CN1982875A - 吸收介质的荧光光谱学 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于通过荧光测量检测样本中分析物的过程和设备。
Description
本发明涉及通过荧光测量检测样本中的分析物的过程和设备。
用于生化分析的测量过程和测量系统是生化分析的重要部分。通过检测荧光团发射的光可测定分析物。用于产生荧光所需的激发光的波长的最佳选择对于作出准确可靠的测定具有重要作用。
荧光团的激发峰常常位于紫外光谱范围(UV)内。因此,例如,NADH的最长波长激发峰是在340nm处。然而目前,对于这个光谱范围,甚至仅仅在UV附近范围,几乎没有任何廉价的、电池供电的光源。
目前,作为唯一廉价的、用于在UV范围激发的具有低功率消耗的窄波段光源,具有显著功率(>0.1mW)的发光二极管,工业上可以得到的只能低至365nm,因此,只能远离激发范围的最高值进行激发。除了伴随的荧光信号的损失,这还导致以下问题:由于激发发生在最长波长吸收峰的肩部,作为LED波长的函数,激发效率变化非常敏感。因此,例如,与在340nm处的激发相比,预期的NADH的信号变化为每nm-5%。为了确保技术信号例如1%的稳定,LED的波长相反地要必须保持0.2nm范围内的稳定,由于LED的功率波动、温度依赖性和老化,这只能以极端的复杂度完成。因此足够波长稳定的需要将仅容许间隔非常小的允许温度范围,或可替换地,必须在测量系统中并入有源温度控制,但由于制造成本和功率消耗这是不可行的。
US 4,547,465描述了包含多孔渗透带(porous zone)的用于分析或传输液体的测试元件,该多孔渗透带包含带有分散在其中的微粒材料例如色素的聚合物。然而,没有任何改善荧光测量精确度的迹象。
EP-A-0 066 648涉及用于测定液态介质中分析物的多层元件,该元件包含具有检测层和反应层的检测元件,该反应层包含纤维性、多孔渗透的可膨胀介质。该元件还可具有包含微粒色素的光保护层。然而,没有任何改善荧光测量精确度的迹象。
US 2002/0137027涉及用于利用镧系元素-配合基复合物测定通过氧化物酶产生的过氧化氢的过程。优选在330-415nm的波长处激发荧光以及在600-630nm处探测发射。
US 3,992,158描述了用于液体分析的测试元件。该测试元件可以包含一个或更多反射层,所述反射层包含例如像二氧化钛和硫酸钡的色素作为吸收体。这个反射层在空间上与包含检测试剂的测试元件层相分隔。仍没有任何改善荧光测量精确度的迹象。
本发明基于的目的是提供用于通过荧光测量检测分析物的过程,其至少部分地消除了上述现有技术的缺点。更具体地,提供测量信号对激发波长依赖性减小的过程。
依据本发明的解决方案将提供通过荧光团的荧光测量检测样本中分析物的过程或系统,其中包含荧光团或荧光团前驱物的检测介质与吸收体相混合,其中吸收体的吸收率频谱重叠荧光团的荧光激发范围。包含荧光团和产生于检测介质中的吸收体的系统具有改变了荧光激发峰的改变的有效荧光激发范围。用荧光激发光的照射可在这个改变了的激发峰范围内发生。从测定荧光发射获得的测量信号仅呈现对激发光波长很低的依赖性。由于激发光的波长改变,还可能进一步使用廉价的光源,例如UV LED。
在第一个方面,本发明涉及用于通过荧光测量检测样本中分析物的过程,包含以下步骤:
(a)提供检测介质,包含:
(i)至少部分样本,其中分析物将被测定,
(ii)适当时至少一种用于测定该分析物的试剂,
(iii)具有激发范围的荧光团,该激发范围在第一波长处具有至少一个激发峰,或荧光团前驱物,当存在样本和适当时的试剂(ii)时可由该荧光团前驱物产生荧光团;
(iv)吸收跨越荧光团(iii)的一部分激发范围的光的吸收体,导致系统有效激发范围改变,所述系统包含存在的或由前驱物产生的荧光团(iii),以及在第二波长处具有激发峰的吸收体(iv),该第二波长与第一波长不同,
(b)用光照射以在第二波长区域激发荧光团,
(c)在一个或更多合适的测量波长处测定荧光团的荧光发射以测定样本内分析物的存在、数量或活性。
在另一个方面中,本发明涉及用于检测分析物的测试元件,包含:
(i)具有激发范围的荧光团,该激发范围在第一波长处具有至少一个激发峰,或荧光团前驱物,当存在样本和适当时的试剂(iii)时可由其产生荧光团;
(ii)吸收跨越荧光团(i)的一部分激发范围的光的吸收体,
(iii)适当时至少一种用于测定分析物的试剂,
其中荧光团或荧光团前驱物(i)和吸收体(ii)以这样的方式设置在测试元件上,以致用于激发荧光团的入射光首先碰撞吸收体然后是荧光团,或者基本上在同一时间碰撞荧光团和吸收体,导致系统的有效激发峰改变,所述系统包含荧光团(i)以及具有第二波长的吸收体(ii),该第二波长与第一波长不同。
下面通过图1-6将更详细说明本发明。
图1示意性描述了作为波长λ的函数的水性溶液中NADH的激发和发射光谱。在波长210nm、260nm和340nm处有3个荧光激发峰,在460nm附近有可识别的发射峰。
图2描述了pH值为7.5的50mM Hepes缓冲剂(buffer)中的NADH荧光激发的激发-发射矩阵。用红色指示的区域对应于高荧光,蓝色指示的区域对应于低荧光。
图3描述了本发明的功能原理图。曲线1描述了无吸收体时荧光团的激发光谱。曲线2描述了吸收体的透射光谱,其与荧光团的激发范围重叠(superimpose)。曲线3是由于荧光团的激发范围和吸收体的透射光谱重叠产生的改变了的有效激发范围。
图4描述了包含荧光团NADH和吸收体TiO2(金红石,平均色素直径:300nm)的测试元件的激发-发射矩阵,类似于图2。如所示的,有效激发光谱的峰值在375nm波长范围内,对于该范围的LED可商业供应。有效激发光谱的幅度围绕激发峰值在相关波长范围内以低于每nm1%波动。
图5描述了使用不同吸收体(具有两个不同粒子大小的TiO2和ZrO2)时NADH的发射光谱。
图6描述了作为时间函数的NADH的荧光信号。这里检测层包含试剂和不同数量的ZrO2。在375nm波长处激发,发射的荧光用光敏二极管(BPW34)通过边缘滤波器(edge filter)(塑料合成滤波器KV418)观察。
依据本发明,术语“荧光团的激发峰”意谓波长,在该波长处包含该荧光团而无吸收体的系统呈现最大的荧光激发。术语“包含荧光团和吸收体的系统的激发峰”意谓波长,在该波长处包含荧光团和吸收体的系统呈现最大的荧光激发。术语“有效激发峰”意谓给定系统(仅有荧光团或荧光团和吸收体)的荧光激发所测量的最大值波长。依据本发明,使用包含荧光团和吸收体的系统,其呈现了被改变的“有效激发峰”,即与只有荧光团的激发峰相比发生偏移了的激发峰。这样激发峰偏移的例子在图3中示出。
依据本发明的过程和测试元件可用于例如在临床诊断领域内检测任何分析物。分析物可被定性和/或定量检测。优选定量检测分析物,即,由荧光测量来测定待测样本中分析物的数量、浓度或活性。
可用依据本发明的过程和测试元件测定的分析物是任何能用荧光测量检测的生物或化学物质。如果需要,除了荧光团或荧光团前驱物外,这里可以在过程或测试元件中使用合适的检测试剂。
优选地,分析物是可由一种或更多酶反应例如酶或酶底物(enzymesubstrate)测定的物质。分析物的优选例子是葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甘油脱氢酶、乙醇脱氢酶、α羟丁酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、葡萄糖、乳酸、马来酸、甘油、乙醇、胆固醇、甘油三酸酯、诸如LDL或HDL的脂蛋白、维生素C(ascorbic acid)、半胱氨酸、谷胱苷肽、肽、尿酸、尿素、铵、水杨酸盐、丙酮酸盐、5’-核苷酸酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和二氧化碳等。
