CN1966517A - 蚯蚓蛋白ep－2及其分离方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蚯蚓蛋白EP－2及其方法和应用。本发明公开的蚯蚓蛋白EP－2是以新鲜赤子爱胜蚓为原料，经水性缓冲液匀浆提取，沉淀剂沉淀分离，弱阴离子交换树脂纯化后获得的一组蛋白混合物，其中含蛋白F－I－0、F－I－1以及纤溶酶组分A为30％－40％。本发明蚯蚓蛋白EP－2具有显著的抗哮喘作用，是一种具有药用价值的活性蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及中药活性成分及提取分离技术领域，具体涉及具有平喘作用的蚯蚓蛋白EP-2及其分离方法和应用。
背景技术
蚯蚓药名称为地龙，药用首载《诗经》，《神农本草经》列为下品。中药地龙具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，是一种常用动物药材。中国药典2005年版收载的地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretimaaspergillum(E.Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulagris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelm(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectiniferaMichaelsen的干燥体。除药典收载品种外：湖北环毛蚓P.hupeiensis、直隶环毛蚓P.tschiliensis、异毛环毛蚓P.diffringens、白颈环毛蚓P.californica、背暗异唇蚓Allolobophora caliginosa trapezoides、赤子爱胜蚓Eiseniafoetida等品种也具有潜在的药用价值。其中赤子爱胜蚓为正蚓科，现已有大量繁殖。但到目前为止，对于蚯蚓具有药效的活性成份蛋白未见有分离及作用机理的研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过对赤子爱胜蚓粗蛋白按离子强度进行分级，然后进行药效学筛选，找出有效部位，提供一种具有药用价值的活性蛋白组分。
本发明公开的蚯蚓蛋白EP-2是以新鲜赤子爱胜蚓为原料，经水性缓冲液匀浆提取，沉淀剂沉淀分离，弱阴离子交换树脂纯化后获得的一组蛋白混合物，其中含蛋白F-I-0、F-I-1以及纤溶酶组分A为30％-40％。
本发明所要解决的另一技术问题是公开上述蚯蚓蛋白EP-2的提取分离方法。
本发明公开的蚯蚓蛋白EP-2的提取分离方法包括下列步骤：
1.粗蛋白液的制备
取新鲜赤子爱胜蚓用水性缓冲液制成匀浆，经冷冻高速离心，取上清液，在0-10℃低温条件下加入沉淀剂，搅拌均匀，放置过夜；经冷冻高速离心，取沉淀，用水性缓冲液溶解，或用水性缓冲液溶解，透析除盐，即得赤子爱胜蚓粗蛋白液EP；
2.粗蛋白的纯化
取上述粗蛋白液，冷冻高速离心，上弱阴离子交换树脂柱，用NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，透析除盐，溶液冷冻干燥后，得到淡黄色粉末，即为赤子爱胜蚓蛋白EP-2。
本发明所述的水性缓冲液选自水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和氯化钠溶液。
本发明所述的沉淀剂是65-100％(v/v)乙醇溶液、丙酮或硫酸铵。
本发明所述的弱阴离子交换树脂是DEAE Sepharose Fast Flow，DEAESepharose CL-6B，DEAE Sepharose A-50或DEAE Bio-Gel A。
本发明所述NaCl溶液是指浓度为5mM-500mM的氯化钠水溶液。
对用本发明方法获得的蚯蚓蛋白EP-2采用双向凝胶电泳进行分析，结果见图1。
对用本发明方法获得的赤子爱胜蚓蛋白EP-2进行肽指纹图谱分析及串级质谱分析，证明其中含有的蛋白F-I-0、F-I-1以及纤溶酶组分A为丝氨酸蛋白酶类胰蛋白酶家族成员，占总量30％-40％。
本发明所要解决的再一技术问题是公开上述蚯蚓蛋白EP-2在制备抗哮喘药物中的应用。
