAGGTGTCGTA
NO.112	NO：110	AGGCTCTGTAGTATTGTTCAAAACCACTACATTAGGTTAT				痢疾志贺氏菌O13的O-抗原基因簇中寡糖单位处理酶基因	痢疾志贺氏菌O13
			NO.113	NO：111	TTCTTTCACCATTAATATGTATCGTAACGCTTCCACTGAT
NO.114	NO：112	GCCTGCACTCATAAATTTCTTTCTTGCAATCGTTGGAATT
			NO.115	NO：113	TGCAATCGTTGGAATTATAGGCTCTGTAGTATTGTTCAAAA

4.探针合成：将表1中的探针序列的5’端延长10个T并氨基化后委托探针合成公司(北京奥科公司)合成，备用。

实施例二：引物的设计和制备

1.序列获得：用Artemis软件整理前述的中国最常见且分型意义较大的33型志贺氏菌的wzx及wzy序列(鲍氏志贺氏菌O6/O10为核糖转移酶基因orf8，鲍氏志贺氏菌O16为核糖转移酶基因orf5，痢疾志贺氏菌O1为wzy和rfpB基因)。

2.设计引物：将上述序列导入引物设计软件Primer Premier 5.0软件中，设定参数为Tm值50℃±5℃、长度20bp±2bp，然后运行程序。

3.引物选择：从输出结果中选取Tm值50℃±5℃、长度20bp±2bp，且包含基因芯片中所用的探针序列在内的引物。个别探针手动调节，引物适当加长或缩短几个碱基，使其包含探针、符合Tm值50℃±5℃及其它参数。

在本发明的较佳实施例中，选取了既包含上述表1所示的探针又适合多重PCR(Multiplex PCR)的用于扩增上述33型志贺氏菌血清型DNA的引物136条，为适应Multiplex PCR，经生物信息学初筛并通过大量Multiplex PCR实验筛选，筛选出如表2所示的适用引物68条。

表2用于志贺氏菌待测样品DNA的PCR扩增的引物序列

引物编号	SEQ ID	引物序列(5’-3’)	扩增作用
				P-1		CACGGGTGAGTAATGTCTGG	16S rRNA上游引物
P-2		ATCCACGATTACTAGCGATTCC	16S rRNA下游引物
				P-3	NO：114	GGCGGTAATTTACTTGAC	鲍氏志贺氏菌O1 wzx上游引物
P-4	NO：115	AACACATTCTGCGTAACTC	鲍氏志贺氏菌O1 wzx下游引物
				P-5	NO：116	GACCTCCTTTATTGGTTGC	鲍氏志贺氏菌O4 wzx上游引物
P-6	NO：117	TCAAAATTGATAATTGTATGC	鲍氏志贺氏菌O4 wzx下游引物
				P-7	NO：118	CATTGCTGTTTCTGGGTTT	鲍氏志贺氏菌O5 wzx上游引物
P-8	NO：119	TACCTGTGATTGCCGTCTG	鲍氏志贺氏菌O5 wzx下游引物
				P-9	NO：120	TGTTTGCTTTTAGCATCCC	鲍氏志贺氏菌O8 wzy上游引物
P-10	NO：121	GATAATATGTCCCATCCTTT	鲍氏志贺氏菌O8 wzy下游引物
				P-11	NO：122	GACTTCAGATACCCTCACT	鲍氏志贺氏菌O12 wzy上游引物
P-12	NO：123	GGTACAGCTACACCCAAT	鲍氏志贺氏菌O12 wzy下游引物
				P-13	NO：124	CTATCAGCGGTGATCTTTAC	鲍氏志贺氏菌O14 wzy上游引物

P-14	NO：125	TGTTATCTCCTCCTGTTCCT	鲍氏志贺氏菌O14 wzy下游引物
				P-15	NO：126	CAATGTTGATAGGATGTTC	痢疾志贺氏菌O7 wzy上游引物
P-16	NO：127	CAGACTTATTATACATGCG	痢疾志贺氏菌O7 wzy下游引物
				P-17	NO：128	GGGCTTATGAAGAGTGTA	痢疾志贺氏菌O9 wzy上游引物
P-18	NO：129	TTCCACCGACTCCCATTT	痢疾志贺氏菌O9 wzy下游引物
				P-19	NO：130	TTTCAGCCAATTTTACTAAT	痢疾志贺氏菌O13 wzx上游引物
P-20	NO：131	GGAAATGTAGATAGAAGTCC	痢疾志贺氏菌O13 wzx下游引物
				P-21	NO：132	TTAAGAGCGATCATTTC	福氏志贺氏菌6型 wzx上游引物
P-22	NO：133	CCATCCAAGCGGACATT	福氏志贺氏菌6型 wzx下游引物
				P-23	NO：134	AGAACATCAGGAAAACGC	鲍氏志贺氏菌O6/O10 orf8上游引物
P-24	NO：135	GCTATTGCTAATGATGCTGT	鲍氏志贺氏菌O6/O10 orf8下游引物
				P-25	NO：136	ATTAGGGTTTTGTCAAGCA	鲍氏志贺氏菌O2 wzx上游引物
P-26	NO：137	CTCCGACTCCATATCTTATT	鲍氏志贺氏菌O2 wzx下游引物
				P-27	NO：138	GTTAGGTTTGTTTCAAGGTC	鲍氏志贺氏菌O3 wzy上游引物
P-28	NO：139	TAGGAATGAGTATGAAAGA	鲍氏志贺氏菌O3 wzy下游引物
				P-29	NO：140	GATATTCTTATAGAGGTGGTT	鲍氏志贺氏菌O11 wzy上游引物
P-30	NO：141	GTGCTGGTATAGTTATTGG	鲍氏志贺氏菌O11 wzy下游引物
				P-31	NO：142	TACCGTTCTCGCCAATAC	鲍氏志贺氏菌O17 wzy上游引物
P-32	NO：143	AAAGATAGTAAAATGGCTCAA	鲍氏志贺氏菌O17 wzy下游引物
				P-33	NO：144	TATTTCGTACCATTAAGTGC	痢疾志贺氏菌O1 wzy上游引物
P-34	NO：145	ACAACAAATAATGCTCCTG	痢疾志贺氏菌O1 wzy下游引物
				P-35	NO：146	ATGGAAAACCATAAGGTTAGTATT	痢疾志贺氏菌O1 rfpB上游引物
P-36	NO：147	TCCGAATGAATCAGAGCCGC	痢疾志贺氏菌O1 rfpB下游引物
				P-37	NO：148	GCGGCAGACTATGGCTTAT	痢疾志贺氏菌O3 wzx上游引物
P-38	NO：149	GCCACAACAATGACCAACC	痢疾志贺氏菌O3 wzx下游引物
				P-39	NO：150	AACGAGTATGGTGGATTG	痢疾志贺氏菌O5 wzy上游引物
P-40	NO：151	CGCATTTCGATAAATCAC	痢疾志贺氏菌O5 wzy下游引物
				P-41	NO：152	TAGATGTGCTGCCTTTGAT	痢疾志贺氏菌O6 wzx上游引物
P-42	NO：153	AATACTCTAGGGCCTCATG	痢疾志贺氏菌O6 wzx下游引物
				P-43	NO：154	AATAACCGCCGTTCTAAT	痢疾志贺氏菌O11 wzy上游引物
P-44	NO：155	CGAAGTAATATCCGTTCATA	痢疾志贺氏菌O11 wzy下游引物
				P-45	NO：156	GTTATTTACCTACGCCTCA	痢疾志贺氏菌O12 wzy上游引物
P-46	NO：157	AGAAATACCAATGCCACCT	痢疾志贺氏菌O12 wzy下游引物
				P-47	NO：158	GAAGAGTATGGGATGGTAG	鲍氏志贺氏菌O15 wzy上游引物
P-48	NO：159	CAACAACACTGTATAATAACCA	鲍氏志贺氏菌O15 wzy下游引物
				P-49	NO：160	GTGTTGACTGCTGGATTTC	鲍氏志贺氏菌O7 wzx上游引物
P-50	NO：161	CGATATGATTGATGGAAGTG	鲍氏志贺氏菌O7 wzx下游引物
				P-51	NO：162	GCGTTGGTTGGTGAAAGAG	鲍氏志贺氏菌O9 wzy上游引物
P-52	NO：163	TTCCCACAAATCAAACCA	鲍氏志贺氏菌O9 wzy下游引物
				P-53	NO：164	AAAGATTGGTAGCGTCGG	鲍氏志贺氏菌O13 wzy上游引物
P-54	NO：165	TGAAGCCCTGGTAAAGTGC	鲍氏志贺氏菌O13 wzy下游引物
				P-55	NO：166	CCATACGGATAATGTTGAG	鲍氏志贺氏菌O16 orf5上游引物
P-56	NO：167	TCTTTGTCTTCTCGGCTA	鲍氏志贺氏菌O16 orf5下游引物
				P-57	NO：168	CAGGGCACAAACTATCT	鲍氏志贺氏菌O18 wzx上游引物