当检测酶底物时,检测试剂优选包含一种或更多适合检测该底物的酶。合适的酶的例子是从以下选出的脱氢酶:葡萄糖脱氢酶(E.C.1.1.1.47)、乳酸脱氢酶(E.C.1.1.1.27,1.1.1.28)、苹果酸脱氢酶(E.C.1.1.1.37)、甘油脱氢酶(E.C.1.1.1.6)、乙醇脱氢酶(E.C.1.1.1.1)、α羟丁酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶或氨基酸脱氢酶,例如L-氨基酸脱氢酶(E.C.1.4.1.5)。其它合适的酶是氧化酶,诸如像葡萄糖氧化酶(E.C.1.1.3.4.)或胆固醇氧化酶(EC.1.1.3.6.)和氨基转移酶,诸如像天冬氨酸或丙氨酸氨基转移酶、5’-核苷酸酶或肌酸激酶。
特别优选检测葡萄糖,检测试剂特别包含葡萄糖脱氢酶。
当检测酶时,检测试剂优选包含一种或更多适合检测酶的底物。
检测试剂的另外组分可以是通常的缓冲剂、辅助物质或添加剂。
依据本发明的过程或系统使用的起始材料(starting material)可以是荧光团本身。代替地,可能使用当存在样本和检测试剂时可产生荧光团的荧光团前驱物,该荧光团的荧光随后被检测。
荧光团是被荧光激发光照射时产生可测量信号的物质,该信号定性地指示样本中分析物的存在或不存在,或者该信号与样本中分析物的数量、浓度或活性相关。例如,荧光团本身可以是待测分析物或可以由待测分析物产生。然而优选地,荧光团是作为酶反应的辅酶(co-enzyme)的物质,通过该酶反应测定分析物。优选的辅酶例子是烟碱氨基嘌呤二核苷酸(nicotin-adenine dinucleotide),诸如NADH或NADPH、黄素核苷酸等。
优选用作荧光团的物质,其在UV范围内具有至少一个激发峰,例如,诸如NADH或NADPH或其衍生物。合适作为荧光团的物质当然还可以是在可见的或近IR范围内有激发峰的物质。
优选用作荧光前驱物的物质,由其可产生荧光团,例如通过诸如氧化作用的化学反应。优选的荧光团前驱物是能够由其产生在UV范围内具有至少一个激发峰的荧光团的物质,例如,诸如NAD或NADP或其衍生物。
依据本发明,包含荧光团或荧光团前驱物以及适当时包含至少一种其它检测试剂的检测介质与吸收体混合,该吸收体在检测介质中对光照的吸收/透射特性在荧光团的激发范围内改变。优选使用在荧光团的一部分激发范围内吸收光以及对荧光团激发范围的另一部分光几乎透明的吸收体。
特别优选使用在荧光团的激发范围的较短波长部分内吸收光以及在激发范围的较长波长部分内几乎透明的吸收体。这导致荧光团的有效激发峰在存在吸收体时向较长波长偏移。激发峰优选在无吸收体时激发峰的基础上偏移至少10nm,尤其优选至少20nm以及更优选至少30nm。
在依据本发明的过程中优选在改变的有效激发峰范围内,例如在改变的有效激发范围的激发峰的波长周围±10nm范围内,特别是±5nm范围内用光照射以激发荧光团。这样,当使用NADH或NADPH作为荧光团时,例如,在优选360nm或更高发生荧光激发,特别是365-380nm的波长范围内。使用合适的光源,例如卤素灯、发光二极管或激光二极管实施荧光激发。优选发射波长范围370-390nm的光的发光或激光二极管。这样,有可能使用廉价光源用于荧光激发。
为了使荧光团的激发峰尽可能有效地偏移,有利地使用了吸收体,该吸收体改变入射光在检测介质中的相对透射,使所述相对透射基于所用检测介质内的最大透射(不存在吸收体时的透射)跨越荧光团的激发范围从不超过20%,优选不超过10%,到至少80%和优选至少90%。这里检测介质的相对透射优选在≤100nm、特别优选≤60nm以及最优选≤40nm的波长范围内改变。
合适的吸收体是吸收跨越荧光团激发范围的一部分的光且其存在不干扰检测过程的任何物质。
吸收体优选是具有直径≤1μm、优选≤500nm、特别优选200-400nm的微粒。微粒的大小优选至少为50nm。合适的吸收体材料的优选的例子为金属氧化物或诸如金属硫化物或金属硫酸盐的金属盐,特别是钛的氧化物,例如TiO、TiO2,锆的氧化物,例如ZrO2,锌的氧化物或硫化物,例如ZnO或ZnS,和钡盐,例如BaS或BaSO4,以及它们的任意组合。吸收体特别优选包含可以是例如金红石形式的TiO2。原理上,在防晒霜或其它配方中作为UV阻挡物使用的色素也适合于依据本发明的过程。
还可优选使用具有光散射特性的吸收体材料,以使荧光激发光在检测介质的区域内散射数次并增加了激发光在检测介质中的平均路径长度以获得更有效的激发。