本发明从赤子爱胜蚓中提取的蚯蚓蛋白EP-2能明显拮抗白三烯收缩离体豚鼠气管平滑肌的作用，口含吞服后可明显抑制致敏豚鼠抗原攻击引起的哮喘反应。因此本发明蚯蚓蛋白EP-2可作为活性成分与药用辅料制成抗哮喘的药物，其剂型可包括各类医学上可接受的药物剂型。
赤子爱胜蚓提取物的药效学筛选：
蛋白质的提取与制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽有了不少改进，但其主要原理仍不外乎两个方面：一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态分为差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等方法；按电荷差异分为电泳、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。本发明利用溶解度不同制备赤子爱胜蚓粗蛋白，采用经典的整体动物模型—致敏豚鼠抗原攻击引起的哮喘模型对赤子爱胜蚓组织粗提取物和粗蛋白进行了筛选，结果发现赤子爱胜蚓粗蛋白10g生药/kg口含吞服或5g生药/kg肌肉注射能明显抑制致敏豚鼠抗原攻击后引起的RL增高和Cdyn下降，表明其能明显抑制致敏豚鼠抗原攻击引起的哮喘反应。而赤子爱胜蚓组织粗提物10g生药/kg口含吞服则无明显作用。
实验方法：取致敏豚鼠，♀
各半，随机分组，分别以受试药物赤子爱胜蚓组织粗提物或粗蛋白10.0g生药/kg、硫酸沙丁胺醇5.0mg/kg或模型组生理盐水4.0ml/kg，口含后吞服。另一组粗蛋白5.0g生药/kg肌肉注射，均于抗原攻击前1小时给药1次。观察受试药物对致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响，实验结果见表1和表2。
表1赤子爱胜蚓提取物对致敏豚鼠抗原攻击后气道阻力(RL)的影响
| 组别 | n | 1％卵白蛋白(抗原)攻击后的气道阻力RL增加％( x±sD) | |||||||||
| 1min | 2min | 3min | 4min | 5min | 10min | 15min | 20min | 25min | 30min | ||
| 模型组(生理盐水)组织粗取物(E)10g生药/kg粗蛋白(EP)10g生药/kg粗蛋白(EP)5g生药/kg(im)沙丁胺醇5mg/kg | 88944 | 91.7±56.679.5±57.935.3±8.2325.8±3.64-1.05±15.9* | 87.1±55.266.5±42.733.8±10.0*25.0±4.77*-7.04±17.6* | 74.5±50.258.7±33.832.4±9.39*25.4±8.24*-2.05±19.0* | 74.6±59.453.8±30.631.3±11.220.8±7.68*-2.98±26.4* | 72.5±66.455.0±32.428.9±11.220.4±6.84*0.71±26.4* | 59.8±57.533.4±12.125.7±14.416.6±1.86-0.12±26.4* | 41.1±30.630.7±15.723.9±16.415.9±2.813.29±17.9* | 29.0±20.231.0±17.222.1±16.115.3±1.26-1.45±11.5 | 22.8±11.332.2±19.222.2±17.714.3±0.55-10.0±27.7 | 22.2±19.926.0±18.721.4±17.512.3±1.67-9.45±19.0 |
注：统计学方法：Mann-Whitney Rank Sum Test，与模型组比较*P＜0.05；im：肌肉注射，其余均采用口含后吞服方式给药
表2 赤子爱胜蚓提取物对致敏豚鼠抗原攻击后动态肺顺应件(Cdyn)的影响
| 组别 | n | 1％卵白蛋白(抗原)攻击后的动态肺顺应性降低％( x±SD) | |||||||||
| 1min | 2min | 3min | 4min | 5min | 10min | 15min | 20min | 25min | 30min | ||