P-58	NO：169	TAATTCGGAATGTGCT	鲍氏志贺氏菌O18 wzx下游引物
				P-59	NO：170	TTTCTGCTTATTCATTATTG	痢疾志贺氏菌O4 wzy上游引物
P-60	NO：171	ACTACCAGCTCTAATACC	痢疾志贺氏菌O4 wzy下游引物
				P-61	NO：172	TTCCCTCTTGTTGTATTGA	痢疾志贺氏菌O8 wzy上游引物
P-62	NO：173	ACCTTTATCAATTGCCTCC	痢疾志贺氏菌O8 wzy下游引物
				P-63	NO：174	CGCTGTTTCTATATTAATTG	痢疾志贺氏菌O10 wzy上游引物
P-64	NO：175	AATTGAAGTGACCAGATAAC	痢疾志贺氏菌O10 wzy下游引物
				P-65	NO：176	TGAGGTTTCACGTTTCTC	宋内氏志贺氏菌1型 wzy上游引物
P-66	NO：177	AATAATCCCTAACTGAGCC	宋内氏志贺氏菌1型 wzy下游引物
				P-67	NO：178	CACTTGTTGGGTATGCTGG	福氏志贺氏菌2a型 wzx上游引物
P-68	NO：179	CCGGCAAACAGATTAGAAA	福氏志贺氏菌2a型 wzx下游引物

3.引物合成：将表2中的引物序列委托引物合成公司(北京奥科)合成，备用。

实施例三：基因芯片制备——芯片点样

1.溶解探针：将上述实施例一中合成好的探针干粉管(由奥科合成)首先进行溶解。步骤如下：将上述探针干粉管在12000转/分钟离心5分钟(注意在离心前不要打开干粉管的盖子)，然后加入50％DMSO(以1OD加入14μl的比例加入)，用振荡器混匀后快速离心，将管壁上的液体离下。在室温下放置1小时后，取1μl用50％DMSO稀释180倍后测OD，测出该探针(单链)的核酸浓度(ng/μl)，再利用以下公式将该探针稀释成终浓度为lμg/μl。

公式：

2.加板：将上述溶解后的113条探针加入到384孔板中相应的位置，每孔加入10μl探针。

3.点样：利用自动点样仪将上述384孔板中的探针点到玻片上，形成设计好的微阵列。本实施例中利用的是PerkiElmer公司的SpotArraymicroarry printing system生物芯片点样仪(型号为SpotArray 72)，使用SpotArray的控制软件(Tele chem smp3 stealty pin)完成全部点样。具体操作步骤如下：以图1所示的57.5mm×25.5mm×1mm(长×宽×高)的洁净的醛基化玻片(CEL Associates，Inc.)为固相载体，放到芯片点样仪(Spotarray72)的载物台上，将上述加好探针的384孔板放到样品台处，然后启动控制软件，设置好相应的参数，开始点样，样品按图2所示的排布方式点在上述玻片上的4mm×4mm的点样区内，构成中低密度DNA微阵列，玻片上的六个点样区内阵列的排布规律相同。在点样过程中，机臂控制针头，每点一个样品要经上样、预点、正式点样、清洗、干燥几个过程。

由图2可见点样区内的探针排布情况，每个探针点为对应表1所示的探针编号的探针，其中0表示50％DMSO，NO.4表示阴性对照，NO.3表示荧光探针。

4.干燥：将点好的芯片室温下过夜干燥，然后在45℃烘箱干燥2小时。

5.交联：用UVP公司的交联仪(uvpcl-2000M ultraciolet Crosslinker)进行紫外交联，600J两次。交联好的芯片放回洁净的芯片盒中，以备使用。

实施例四：利用上述制备好的基因芯片快速检测志贺氏菌血清型

在利用上述制备好的基因芯片检测志贺氏菌血清型的方法中，本发明对检测步骤、检测条件等因素均作了一系列的实验摸索，如Multiplex PCR反应混合物中各成分比例，PCR循环条件，杂交温度，杂交时间等及主要试剂配方，如杂交液，洗液等(配方详见以下实施例)。其中PCR反应混合物中的各个成分，尤其引物分组及引物间比例，Buffer的选择，Taq酶浓度，荧光素的种类和用量，及模板浓度均为多次对比实验后得到的最优组合。PCR所采用的退火温度、时间及延伸时间，循环数目亦为梯度实验后选出的优良条件。杂交温度经40℃、50℃、60℃三个温度梯度实验，最终选择40℃。杂交时间在经验基础上做了1.5h、8h、14h、16h和18h五个时间梯度实验，最终选择16h。志贺氏菌分型检测芯片的实验流程亦为优化后结果，在保证本发明顺利实现的基础上，本实施例最终选择了一步Multiplex PCR法，大大缩短了检测的时间，简化了检测方法。以下为利用上述制备好的基因芯片检测志贺氏菌血清型的较佳实施例，具体说明如下：

1.提取基因组：将分离到的待测志贺氏菌单菌落用血平板，37℃，5％CO₂培养箱过夜培养，按照常规提取普通革兰氏阳性菌基因组的方法提取志贺氏菌培养物的基因组DNA(该方法可参照Bastin DA，Reeves PR.Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coliO111.Gene 1995；164：17-23.)。

2.扩增靶序列：各取上述提取到的100ng/μl基因组DNA 1μl加入分别装有Multiplex PCR反应混合液1、2和3的三个管中混匀(注意：此过程要避光)，即每个待测样品须同时做三管PCR。PCR反应混合液1、2和3的配方分别如下表3、4和5所示。然后补加灭菌超纯水至体积为50μl。下表3-表6中所用的dNTP Mixture来自上海生工D0056，Taq酶、PCRbuffer来自Takara DR100DM，Cy3-dutp来自Amersham PA53022。

表3Multiplex PCR反应混合液1配方

成分	浓度	加样量(μl)
			灭菌超纯水10×PCR bufferdNTP MixtureP-3至P-24P-1和P-2Taq酶Cy3-dutp	10×10mM10μM1.67μM5U/μl25nM	18.950.5各1各10.30.3