通过改变吸收体材料、颗粒大小、晶体结构或/和纯度,特别是通过加入相对少量的其它吸收体,可能改变吸收光谱的位置和形状并从而也改变包含荧光团和吸收体的系统的激发范围的形状和位置。
荧光团或/和吸收体的适当选择使荧光团和吸收体的系统的有效激发范围的肩部斜率能够在所需波长处改变。因此可能,例如,通过使用ZrO2作为吸收体将吸收率肩部偏移至与TiO2相比较短的波长。这使荧光团和吸收体的有效激发光谱的幅度能够在所需波长处增加,不管怎样使这个点处肩部斜率进入容许范围是可能的。这样图5分别描述了使用TiO2和ZrO2的NADH的发射光谱。还可能通过改变吸收体最优化荧光输出和有效吸收率的肩部斜率。
荧光团的荧光发射可以通过使用技术人员公知的合适的检测系统以通常方法在一个或更多个合适的测量波长处测定。所述测定因此也可通过测量例如分析物的存在而导致的荧光猝灭来实施。
依据本发明的过程可显著地减少测量信号对荧光激发光波长的依赖。优选达到荧光激发波长的改变每nm≤1%的信号稳定性。
该过程可以液体分析的方式实施,对于荧光团或荧光团前驱物,适当时至少一种另外的试剂和吸收体以悬浮形式存在于含水的或非水的液体中或者作为粉末存在是可能的。优选以干式分析(dry assay)方式实施该过程,其中试剂被施加给测试元件。测试元件可包含例如,吸收剂或/和可膨胀材料的测试条或测试带,待测样本可被施加在该检测条或检测带上。可以从例如纤维素、塑料材料等组成的组中选择合适的材料。测试元件的其它优选的例子为集成测量系统,例如那些包含集成在测量设备内的采样元件(诸如针或刀(lancet))和适当时用于样本运输(sampletransport)的设备的测量系统。测试元件可以具有一个或更多包含测定试剂、吸收体和荧光团或荧光团前驱物的层。此处优选荧光团或荧光团前驱物和吸收体以这样的方式被布置在测试元件上,使得用于激发荧光团的入射光首先碰撞吸收体以及然后是荧光团,或同时碰撞所述的荧光团和吸收体。优选将荧光团或荧光团前驱物和吸收体布置在测试元件上的一个层内。EP-A-1035920描述了优选的测试条。EP-A-1424040描述了将测试元件设计为测试带即包含多个测试条的测试元件的优选例子,WO 03/009 759和WO 2004/107 970披露了集成测量系统的优选例子。可替换地,检测试剂也可被包埋在胶体基质(gel matrix)中(参见,例如,DE 102 21 845)。明确参考了上述文献的披露。特别优选的是,在施加样本之前,荧光团和吸收体一起存在于例如测试元件上的一个相或一个层中的过程。
待检测样本通常是液体样本,特别是例如血液、血浆、血清、唾液或尿的体液,特别优选测定血液中的葡萄糖。
本发明还涉及用于检测分析物的新型测试元件,其包含荧光团、吸收体和适当时的检测试剂,这些组分以这样的方式布置在测试元件上,使得用于激发荧光团的入射光首先碰撞吸收体然后是荧光团,或基本上同时碰撞吸收体和荧光团。优选以这样的方式设置所述组分,使得它们在施加样品前存在于测试元件的一个相内或一层内。
测试元件优选设计为测试条、检测带或集成测量系统的形式。它可被用于检测样本中分析物的过程,该过程包含步骤:
(a)将测试元件与样本接触,
(b)用光照射以在荧光团加吸收体的改变的有效激发峰范围内的波长区域中激发荧光团,和
(c)在合适的检测波长处测定荧光团的荧光发射以测定样本内分析物的存在和数量或活性。
还有另一个主题是,如上所述在测试元件中使用吸收体用于调整荧光团的荧光激发峰,特别是在测定样本中分析物的过程中。
Claims (23)
1.用于通过荧光测量检测样本中分析物的过程,包含以下步骤:
(a)提供检测介质,包含:
(i)至少部分样本,其中分析物将被测定,
(ii)适当时至少一种用于测定该分析物的试剂,
(iii)具有激发范围的荧光团,该激发范围在第一波长处具有至少一个激发峰,或荧光团前驱物,当存在样本和适当时的试剂(ii)时荧光团可由该荧光团前驱物产生荧光团;
(iv)吸收跨越荧光团(iii)的激发范围的一部分的光的吸收体,导致系统有效激发范围改变,所述系统包含荧光团(iii)、以及在第二波长处具有激发峰的吸收体(iv),该第二波长与第一波长不同,