| 模型组(生理盐水)组织粗取物(E)10g生药/kg粗蛋白(EP)10g生药/kg粗蛋白(EP)5g生药/kg(im)沙丁胺醇5mg/kg | 88944 | 49.7±19.559.9±14.628.5±17.5*25.8±3.88*14.2±10.9* | 50.1±15.156.8±17.828.4±16.3*20.3±6.62*13.7±5.55* | 44.7±16.052.7±14.426.6±18.4*19.7±10.1*12.2±9.03* | 43.8±13.449.9±15.126.3±15.6*16.7±10.7*15.5±12.8* | 46.1±15.048.5±15.822.2±15.5*19.5±7.55*16.2±10.6* | 34.5±11.835.0±16.217.3±14.0*16.0±5.6114.6±10.0* | 28.1±14.633.8±21.516.9±15.216.1±4.297.62±6.78* | 22.9±13.832.0±17.917.2±15.516.0±4.279.65±5.59 | 21.2±15.629.1±15.914.6±12.715.5±5.457.24±5.48 | 18.1±14.427.1±16.213.0±10.514.9±5.567.12±4.64 |
注：统计学方法：Mann-Whitney Rank Sum Test，与模型组比较*P＜0.05；im：肌肉注射，其余均采用口含后吞服方式给药
从表中数据可看出，模型组在抗原攻击后1-5分钟内RL明显增高，Cdyn值明显下降，抗击后1分钟达到最高峰，RL值与攻击前基线值比较增加92±56％，Cdyn值下降49±20％。蚯蚓粗蛋白10g生药/kg口含后吞服能明显抑制RL增高和Cdyn下降，抗原攻击后1分钟RL最高峰值与攻击前基线值比较增加35±8％，Cdyn值下降28±17％；与模型组比较分别抑制62％和43％。蚯蚓组织粗提物10g生药/kg口含后吞服不能抑制RL增高和Cdyn下降，与模型组比较无明显差异。阳性对照药沙丁胺醇5mg/kg完全抑制RL增高和Cdyn下降，与模型组比较差异非常显著。蚯蚓粗蛋白5g生药/kg肌肉注射也能明显抑制RL增高和Cdyn下降，抗原攻击后1分钟RL最高峰值与攻击前基线值比较增加26±4％，Cdyn值下降26±4％；与模型组比较分别抑制73％和47％。
用含本发明方法制得的赤子爱胜蚓蛋白EP-2进行有关药效学研究，结果如下：
1.对白三烯(LTD4)收缩离体豚鼠气管平滑肌的影响
先用氨甲酰胆碱(CCH)1×10-6M收缩气道平滑肌以检验平滑肌制备的活性，洗3遍，待回到基线后再次加入氨甲酰胆碱(CCH)1×10-6M收缩平滑肌，洗3遍，待回到基线后加入消炎痛(indomethacin)5×10-6M(避免孵育在克-亨氏液的气管平滑肌产生环氧酶产物)和L-半胱氨酸盐酸盐(L-Cysteine盐酸盐)3×10-3M(避免LTD4快速降解)，5分钟后加入受试样品1×10-7g/L或孟鲁司特1×10-7M，最后加入LTD41×10-7M。计算公式：LTD41×10-7M收缩％(以CCH1×10-6M收缩高度为100％)＝LTD41×10-7M收缩幅度/CCH1×10-6M收缩幅度×100％，实验结果见表3。
表3赤子爱胜蚓蛋白EP-2对LTD4收缩离体豚鼠气管平滑肌的影响
| 组别 | 受试药物(％) | |
| 对照品 | 赤子爱胜蚓蛋白 | |
| 123456平均值 | 68.6507679.356.858.864.9 | 34.838.244.732.229.822.633.9* |
从表中数据看出，与对照组相比，赤子爱胜蚓蛋白EP-2(1×10-7g/L)对LTD4(10-7mol/L)引起的离体豚鼠气管平滑肌收缩反应有明显的拮抗作用(P＜0.001)，对LTD4的抑制率为43.9％。
2.对致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响
实验方法：取致敏豚鼠，♀
各半，随机分组，分别以受试药物赤子爱胜蚓蛋白EP-2 10.0mg/kg、孟鲁司特10mg/kg或模型组生理盐水4.0ml/kg，口含后吞服给药1次。观察赤子爱胜蚓蛋白EP-2对致敏豚鼠抗原攻击后肺功能的影响，实验结果见表4和表5。
表4赤子爱胜蚓蛋白EP-2对致敏豚鼠抗原攻击后气道阻力(RL)的影响
| 组别 | n | 1％卵白蛋白(抗原)攻击后的气道阻力RL增加％( x±SD) | |||||||||
| 1min | 2min | 3min | 4min | 5min | 10min | 15min | 20min | 25min | 30min | ||
