CN1985776B - 生物型脊髓支架 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物型脊髓支架，它由芯体(1)、包裹在芯体(1)外的半透膜(2)、固定在半透膜(2)上的螺旋骨架(3)以及包裹在螺旋骨架(3)上的外膜(4)组成，其中芯体(1)由通过非醛类固定剂交联固定和用活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物脊髓制成，半透膜(2)及外膜(4)分别由通过非醛类固定剂交联固定和用活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物膜组织制成。本发明的优点是：仿照人体脊髓的组成和结构设计，所有的构造都是天然生物材料制成，生物相容性好，无免疫原性，可被降解吸收，可诱导组织再生。

Description

生物型脊髓支架

技术领域

本发明涉及一种用于脊髓损伤修复治疗的医疗装置，属植入类医疗器械。

背景技术

脊髓损伤常引起瘫痪，至今未找到有效治疗方法。以往一直认为脊髓神经是不能再生的，脊髓损伤是不治之症。近年来，对中枢神经及神经干细胞的深入研究发现，包括脊髓神经在内的中枢神经是可以再生的，关键是要有适于神经组织再生和重建的临时性基质和良好的微环境。这里所谓临时性基质就是供神经干细胞以及其分化形成的神经元细胞及神经胶质细胞分裂、增殖和迁移的温床。它可被降解吸收，为神经细胞提供养分。所谓优良微环境是指有利于诱导神经干细胞定向分化为神经元细胞及胶质细胞和促进这些细胞分裂、增殖和迁移的物质环境和新组织生长的空间。组织工程习惯将这些可作为组织重建的临时性基质和微环境，简单化地称为“支架”，虽不很确切，胜在简单。但现有技术还没有这样的支架。

发明内容

本发明的目的是提供一种生物相容性好、可被降解吸收的生物型脊髓支架及其制备方法。

本发明的技术解决方案是：生物型脊髓支架，由芯体、包裹在芯体外的半透膜、固定在半透膜外的螺旋骨架以及包裹在螺旋骨架外的外膜组成，其中芯体由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原的动物脊髓制成，半透膜及外膜分别由通过非醛类固定剂交联固定和活泼试剂及强氢键试剂去除抗原的动物膜组织制成。

动物组织易被微生物降解或分解，需用固定剂使之交联固定，传统上使用戊二醛作固定剂，有残留毒性，我们选用非醛类固定剂，如环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亚胺，就没有这一缺点。以环氧化物为例，当应用环氧化物来代替醛类作固定试剂时，由于环氧化物很不稳定，易发生开环交联反应，控制反应条件可以做到使其与胶原蛋白的交联产物很稳定，不轻易降解，只有在再生组织生长、增殖需对其蚕蚀时，分泌出激肽释放酶、纤溶酶、糖皮质激素协同胶原酶作用下才能将其缓慢分解为多肽及氨基酸，并被吸收利用。这样一种被动式降解与组织的再生是同步的，是最有利于组织的再生性修复的，而且无醛类的残留毒性；根据现代免疫学理论，动物组织的抗原性主要是由蛋白质中某些特殊位置的活性基团及特异构象引起的，这些活性基团主要是-OH，-NH₂，-SH等，而特异构象则主要是由于蛋白质分子螺旋链的某些持殊氢键引起，在处理动物组织时，用一种或多种易与这些基团起反应的活泼试剂(如酸酐、酰氯、酰胺、环氧化物等)与这些基团结合，将其封闭起来，去除其抗原，同时，还应用强氢键试剂(如胍类化合物)，置换引起特异构象的氢键，改变其构象，从多方面有效的消除其抗原性。本发明中的芯体是用去抗原的异种脊髓基质制成，无抗原性，生物相容性好，可以作为神经干细胞以及神经元细胞、胶质细胞寄居、分裂、增殖及迁移的优良基质和载体。半透膜和外膜是用猪、牛、羊、猴等动物的膜组织经系列生化处理得到的，具有脊髓软、硬脊膜相似的组成和特性，生物相容性好。螺旋骨架可以由半透膜或外膜裁成细长片条，在半透膜外螺旋盘绕粘贴多层而形成，除对支架起到支撑作用外，所形成的螺旋凹坑，还起到临时性脑脊液通道腔的作用，类似于脊髓蛛网膜下腔的作用。

