CN1966493A - 一种氨基酸衍生物及其盐类与溶剂合物,它们的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨基酸衍生物及其盐类与溶剂合物，它们的制备方法与应用。本发明所提供的氨基酸衍生物，具有式I结构，其中Het、Ar、X1、X2、R1、R2如权利要求1所定义。本发明所公开的氨基酸衍生物及其盐类与溶剂合物作为新型的胰岛素增敏剂，开发成为药物将可能解决现有II型糖尿病胰岛素增敏剂存在产品单一、品种少、副作用大的问题，为广大患者提供了一种新选择。且价格低廉，有利于临床上推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的氨基酸衍生物及其盐类与溶剂合物以及它们的制备方法和医药用途。
背景技术
代谢综合症包括II型糖尿病以及相关的并发症，如肥胖、心血管疾病、异常脂血症等。这些疾病已成为严重危及人民健康的重大疾病。糖尿病是多种基因紊乱导致的疾病，目前它困饶着全世界相当一部分人群。又分为两种类型：(1)I型糖尿病或胰岛类依赖型糖尿病(IDDM)，患者分泌极少或根本不分泌胰岛素(2)II型糖尿病或非胰岛类依赖型糖尿病，II型糖尿病患者血浆胰岛素的浓度与正常人是基本相同的，但是，患者的机体却对胰岛素具有抵抗作用，因而会进一步影响糖和脂肪在胰岛素敏感的组织即肌肉、肝脏和脂肪组织中的代谢。糖尿病患者中90％为II型糖尿病患者。这种代谢异常疾病的特征是高血糖(空腹血糖浓度大于130mg/dl)及糖尿，持续的高血糖会导致许多并发症的发生，如视网膜、肾脏、神经系统病变、高甘油三脂血症、胆肺或其它心血管病等代谢综合症。尤其是心血管并发症是糖尿病患者致死致残的主要原因。所以控制病人的血糖水平对延缓或阻断并发症的产生极为重要。目前临床上主要用磺酰脲类促进胰岛素分泌的药物和双胍类药物等控制病人血糖。由于胰岛素抵抗是II型糖尿病发病的主要原因，所以胰岛素增敏剂是抗II型糖尿病药物研究的一个重要方向。曲格列酮是第一个上市的噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂，2002年因肝毒性而撤出市场，后来上市的同类药物匹格列酮和罗格列酮，现已证明这类化合物为PPARγ激动剂，PPARγ被激动剂激活以后，该受体可以促进葡萄糖的利用以及胰导素的增敏。在临床上都能很好的控制血糖，但仍存在轻微的肝毒性，由于该类化合物的毒性被怀疑与其结构中的噻唑烷二酮环有关，所以非噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂的合成和开发逐渐成为了抗II型糖尿病药物研究的一个主要方向。
专利(WO0121602)报道了一类氨基酸化合物，这类化合物为PPARα、PPARγ激动剂，可以作为潜在的抗糖尿病药物，含有芳基取代的噁唑和噻唑取代基，合成这类化合物需要使用中间体：芳基取代噁唑乙醇，制备该中间体需使用价格昂贵的四氢铝锂还原剂，因此这类药物价格昂贵，增加了糖尿病患者的经济负担，不利于临床上推广使用，本发明公开了一类新的氨基酸衍生物，与WO0121602所公开的化合物比较，价格低廉，有利于临床上推广使用，此外现有II型糖尿病胰岛素增敏剂存在产品单一、品种少、副作用大的问题，由于存在个体差异以及药物耐受性问题，迫切需提供新的胰岛素增敏剂。
发明内容
为了解决现有药物品种少、品种单一、副作用大的问题，为广大患者提供一种新选择，本发明提供了一种氨基酸衍生物及其盐类与溶剂合物。
本发明所提供的氨基酸衍生物，具有式I结构
式I
Het选自如下基团的芳香环基或芳香杂环基：
X为共价键、-S-、-O-、-CH＝CH-或-CH2CH2-；
X1为共价键、-O-或-NR6-；
X2是-O-，-S-，-SO-，-SO2-，-NR7-，-NR7CO-，CONR7-，-NR7SO2-或-SO2NR7-；
Ar选自以下基团，且这些基团可被卤原子、C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或卤代的C1-C4烷氧基任意取代；
R1是C1-C4烷基、芳基取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧羰基、芳基羰基、C1-C4烷基羰基、芳基、杂芳基、芳氧基羰基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基，C1-C4烷氧羰基氨基或芳氧羰基氨基，且这些芳基可被卤原子、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基任意取代。
R2为氢或C1-C4烷基；
R3、R4为氢、卤原子、C1-C4烷基、任意卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或C6-C10芳氧基并可被C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代的C1-C4烷氧基、C1-C4烷磺酰氧基或C1-C4烷磺酰基任意取代；
R5为分别独立选自氢或C1-C4烷基；
R6为氢、C1-C4烷基、C6-C10芳基或C6-C10芳基取代的C1-C4烷基；
R7为氢或C1-C4烷基；
(CH2)m可以为(CH2)、(CH2)2或(CH2)3；
(CH2)n可以为(CH2)或(CH2)2；
(CH2)p可以为(CH2)、(CH2)2或
R8，R9分别独立地为氢、C1-C4烷基或芳基取代的C1-C4烷基；
本发明所优选化合物具有如下式(II)所示的结构：
Het选自下列基团
X1为共价键、-O-或-NR6-；
R3、R5、R6的定义如权利要求1所述；
R10为芳基，可被卤原子、C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或卤代的C1-C4烷氧基任意取代。
更具体地，本发明化合物包括：
本发明所优选化合物具有式III所示的结构：
其中m＝1或2，Het选自下列基团
X1为共价键、-O-或-NR6-；
R3、R4、R6、R10的定义同权利要求1
更具体地，本发明化合物包括：
本发明化合物可形成盐，这些盐的性质没有特殊限制，只有当它们作治疗用途时，是药学上可接受的。当它们作非治疗用途时，例如作为制备其它更具活性的化合物的中间体上，甚至连一限制也没有。当做治疗用途时，可与碱形成盐，例如，与碱金属，如钠、钾或锂形成的盐；与碱土金属如钡或钙成的盐；与其它金属，如镁或铝形成的盐；也可与有机碱形成盐，如与二环己基胺，胍或三乙胺形成的盐；还可与碱性氨基酸形成盐，如与赖氨酸或精氨酸形成的盐。本发明化合物含有碱性基团可与酸成盐。这类酸加成盐的例子包括：与无机酸，尤其是氢卤酸(如氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、氢氯酸)，硝酸，碳酸，硫酸或磷酸成的盐；与低级烷基磺酸，如甲磺酸，三氟甲磺酸形成的盐；与芳基磺酸，如苯磺酸或对甲苯磺酸形成的盐；与有机羧酸，如乙酸，富马酸，酒石酸，草酸，马来酸，苹果酸，琥珀酸或柠檬酸形成的盐；与氨基酸，如谷氨酸或天冬氨酸形成的盐。