| 模型组蛋白EP-210mg/kg孟鲁司特10mg/kg | 141210 | 59.9±21.229.5±30.6**23.2±12.5*** | 59.2±18.434.3±34.2*18.6±15.5*** | 61.8±20.329.8±28.3**18.5±11.6*** | 60.4±21.435.1±30.3*17.7±11.0*** | 57.5±22.728.9±21.7**13.0±11.9*** | 52.3±29.425.6±20.0**10.6±10.6*** | 47.6±23.727.6±23.5*8.93±9.63*** | 49.8±23.432.5±18.9*9.33±10.4*** | 49.2±24.528.5±18.6*7.25±15.7*** | 50.3±29.726.7±20.3*7.55±8.05*** |
统计学方法：T-Test或Mann-Whitney Test，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；均采用口含后吞服方式给药，模型组给予生理盐水
表5赤子爱胜蚓蛋白EP-2对致敏豚鼠抗原攻击后动态肺顺应性(Cdyn)的影响
| 组别 | n | 1％卵白蛋白(抗原)攻击后的动态肺顺应性降低％( x±SD) | |||||||||
| 1min | 2min | 3min | 4min | 5min | 10min | 15min | 20min | 25min | 30min | ||
| 模型组蛋白EP-210mg/kg孟鲁司特10mg/kg | 141210 | 42.3±9.925.6±16.3**31.0±9.7** | 39.6±10.828.9±15.0*31.6±12.9 | 42.7±10.326.6±13.8**32.5±12.5* | 41.3±10.026.1±16.7**32.6±8.8* | 38.4±11.027.6±13.3*28.6±9.9* | 34.8±8.221.6±18.2*20.3±7.3*** | 29.0±9.922.2±13.717.8±10.5** | 29.6±11.125.3±12.916.6±9.3** | 29.7±11.424.0±13.413.0±13.0** | 27.8±14.618.2±14.411.1±12.5** |
统计学方法：T-Test或Mann-Whitney Test，与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；均采用口含后吞服方式给药
从表中数据看出，模型组在抗原攻击后1-5分钟内RL明显增高，Cdyn值明显下降，抗原攻击后3分钟达到最高峰，RL值与攻击前基线值比较增加61.8±20.3％，Cdyn值下降42.7±10.3％。抗原攻击后1-5分钟(5个测定点的值)的平均值，与攻击前基线值比较RL值增加60±2％，Cdyn值下降41±2％。抗原攻击后1-30分钟(10个测定点的值)的平均值，与攻击前基线值比较RL值增加55±5％，Cdyn值下降36±6％。蛋白EP-2(10mg/kg)口含后吞服，抗原攻击后1-5分钟(5个测定点的值)的平均值，与攻击前基线值比较RL值增加32±3％，Cdyn值下降27±1％。抗原攻击后1-30分钟(10个测定点的值)的平均值，与攻击前基线值比较RL值增加30±3％，Cdyn值下降25±3％。孟鲁司特(10mg/kg)灌胃给药，抗原攻击后1-5分钟(5个测定点的值)的平均值，与攻击前基线值比较RL值增加18±4％，Cdyn值下降31±6％。抗原攻击后1-30分钟(10个测定点的值)的平均值，与攻击前基线值比较RL值增加13±6％，Cdyn值下降24±8％。
结论：在整体试验中，赤子爱胜蚓蛋白EP-2口含吞服后可明显抑制致敏豚鼠抗原攻击引起的哮喘反应，实验初步证明赤子爱胜蚓蛋白EP-2可能是白三烯拮抗剂，作用靶点可能通过拮抗白三烯受体。
本发明公开的赤子爱胜蚓蛋白EP-2，抗哮喘作用显著，提供了一种具有药用价值的活性蛋白。
附图说明
图1赤子爱胜蚓蛋白EP-2的双向凝胶电泳图谱
具体实施方式
实施例1
(1)赤子爱胜蚓粗蛋白液的制备
取新鲜蚯蚓放入水中反复清洗，排尽其消化道污物，洗净，称重，加入2倍量的20mM、PH值为6.8的磷酸盐缓冲液，组织搅碎机中捣碎，制成匀浆，室温抽提4-6小时，4℃高速离心20分钟，取上清液，在4℃下，缓慢加入研磨好的硫酸铵固体，边加边搅拌，使硫酸铵的饱和度达到80％，4℃放置过夜，4℃高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀用20mM、PH值为6.8的磷酸盐缓冲液悬浮，分子量3500透析袋中对20mM、PH值为6.8的磷酸盐缓冲液透析48小时，中间换液4-5次，所得蛋白液4℃高速离心20分钟，上清液为蚯蚓粗蛋白液。