注：表中P-3至P-24以及P-1和P-2为表2中所列的引物。

表4Multiplex PCR反应混合液2配方

成分	浓度	加样量(μl)
			灭菌超纯水10×PCR bufferdNTP MixtureP-25至P-48	-10×10mM5μM	16.950.5各1

P-1和P-2Taq酶Cy3-dutp

1.67μM5U/μl25nM

各10.30.3

注：表中P-25至P-48以及P-1和P-2为表2中所列的引物。

表5Multiplex PCR反应混合液3配方

成分	浓度	加样量(μl)
			灭菌超纯水10×PCR bufferdNTP MixtureP-49至P-68P-1和P-2Taq酶Cy3-dutp	-10×10mM5μM1.67μM5U/μl25nM	20.950.5各1各10.30.3

注：表中P-49至P-68以及P-1和P-2为表2中所列的引物。

将上述3个反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：

95℃5min

95℃30sec

50℃45sec

72℃1min返回第二步进行35个循环

72℃5min

3.杂交：

将上述PCR扩增产物取出20μl放到65℃烘箱中烘干(要避光)，烘干后加入40℃预热的杂交液16μl，用移液器将其吹匀后放入PCR仪中98℃变性10min。

将交联好的芯片用灭菌超纯水冲洗1分钟后吹干，放在避光处备用。打开杂交盒在其暗格中加入50μl灭菌超纯水，放入洗好的芯片，点有探针的那面向上并盖好盖片。(注意：盖片有凸起的一面朝下，使盖片的加样孔朝向操作者，切勿放反)。将变性好的反应液从PCR仪中取出迅速的加入相应的加样孔中，盖好杂交盒的盖子放到40℃水浴中杂交16小时(注意：杂交过程中要避光)。芯片杂交完毕后，从水浴锅中取出杂交盒，取走盖片，将芯片分别在洗液A中洗3min，洗液B中洗3min，最后在95％乙醇中洗1.5min吹干后放到避光处以备扫描。

洗液A：1×SSC，10％SDS

洗液B：0.05×SSC

洗液C：95％乙醇

杂交液配方：10％硫酸葡聚糖(dextran Sulfate)；25％甲酰胺(formamide)；0.1％SDS；6×SSPE

4.扫描：打开扫描仪(Gene Pix 4100A)，并使机器预热15分钟。将芯片放到扫描仪中(点有探针的一面朝下)后盖好扫描仪的盖子，启动GenePix Pro 6.0扫描程序。选用532通道，GMT值设定为650进行扫描。分别将扫描的图片保存为.jpg和.GIF两种格式。

用上述制备好的基因芯片分别检测样品为鲍氏志贺氏菌O12、宋内氏志贺氏菌1型、痢疾志贺氏菌O9、痢疾志贺氏菌O12、痢疾志贺氏菌O8时的杂交扫描结果分别如图3、图4、图5、图6和图7所示。

5.结果分析：

上述志贺氏菌分型检测芯片的检测结果是扫描得到的一张图片，其中每个探针点的亮度代表着该点的杂交结果。对于探针点较少的芯片，检测结果可由肉眼判断。然而，对于数据点较多的芯片使用肉眼判断即不客观也不现实。因此，为了客观、准确的对检测芯片的结果进行分析，本发明提供了一个计算机判读程序——Bactarray Analyzer。

该Bactarray Analyzer基于Microsoft.NET Framwork开发，是一个界面友好、易于使用的程序。用户只需将芯片扫描仪扫描并套圈得到的荧光数据文件导入分析程序，进行简单设定后点击处理即可获得分析结果。

在芯片杂交完毕之后，荧光标记的目标DNA片段已被固定在芯片的特异探针上。使用芯片扫描仪可以看到探针的荧光图像，荧光的强弱代表着该点杂交情况的优劣，也就是目标DNA序列片段和该点特异探针DNA序列的相似性。在经过套圈分析之后，每个点的荧光强度值被读取并存储为上述程序可处理的荧光强度文件。(不同型号的扫描仪命名规则不同，如AXON公司的Genpix Personal 4100A型扫描仪存储为.GPR文件，博奥生物芯片有限公司的晶芯LuxScan-10K/A微阵列芯片扫描仪存储为.LSR文件)本软件的处理均针对荧光强度文件。

由于芯片的杂交过程中受到的影响因素很多，而且实际使用时病人的目标DNA片段的序列和理论上的序列可能存在部分差异。因此，在实际处理时，本软件程序会做出如下处理：

1)荧光信号的有效性验证。

对于每条特异探针，芯片上均点了若干重复点。在处理时，软件会先对这些重复点的荧光强度进行置信度检验，剔除荧光素沉积、芯片划伤、探针部分脱落等原因造成的荧光强度异常，然后取剩余正常荧光点的荧光强度的平均值作为该特异探针的荧光信号强度。

2)归一化

在对数据进行进一步处理之前，软件还需要消除由于待测样品中DNA量、荧光素标记情况等带来的总体荧光强度上的差异，即对荧光强度数据的归一化。在实际处理过程中，本软件使用特异探针总体荧光强度值作为归一化标准，即：用每点的荧光强度去除以归一化标准，将每点的绝对荧光强度变为相对荧光强度，从而使不同时间、不同条件下进行的试验具有可比性。

3)对每个特异探针打分

经过上述处理，特异探针的荧光强度已变为可比较的相对荧光强度，但本软件并未简单的断定样品中是否存在该特异序列，而是针对每个特异探针给出一个分值，代表样品的DNA片段序列和该特异探针序列的相似程度。

4)应用模式对样品中可能含有的物种进行打分

这里的“模式”指的是存储物种与其相关的特异探针之间的对应关系的模式文件，该文件按照.XML(扩展标记语言)1.0标准编写，不同类型的芯片有各自不同的模式。模式文件中保存了该类型芯片的一些基本信息以及该芯片所能检测的所有物种与其相关特异探针之间的对应关系。在对物种进行打分时，本软件会统计该物种所有相关探针的分值，而该物种的分值为所有相关探针分值的加权平均值。

5)判断样品中可能有的物种

经过上述步骤的处理，程序给样品中所有可能的物种均给出一个分值，分值最高的即为最有可能存在的物种，分值低于阈值的物种不可能存在。

利用上述Bactarray Analyzer软件判读上述杂交结果的具体操作步骤如下：

运行Bactarray Analyzer 1.0程序，并输入用户名、密码。点击工具栏上的“新建项目”按钮新建一个项目，然后按“添加多个文件”导入待分析的.GPR文件。按下Ctrl键，可同时选择并打开多个文件。

在“文件列表”中选中相应的文件，然后点击“阳性对照”、“阴性对照”按钮指定该文件的类型，未指定者默认为待测样品等。一个项目中必须含有一个阳性对照和一个阴性对照两组数据。可按实际需要更改“样本来源”、“样本编号”等字段。点击“处理数据”按钮，软件将会自动生成一个处理过程的记录文件。在“文件列表”页面点击文件名，报告页面会自动切换到该文件的分析结果报告。分析结果报告已被自动保存在本项目所在目录之下。

结果判读：报告给出送检文件名称、样品来源、芯片类型、结果、菌名、分值、特异探针杂交率、对照品情况、出现问题的可能原因分析、荧光强度、软件判读日期、软件操作人等信息。其中，“结果”项即为检测到样品的血清型。