作为一个优化的方案，就是对所述芯体、半透膜及外膜分别通过偶联剂偶合多肽及糖胺聚糖类活性组分到它们的表面，使之具有粘附生长因子、促进组织生长的功能；对于半透膜及外膜，考虑到一些膜组织，力学强度还不能满足应用要求，而且在生化处理中常会引起力学性能的损失，所以还设置了对胶原蛋白分子进行接枝改性的处理步骤，如在胶原蛋白分子中适当接枝聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸、聚羟乙酸等链段，来提高基材的力学强度和韧性，接枝的原料是用它们的预聚体，方法可以选用缩合、引发、辐射等高聚物接枝方法。

所述的多肽之一是由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角质素。这些多肽或糖胺聚糖对生长因子有广谱粘附和富集作用，能激发未分化细胞定向分化，具有诱导机体组织的再生性修复的功能。

所述的半透膜为动物的肠膜或其它经过机械薄化处理的动物膜组织；所述外膜为动物心包膜或膈膜或脂肪网膜或胸膜或腹膜。

本发明的生物型脊髓支架的制备方法包括以下步骤：

(1)、选料：收集新鲜动物的脊髓以及膜组织，对脊髓小心剪去全部外膜取髓质，剔除血管；对膜组织修剪去除多余杂质及不规整部分，张力定型；

(2)、碱处理：使用碱溶液浸泡髓质和膜组织；

(3)、脱脂：使用有机溶剂抽提髓质及膜材中的脂肪及脂溶性杂质；

(4)、交联固定：使用非醛类固定剂交联固定髓质及膜材中的胶原蛋白分子；

(5)、去除抗原：使用活泼试剂封闭髓质及膜材蛋白中引起抗原的特异活性基团-OH，-NH₂，-SH，并用强氢键试剂置换基材蛋白质分子螺旋链中引起特异构象的特殊氢键。

(6)、成品制备：在棒状模具上，用医用胶将相应尺寸的半透膜粘合成管状体；另取上述任一膜材裁成规定宽度的长片条，按一定间距螺旋盘绕粘贴在半透膜上，粘贴多层，形成螺旋骨架；再将外膜粘合在螺旋骨架的凸梁上形成管状体；取出模具，用制好的去抗原异种髓质小心填充管心，必要时加些胶原溶胶或蛋白胶作粘结剂，再冷冻干燥，即得成品。

作为一种优化方案，芯体、半透膜和外膜还包括通过偶联剂偶联特定多肽或糖胺聚糖活性组分的处理步骤，即在芯体、半透膜和外膜的表面上通过偶联剂偶联可粘附生长因子的多肽或糖胺聚糖活性组分。此外，对于半透膜和外膜还经过增韧改性的处理步骤，即使用缩合、引发或辐射接枝的方法，在芯体、半透膜和外膜的胶原蛋白分子中适当接枝聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羟乙酸链段。

生物型脊髓支架的制备方法中所使用的碱溶液为NaOH、KOH或Ca(OH)₂溶液。

生物型脊髓支架的制备方法中所述的非醛类固定剂为易与蛋白质分子发生交联反应的试剂如环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯、聚乙二醇或碳化二亚胺试剂中的一种或两种，这里的环氧化物可以是单环氧化物