(2)赤子爱胜蚓粗蛋白的纯化
取赤子爱胜蚓粗蛋白液，4℃高速离心20分钟，上DEAE SepharoseFF弱阴离子交换树脂柱，依次用150mM NaCl、300mM NaCl洗脱，收集300mMNaCl的洗脱液，透析除盐，溶液冷冻干燥后，得到淡黄色粉末，即为赤子爱胜蚓蛋白EP-2。
实施例2
(1)赤子爱胜蚓粗蛋白液的制备
取新鲜蚯蚓放入水中反复清洗，排尽其消化道污物，洗净，称重，加入3倍量的水，组织搅碎机中捣碎，制成匀浆，室温抽提4-6小时，4℃高速离心20分钟，取上清液，在4℃下，缓慢加入等量丙酮，搅拌均匀，4℃放置过夜，4℃高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀用水悬浮，4℃高速离心20分钟，上清液为蚯蚓粗蛋白液。
(2)赤子爱胜蚓粗蛋白的纯化
取赤子爱胜蚓粗蛋白液，4℃高速离心20分钟，上DEAE SepharoseCL-6B弱阴离子交换树脂柱，300mM NaCl洗脱，收集洗脱液，透析除盐，溶液冷冻干燥后，得到淡黄色粉末，即为赤子爱胜蚓蛋白EP-2。
实施例3
(1)赤子爱胜蚓粗蛋白液的制备
取新鲜蚯蚓放入水中反复清洗，排尽其消化道污物，洗净，称重，加入1倍量的氯化钠溶液，组织搅碎机中捣碎，制成匀浆，室温抽提4-6小时，4℃高速离心20分钟，取上清液，在4℃下，缓慢加入等量95％乙醇，搅拌均匀，4℃放置过夜，4℃高速离心10分钟，取沉淀，将沉淀用水悬浮，4℃高速离心20分钟，上清液为蚯蚓粗蛋白液。
(2)赤子爱胜蚓粗蛋白的纯化
取赤子爱胜蚓粗蛋白液，4℃高速离心20分钟，上DEAE SepharoseA-50阴离子交换树脂柱，200mM NaCl洗脱，收集洗脱液，透析除盐，溶液冷冻干燥后，得到淡黄色粉末，即为赤子爱胜蚓蛋白EP-2。
实施例4赤子爱胜蚓蛋白EP-2的肽指纹图谱分析及串级质谱分析
(1)赤子爱胜蚓蛋白EP-2的双向凝胶电泳
将3mg总蛋白溶于150μl纯水中，加入1mM PMSF，离心后，取上清液到Millipore YM-3型超滤管中，在7500G 4℃离心1h(超滤法除去样品中少量的盐)，待溶液为15-20μl后，以高速离心将蛋白液离心到新的样品管中。将80μg总蛋白质与重泡涨液[尿素(9mol/L)+CHAPS(4％)+DTT(0.5％)+PMFS(0.14％)+两性电解质(0.5％)+痕量溴酚蓝]混合，总体积125μl，加入IPG持胶槽中，IPG干胶条(70mm×3mm×0.5mm，非线性，PH3-10)胶面朝下放入持胶槽中，其上覆盖一层矿物油以防样品液蒸发，加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上，20℃下泡涨12h以上。等点聚焦条件设置：①梯度升压250V/30min；②梯度升压1000V/h；③快速升压4000V/h，并保持聚焦8h。等电聚焦结束后，胶条在平衡液A[Tris(50mmol/L，PH6.8)，尿素(6mol/L)，甘油(30％)，SDS(2％)，DTT(1％)]中平衡10min，于平衡液B[Tris(50mmol/L，PH6.8)，尿素(6mol/L)，甘油(30％)，SDS(2％)，碘乙酰胺(2.5％)]中平衡10min，然后将胶条移至分离胶(12.5％)上端，琼脂糖(0.5％)封胶。以恒电流方式，20mA/胶电泳至蛋白转至分离胶后，换用30mA/胶，直至溴酚蓝前沿迁移至距凝胶底边1cm处停止电泳。采用快速银染法染色。双向凝胶电泳图谱见图1。
(2)图像采集分析
染色后的凝胶用凝胶扫描仪透射扫描，得到的数字化图像，用Imagemaster 2D软件进行分析。图像分析过程包括图谱的剪切、蛋白质点的检测、分析丰度。
(3)蛋白质胶内酶解