本发明的第二个目的是提供式(I)结构的氨基酸衍生物的制备方法，
反应式
Y为可离去基团式(I)如Cl，Br或I，中间体(IV)的制备参考专利WO98001378方法或按本领域专业人员所公知的方法合成。式(I)化合物的合成由中间体(V)与YR1在碱存在下参考WO00121602所公开的方法合成，或根据化合物结构特点采用其他本领域所公知的方法合成。
本发明的第三个目的是提供上述氨基酸衍生物及其盐类与溶剂合物为活性成分的预防或治疗胰岛素抗性糖尿病、高血压、动脉硬化、高血脂、脂质紊乱和肥胖症的药物。
本发明发明人通过实验证实，本发明化合物及吡格列酮分别作用于荧光素酶报告基因载体(含PPRE)转染的HepG2细胞，可使后者的荧光素酶相对表达水平显著增加，并呈一定的剂量依赖性，而且其中一些化合物的作用强于吡格列酮。本发明化合物与吡格列酮类似，都可以激活PPAR受体，可以作为改善胰岛素抵抗及降血脂活性药物的良好候选物，PPAR是其重要作用靶点之一。
本发明所公开新的氨基酸衍生物，与WO0121602所公开的化合物比较，价格低廉，有利于临床上推广使用，此外现有II型糖尿病胰岛素增敏剂存在产品单一、品种少、副作用大的问题，由于存在个体差异以及药物耐受性问题，迫切需提供新型的胰岛素增敏剂，因此本发明所公开的化合物开发成为药物将可能解决现有药物品种少、品种单一、副作用大的问题，为广大患者提供一种新选择。
本发明的通式(I)的化合物可以接受的剂型服用，制备这种剂型时可使用可以药用的载体，采用文献中熟知的方法。虽然这类剂型包括可以药用的各种剂型，例如胶囊、片剂、缓释剂、糖衣片、糖浆或注射剂。
本发明的化合物可以与常规的赋形剂混合使用，即与可以药用的有机或无机载体物质混合使用，这些物质适于非肠道或肠道(口服)给药，这些物质不与活性化合发生有害的作用。适宜的可以药用的载体包括水，盐溶液，醇类，阿拉伯胶，植物油，苄醇，聚乙二醇，明胶，糖，例如乳糖，直链淀粉或淀粉，硬脂酸镁，滑石粉，硅酸，粘性石蜡，香精油，脂肪酸单甘油酯和二甘油酯，季戊四醇脂肪酸酯，羟甲基纤维素，聚乙烯基吡咯烷酮和类似的化合物，但不限于这些。这些药用制剂可以消毒，希望的话还可以与辅助剂混合，例如与防腐剂，稳定剂，乳化剂，影响渗透压的盐，缓冲溶液，芬芳和/或芳香物质，以及类似的物料混合，这些物料可与活性剂联合使用，例如与抗高血压药物联合使用。
具体实施方式
实施例1、N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[(4-(2-(9-咔唑基)乙氧基)苯基)甲基]甘氨酸(LTD-1)的制备
1. 2-(9-咔唑基)乙醇的制备
将咔唑5g，碳酸亚乙酯13.2g，DBU5.5g，DMF6ml加入100ml三颈瓶中，100℃反应3小时，冷却，加到稀硫酸中，用乙酸乙酯萃取，稀硫酸洗2次，水洗1次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得蜡状固体，乙醚重结晶，得针状结晶。m.p.83-84℃
2.甲磺酸2-(9-咔唑基)乙酯的制备
取100ml三颈瓶，将步骤(1)原料5g溶于10ml二氯甲烷中，加甲烷磺酰氯11g，冰浴冷却，滴加三乙胺5.5g并维持体系温度10-15℃，滴毕，搅拌30分钟，冲入水中，分出有机层，用碳酸氢钠溶液洗至中性，无水硫酸镁干燥，减压浓缩，得油状物，放至析出结晶，甲醇洗涤.直接用于下一步反应。
3. 4-(2-(9-咔唑基)乙氧基)苯甲醛的制备
将步骤(2)原料4g，4-羟基苯甲醛1.8g，碳酸钾3g和DMF15ml加入100ml三颈瓶中，N2条件，80℃反应4小时，冲入水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得固体，加适量甲醇洗涤，得灰白色结晶3g，m.p.138-142℃
4. N-[(4-(2-咔唑基乙氧基)苯基)甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
将步骤(3)原料0.5g，甘氨酸甲酯盐酸盐0.25g，三乙胺0.3ml，甲醇10ml，THF5ml加入100ml三颈瓶，室温搅拌5小时，冰浴条件下分批加入NaBH4，伴有大量气泡产生，溶液变混浊，搅拌反应2小时后，减压浓缩，加入冰水中，乙酸乙酯萃取，用稀盐酸调PH值2-3，析出固体0.36g。
1HNMR(DMSO-d6ppm)δ3.71s，3H)δ3.86(s，2H)δ4.04(s，2H)δ4.39(t，2H)δ4.81(t，2H)δ6.85(d，2H)δ7.21(t，2H)δ7.33(d，2H)δ7.47(t，2H)δ7.69(d，2H)δ8.14(d，2H)δ9.38(br，2H)
5. N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[(4-(2-(9-咔唑基)乙氧基)苯基)甲基]甘氨酸(LTD-1)的制备
将步骤(4)原料350mg，三乙胺202mg，二氯甲烷10ml，加入100ml三颈瓶中，冰浴条件下滴加氯甲酸对甲氧苯酯169mg，反应2小时，加入冰水中，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物。
将上述油状物溶于20mlTHF中，加水10ml，冰浴条件下加入LiOH·H2O700mg，反应2小时，减压蒸出THF，冷却，用2N的HCl调PH到3，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，加甲醇结晶，析出晶体0.3g，mp184-186℃。1HNMR(DMSO-d6ppm)δ3.73(s，3H)δ3.86 or 3.93(2s，2H)δ4.36(t，2H)δ4.38 or 4.51(2s，2H)δ4.80(t，2H)δ6.79(t，2H)δ6.89～6.96(m，4H)δ7.19～7.23(m，4H)δ7.46(t，2H)δ7.69(d，2H)δ8.14(d，2H)MS(FAB)524。
实施例2、N-[4-[2-[N-甲基-N-(2-苯并噁唑基)氨基]乙氧基]苯基]甲基-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸(LTD-2)的制备
1. 2-氯苯并噁唑的制备
在500ml三颈圆底烧瓶中，加入五氯化磷62.5g，苯并噁唑啉15.1g，慢慢加热至内温140℃，在此温度搅拌反应20分钟，停止加热，稍冷后加入氯苯100ml，冷却析晶，过滤，氯苯洗涤，滤液浓缩后，剩余物减压蒸馏，收集80～90℃/1-5mmHg馏分110g。
2. 2-(N-羟乙基-N-甲基)胺基苯并噁唑的制备
在1000ml三颈圆底烧瓶中，冰浴冷却至10℃以后，滴加10ml 2-甲胺基乙醇，控制滴加速度使内温不超过10℃，加毕，室温反应2小时，薄层层析(展开剂CH2Cl2)示反应完全，乙酸乙酯萃取，水洗(50ml×3)，干燥(Na2SO4)过滤，浓缩得产物8.7g。
3. 2-[N-(2-甲磺酰氧基)乙基-N-甲基]氨基苯并噁唑的制备