实施例五：对基因芯片进行特异性鉴定和灵敏度检测

1、特异性鉴定实验

用本发明的基因芯片对不同菌株进行检测，其检测范围包括以下三类菌株：

1)属于前述的33型志贺氏菌68株；

2)与33型志贺氏菌亲缘关系较近的大肠杆菌50株、沙门氏菌2株；

3)其它菌株：蜡样芽孢杆菌2株、金色葡萄球菌2株、霍乱弧菌DNA2份。

针对上述每株菌进行3次平行实验。其中对于属于上述33型的志贺氏菌应得到的杂交扫描结果为：待检测细菌相应的特异探针、正对照探针和荧光探针得到阳性信号；计算机判读程序——Bactarray Analyzer给出的判读结果为：检测到某一型的细菌。

对于亲缘关系较近的大肠杆菌和沙门氏菌应得到杂交扫描结果为：只有正对照探针和荧光探针得到阳性信号；计算机判读程序——BactarrayAnalyzer给出的判读结果为：检测到细菌但不在检测范围内。

对于其它菌株应得到的杂交扫描结果为：只有荧光探针得到阳性信号；计算机判读程序——Bactarray Analyzer给出的判读结果为：未检测到志贺氏菌。

检测结果：均得到正确的检测结果。该检测结果说明本发明的基因芯片对志贺氏血清型的检测具有很高的特异性。

2、灵敏度检测实验

针对前述33型的志贺氏菌的68株不同时间和地点分离到的分离菌株进行检测，每个菌株做3次平行实验。将欲检测的模板以10ng、50ng、100ng及500ng四个梯度加入到PCR体系中进行反应并最终得到软件判读结果。能够得到正确且稳定的检测结果的最低模板量即为其灵敏度的值。

检测结果：本发明的基因芯片以DNA为起始检测标本的灵敏度为50ng。该检测结果说明本发明的基因芯片对志贺氏血清型的检测具有很高的灵敏度。

综上所述，本发明将源于志贺氏菌的O-抗原基因簇中高度特异的基因或rfpB基因的寡核苷酸构造成特异的核酸探针，并固定到芯片的载体上，制成基因芯片。同时针对志贺氏菌的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因设计引物，通过PCR方法扩增标记特异的基因和寡核苷酸片段，然后与基因芯片进行杂交反应，最后利用基因芯片信号分析设备及软件，就可以检测出样品中存在致病菌情况。本发明的优点在于：继承和发展了传统的血清学检测方法，并且弥补了传统检测的不足，使检测过程变得快速、灵敏且特异性和准确率高。

序列表

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片及其检测方法和检测用试剂盒

<130>5P99009-CN

<160>180

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>37

<212>DNA

<213>志贺氏菌属(Shigella)

<400>1

cgggaactca aaggagactg ccagtgataa actggag                               37

<210>2

<211>30

<212>DNA

<213>志贺氏菌属(Shigella)