将蛋白点用Ettan切胶仪(Amersham Pharmacia，直径Φ＝1.4mm的切割头)切胶，置于96孔板中。在含有胶粒的每个孔中加入200μl脱色液(由100mM硫代硫酸钠和30mM铁氰化钾溶液按照1∶1混合而成)，静置30分钟后，弃去上清液。然后加200μl水清洗，静置30分钟后弃上清液，并重复该步骤直至胶粒变为无色。在胶粒中加入200μl乙腈静置30分钟后，弃上清液。重复该步骤至凝胶完全脱水变白。将乙腈吸出舍弃后，将胶粒置于37℃使完全干燥。测序级的胰蛋白酶酶液用20mM碳酸氢铵溶液配制为浓度12.5ng/μl后，加入适量酶液于胶粒中，并于4℃放置30分钟使胶粒完全泡胀。然后吸出多余的酶液弃去，以防止质谱检测时出现过多的胰蛋白酶自身降解的肽段。加约5μl 25mM碳酸氢铵溶液覆盖胶粒以防止溶液在酶解过程中干涸。置于37℃控温箱内保温12-16小时。酶解后的胶粒用60μl0.1％三氟乙酸/50％乙腈提取3次，每次20分钟。合并提取液。在氮气流中将溶液吹干以进行后续的MALDI-TOF-MS鉴定。
(4)肽混合物的质谱鉴定
将完全干燥的肽段重新溶解于0.7μl 0.5g/lCHCA溶液(溶剂，0.1％三氟乙酸+50％α-羟基肉桂酸)中，并将其全部点到不锈钢MALDI靶板上，并在室温下自然干燥。冻干样品管中加10μl0.5％三氟乙酸溶液，混匀后取1μl做MALDI-TOF-MS肽指纹图谱分析。样品用4700串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，激光源为355nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为20kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。PMF质量扫描范围为700-3500Da，且强度最大的5个峰进行串级质谱分析；PMF谱图用两个trypsin自降解的峰m/z 842.510和m/z 2211.105进行内标校正。所得结果用NCBInr进行数据库检索。搜索参数设置：数据库为NCBInr；检索种属为Metazoa(animals)；数据检索的方式为combined；最大允许漏切位点为1；酶为胰蛋白酶。质量误差范围设置：PMF 0.3Da，MS/MS0.4Da；设置的可变修饰为carbamidomethylation(半胱氨酸)和氧化(甲硫氨酸)。在数据库检索时胰酶自降解峰和污染物质的峰都手工剔除。质谱分析及蛋白质数据库同源性检索的实验结果见表6。
表6 质谱分析及蛋白质数据库同源性检索结果
| 凝胶点 | 蛋白质含量(％) | 蛋白质库文献编号 | 蛋白质分子量 | 蛋白质等电点 | 蛋白质得分 | 蛋白质匹配结果描述 |
| 918871713019102928202122146251612 | 8.337.767.06.465.405.375.104.604.013.943.933.663.242.792.522.472.401.521.13 | gi|627108gi|627108gi|627108gi|543530gi|627108gi|24653495gi|1363181gi|627108gi|24211029gi|6690788gi|36031059gi|6978605gi|27807301gi|17019507gi|7513796gi|543530gi|3098266gi|21666362gi|45552597 | 2482.22482.22482.22508.32482.2588630.25417.92482.2409542.2594226.9363890.531471.2169830.8490174.77889.22508.3143011.924791.840864.8 | 6.756.756.756.896.756.0510.016.7510.456.1410.625.926.326.296.786.896.74.699.86 | 1561251181161281156014213680818412594651069213179 | (EC3-4.21-)F-I-1-earthworm(Lumbricus rubellus)(EC3.4.21-)F-I-1-earthworm(Lumbricus rubellus)(EC3.4.21-)F-I-1-earthworm(Lumbricus rubellus)(EC3.4.21-)F-I-0-earthworm(Lumbricus rubellus)(EC3.4.21-)F-I-1-earthworm(Lumbricus rubellus)CG18076-PC[Drosophila melanogaster]laminin alpha chain-mouse(fragment)(EC3.4.21-)F-I-1-earthworm(Lumbricus rubellus)Asp(abnormal