在100ml三颈圆底烧瓶中加入8.7g步骤(2)原料，25ml三氯甲烷，10ml三乙胺，冰浴冷却至5℃以下，滴加10ml甲磺酰氯，加毕，室温反应2小时。水洗(50ml×3)，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩，乙醇重结晶得产物5.4g。m.p.87-91℃。
4. 4-[2-[N-甲基-N-(2-苯并噁唑基)氨基]乙氧基]苯甲醛的制备
将步骤(3)原料2g，4-羟基苯甲醛0.8g，碳酸钾1.5g和DMF10ml加入100ml三颈瓶中，N2条件，80℃反应4小时，冲入水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得固体，加适量甲醇洗涤，得灰白色结晶3g，m.p.138-142℃
5. N-[4-[2-[N-甲基-N-(2-苯并噁唑基)氨基]乙氧基]苯基]甲基甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
在100ml三颈圆底烧瓶中，加入步骤(4)原料0.55g，甲醇5ml，四氢呋喃5ml，甘氨酸甲酯盐酸盐0.25g，三乙胺0.25ml，室温反应3小时。冰浴条件下分批加入NaBH40.1g，反应2小时。减压浓缩，加入冰水中，稀盐酸调PH值2-3，然后用碳酸钠溶液调PH值9-10，乙酸乙酯萃取，水洗(50ml×3)，干燥(Na2SO4)，过滤，浓缩至1/3体积，通氯化氢，用析出固体0.48g。m.p.91-93℃。
6. N-[4-[2-[N-甲基-N-(2-苯并噁唑基)氨基]乙氧基]苯基]甲基-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸的制备
在100ml三颈圆底烧瓶中，加入步骤(5)原料0.45g，三乙胺0.25ml，二氯甲烷10ml，冰浴冷却下滴加氯甲酸对甲氧苯酯245mg，反应2小时，加入冰水中，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物。
将上述油状物溶于20mlTHF中，加水10ml，冰浴条件下加入LiOH·H2O600mg，反应2小时，减压蒸出THF，冷却，用2N的HCl调PH到3，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得油状物。MS(FAB)505。
实施例3、N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[2-[6-(2-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸(LTD-3)的制备
1. 2-氟苯甲醇的制备
将2-氟苯甲醛5ml，甲醇10ml加到100ml反应瓶中，冰浴搅拌下加入硼氢化钠0.5g。搅拌约30分钟，撤去冰浴，继续搅拌约1.5小时，TLC显示反还有原料存在，补加硼氢化钠0.2g，反应约30分钟，TLC显示反应完全。用2N盐酸调PH至酸性，减压蒸去甲醇，再用乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得白色液体3.6g。
2. 1-(氯甲基)-2-氟苯的制备
将15ml浓盐酸加入到100ml反应瓶中，冰浴搅拌下加入2-氟苯甲醇(上部所得全部)，温度变化不大。室温搅拌，仅有少量原料反应。60℃油浴反应6小时，TLC显示反应完全。用乙酸乙酯萃取3次，再用饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得淡黄色液体3.5g。
3. 6-(2-氟苄氧基)-2-萘甲醛萘甲醛的制备
将1-(氯甲基)-2-氟苯7.3g和6-羟基-2-萘甲醛8.6g加入到250ml反应瓶中，再加入DMF15ml搅拌溶解后，加入碳酸钾8.3g。70℃油浴反应约2小时，TLC显示反应完毕。将反应液倒入水中，立刻析出固体，过滤得土黄色固体。用乙醇重结晶得灰色粉末12.5g，m.p.86-88℃。
4. N-[2-[6-(2-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
将6-(2-氟苄氧基)-2-萘甲醛1g和甘氨酸甲酯盐酸盐0.7g加入到100ml反应瓶中，加入5mlTHF，20ml甲醇和0.75ml三乙胺，室温搅拌3小时。冰浴冷却到0-5℃后，分批加入0.4g硼氢化钠。放置过夜，TLC显示反应完毕。冰浴冷却下用2N盐酸调PH至2-3，过滤，水涤洗3次，乙酸乙酯洗3次，得白色粉末；母液用碳酸氢钠水溶液调至碱性，用乙酸乙酯提取3次，浓缩干后加入2NHCl成盐，过滤得白色粉末。m.p.196-197℃。
5. N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[2-[6-(2-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸的制备
将N-[2-[6-(2-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐0.5g加入到100ml反应瓶中，加入二氯甲烷10ml，三乙胺0.32ml，冰浴冷却到5℃下，滴加入4-甲氧苯基氯甲酸酯0.22ml，搅拌约1小时，TLC显示反应完毕。加入冰水，分离有机层，再用二氯甲烷萃取一次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得棕黄色油状物。
另取100ml反应瓶中，将棕黄色油状物溶于再加入25mlTHF，加25ml水，冷却后加0.05g氢氧化锂，室温搅拌5小时，用稀盐酸调PH2-3，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，浓缩，甲醇结晶，得无色固体0.6g。m.p.195-196℃。MS(FAB)489。
实施例4、N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[2-[6-(4-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸(LTD-4)的制备
1. 4-氟苯甲醇的制备
将5ml 4-氟苯甲醛，10ml甲醇加到100反应瓶中，冰浴搅拌下加入硼氢化钠0.5g。搅拌约30分钟，撤去冰浴，继续搅拌约1.5小时，TLC显示反还有原料存在，补加硼氢化钠0.2g，反应约30分钟，TLC显示反应完全。用2N盐酸调PH至酸性，减压蒸去甲醇，再用乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得无色液体3.5g。
2. 1-(氯甲基)-4-氟苯的制备
将15ml浓盐酸加入到100ml反应瓶中，冰浴搅拌下加入4-氟苯甲醇(上部所得全部)，温度变化不大。室温搅拌，仅有少量原料反应。60℃油浴反应6小时，TLC显示反应完全。用乙酸乙酯萃取3次，再用饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得淡黄色液体3.3g。