也可以是双环氧化物这里R＝C_nH_2n+1-，n＝0-10，还可以是低聚环氧化物如聚环氧丙烷。

生物型脊髓支架的制备方法中所述的活泼试剂是小分子有机酸酐、酰氯、酰胺或环氧化物，强氢键试剂为胍类化合物。

生物型脊髓支架的制备方法中所述的偶联剂为二酰二胺、二酸酐、碳化二亚胺、双环氧化物或其它能与-NH₂，-OH，-COOH起缩合反应的双官能团试剂。

本发明的优点是：仿照人体脊髓的组成和结构设计，芯体类似于人脊髓的髓质(灰质和白质)，它是用去抗原异种脊髓基质，引入可粘附神经干细胞及有关生长因子的活性组分制成，可征集神经干细胞并诱导其定向分化，促进脊髓组织的再生。半透膜类似于脊髓的软脊膜，可透过脊液中的营养物质。螺旋骨架除起支撑作用外，所形成的螺旋凹坑起到脑脊液流动腔的作用。外膜类似于硬脊膜。所有的构造都是天然生物材料制成，生物相容性好，可被降解吸收，可诱导组织再生。

附图说明

附图1为本发明实施例的结构示意图；

1、芯体，2、半透膜，3、螺旋骨架，4、硬脊膜。

具体实施方式

实施例：如图1所示，生物型脊髓支架，由芯体1、包裹在芯体外的半透膜2、固定在半透膜2上的螺旋骨架3以及包裹在螺旋骨架3外的外膜4组成，其中芯体1、半透膜2及外膜4分别由通过非醛类固定剂交联固定、活泼试剂和强氢键试剂去除抗原及通过偶联剂偶联特定多肽或糖胺聚糖活性组分的处理步骤的动物脊髓、动物膜组织制成。

具体制备步骤如下：一、芯体材料的制备：取新鲜的猪脊髓，小心剪除硬脊膜、蛛网膜及软脊膜，取髓质，小心剔除微血管，放入0.2～2％的NaOH溶液中浸泡2小时，取出，用水漂洗三次。取出沥干水分，用有机溶剂抽取其中脂肪及脂溶性杂质。取出，除去溶剂后，用碳链环氧化物与之进行交联固定反应。取出，洗净，冷冻干燥，用乙酸酐或丁酸酐与之反应，封闭抗原基因；再用盐酸胍的Tris缓冲溶液处理，改变引起抗原的特异构象。取出，洗净，用碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R)作偶联剂将由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的多肽或糖胺聚糖偶合到髓质的胶原分子上，洗净，即得芯体材料，置于生理盐水中低温保存备用。

二、半透膜2和外膜4的制备：分别取牛心包或猪心包或猪胸膜及猪肠膜，洗净，小心除去多余组织和杂质，取坚实平整的膜体，洗净，用0.1～2％浓度的KOH溶液浸泡处理2小时。取出，用水漂洗三次以上，取出沥干水分，用有机溶剂抽取其中脂肪及脂溶性杂质。取出，除去溶剂后，用碳链环氧化物与之进行交联固定反应。取出，洗净，冷冻干燥，用乙酸酐或丁酸酐与之反应，封闭抗原基因；再用盐酸胍的Tris缓冲溶液处理，改变引起抗原的特异构象。取出洗净，冷冻干燥，用P₂O₅作脱水缩合剂将聚羟基乙酸的预聚体接枝到膜材的胶原分子上。用碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R)作偶联剂将由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的多肽或透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角质素偶合到上述膜材的胶原分子上，洗净，置于生理盐水中低温保存备用。半透膜2选用最薄渗透性最好的猪肠膜，外膜4选用较厚的猪、牛心包或猪隔膜。

三、生物型脊髓支架的制备：在设定直径的圆棒模具上，用医用胶将相应尺寸的半透膜2边边粘合形成圆管状体。另取上述任一膜裁成规定宽度的长片条，用医用胶将长片条按一定间距螺旋盘绕粘贴到软脊膜的管壁上，绕粘数层，形成有一定支撑力的螺旋骨架3，再用医用胶将外膜4粘合到螺旋骨架3的凸梁上，自身再边边粘合成圆管体。脱出圆棒模具，小心将制好的芯体材料充填到管心的圆柱腔内形成芯体1，必要时加少量医用蛋白胶作赋形剂。充填密度不宜太紧，也不宜太松，以适中为好，填好后冷冻干燥以定型，至此，生物型脊髓支架便整体制成。用生理盐水作保存液密封包装，用钴-60辐射灭菌，即得到产品。