<400>2

cgggaactca aaggagactg ccagtgataa                                       30

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O2

<400>3

ttggctactt taacgctgct aatacaatta gaaatgcagc                            40

<210>4

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O2

<400>4

agcccagagt ctaatgaatc ctatttatca agctgtttat                            40

<210>5

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O2

<400>5

tcaggttcat tactcctgtg catactttct ccaataataa                            40

<210>6

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O1

<400>6

gcaattactg attcattaag atttggaggc gtgttttctg                            40

<210>7

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O1

<400>7

cggtgcaaag ttaattccgc taacgataat atgttgtttt                            40

<210>8

<211>39

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O1

<400>8

atcaaggttt ctttatattc tttcatgaca gaatgcctg                             39

<210>9

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O1

<400>9

ggcggtaatt tacttgacaa atcagatatg gctaatgttg                            40

<210>10

<211>36

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O3

<400>10

atgccgaatg aaaatacaat gttgttaggt gatggg                                36

<210>11

<211>37

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O3

<400>11

gagttgaagg gagagtcatt tatatcattt tcggcaa                               37

<210>12

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O3

<400>12

tcagtttaca agtcattcga caaatgattt atccagcatg                            40

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O6/O10

<400>13

tcaatgatga acgccacata gacgaagccc                                       30

<210>14

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O6/O10

<400>14

cccagattgt ttgaatggaa tatactcaat cacagcatca                            40

<210>15

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O6/O10

<400>15

gctggattag atatttatat acgtcatgtt tctcacccca                            40

<210>16

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O6/O10

<400>16

cgtcatgttt ctcaccccag attgtttgaa tggaatatac                            40

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O4

<400>17

ttggtgttgg aacctaaaag tttcgttgtc ttttcaactg                            40

<210>18

<211>37

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O4

<400>18

catgcctgta tttagtaaac tgtatcacct gcatggc                               37

<210>19

<211>39

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O4

<400>19

ctgaaagaat cgtgaaggtg ttatcgatta caacaacgc                             39

<210>20

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O9

<400>20

catattcatt taatcaatgg atggaaaagg attttaatac                            40

<210>21

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O9

<400>21

aagtatatgg tcatcattca taggaactgt tgcttgttgg                            40

<210>22

<211>36

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O17

<400>22

tggtctagat atccggcatt ttcatttgag ccattt                                36

<210>23

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O17

<400>23

ggagtgatag cagcattaat tatactattt gcttctgtgc                            40

<210>24

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O5

<400>24

tggcacgttg ctttcattat ttagagatac cttatcacca                            40

<210>25

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O5

<400>25

acatggtgtt ttattcttga catagtattc acgacagcat                            40

<210>26

<211>34

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O5

<400>26

gcgattgtat ctccttttgt ttgggaagac acaa                                  34

<210>27

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O11

<400>27

cttttctctc ccatacctgt attagctgca cgaataagtc                            40

<210>28

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O11

<400>28

tttatctgca tgattttact caaattagag ctggcttagc                            40

<210>29

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O11

<400>29

cttttgtttt cgcaaatttc atggttcctt ttctctccca                            40

<210>30

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O11

<400>30

atttcatggt tccttttctc tcccatacct gtattagctg                            40

<210>31

<211>39

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O7

<400>31

gatttttggt gttttatttt aggaaatgaa tttgttgat                             39

<210>32

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O7

<400>32

caattagatc gagttttgat atatagccgt ttttctgctt                            40

<210>33

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O7

<400>33

tagggggcta ttctgctgca tttcaaatag cctcagttct                            40

<210>34

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O12

<400>34

tggtgaaggt tatgatggta tctggctcca taatatgtta                            40

<210>35

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O12

<400>35

atccatgggg aggtttaatt gttcatggtg aaggttatga                            40

<210>36

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O12

<400>36

ggtttaattg ttcatggtga aggttatgat ggtatctggc                            40

<210>37

<211>39

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O12

<400>37

gggtatcagg ttactatact atgtttgtat ggctgttca                             39

<210>38

<211>35

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O8

<400>38

gcatcagggg attaggtata tcaggttctg ttgcc                                 35

<210>39

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O8

<400>39

gcattattca gctctgttat aattgcgtcg catttaatcc                            40

<210>40

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O8

<400>40

ttgcgtcgca tttaatccag cataacaatg ataatgtgtt                            40

<210>41

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O15

<400>41

gcttaaagtc cttatgggaa gctttgttct gtatactgtt                            40

<210>42

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O15

<400>42

gttaagcttg agaatgcata cgtgcttgta gtaatgatgg                            40

<210>43

<211>39

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O15

<400>43

cgagacggta taaattgaag tttagtgtgc ttaaagtcc                             39

<210>44

<211>39

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O15

<400>44

ttccttatgg gaagctttgt tctgtatact gttccttta                             39

<210>45

<211>35

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O13

<400>45

gtgctgcttg cactttacca gggcttcatg gccat                                 35

<210>46

<211>38

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O13

<400>46

ctgcagcatc gctattaggt atcatttata tttatcca                              38

<210>47

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O13

<400>47

ctcatgtata tttacgctgc ggggaataga aataagaatc                            40

<210>48

<211>34

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O16

<400>48

tatgaaactg caatagaggc cggcgttata tcat                                  34

<210>49

<211>36

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O16

<400>49

gctcctgaca atgtcacatt tgagagtgac attgag                                36

<210>50

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O16

<400>50

gctgaggctt tgagctatgg tttgtatgta atcgcaaata                            40

<210>51

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O16

<400>51

agccgagaag acaaagatat tatttacaaa tcacttcatg                            40

<210>52

<211>38

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O14

<400>52

actattgctg agttggaatt atctttcctc tactggtc                              38

<210>53

<211>35

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O14

<400>53

ggaacaggag gagataacag ttcaaatgaa cgttt                                 35

<210>54

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O14

<400>54

ttcaggatta attgatttct tatcaggaac aggaggagat                            40

<210>55

<211>39

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)6型

<400>55

cgtctgaagg tatacaacgc ttaacgatat taccaagtg                             39

<210>56

<211>42

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)6型

<400>56

catggaggat tactaagtgc tatatatggt ttagttatgg ca                         42

<210>57

<211>42

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)6型

<400>57

tatttcagct accataccct tatacttgtt aaaccaagtc tg                         42

<210>58

<211>40

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)6型

<400>58

ggtttagtta tggcaagagt cttatcactt atagtgacct                            40

<210>59

<211>33

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18

<400>59

cgggcaatgg tggctaatta ccactaatag gac                                   33

<210>60

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18

<400>60

cattggagtt ccattatccg agtggtattt tggtaacaat                            40

<210>61

<211>40

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18

<400>61

gggagtaact cttttggcat atatgcaatg atacttgctg                            40

<210>62

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>62

ccaaaactga tattttgcct tggatcaaca ttggtgtatg                            40

<210>63

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>63

tggagtgttt gtatttggac tgttcgcttt atcaagtatt                            40

<210>64

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>64

gaccctgaag gcaagattat ttcagcaata tttgatacgt                            40

<210>65

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>65

tcaagtatta tcttgggtaa gttctcttca gaccctgaag                            40

<210>66

<211>38

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneti)2a型

<400>66

gcaattcatc gtgataatca tcatgaaaga accaaggt                              38

<210>67

<211>40

<212>DNA

<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)2a型

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>68

gttatttctt atcccggatt tgtttctaat gtggctgatt ggat                       44

<210>69

<211>44

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>69

ggagggttat ctgaatctga cgtagatact ttaattaaat cagg                       44

<210>70

<211>44

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>70

tgaatttatt atacttggcg ctatagataa ggaaaacccc ggag                       44

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<212>DNA

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<211>39

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O6

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O6

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<400>74

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<212>DNA

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<400>75

ctgtaattct atgtgcggat gagttgttaa agatatggct                            40

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<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O3

<400>76

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O3

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O9

<400>79

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O4

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O4

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O4

<400>84

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O10

<400>86

gcctctactt taccgacaaa gaaagtgagt tatatcatca                            40

<210>87

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O10

<400>87

atgttaattc ccctactcaa ttcatctgtc acgtcagttt                            40

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<212>DNA

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O5

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O5

<400>90

gctctaaagc ttcgctcata ttaattttga tgagtggtgt                            40

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O5

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ggacctcttg atttagctgt tcaattagca gaagaactat                            40

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tttatcttgg taggtttggt actattagca ccaggct                               37

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<211>37

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O11

<400>94

tgatattcat ggacgtttat cttggtaggt ttggtac                               37

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O7

<400>95

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O7

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O7

<400>97

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O7

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<211>40

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O12

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O12

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gtacccattt attttattgc gcgatttaga gtccgtagtt                            40

<210>101

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O12

<400>101

aatcttaata ttctattgtg gatgtctgtt ggatgtgtgc                            40

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O12

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<212>DNA

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<211>37

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O8

<400>104

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<210>105

<211>38

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O8

<400>105

aatgtgtctt tagggaataa catgtttact ttcctaaa                              38

<210>106

<211>39

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O8

<400>106

cattacagtt gtaaatatat gctttattat aatgatagg                             39

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<213>宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)1型

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<211>39

<212>DNA

<213>宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)1型

<400>109

cagatgttgt tgttatcagc ggatatatca ggtgtcgta                             39

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<212>DNA

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<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O13

<400>111

ttctttcacc attaatatgt atcgtaacgc ttccactgat                            40

<210>112

<211>40

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O13

<400>112

gcctgcactc ataaatttct ttcttgcaat cgttggaatt                            40

<210>113

<211>41

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O13

<400>113

tgcaatcgtt ggaattatag gctctgtagt attgttcaaa a                          41

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<212>DNA

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O1

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O4

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O5

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<211>18

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O9

<400>129

ttccaccgac tcccattt                                                    18

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<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)6型

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O6/O10

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<211>20

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O2

<400>137

ctccgactcc atatcttatt                                                  20

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<211>20

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O3

<400>138

gttaggtttg tttcaaggtc                                                  20

<210>139

<211>19

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O3

<400>139

taggaatgag tatgaaaga                                                   19

<210>140

<211>21

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O11

<400>140

gatattctta tagaggtggt t                                                21

<210>141

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<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O11

<400>141

gtgctggtat agttattgg                                                   19

<210>142

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<212>DNA

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<211>21

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O17

<400>143

aaagatagta aaatggctca a                                                21

<210>144

<211>20

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>144

tatttcgtac cattaagtgc                                                  20

<210>145

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>145

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

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<211>20

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O1

<400>147

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O3

<400>148

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<211>19

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O3

<400>149

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<210>150

<211>18

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O5

<400>150

aacgagtatg gtggattg                                                    18

<210>151

<211>18

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O5

<400>151

cgcatttcga taaatcac                                                    18

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<211>19

<212>DNA

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tagatgtgct gcctttgat                                                   19

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<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O6

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aataaccgcc gttctaat                                                    18

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<211>20

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O11

<400>155

cgaagtaata tccgttcata                                                  20

<210>156

<211>19

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O12

<400>156

gttatttacc tacgcctca                                                   19

<210>157

<211>19

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O12

<400>157

agaaatacca atgccacct                                                   19

<210>158

<211>19

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O15

<400>158

gaagagtatg ggatggtag                                                   19

<210>159

<211>22

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O15

<400>159

caacaacact gtataataac ca                                               22

<210>160

<211>19

<212>DNA

<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O7

<400>160

gtgttgactg ctggatttc                                                   19

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O7

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O9

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gcgttggttg gtgaaagag                                                   19

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O9

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ttcccacaaa tcaaacca                                                    18

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<211>18

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O13

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aaagattggt agcgtcgg                                                    18

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O13

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tgaagccctg gtaaagtgc                                                   19

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O16

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ccatacggat aatgttgag                                                   19

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O16

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tctttgtctt ctcggcta                                                    18

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18

<400>168

cagggcacaa actatct                                                     17

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<213>鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)O18

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taattcggaa tgtgct                                                      16

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O4

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tttctgctta ttcattattg                                                  20

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O4

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actaccagct ctaatacc                                                    18

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O8

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ttccctcttg ttgtattga                                                   19

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O8

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acctttatca attgcctcc                                                   19

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O10

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<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O10

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aattgaagtg accagataac                                                  20

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<211>18

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<213>宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)1型

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tgaggtttca cgtttctc                                                    18

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<213>宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)1型

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aataatccct aactgagcc                                                   19

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<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)2a型

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cacttgttgg gtatgctgg                                                   19