3. 6-(4-氟苄氧基)萘甲醛的制备
将7.3g1-(氯甲基)-4-氟苯和8.6g6-羟基-2-萘甲醛加入到250ml反应瓶中，再加入15mlDMF搅拌溶解后加入8.3g碳酸钾。70℃油浴反应约2小时，TLC显示反应完毕。将反应液倒入水中，立刻析出固体，过滤得土黄色固体。用乙醇重结晶得灰色粉末13g，m.p.117-120℃。
4. N-[2-[6-(4-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
将6-(4-氟苄氧基)萘甲醛1g和甘氨酸甲酯盐酸盐0.7g加入到100ml反应瓶中，加入THF5ml，甲醇20ml和三乙胺0.75ml，室温搅拌3小时。冰浴冷却到0-5℃后，分批加入0.4g硼氢化钠。放置过夜，TLC显示反应完毕。冰浴冷却下用2N盐酸调PH至2-3，过滤，水涤洗3次，乙酸乙酯洗3次，得白色粉末；母液用碳酸氢钠水溶液调至碱性，用乙酸乙酯提取3次，浓缩干后加入2NHCl成盐，过滤得白色粉末0.9g。m.p.170-172℃。
5. N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[2-[6-(4-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸的制备
将N-[2-[6-(4-氟苄氧基)萘基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐0.5g加入到100ml反应瓶中，加入二氯甲烷10ml，三乙胺0.32ml，冰浴冷却到5℃下，滴加入4-甲氧苯基氯甲酸酯0.5ml，搅拌约1小时，TLC显示反应完毕。加入冰水，分离有机层，再用二氯甲烷萃取一次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得棕黄色油状物。另取100ml反应瓶中，将棕黄色油状物溶于再加入25mlTHF，加25ml水，冷却后加0.05g氢氧化锂，室温搅拌5小时，用稀盐酸调PH2-3，用乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，浓缩，甲醇结晶，得无色固体0.35g。m.p.194-195℃。
1HNMR(DMSO-d6ppm)δ3.75(s，3H)δ4.04(d，2H)δ4.72(d，2H)δ5.21(s，2H)δ6.93(m，2H)δ7.02(m，2H)δ7.24(m，3H)δ7.43～7.59(m，4H)δ7.83(m，3H)MS(FAB)489。
实施例5、N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-{{4-[(1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基}甲基}甘氨酸(LTD-5)的制备
1. 2-(氯甲基)-1-甲基-苯并咪唑的制备
将90ml2NHCl加入到250ml具氮气保护的反应瓶中，再加入12g一氯乙酸和10g1-(N-甲基)-1，2-邻苯二胺。100℃左右反应5小时，TLC显示反应完全。加入活性炭脱色后用碳酸氢钠调PH至碱性，用乙酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得黑色油状物。过柱得灰白色固体，m.p.98-100℃。
2. 4-[(1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯甲醛的制备
将1.2g 2-(氯甲基)-1-甲基-苯并咪唑加入到100ml反应瓶中，再加入15mlDMF溶解后加入1.7g对羟基苯甲醛和1.5g碳酸钾。80℃左右反应1.5小时，TLC显示反应完全。将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，水洗固体2次，乙醇重结晶得灰白色固体，m.p.141-145℃。
3. N-{[4-[(1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基]甲基}甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
将1.2g4-[(1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯甲醛和1.13g甘氨酸甲酯盐酸盐加入到100ml反应瓶中，再加入15ml甲醇和5mlTHF溶解后加入1.25三乙胺。室温反应5小时后，冰浴冷却下分批加入0.2g硼氢化钠，控制温度在5℃以下，加完后放置过夜。TLC显示反应完全。用2NHCl调PH至酸性后乙酸乙酯萃取1次。水层再用碳酸氢钠调PH至碱性后乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩还剩少量乙酸乙酯，冷却后通入氯化氢，析出白色固体，过滤，热的乙醇回流洗固体得白色粉末，m.p.200-203℃。
4. N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[[4-[(1-甲基-苯并咪唑-2基)甲氧基]苯基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
将0.5g N-{[4-[(1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基]甲基}甘氨酸甲酯盐酸盐加入到100ml反应瓶中，再加入15ml二氯甲烷使成混悬液，加入1.1ml三乙胺后溶液变澄清。冰浴冷却至5℃以下加入氯甲酸对甲氧苯酯，搅拌反应30分钟，TLC显示反应完全。将反应液倒入冰水中，分离有机层，再用二氯甲烷萃取水层一次，合并后无水硫酸镁干燥，减压浓缩得淡黄色油状物，加少量甲醇结晶得白色固体。m.p.200-203℃。
5. N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[[4-[(1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基]甲基]甘氨酸的制备
将0.4g N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[[4-[(1-甲基-苯并咪唑-2基)甲氧基]苯基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐加入到100ml反应瓶中，再加入20mlTHF和20ml水后加入0.052g氢氧化锂。室温反应5小时后，放置过夜，TLC显示反应完全。先用乙酸乙酯萃取1次，水层再用2NHCl调PH至酸性后乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得淡黄色油状物，加少量甲醇结晶得白色固体，m.p.138-142℃。