Claims (10)

1.一种生物型脊髓支架，其特征在于：它由芯体(1)、包裹在芯体(1)外的半透膜(2)、固定在半透膜(2)上的螺旋骨架(3)以及包裹在螺旋骨架(3)上的外膜(4)组成，其中芯体(1)由通过非醛类固定剂交联固定和用活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物脊髓制成，半透膜(2)及外膜(4)分别由通过非醛类固定剂交联固定和用活泼试剂及强氢键试剂去除抗原处理的动物膜组织制成。

2.根据权利要求1所述的生物型脊髓支架，其特征在于：所述芯体(1)由通过偶联剂偶合多肽及糖胺聚糖类活性组分处理的动物脊髓制成，所述半透膜(2)及外膜(4)分别由通过偶联剂偶合多肽及糖胺聚糖类活性组分处理的动物膜组织制成，制成半透膜(2)及外膜(4)的动物膜组织还通过增韧改性处理。

3.根据权利要求2所述的生物型脊髓支架，其特征在于：所述的多肽之一是由16个赖氨酸(K16)、甘氨酸(G)、精氨酸(R)、天冬氨酸(D)、丝氨酸(S)、脯氨酸(P)及半胱氨酸(C)缩聚而成的，所述的糖胺聚糖是透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素或硫酸角质素。

4.根据权利要求1或2或3所述的生物型脊髓支架，其特征在于：所述的半透膜(2)为动物的肠膜或者其它经过机械薄化处理的动物膜组织；所述外膜(4)为动物心包膜、膈膜、脂肪网膜、胸膜、腹膜；所述螺旋骨架(3)由所述半透膜(2)或外膜(4)裁成的小长片条螺旋粘贴制成。

5.一种权利要求1所述的生物型脊髓支架的制备方法，其特征在于：它包括以下步骤：

a、选料：收集新鲜动物的脊髓以及膜组织并修剪去除多余杂质及不规整部分，得纯净髓质及坚实膜材；

b、碱处理：使用碱溶液浸泡髓质及膜材；

c、脱脂：使用有机溶剂抽提髓质及膜材中的脂肪及脂溶性杂质；

d、交联固定：使用非醛类固定剂交联固定髓质及膜材中的胶原蛋白分子；

e、去除抗原：使用活泼试剂封闭髓质及膜材蛋白质中引起抗原性的特异活性基团-OH，-NH₂，-SH，并用强氢键试剂置换基材蛋白质分子螺旋链中引起特异构象的特殊氢键；

f、成品制备：在棒状模具上，用医用胶将相应尺寸的半透膜(2)粘合成管状体；另取上述任一膜裁成规定宽度的长片条，按一定间距螺旋盘绕粘贴在半透膜(2)上，形成螺旋骨架(3)；再将外膜(4)粘合在螺旋骨架(3)的凸梁上形成管状体；取出模具，将制好的髓质小心充填中心空腔形成芯体(1)。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：它在e和f步骤之间还设有通过偶联剂偶联特定多肽或糖胺聚糖活性组分的处理步骤，即在所述髓质及膜材的表面上通过偶联剂偶联可粘附生长因子的多肽或糖胺聚糖活性组分。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：对于膜材它在e和f步骤之间还设有增韧改性的处理步骤，即使用缩合、引发或辐射接枝的方法，在所述膜材的胶原蛋白分子中适当接上聚氨酯、聚酰胺、聚酯、聚乳酸或聚羟乙酸链段。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的非醛类固定剂为易与蛋白质分子发生交联反应的环氧化物、二酰二胺、二异氰酸酯或碳化二亚胺试剂中的一种或两种，这里的环氧化物是单环氧化物

或者是双环氧化物

这里R＝C_nH_2n+1-，n＝0-10，或者是聚环氧丙烷。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的活泼试剂是小分子有机酸酐或酰氯或酰胺或环氧化物，强氢键试剂为胍类化合物。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述的偶联剂为二酰二胺、二酸酐、双环氧化物或者碳化二亚胺。