splindle)-like，microcephaly associatedShort stop/Kakapo long isoform[Drosophila melanogaster]Calmodulin binding protein 1[Mus musculus]Caspase3(ICE-like cysteine protease)；CPP32betaKIAA0373 homolog[Bos taurus]Dynein heavy chain isotype 1B[Tripneustes gratilla]protein-tyrosine kinase-mouse(fragment)(EC3.4.21-)F-I-0-earthworm(Lumbricus rubellus)Mitosis-specific chromosome segregation protein SMC1Fibrinolytic enzyme component A[Eisenia fetida]CG13168-PB[Drosophila melanogaster] |
Claims (7)
1、一种蚯蚓蛋白EP-2，其特征在于该蛋白是以新鲜赤子爱胜蚓为原料，经水性缓冲液匀浆提取，沉淀剂沉淀分离，弱阴离子交换树脂纯化后获得的一组蛋白混合物，其中含蛋白F-I-0、F-I-1以及纤溶酶组分A为30％-40％。
2、一种权利要求1所述的蚯蚓蛋白EP-2的制备方法，其特征在于所述蛋白由下述方法制得：
(1)粗蛋白液的制备
取新鲜赤子爱胜蚓用水性缓冲液制成匀浆，经冷冻高速离心，取上清液，在0-10℃条件下加入沉淀剂，搅拌均匀，放置过夜；经冷冻高速离心，取沉淀，用水性缓冲液溶解，或用水性缓冲液溶解，透析除盐，即得粗蛋白液；
(2)粗蛋白的纯化
取上述粗蛋白液，冷冻高速离心，上弱阴离子交换树脂柱，用NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，透析除盐，溶液冷冻干燥，即得。
3、根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制备方法，其特征在于其中所述的水性缓冲液选自水、磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液和氯化钠溶液。
4、根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制备方法，其特征在于其中所述的沉淀剂是65-95％乙醇溶液、丙酮或硫酸铵。
5、根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制备方法，其特征在于其中所述的弱阴离子交换树脂是DEAE Sepharose Fast Flow，DEAE SepharoseCL-6B，DEAE Sepharose A-50或DEAE Bio-Gel A。
6、根据权利要求2所述的蚯蚓蛋白EP-2的制备方法，其特征在于其中所述的NaCl溶液是指浓度为5mM-500mM的氯化钠水溶液。
7、一种权利要求1所述的蚯蚓蛋白EP-2在制备抗哮喘药物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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-
2006
- 2006-03-03 CN CN 200610024328 patent/CN1966517A/zh active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102288467A (zh) * | 2011-07-20 | 2011-12-21 | 浙江工业大学 | 一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法 |
| CN105412154A (zh) * | 2015-12-02 | 2016-03-23 | 云南永安制药有限公司 | 一种鲜地龙提取物的制备方法 |
| CN105412154B (zh) * | 2015-12-02 | 2018-11-09 | 云南永安制药有限公司 | 一种鲜地龙提取物的制备方法 |
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