1HNMR(DMSO-d6ppm)δ3.74(s，3H)δ3.86(s，3H)δ4.02(d，2H)δ4.50(d，2H)δ5.41(d，2H)δ6.90～7.01(m，4H)δ7.10～7.14(m，2H)δ7.22～7.33(m，4H)δ7.58(d，1H)δ7.65(d，1H)MS(FAB)475。
实施例6、N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-{{4-[(6-甲基-1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基}甲基}甘氨酸的制备
1. 5-甲氧基-2-硝基-苯胺的制备
将甲醇钠11.5g、5-氯-2-硝基-苯胺10g、甲醇25ml、1，4-二氧六环100ml，于室温加入到250ml的三颈瓶中，将混合物加热回流5h，薄层层析示反应完全，用醋酸调节PH至中性，减压蒸去溶剂，加入水100ml，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得固体物质，乙醇重结晶得褐色颗粒状固体8.7g，m.p.128-132℃。
2. N-乙氧羰基5-甲氧基-2-硝基苯胺的制备
将5-甲氧基-2-硝基-苯胺8.7g、醋酸酐15ml、四氢呋喃30ml、冰醋酸30ml，于室温加入到250ml的三颈瓶中，加三滴浓硫酸于混合液中，升温至50℃反应6h，薄层层析示反应完全，将反应液冲入冰水中，析出固体，过滤得黄色粉末状固体8.3g，m.p.118-122℃。
3. N-乙氧羰基-N-甲基-5-甲氧基-2-硝基苯胺的制备
将N-乙氧羰基5-甲氧基-2-硝基苯胺8.3g、DMF60ml，于室温加入到250ml三颈瓶中，冰浴冷却下加入氢化钠(为70％w/w矿物油中的分散体)2.7g，室温反应1h，冰浴下滴加碘甲烷6.2ml，滴毕室温反应1h，薄层层析示反应完全，将反应液冲入水中，乙酸乙酯萃取，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得油状液体，经柱色谱得橘红色油状液体，加入适量异丙醚结晶得黄色粉末状固体7.9，m.p.73.5-75.5。
4. N-甲基-5-甲氧基-2-硝基苯胺的制备
将N-乙氧羰基-N-甲基-5-甲氧基-2-硝基苯胺7.9g、6N的氢氧化钠50ml，加入到250ml的三颈瓶中，室温反应1h，然后加热至回流反应2h，薄层层析示反应完全，将反应液冲入冰水中，析出固体，过滤得黄色粉末状物质6.3g，m.p.118-121℃。
5. 5-甲氧基-1-(N-甲基)-1，2-邻苯二胺的制备
将N-甲基-5-甲氧基-2-硝基苯胺6.0g经催化氢化得黄色固体。
6. 6-甲氧基-2-(氯甲基)-1-甲基-苯并咪唑的制备
将90ml2NHCl加入到250ml具氮气保护的反应瓶中，再加入12g一氯乙酸和10g5-甲氧基-1-(N-甲基)-1，2-邻苯二胺。100℃左右反应5小时，TLC显示反应完全。加入活性炭脱色后用碳酸氢钠调PH至碱性，用乙酸乙酯萃取3次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得黑色油状物。过柱得灰白色固体。
7. 4-[(6-甲氧基-1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯甲醛的制备
将1.4g6-甲氧基-2-(氯甲基)-1-甲基-苯并咪唑加入到100ml反应瓶中，再加入15mlDMF溶解后加入1.8g对羟基苯甲醛和1.5g碳酸钾。80℃左右反应1.5小时，TLC显示反应完全。将反应液倒入冰水中，析出固体，过滤，水洗固体2次，乙醇重结晶得灰白色固体。
8. N-{[4-[(6-甲氧基-1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基]甲基}甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
将1.3g4-[(6-甲氧基-1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯甲醛和1.16g甘氨酸甲酯盐酸盐加入到100ml反应瓶中，再加入15ml甲醇和5mlTHF溶解后加入1.25三乙胺。室温反应5小时后，冰浴冷却下分批加入0.2g硼氢化钠，控制温度在5℃以下，加完后放置过夜。TLC显示反应完全。用2NHCl调PH至酸性后乙酸乙酯萃取1次。水层再用碳酸氢钠调PH至碱性后乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩还剩少量乙酸乙酯，冷却后通入氯化氢，析出白色固体，过滤，热的乙醇回流洗固体得白色粉末。
9. N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[[4-[(6-甲氧基-1-甲基-苯并咪唑-2基)甲氧基]苯基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
将0.5g N-{[4-[(6-甲氧基-1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基]甲基}甘氨酸甲酯盐酸盐加入到100ml反应瓶中，再加入15ml二氯甲烷使成混悬液，加入1.1ml三乙胺后溶液变澄清。冰浴冷却至5℃以下加入氯甲酸对甲氧苯酯，搅拌反应30分钟，TLC显示反应完全。将反应液倒入冰水中，分离有机层，再用二氯甲烷萃取水层一次，合并后无水硫酸镁干燥，减压浓缩得淡黄色油状物，加少量甲醇结晶得白色固体。
10. N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[[4-[(6-甲氧基-1-甲基-苯并咪唑-2-基)甲氧基]苯基]甲基]甘氨酸的制备
将0.4g N-[(4-甲氧苯基)羰基]-N-[[4-[(6-甲氧基-1-甲基-苯并咪唑-2基)甲氧基]苯基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐加入到100ml反应瓶中，再加入20mlTHF和20ml水后加入0.052g氢氧化锂。室温反应5小时后，放置过夜，TLC显示反应完全。先用乙酸乙酯萃取1次，水层再用2NHCl调PH至酸性后乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸镁干燥，减压浓缩得淡黄色油状物，加少量甲醇结晶得白色固体。MS(FAB)505。
实施例7、N-[[4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸(LTD-7)的制备
1. 3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙醇的制备
在250ml三颈瓶中加入对苯氧基苯酚10g、3-氯丙醇5ml、碳酸钾9g、碘化钾0.2g及DMF60ml，于搅拌下加热至100℃反应5h，薄层层析示反应完全，将反应液冲入水中，乙酸乙酯萃取，有机层用水洗涤一次，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得黄色油状物，用乙醇结晶得白色粉末6.3g。