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<213>福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)2a型

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ccggcaaaca gattagaaa                                                   19

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<211>12452

<212>DNA

<213>痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)O9

<400>180

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc      60

gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt     120

caactgctgg cggaagtgca gtccatctgt ccaccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt     180

cagggcgaac ctttaggttt gggccactcc attttatgtg cacgacctgc tattggtgac     240

aacccatttg tcgtggtact gccagacgtt gttattgatg acgccagcgc cgacccgctg     300

cgttacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggtgctg     360

gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactctgtca tccagaccaa agagccgctg     420

gaccgcgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccgcag     480

acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg     540

gaactagaac gcactcaacc aggtgcatgg ggacgtattc agctgactga tgctattgct     600

gaactggcaa aaaaacagtc tgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc     660

ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttc gtgaagtatg gattacgcaa cctcaaagaa     720

ggggcgaagt tccgtaaagg cattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg     780

atgtaacggt tgataacaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggagaa agtaatttgt     840

tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag     900

gattttagtc aaagttttcc aagattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt     960

agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtaggcatgc    1020

atgcagtgca ttggtagctg taagccaagg gcggtagcgt gggtattttg aagcatttat    1080

acctccttat tcagtgagaa gggacagatt acgtaacact gctttgttgt actaaataat    1140

tcgcatttta tgttcaacaa tcgagatatt ccttattacc taaagctgtt tttcattgtt    1200

tatacatgat cgaagactcc ttacataaat aaggagaaca aaatggaact taaaaaattg    1260

atggaacata ttctattata cccgattcca gacaagtctg gaaagtggaa cataaattat    1320

cggatattct actgttgact atttgtgccg ttatttctgg tgcagaaggc tgggaaaata    1380

tagggttttt ggggaaactc atctcgattt tttgaagcaa tatggtgatt ttgaaaatgg    1440

tattcctgtt cacggtacca ttgccagagt tatatcctgt atcagtcctg caaaatttta    1500

cgagtgcctt attaactgga tgcgtggatg ccattcttca aatgataaag acgtcatcgc    1560

aattgatgga aaacactccg gcattcttat gacaagagtc gccgcaaggg agtgattcat    1620

gtcattagtg cgttcttaac aatgcacatt ctggttcaag acagatgaga aatccaatga    1680

gattacagct atccctgagc ttattaacac gttggatatt aaaggaaaaa ttatcacaac    1740

tgatgcgatg ggttgcctga aagatattgc tgagaagata caaaaacagg gaggtgatta    1800

tttattcgct gtacacggaa accagggggg gcttaataaa gcctttcagg aaaaatttcc    1860

gctgaaagaa ttaaataatc cagagcatga cagttacgca atgagtgaaa agagtcacgg    1920

cagagaagaa atccgtcttt atattgtttg cgatgtccct gatgaactta ttgatttcac    1980

gtttgaatgg aaagggctga aaaaattctg tgtggcagtc tcctttcggt caataatagc    2040

agaacaaaag aaagagccag aaatgacgtt cagatattat atcagttctg ctgatttaac    2100

cgcagaaaag ttcgccacag caatccgaaa ccactggtac gtggagaata agctgcactg    2160

gcgtctggat gtggtaatga attaagacga ctgcaaaata agaagaggaa acgcagcaga    2220

attattttca cggatgcggt acatcgctat taatattttt acgaatgata aggtattcaa    2280

ggcagggtta agacgtaaga tgcgaaaagc agccatggac agaaactacc tagcgtcagt    2340

ccttgtgggg aacgggtttt cgtaattttg ccatgggtgc taaggaagaa acgagaatat    2400

tattattcca tagattggat ctgtcataag atgaaatcag ttaatactaa aattaaaatt    2460

gcacatctac aattaatgcc cttgttaagt ggtgtccagc gagtatcttt gcaggaaatt    2520

gaaaatttac ctcctgagta ttttgagatt gatttaatat gtaaagaggg tgggccgtta    2580

gttgatgcgc taaataaaaa agttagaaag ttctttatcc cgactctttg tagaaatatt    2640

tctccggttg aggatttaaa atccttgatt agcttatata aaatattcaa aagagaaaga    2700

tatgatattg tgcatacaca ctcttcgaaa acaggtattc taggaagaat agctgcacgt    2760

atggctaaag ttccgtgtgt tgtgcataca gttcatggtt ttgcatttga aagtacgaaa    2820

aaacaggcaa taaaaaatct atacaaatgg ctggagatga ttggtgcaaa atgctctaca    2880

aaaataatat gtctccatga ggaagacaaa aatatatgtt taaatatact aaaaataaaa    2940

gcagataaaa ttgtagttat tccaaatggt gttgatataa ataagttcac tccagcaacg    3000

aataaaggta aaataaaaga agaaatatta agcttgagag aatcaaattt tgtttttact    3060

atggtaggac gattatggcc acaaaaaaat cccttatatt ttgttgaggt tgctaaacaa    3120

attataaaaa atgaactaat acccggttcg atttttgtac tcgttggtga tggtgaattg    3180

atgagtgtaa taaaagaaca ttatcttgaa gatgagttgt tacataatag gttgttatta    3240

ttaggttggc gaaatgatat ctcagatatt ttgaaagcta gcgatgtatt cgtactccct    3300

tctctttggg aaggaatgcc attggccata ctggaagccc aatcaacagg tttaccatgc    3360

gtagtatcta acattaatgg aaataaatca ttagttacga ataaagtcga tggctacttg    3420

gttgaactta acgatattaa tagctttatc aacgcactag ttaatattag tgaaaaaaat    3480

gtttatgcca gaatgtctaa taattgccgt gcaaaaatag ttagtaatta caatataaca    3540

caaagaattg aaaaaataaa aatcatgtat tatcaactac taaatgtaaa catgaactag    3600

catgtttttg taatgtatgt ttatttcata taaggttgca gggaaagaac atcagaagta    3660

cactttttgt actgaataat tcgcatttta tgttcaatat ttgagatatt ccttattacc    3720

taaagctgtt ttccattgtt tatacatgat cgaatactcc ttacataaat aaggagaaca    3780

aaatggaact taaaaaattg atggaacata tttctattat ccccgattcc agacaagtct    3840

ggaaagtgga acataaatta tcggatattc tactgttgac tatttgtgct gttatttctg    3900

gtgcagaagg ctggaatgat atagagagtt ttggggaaac tcatctcgat tttttgaagc    3960

aatatggtga ttttgaaaat ggtattcctt ttcacgatac aattgccagg gttgtatcct    4020

gtatcagtcc tgcaaaattt cacgagtgct ttattaactg gatgcgtgac tgccattctt    4080

caaatgataa agacgtcatc gcaattgatg gaaaacactc cggcattctt atgacaagag    4140

