CN1973828A

CN1973828A - Vegf缓释注射微球支架及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN1973828A
Application number: CNA2006101181832A
Authority: CN
Inventors: 钟延强; 齐琰; 鲁莹; 史国兵; 樊莉; 邓莉
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2026-11-10
Also published as: CN100457187C

Abstract

本发明公开了一种VEGF缓释注射微球支架，其组成包括基质、VEGF、保护剂和碳酸氢铵，其特征在于所述基质为聚乳酸∶羟基乙酸＝25∶75－75∶25的聚乳酸－羟基乙酸共聚物；所述保护剂包括碳酸锌、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇；VEGF与聚乳酸－羟基乙酸共聚物的重量比例为1∶100000至1∶10，微球粒径在室温时为50μm至1000μm。其制备采用下列方法：w/o/w溶剂挥发法，或药物以微粉形式加入的w/o/w溶剂挥发法。本发明方法简便，易于操作，重现性好。蛋白质药物VEGF在微球支架中体外释放达4周以上，其释放近似符合零级动力学模式，可应用于各类组织血管缺损的修复与治疗中。

Description

VEGF缓释注射微球支架及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，是一种载蛋白质药物VEGF(血管内皮细胞生长因子vascular endothelial growth factor，VEGF)缓释注射微球支架及其制备方法和用途。

背景技术

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，能促进血管的增生、转移和分化出新的血管，同时由于VEGF可以增强血管通透性，故又称作血管通透因子。最早于1989年由Ferrara等从牛脑垂体滤泡星状细胞的条件培养基中提纯。重组人血管内皮生长因子(recombinant human vascular endothelial growth factor，rhVEGF)治疗缺血性疾病已经从广泛的临床前研究进入了临床试验阶段并可望于近期成为治疗性药物应用于临床。(N.Ferrara，K.Alitalo.Clinical applications of angiogenicgrowth factors and their inhibitors，[J].Nature Med.1999，5(12)：1359)。然而，与其他生长因子相似，VEGF由于半衰期短而导致体内降解速度过快(Jeffrey L.Cleland Ph.D，Eillen T.Puenas et al.Cuthbertson Development ofpoly-(D，L-Lactide-co-glycolide) microspheres fermulation containing recombinanthuman vascular endothelial growth factor to promote local angiogenesis[J].controlled Release 2001，72：13)，从而限制了它的临床应用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的上述不足，结合微球制备技术与组织工程支架技术的优点提供一种VEGF的缓释注射微球支架及其制备方法，蛋白药物VEGF可持续释药达4周，达到增加细胞存活率促进其生长从而增加新生血管的形成的作用，用于治疗局部缺血性疾病。

近年来生物可降解的高分子材料广泛应用于蛋白多肽类药物缓释微球的制备及组织工程技术，其中聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactide-co-glycolide)，PLGA]，由于其良好的生物相容性及生物降解性已被美国FDA批准为药用高分子材料使用。以PLGA作为微球基质，体内外降解实验证明，在药物释放过程中，整个聚合物骨架呈均匀性降解，随着分子量的下降，骨架材料的亲水性增强，由于水分的不断渗入使蛋白多肽类药物持续释放出来(Wang YM，Sato H，Horikoshi.In vitro and in vivo evalution of taxol release fromploy(lactic-co-glycotic acid)microspheres containing isopropyl myristate anddegradation of the microspheres.J Control Rel，1997，49：157)。本发明就是使用PLGA作为基质制备VEGF缓释微球支架。本发明以PLGA为基基本骨架，制备VEGF缓释注射微球支架，为具有多孔状的载蛋白质药物微球，一方面微球中的孔洞通过细胞培养种植相应细胞通过注射途径定位到组织缺损部位，另一方面微球中的VEGF可以以恒定的释药速率释放药物来刺激细胞生长分化形成新的组织。

本发明的VEGF缓释注射微球支架，其组成包括基质、VEGF、保护剂和碳酸氢铵，其特征在于所述基质为聚乳酸∶羟基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述保护剂包括碳酸锌、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇；VEGF与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比例为1∶100000至1∶10，微球粒径在室温时为50μm至1000μm。

本发明的VEGF缓释注射微球支架制备方法有两种：

1.w/o/w溶剂挥发法：采用w/o/w复乳化-溶剂挥发法制备微球

制备油相

将基质材料PLGA溶于有机溶剂二氯甲烷制成油相，浓度为30mg～300mg/ml；

制备内水相

取适量VEGF和保护剂以及碳酸氢铵溶于水形成内水相，碳酸氢铵浓度为2％-50％，VEGF浓度为1μg～1mg/ml，保护剂选自碳酸锌、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇等，其含量为1～5％；