(b)用光照射以在第二波长区域激发荧光团,
(c)在一个或更多合适的测量波长处测定荧光团的荧光发射以测定样本内分析物的存在、数量或活性。
2.依据权利要求1的过程,其中分析物是荧光团。
3.依据权利要求1的过程,其中分析物通过一个或更多酶反应测定,且荧光团或荧光团前驱物是这些酶反应之一的辅酶。
4.依据权利要求3的过程,其中分析物是酶或酶底物。
5.依据任一项前述权利要求的过程,其中分析物从以下物质组成的组中选出:葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、甘油脱氢酶、乙醇脱氢酶、α羟丁酸脱氢酶、山梨醇脱氢酶、氨基酸脱氢酶、葡萄糖、乳酸、马来酸、甘油、乙醇、胆固醇、甘油三酯、诸如LDL或HDL的脂蛋白、维生素C、半胱氨酸、谷光苷肽、肽、尿酸、尿素、铵、水杨酸盐、丙酮酸盐、5’-核苷酸酶、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)和二氧化碳。
6.依据任一项前述权利要求的过程,其中葡萄糖被测定。
7.依据权利要求6的过程,其中测定试剂包含葡萄糖脱氢酶。
8.依据任一项前述权利要求的过程,其中使用了在UV范围内具有激发峰的荧光团,例如NADH或NADPH,或相应荧光团前驱物,例如NAD或NADP。
9.依据任一项前述权利要求的过程,其中荧光团的激发峰在存在吸收体的情况下向较高波长偏移例如至少10nm,特别是至少20nm。
10.依据任一项前述权利要求的过程,其中荧光激发在360nm或更高区域的波长处发生,特别是从365-380nm。
11.依据任一项前述权利要求的过程,其中通过发光二极管或激光二极管产生光照。
12.依据任一项前述权利要求的过程,其中检测介质对于入射光的相对透射在最大透射的基础上跨越荧光团的激发范围改变从不多于20%到至少80%。
13.依据权利要求12的过程,其中相对透射在≤100nm,优选≤60nm以及特别优选≤40nm的波长范围内改变。
14.依据任一项前述权利要求的过程,其中吸收体是微粒且优选具有≤1μm、优选≤500nm和特别优选200-400nm的平均粒子直径。
15.依据任一项前述权利要求的过程,其中吸收体从金属氧化物和金属盐例如像硫化物或硫酸盐的组中选出,特别从TiO、TiO2、ZrO2、ZnS、BaS、BaSO4、ZnO和它们的任意组合中选出。
16.依据任一项前述权利要求的过程,其中吸收体还具有散射特性。
17.依据任一项前述权利要求的过程,其中使用例如血液、血浆、血清、唾液或尿样本的体液样本。
18.依据任一项前述权利要求的过程,其中荧光团和吸收体在施加样本前一起存在于一个相中。
19.依据任一项前述权利要求的过程,其以干式分析的形式在测试元件例如测试条或测试带或集成测量系统上实施。
20.用于检测分析物的测试元件,包含:
(i)具有激发范围的荧光团,该激发范围在第一波长处具有至少一个激发峰,或荧光团前驱物,当存在样本和适当时的试剂(iii)时可由其产生荧光团;
(ii)吸收跨越荧光团(i)的一部分激发范围的光的吸收体,
(iii)适当时至少一种用于测定分析物的试剂,
其中荧光团或荧光团前驱物(i)和吸收体(ii)以这样的方式设置在测试元件上,以致用于激发荧光团的入射光首先碰撞吸收体然后是荧光团,或者基本上在同一时间碰撞荧光团和吸收体,导致系统的有效激发峰改变,所述系统包含荧光团(i)和具有与第一波长不同的第二波长的吸收体(ii)。
21.依据权利要求20的测试元件,所述元件是检测条、检测带或集成测量系统的形式。
22.依据权利要求20或21的测试元件在用于测定样本中分析物的过程中的使用,包含以下步骤:
(a)使测试元件与样本接触,
(b)用光照射以在第二波长区域激发荧光团,和
(c)在合适的测量波长处测定荧光团的荧光发射以测定样本中分析物的存在、数量或活性。
23.吸收体在用于调整荧光团的吸收峰的检测元件中的使用,特别是在用于检测分析物的过程中的使用。
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