tcgctgcagg ggagcgattc atgtcattag tgcgttctca acaatgcaca gtctggtcat    4200

cggacagatc aagacagatg agaaatccaa tgagatcaca actatccctg aacttcttaa    4260

catattggat attaaagcag ggcaagatcg tgaaaagcgt gatataagtc actcttttta    4320

tcctggtttt aactctcacg ggtgattaaa atttaatctt tggaataact aaaaagataa    4380

aaggacaccc agatgagtat tcaaagtttg cttgattata tttctgtgat ccctgatgga    4440

cgacaacaag gaaaagttag acataaatta tctgatattt tgctcctcac cgtctgtgca    4500

gtaattgctg gtgccgatga gtggcaggaa attgaagatt ttggacatga aagactggaa    4560

tggctaaaga aatatggtga ttttgctaat ggcattccgg tggatgacac cattgcacgc    4620

gttgtgagta acattgacag tttggccttt gaaaagatgt ttattgaatg gatgcaggaa    4680

tgccatgaaa tcactgatgg cgaaattata gcaatagatg gaaagaccat aagaggctcc    4740

tttgataagg gaaaaagaaa aggagcaatc catatggtga gtgcattctc gaccgaaaat    4800

ggtattgtac tggggtaggt gaaaacggaa gccaaaagta atgaggttac agccattcca    4860

gagttgctta acctactgga tttaaagaaa agtttgataa ccattgatgc tatgggctgt    4920

cagaaagata tcgcttctaa aattaaagat aaaaaggcag attatcttct ggcagtaaaa    4980

ggcaatcagg ggaaattaca tcatgcattc gaagaaaaat tccctgtaaa aatgttctct    5040

aattataaag gcgattcatt tgatactcag gagataagcc atggaagaaa agaaacacgt    5100

ttacatatta tcagtaacgt aacgcctgaa ttttgtgatt ttgaatttga atggaaggga    5160

ttaaaaaagc tttgtgtggc attgtcattc aggtaaaaga aagaagataa atcagcggaa    5220

ggtttaatca ttcgatatta catttcatca aaggatatgg atgctaaaga atttgcacat    5280

gctatcagag ctcactggaa aatcgagaat aatcatcatt gggtgctcga tgtaaaaatg    5340

aatgaagatg gaagcagaat aagaagagga aacgcagcca aaataatatc tggaataaag    5400

aaaatggccc tgaatttatt aagagattgc aaaggtttta agggcggggt aaagagaaaa    5460

agaaagaagg ctgcgttaaa tacaagttac atagagaaag taattgcatc ctgcgcaatg    5520

cctggatttc ggtctgacaa aatgaaaaat ttaacacaaa tttaattcat gctcttgccc    5580

tgcggttgtg gaagtttgaa ctatagaaat acttaatcaa cttaagttct aagtatagga    5640

aatgaataga acatgaaatg ttttgtagtg tcattgaaga atagtggtcg tagaaaagat    5700

tttgaccata gatttaaaat ttttaattat caattttttg acgctatcac tgaatgcaca    5760

agtaatcaat tcaactcagc tattgcaaaa tcaatatatg gaaggtgttt gagaaaaggg    5820

gagattggtt gttcgttgag ccattttaat attattagag attttgcatt aaactccaaa    5880

gaaaattggt tgctaatcat ggaggatgat gctgttccag agagtcaatt tattcatttt    5940

ataaatgaat ttgaaaataa acatgtaact acaaacgctg aagtaatatt attaggtcat    6000

tcaaaaacaa gccgtaagca tatatttgtt caacgtttga agcagcccct gcgtaactat    6060

aaaaacataa acggaataag ttttggtgaa aataaaaatg ttaccctttg tgggacagtt    6120

gcatatctaa ttaataaaca agccgccaac ataatatctg gtaatagcca accgtattgg    6180

cttgctgacg attggttctt attccaaaat atggggatta gggtttatca tccacaaatt    6240

ccgctagtgt atgaagatct ctcttatgat agctctacag aaaatgatat ttattaccat    6300

cacaatttta taaaagaacc cctaaaaaat atcatacaca taatcatagg gcaatataaa    6360

ttctggaatg actctcgaaa gttacggaaa tcaaataata aatgagtcat ttcggagggg    6420

ggcttatgaa gagtgtaaat aattttaatt tttacttggc tatttttata ggcatgtttg    6480

atttaactat ttttagcaca ggtaatagct tagggcaagc acttacaacg gtattgttat    6540

tattttccat attaagtgat atcaacaagg tttttttgaa accatttttt tttgttattt    6600

catacatagt tcttgcgcta ctggtttctt tatttcatgg ggagacatcg tatcattatt    6660

catttattat tgttaaaaca gggcttattc tgttcaatgc aatggtaatt tcacaaattc    6720

taattttgta tgctgataaa aaacaaattt caaattttgt taattttatt tttctaatcc    6780

agaccatttc attattatta tattcaaatg aacttttcca aatgatgcgc ggtttttttc    6840

tttcagcccg ctcagagcat ctatatgaga attttagtga ttcatattgg tacagagatg    6900

caacaatctc aaatcaagga tattctggat atgcattagg cgcacttcct ttagtaatta    6960

ttgccgtcca taacataatg aaatcaaaat tctttagtat tagatatttt gttgcagtag    7020

tgtgttgcgg attaggggtg tcagttgcaa tgttaaatgg tcgttcagta tttttgttta    7080

tcccattata tatgatatat cttatgctga ggcctaaaga aatatgtctg acatataaaa    7140

taattcctgt tattctgatt attgtaagtg caattattat tgtacttaca aattttgata    7200

tatccagtaa ttttgttttg gctttttttg aacaaaagga taaatcatat ggcatagatt    7260

cagttgatga tttaatgtat aaccatacta tcttacattt tgatataacg ttatttgggt    7320

tgggaaaata tctactttcc gatggttcag catttgttag atctgatatt ggatactata    7380

gacaaatggg agtcggtgga atatctttgg tgttatttta tattttcagc atatggttag    7440

ctgtaagata tgttatctat cgtgatttat cattatttat tttattcata atattactgg    7500

ctaattttaa gcaagaagca tttaataatg caatgttaat gtatggtgct tttttactag    7560

cagcatattg ggtagctcgg gataaaatag agataacaaa gaaatgaaga taattttgtg    7620

gcatttgggg cgtaaaggtg ctgggccaaa atataactta gaaatggcac tagctttaaa    7680

aaaagaaggc tatgacgtat atgcttgtat ttccaagcag gcggaaaatg caaatgatta    7740

taagaaacat aacattaatc acttatcgct taatacatat acggggggtg tttccgcatt    7800

aatcaattct ctgcgattac cttggttgat taatgaattt aaagattatt taaagataaa    7860

tcgtattacg catgtttatt gtacaatgcc gcatatatgg aatttcttct tttctaagag    7920

gtttaagaaa ttagacatat cctatttgct cacaattcat gatgcagaat tacatagtgg    7980

tgaggaaaat aaattaattg atattttgat gaaaaaagat agaaaaaatg cagatggaat    8040

tgttgttctt acaaaacatg taaaagaaca attaaaaaat ttagggaaat caatttttat    8100

aattccacat ccagcctttt catttaataa caataaaaac agtgcgaaaa gtattgtacc    8160

cgaccaaaaa ataaaattgc ttttttttgg taggattcat cactacaaag ggctggatat    8220

tcttattgat gcatttgaaa aactgaacaa aaaaaataac aggtatagtc tttctatcta    8280

cggtagtggg aatatctctc catatcaaaa gaaaattcta gaactaagca atattacagt    8340

gcataatcgt tggatcgatg atgtagaaat tccttcaatc atctctagcc atgatgtctg    8400

tgttattcct tatcgggatg caagtcagtc aggagtaatt cctacggtaa tgacttgtgg    8460

tgtgcctctt gttgtgaccc cggttgctgg gcttaaagag caggttgttc acttacaaac    8520

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taaggatata tctttgtatg aaaagatatc aaagaatgct ctactatacg ctcaggaaga    8640

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ttctaaaaag tataatcaat gatatctact tcatatgcat gatagtacta ttgtattcat    8760