制备微球

将内水相加入上述油相均质匀化(或超声)形成初乳，将初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中，机械搅拌充分匀化(搅拌速度为100～1800rpm)，室温下继续低速搅拌4小时(搅拌速度为100～300rpm)，洗涤，收集，冷冻干燥即可。

2.药物以微粉形式加入的w/o/w溶剂挥发法：

制备油相

制备内水相

取适量碳酸氢铵溶于水形成内水相，碳酸氢铵浓度为2％-50％；

制备VEGF微粉

将适量的聚乙二醇(PEG)和VEGF及保护剂(其比例为4∶1∶2)分散于水中，为冷冻干燥后，用二氯甲烷洗涤、离心，除去PEG，得到VEGF微粉，保护剂选自碳酸锌、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇等；

制备微球

将VEGF微粉及内水相加入油相，匀化分散乳化混匀形成初乳，将初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中，机械搅拌充分匀化(搅拌速度为100～1800rpm)，室温下继续低速搅拌4小时(搅拌速度为100～300rpm)，洗涤，收集，冷冻干燥即可。

本发明所用的基质材料PLGA，分子量为3000～40000，聚乳酸(PLA)∶羟基乙酸(PGA)为25∶75～75∶25，浓度为30mg～300mg/ml。均质匀化条件为：2000～10000rpm。

本发明中的微球支架采用了微球的常规制备方法与组织工程支架发泡法相结合，微球支架由血管内皮细胞生长因子，生物可降解基质和添加剂组成，制备成VEGF缓释注射微球支架，见图1。

本发明VEGF缓释微球经体外释放实验，缓释达4周以上，释放符合近似零级模式，可用于治疗局部缺血性疾病的治疗。

附图说明

图1为VEGF缓释注射微球支架，

图2为方法1制备的VEGF缓释注射微球体外累积释放～时间曲线图，

图3为方法2制备的VEGF缓释注射微球体外累积释放～时间曲线图。

具体实施方式

实施例1：w/o/w溶剂挥发法制备VEGF缓释微球支架

将PLGA(PLA∶PGA＝75∶25，Mw＝10,000)100mg溶于3.2ml二氯甲烷制成油相，VEGF3μg及碳酸氢铵100mg溶于1ml的重蒸馏水中(内含3％海藻糖、5％甘露醇)形成内水相，将其加入上述油相，均质匀化，形成w/o的初乳，将含0.1％PVA溶液120ml置于搅拌容器中，将初乳在搅拌(450rpm)下快速加入外水相中充分匀化，五分钟后，将转速下调至200rpm同时外水相加入30ml蒸馏水，室温下搅拌4小时，微球硬化后抽滤并洗涤，冷冻干燥。密封分装后辐照消毒即可。粒径500μm左右。

实施例2：药物以微粉形式加入的w/o/w溶剂挥发法制备VEGF缓释微球支架

将PEG(PEG6000)1.2mg和VEGF300μg及保护剂(碳酸锌600μg)分散于1ml重蒸馏水中，旋涡混合3分钟左右，分装，冷冻干燥后，用二氯甲烷洗涤、离心，除去PEG，得到VEGF微粉。将PLGA(PLA∶PGA＝75∶25，Mw＝10000)100mg溶于3.2ml二氯甲烷制成油相，碳酸氢铵100mg溶于1ml的重蒸馏水中(内含3％海藻糖、5％甘露醇)形成内水相，将其加入上述油相，均质匀化三分钟后，加入微粉化的药物再低速匀化一分钟，形成w/o的初乳，将含0.1％PVA溶液120ml置于搅拌容器中，将初乳在搅拌(450rpm)下快速加入外水相中充分匀化，五分钟后，将转速下调至200rpm同时外水相加入30ml蒸馏水，室温下搅拌4小时，微球硬化后抽滤并洗涤，冷冻干燥。密封分装后辐照消毒即可。粒径500μm左右。

实施例3：VEGF缓释微球经体外释放实验

仪器：0508-2型台式低速离心机(上海医疗器械有限公司)；XW-80型旋涡混合器(上海第一医学院仪器厂)CARY 100紫外分光光度仪(美国varian公司)；CS501型超级恒温水浴(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)，FA1004型万分之一电子天平(上海天平仪器厂)；