2.甲磺酸3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙酯的制备
在250ml三颈瓶中加入3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙醇6.3g、三乙胺11ml、二氯甲烷20ml，冰浴冷却至0℃，于搅拌下滴加甲烷磺酰氯5ml，滴毕室温反应3h，薄层层析示反应完全，将反应液冲入水中，二氯甲烷萃取，有机层用水洗涤一次，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得黄色油状物。
3. 4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯甲醛的制备
在250ml三颈瓶中加入上一步所得黄色油状物质、对羟基苯甲醛3g、碳酸钾4g、DMF50ml，于搅拌下加热至85℃反应5h，薄层层析示反应完全，将反应液冲入水中，乙酸乙酯萃取，有机层用饱和碳酸钾水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得黄色油状物，用乙醇结晶得白色粉末4.5g，m.p.85-88℃。
4. N-[[4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
在100ml三颈瓶中加入4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯甲醛2g、甘氨酸甲酯盐酸盐1.5g、三乙胺2ml、甲醇5ml、四氢呋喃15ml，于搅拌下室温反应4h后，冰浴冷却至0℃，分批加入硼氢化钠0.9g，静置过夜，薄层层析示反应完全，冰浴冷却至0℃，用2N的盐酸调节pH2-3，于冰浴下反应0.5h，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤得白色粉末1.5g，m.p.120-122℃。
5. N-[[4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸甲酯的制备
向100ml三颈瓶中加N-[[4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐1g和二氯甲烷20ml，搅拌溶解，加三乙胺0.5ml，冰浴条件下滴加氯甲酸对甲氧苯酯0.4ml，反应0.5小时，加入冰水中，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得淡黄色油状物，用甲醇结晶，得白色粉末，m.p.75-77℃。
6. N-[[4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸
将N-[[4-[3-[(4-苯氧基)苯氧基]丙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸甲酯0.5g溶于30mlTHF中，加水25ml，有固体析出，补加5mlTHF，得澄清溶液，室温条件下加入LiOH·H2O120mg，反应5小时，用2N的HCl调PH到3，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩，加甲醇结晶，放置过夜，析出结晶0.3g，m.p.57-60℃。
1HNMR(DMSO-d6ppm)δ2.17(m，2H)δ3.74(s，3H)δ3.95(d，2H)δ4.12(m，4H)δ4.50(d，2H)δ6.90～7.08+δ7.25～7.36(m，17H)MS(FAB)557。
实施例8、N-[[4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸(LTD-8)的制备
1. 2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙醇的制备
在250ml三颈瓶中加入对苯氧基苯酚10g、2-氯乙醇7.2ml、碳酸钾7.42g及DMF60ml，于搅拌下加热至125℃水浴回流反应20h，薄层层析示反应完全。将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机层用水洗涤一次，2mol/L盐酸洗涤一次，再用水洗涤一次。无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得深黄色油状物，用甲醇结晶得淡白色粉末7.2g。m.p.68-70℃
2.甲磺酸2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙酯的制备
在250ml三颈瓶中加入2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙醇6.2g、三乙胺16.4ml、二氯甲烷20ml，冰浴冷却至0℃，于搅拌下滴加甲烷磺酰氯6.2ml，控制滴速使其不超过5℃。滴毕室温反应30min，薄层层析示反应完全，将反应液倒入碎冰水中，二氯甲烷萃取，有机层用水洗涤一次，水层再用二氯甲烷萃取一次，合并有机层，用2mol/L盐酸洗涤一次，水洗涤一次，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得9g深棕色色油状物。
3. 4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯甲醛的制备
在250ml三颈瓶中加入上一步所得黄色油状物质、对羟基苯甲醛3.6g、碳酸钾5.1g、DMF50ml，于搅拌下加热至85℃反应4.5h，薄层层析示反应完全，将反应液倒入水中，乙酸乙酯萃取，有机层用饱和碳酸钾水溶液洗涤，无水硫酸镁干燥，减压蒸馏得淡黄白色粉末，用乙醇重结晶得白色粉末5.2g。m.p.115-118℃。
4. N-[[4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯基]甲基]甘氨酸甲酯盐酸盐的制备
在100ml三颈瓶中加入4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯甲醛2.5g、甘氨酸甲酯盐酸盐1.4g、三乙胺1.6ml、甲醇25ml、四氢呋喃30ml，于搅拌下室温反应4h后，冰浴冷却至0℃，分批加入硼氢化钠0.85g，静置过夜，薄层层析示反应完全，冰浴冷却至0℃，用2N的盐酸调节pH2-3，于冰浴下反应0.5h，过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤得白色粉末1.5g，m.p.145-153℃。
5. N-[[4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸甲酯的制备