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caatatatct ttttattctt tcattgcaaa ggctacggta tttctatgtg gacctttaac    8880

attacttctg atctctcata aattaagtac tgaagagatc gctttttatt ataccttctt    8940

caatttaatc gcgttacaac aacttgttga actaggttta ggttttactc taaaacagtg    9000

tatatcacat gcttataaaa ttgaaaatga tgtatggtta tatgattcga agaaaatagt    9060

taaatcatat atacaatttg gtttgtactg gtttattggg gtgtcgtgta ttattatatt    9120

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gggggcttgg ttaggaacta taggtgttct tgcatttagt ataatactgg ttccaataca    9240

aattgctatt gaagcaacac aaaatcaaat tgcaatatat cgttgtcaag ttatatattc    9300

tctcacaaat agtttatctc tttgggtatt catttataat gactttaagt tatattccat    9360

tcctctaagt atgcttatag caaacatatt tttgttgatt gcactaaaaa atcattatat    9420

aaaactttat aataaattag cctttgttaa agaaatggat aaattctgga ccatcttttc    9480

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gaatgggttt aatttaatct cattcaaaat tttttcgcct gaagaggctg ggagaattat    9600

ctttagtatt acgttagctc gtgccggatt tactatagca gagtcaatta tttgcgcaca    9660

aactactgtt gtttcaaata tgatttctaa aggagaaaat actgaagctg ctaagtatta    9720

tcgaaaatat caactgattt cctttgctgt tttaattata gggtacggct tttattatgt    9780

tgtgaagtgt tttttttctg atttttactt gtttgacaaa ttaatgccaa actcatttat    9840

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cctgcgaact tgatccaggc acagcgtgac ta                                 12452

Claims (12)

1.一种用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其特征是该寡聚核苷酸探针包括从志贺氏菌16S rRNA序列中选取的DNA片段和从一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因中选取的DNA片段。

2.根据权利要求1所述的用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片，其特征是上述一种或几种不同血清型的志贺氏菌选自福氏志贺氏菌2a型、福氏志贺氏菌6型、宋内氏志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌O1、鲍氏志贺氏菌O2、鲍氏志贺氏菌O3、鲍氏志贺氏菌O4、鲍氏志贺氏菌O5、鲍氏志贺氏菌O6、鲍氏志贺氏菌O7、鲍氏志贺氏菌O8、鲍氏志贺氏菌O9、鲍氏志贺氏菌O10、鲍氏志贺氏菌O11、鲍氏志贺氏菌O12、鲍氏志贺氏菌O13、鲍氏志贺氏菌O14、鲍氏志贺氏菌O15、鲍氏志贺氏菌O16、鲍氏志贺氏菌O17、鲍氏志贺氏菌O18、痢疾志贺氏菌O1、痢疾志贺氏菌O3、痢疾志贺氏菌O4、痢疾志贺氏菌O5、痢疾志贺氏菌O6、痢疾志贺氏菌O7、痢疾志贺氏菌O8、痢疾志贺氏菌O9、痢疾志贺氏菌O10、痢疾志贺氏菌O11、痢疾志贺氏菌O12和痢疾志贺氏菌O13。

3.根据权利要求1或2所述的用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片，其特征是从上述一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因中选取的DNA片段选自具有如SEQ ID NO：3-NO：113所示的碱基序列的DNA片段。

4.根据权利要求1所述的用于志贺氏菌血清型检测的基因芯片，其特征是从上述志贺氏菌16S rRNA序列中选取的DNA片段具有如SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2所示的碱基序列。

5.一种检测志贺氏菌血清型的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)根据志贺氏菌16S rRNA序列和一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因序列设计并制备出用于PCR扩增的引物；

(2)按常规方法制备待测样品的基因组DNA，使用步骤(1)中的引物对待测样品基因组DNA进行PCR扩增并纯化扩增得到靶序列；

(3)标记步骤(2)中得到的靶序列；

(4)将标记后的靶序列与权利要求1所述的基因芯片杂交；

(5)用生物芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果。

6.根据权利要求5所述的检测志贺氏菌血清型的方法，其特征是上述步骤(1)中一种或几种不同血清型的志贺氏菌选自福氏志贺氏菌2a型、福氏志贺氏菌6型、宋内氏志贺氏菌1型、鲍氏志贺氏菌O1、鲍氏志贺氏菌O2、鲍氏志贺氏菌O3、鲍氏志贺氏菌O4、鲍氏志贺氏菌O5、鲍氏志贺氏菌O6、鲍氏志贺氏菌O7、鲍氏志贺氏菌O8、鲍氏志贺氏菌O9、鲍氏志贺氏菌O10、鲍氏志贺氏菌O11、鲍氏志贺氏菌O12、鲍氏志贺氏菌O13、鲍氏志贺氏菌O14、鲍氏志贺氏菌O15、鲍氏志贺氏菌O16、鲍氏志贺氏菌O17、鲍氏志贺氏菌O18、痢疾志贺氏菌O1、痢疾志贺氏菌O3、痢疾志贺氏菌O4、痢疾志贺氏菌O5、痢疾志贺氏菌O6、痢疾志贺氏菌O7、痢疾志贺氏菌O8、痢疾志贺氏菌O9、痢疾志贺氏菌O10、痢疾志贺氏菌O11、痢疾志贺氏菌O12和痢疾志贺氏菌O13。

7.根据权利要求5所述的检测志贺氏菌血清型的方法，其特征是上述步骤(1)中根据志贺氏菌16S rRNA序列设计的上游引物序列为5’-CACGGGTGAGTAATGTCTGG-3’，下游引物序列为5’-ATCCACGATTACTAGCGATTCC-3’。

8.根据权利要求5或6所述的检测志贺氏菌血清型的方法，其特征是上述步骤(1)中根据一种或几种不同血清型的志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因序列设计的引物选自具有如SEQ ID NO：114-NO：179所示的碱基序列的寡核苷酸片段。

9.根据权利要求5-8之任一所述的检测志贺氏菌血清型的方法，其特征是上述步骤(5)中使用判读软件BactarrayAnalyzer分析鉴定杂交结果。

10.根据权利要求9所述的检测志贺氏菌血清型的方法，其特征是使用上述判读软件BactarrayAnalyzer按下列步骤分析鉴定杂交结果：

(1)杂交信号的有效性验证

对上述基因芯片上每条特异探针的多个重复点的信号强度进行置信度检验，剔除异常的信号强度，取正常的信号强度的平均值作为每条特异探针的信号强度；

(2)归一化

使用上述基因芯片上全部特异探针的总信号强度值作为归一化标准，然后用每个探针点的信号强度除以该归一化标准，将每个探针点的绝对信号强度变为相对信号强度；

(3)对每条特异探针打分

针对每条特异探针给出一个分值，代表待测的DNA片段序列和该特异探针序列的相似程度；

(4)应用模式对待测样品中可能含有的血清型进行打分

(5)判断样品中可能含有的血清型

经过上述步骤的处理，程序给样品中所有可能的志贺氏菌血清型均给出一个分值，分值最高的即为最有可能存在的血清型，分值低于阈值的血清型不可能存在。

11.一种用于志贺氏菌血清型检测的试剂盒，其特征是至少包括：

基因芯片，其包含固相载体和固定在该载体上的寡聚核苷酸探针，其中，寡聚核苷酸探针包括从志贺氏菌16S rRNA序列中选取的DNA片段和从一种或几种不同血清型志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因中选取的DNA片段；

PCR扩增引物，根据志贺氏菌16S rRNA序列和上述一种或几种不同血清型志贺氏菌O-抗原基因簇中的寡糖单位处理酶基因、糖基转移酶基因或rfpB基因序列设计。

12.根据权利要求11所述的用于志贺氏菌血清型检测的试剂盒，其特征是还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件BactarrayAnalyzer。

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