方法及操作：精密称取含药微球或空白微球约20mg置于7ml离心管中，加入1.5ml 10mM pH 7.2磷酸盐缓冲液(含0.02％叠氮化钠作为抑菌剂，0.02％F-68作为润湿剂)，置于37℃恒温水浴摇床中，振荡速度100rpm。分别在1天、3天取出离心管，置于离心机2000rpm离心5min，将释放介质小心吸出2mL并更换等量新的释放介质，以后每隔3-4天以上方法取样一次，以空白微球的释放上清液作为空白对照，按BCA试剂盒要求进行加样，反应显色后于562nm处测得其吸光度，代入标准曲线，计算求得释放液中BSA的含量。

(1)方法1制备的VEGF缓释微球支架

结果见图2。试验表明，蛋白质药物在微球支架中体外释放达4周以上，其释放近似符合零级动力学模式。

(2)方法2制备的VEGF缓释微球支架

结果见图3。试验表明，蛋白质药物在微球支架中体外释放达4周以上，其释放近似符合零级动力学模式。

本发明涉及医药技术领域与组织工程学相关技术领域，是一种组织工程用聚合物微球支架的制备方法及其包裹蛋白药物应用上的创新。本发明的新颖性在于，改变了传统支架需手术植入体内的传统观念，应用注射剂型减小了传统支架需手术植入的不便，增加了病人的顺应性。在微球支架中加入促细胞生长的生长因子类蛋白质药物，使之在注射后缓慢释放，从而达到增加细胞成活率、促进细胞生长的作用，促进细胞生长繁殖并在体内组织缺损部位形成新鲜组织，。本发明方法简便，易于操作，重现性好。蛋白质药物在微球支架中体外释放达4周以上，其释放近似符合零级动力学模式。本发明的VEGF缓释注射微球支架可应用于各类组织血管缺损的修复与治疗。

Claims

1.一种VEGF缓释注射微球支架，其组成包括基质、VEGF、保护剂和碳酸氢铵，其特征在于所述基质为聚乳酸∶羟基乙酸＝25∶75-75∶25的聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述保护剂包括碳酸锌、血清白蛋白、海藻糖和甘露醇；VEGF与聚乳酸-羟基乙酸共聚物的重量比例为1∶100000至1∶10，微球粒径在室温时为50μm至1000μm。

2.根据权利要求1所述的一种VEGF缓释注射微球支架，其特征在于其制备采用下列方法：

方法1：w/o/w溶剂挥发法，或

方法2：药物以微粉形式加入的w/o/w溶剂挥发法，

具体步骤如下：

方法1：将基质溶于有机溶剂制成油相，浓度为30mg-300mg/ml；取VEGF、保护剂以及发泡剂碳酸氢铵溶于水中形成内水相，其中碳酸氢铵浓度为2％-50％，VEGF浓度为1μg～1mg/ml，保护剂含量为1～5％；将内水相加入上述油相，均质乳化形成初乳，将初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇水溶液中，机械搅拌充分匀化(搅拌速度为100～1800rpm)，室温下继续低速搅拌4小时(搅拌速度为100～300rpm)，洗涤，收集，冷冻干燥即得经W/O/W溶剂挥发法制备的VEGF缓释注射微球支架；

方法2：将基质溶于有机溶剂制成油相，浓度为30mg-300mg/ml，取适量发泡剂碳酸氢铵溶于水中形成内水相，碳酸氢铵浓度为2％-50％；将聚乙二醇(PEG)、VEGF及保护剂(其比例为4∶1∶2)分散于水中，冷冻干燥后，用二氯甲烷洗涤、离心，除去PEG，得到VEGF微粉；将内水相加入油相，水油相混合匀化几分钟后，加入经过冷冻干燥处理得到的VEGF微粉，匀化分散乳化混匀形成初乳，将初乳迅速滴加在0.01-6％聚乙烯醇(PVA)水溶液中，机械搅拌充分匀化(搅拌速度为100～1800rpm)，室温下继续低速搅拌4小时(搅拌速度为100～300rpm)，洗涤，收集，冷冻干燥即得药物以微粉形式加入的w/o/w溶剂挥发法制备的VEGF缓释注射微球支架。

3.根据权利要求1或2所述的一种VEGF缓释注射微球支架在各类组织血管缺损的修复与治疗中的应用。