向100ml三颈瓶中加入N-[4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯基]甲基甘氨酸甲酯盐酸盐1g和二氯甲烷20ml，搅拌溶解，加三乙胺0.7ml，冰浴条件下滴加氯甲酸对甲氧苯酯0.37ml，反应0.5小时，加入冰水中，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得淡黄色油状物，用甲醇结晶，得白色粉末1g。m.p.103-108℃
6. N-[[4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸的制备
将1g N-[[4-[2-[(4-苯氧基)苯氧基]乙氧基]苯基]甲基]-N-[(4-甲氧苯基)羰基]甘氨酸甲酯溶于40mlTHF和30ml水，室温条件下加入LiOH·H2O0.2g，反应5小时，用2N的HCl调PH到3，乙酸乙酯萃取2次，无水硫酸钠干燥有机层，减压浓缩，加甲醇结晶，放置过夜，析出结晶0.3g。m.p.63-68℃
1HNMR(DMSO-d6ppm)δ3.74(s，3H)δ3.96(d，2H)δ4.30(s，4H)δ4.55(d，2H)δ6.91～7.02+δ7.27～7.37(m，17H)MS(FAB)543。
实施例8、受试物激活PPAR反应元件(PPRE)的活性分析
1实验材料
1.1细胞、质粒
HepG2细胞购自ATCC，pGL3-Basic荧光报告载体、转染内参照pRL-TK载体购自Invitrogen公司，PPRE-pGL3载体自行构建。
1.2主要试剂和仪器
高糖DMEM干粉培养基 Gibco-BRL
新生小牛血清 Gibco-BRL
LipofectamineTM2000(1mg/mL) Invitrogen公司
质粒DNA提取试剂盒 Promega公司
双荧光报告基因检测试剂盒 Promega公司
洁净工作台 北京半导体设备一厂
二氧化碳培养箱 NAPCO-5410
THZ-C恒温振荡器 江苏太仓实验设备厂
高速冷冻离心机 Heraeus Labofuge 400
台式高速离心机 Sigma公司
DYY-III2稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂
DU-640核酸蛋白分析仪 Beckman
Fluo star微板孔读数仪 德国bMG公司
1.3受试物及配制
LTD1：白色粉末，分子量524，纯度大于98.5％。LTD2：无色液体，分子量491，纯度大于98.5％。吡格列酮(阳性对照)。
上述三种化合物均以DMSO溶解，配制成储存浓度为1mmol/L的溶液，用前按需要稀释、加样。
2、实验方法
2.1细胞培养及转染
2.1.1细胞培养
HepG2细胞于37℃、5％ CO2条件下，在含有10％小牛血清(不含抗生素)的DMEM培养基中生长。转染前一天，用0.2％胰蛋白酶消化传代，以台盼兰染色计数活细胞，调整细胞至1×105 cell/mL，接种于24孔板，1mL/孔，继续培养至90％-95％左右融合时进行细胞转染。
2.1.2细胞转染
首先制备纯度符合要求的质粒PPRE-pGL3和pRL-TK。然后按LipofectamineTM2000说明书配制转染混合物，即：将重组报告基因载体PPRE-pGL3 0.7μg、内参照载体pRL-TK 0.1μg共0.8μg质粒DNA和LipofectamineTM2000脂质体试剂4.5μL分别在无血清DMEM中稀释，得到转染混合物。当HepG2细胞融合达90-95％时，将转染混合物直接加入400μl DMEM中，4～6h后更换DMEM培养液，根据分组情况对细胞予以处理并继续培养24h。
2.2细胞分组及处理
转染细胞的分组及处理如下：LTD1和LTD2各设低、中、高三个浓度组(5、10、20μmol/L)，即分别以上述不同终浓度的LTD1和LTD2作用细胞24h；吡格列酮亦设置上述三个浓度组(5、10、20μmol/L)，作为阳性对照；三个受试物同设一个溶剂对照组。
2.3转录活性分析
2.3.1细胞裂解物的制备
待裂解细胞以预冷PBS洗涤三次，加入100μl细胞裂解液PLB(Passive LysisBuffer，Promega公司)，温和摇动培养液达15分钟(被动细胞裂解)。待细胞充分裂解后，收集裂解产物，进行荧光素酶的表达量测定；若不即时测定，则保存于-20℃，使用时一次性融化，避免反复冻融。
2.3.2细胞提取物荧光素酶相对表达量的测定
严格依照双荧光报告基因检测试剂盒说明操作，将20μl细胞裂解液和100μl荧光素酶测试试剂II(Luciferase Assay Reagent II，LARII)混合，采用德国bMG公司Fluo star微板孔读数仪检测细胞裂解物萤火虫荧光素酶的活力。随后，每孔加入100μlStop &GloTM试剂，湮灭萤火虫荧光素酶反应，同时激活Renilla荧光素酶(pRL-TK中)反应，并立即检测Renilla荧光素酶的活力。萤火虫荧光素酶的相对表达量以其信号强度与相应的Renilla荧光素酶信号强度的比值表示。
2.4统计学处理
本实验每组数据均为四次独立重复实验测定数值的平均值，全部数据以均数±标准差(x±s)表示。用SPSS统计软件，以One-way ANOVA分析各组别之间的差异，两组间的比较采用q检验。
3、实验结果
结果归纳为表1。与溶剂对照组比较，LTD1和LTD2各浓度组的细胞荧光素酶相对表达水平均显著增加，并呈一定的浓度依赖性；吡格列酮组的荧光素酶相对表达水平亦有增加，但低于LTD1组。结果表明，LTD1和LTD2均有激活PPAR的作用。
表1各受试物对HepG2细胞荧光素酶相对活力的影响(x±s，n＝4)
| 组别 | 0(DMSO) | 5μmol/L | 10μmol/L | 20μmol/L |
| LTD1 | 1.00±0.07 | 1.32±0.06** | 1.85±0.05** | 2.36±0.08** |
| LTD2 | 1.00±0.07 | 1.23±0.10** | 1.53±0.09** | 1.77±0.06** |
| 吡格列酮 | 1.00±0.07 | 1.28±0.07** | 1.51±0.08** | 1.80±0.10** |
注：萤火虫荧光素酶的相对表达量以其信号强度与相应的Renilla荧光素酶信号强度的比值表示。**P＜0.01，与溶剂对照组(0μmol/L)比较。
4结论
本研究结果显示：LTD1、LTD2及吡格列酮分别作用于荧光素酶报告基因载体(含PPRE)转染的HepG2细胞，可使后者的荧光素酶相对表达水平显著增加，并呈一定的剂量依赖性，而且LTD1的作用强于吡格列酮。结论：LTD1、LTD2与吡格列酮类似，都可以激活PPAR受体，可以作为改善胰岛素抵抗及降血脂活性药物的潜在药物，PPAR是其重要作用靶点之一。
实施例9、受试物激活PPAR反应元件(PPRE)的活性分析
1实验材料
1.1细胞及质粒
HepG2细胞购自ATCC，pGL3-Basic荧光报告载体、转染内参照pRL-TK载体购自Invitrogen公司，PPRE-pGL3载体自行构建。
1.2主要试剂和仪器
细胞培养基DMEM和新生牛血清购自Gibco-BRL公司；转染试剂LipofectamineTM2000和双荧光报告基因检测试剂盒购自Invitrogen公司；Fluo star微板孔读数仪为德国bMG公司产品。
1.3受试物及配制
LTD1～LTD8：纯度大于98.5％；吡格列酮(阳性对照)。
上述化合物均以DMSO溶解，配制成储存浓度为1mmol/L的溶液，用前按需要稀释、加样。
2、实验方法
2.1细胞培养及转染
2.1.1细胞培养
HepG2细胞于37℃、5％ CO2条件下，在含有10％小牛血清(不含抗生素)的DMEM培养基中生长。转染前一天，用0.2％胰蛋白酶消化传代，以台盼兰染色计数活细胞，调整细胞至1×105 cell/mL，接种于24孔板，1mL/孔，继续培养至90％-95％左右融合时进行细胞转染。
2.1.2细胞转染
首先制备纯度符合要求的质粒PPRE-pGL3和pRL-TK。然后按LipofectamineTM2000说明书配制转染混合物，即：将重组报告基因载体PPRE-pGL3 0.7μg、内参照载体pRL-TK 0.1μg共0.8μg质粒DNA和LipofectamineTM2000脂质体试剂4.5μL分别在无血清DMEM中稀释，得到转染混合物。当HepG2细胞融合达90-95％时，将转染混合物直接加入400μl DMEM中，4～6h后更换DMEM培养液，根据分组情况对细胞予以处理并继续培养24h。
2.2细胞分组及处理
转染细胞的分组及处理如下：LTD系列化合物各设低、中、高三个浓度组(0.1、1、10μmol/L)，并分别以上述不同终浓度的LTD化合物作用细胞24h；相应地，吡格列酮亦设置上述三个浓度组，作为阳性对照；共设一个溶剂(DMSO)对照组。
2.3转录活性分析
2.3.1细胞裂解物的制备
待裂解细胞以预冷PBS洗涤三次，加入100μl细胞裂解液，温和摇动培养液达15分钟(被动细胞裂解)。待细胞充分裂解后，收集裂解产物，进行荧光素酶的表达量测定；若不即时测定，则保存于-20℃，使用时一次性融化，避免反复冻融。
2.3.2细胞提取物荧光素酶相对表达量的测定
严格依照双荧光报告基因检测试剂盒说明操作。采用德国bMG公司Fluo star微板孔读数仪检测细胞裂解物萤火虫荧光素酶的活力。萤火虫荧光素酶的相对表达量以其信号强度与相应的Renilla荧光素酶信号强度的比值表示。
2.4统计学处理
本实验每组数据均为四次独立重复实验测定数值的平均值，全部数据以均数±标准差(x±s)表示。用SPSS统计软件，以One-way ANOVA分析各化合物与溶剂对照组的差异，两组间的比较采用t检验。
3、实验结果
结果归纳为表1。与溶剂对照组比较，LTD4中、高浓度组，LTD7和LTD8各浓度组的细胞荧光素酶相对表达水平均显著增加；吡格列酮各浓度组的荧光素酶相对表达水平亦均明显增加。结果表明，LTD1、LTD4、LTD7和LTD8均不同程度地具有激活PPAR的作用。
表1. LTD系列物对HepG2细胞荧光素酶相对活力的影响(x±s，n＝4)
| 组别 | 0μmol/L(DMSO) | 0.1μmol/L | 1μmol/L | 10μmol/L |
| LTD1 | 3.5±0.3 | 4.0±0.1* | 4.3±0.2* | 5.1±0.3* |
| LTD3 | 3.5±0.3 | 4.2±0.1* | 4.4±0.2* | - |
| LTD7 | 3.5±0.3 | 4.0±0.1* | 4.4±0.1* | 5.0±0.0* |
| LTD8 | 3.5±0.3 | 3.9±0.0* | 4.3±0.3* | 5.6±0.5* |
| 吡格列酮 | 3.5±0.3 | 3.9±0.1* | 4.7±0.1* | 5.3±0.4* |
注：相对活力以荧火虫与Renilla二者荧光素酶信号强度的比值表示。*P＜0.05，与溶剂对照组(0μmol/L)比较。“-”：示该浓度下细胞死亡，未能进一步检测。
4、结论
本研究结果显示：与吡格列酮类似，LTD1、LTD3、LTD7和LTD8均有激活HepG2细胞PPAR受体反元件(PPRE)的作用。结论：本实验条件下，LTD1、LTD4、LTD7和LTD8都可以激活PPAR受体，可以作为改善胰岛素抵抗及降血脂活性药物的良好候选物。
Claims (12)
1、式I化合物
其中，Het选自如下基团的芳香环基或芳香杂环基：
X为共价键、-S-、-O-、-CH＝CH-或-CH2CH2-；
X1为共价键、-O-或-NR6-；
X2是-O-，-S-，-SO-，-SO2-，-NR7-，-NR7CO-，CONR7-，-NR7SO2-或-SO2NR7-；
Ar选自以下基团，且这些基团可被卤原子、C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或卤代的C1-C4烷氧基任意取代；
R1是C1-C4烷基、芳基取代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧羰基、芳基羰基、C1-C4烷基羰基、芳基、杂芳基、芳氧基羰基、芳基羰基氨基、杂芳基羰基氨基，C1-C4烷氧羰基氨基或芳氧羰基氨基，且这些芳基可被卤原子、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基任意取代。
R2为氢或C1-C4烷基；
R3、R4为氢、卤原子、C1-C4烷基、任意卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C6-C10芳氧基并可被C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、卤代的C1-C4烷氧基、C1-C4烷磺酰氧基或C1-C4烷磺酰基任意取代；
R5为分别独立选自氢或C1-C4烷基；
R6为氢、C1-C4烷基、C6-C10芳基或C6-C10芳基取代的C1-C4烷基；
R7为氢或C1-C4烷基；
(CH2)m可以为(CH2)、(CH2)2或(CH2)3；
(CH2)n可以为(CH2)或(CH2)2；
(CH2)p可以为(CH2)、(CH2)2或
R8，R9分别独立地为氢、C1-C4烷基或芳基取代的C1-C4烷基；
2、根据权利1所述化合物，其特征在于所述化合物具有式II结构
式II
其中，Het选自下列基团
X1为共价键、-O-或-NR6-；
R3、R5或R6的定义如权利要求1所述；
R10为芳基，可被卤原子、C1-C4烷基、卤代的C1-C4烷基、C1-C4烷氧基或卤代的C1-C4烷氧基任意取代。
3、根据权利要求2所述的化合物，其特征在于所述的化合物为：
4、根据权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物具有具有式III结构
式III
其中m＝1或2，Het选自下列基团
X1为共价键、-O-或-NR6-；
R3、R4、R6、R10的定义同权利要求1
5、根据权利要求4所述的化合物，其特征在于所述的化合物为：
6、根据权利要求1-5任一所述化合物的盐，其特征在于：所述盐为有机酸盐或无机酸盐，其中有机酸盐为枸橼酸盐、富马酸盐、草酸盐、苹果酸盐、乳酸盐、对甲苯磺酸盐或甲磺酸盐；所述无机酸盐为氢卤酸盐、硫酸盐、磷酸盐或硝酸盐。
7、根据权利要求1-3任一所述化合物的盐，其特征在于：所述的盐为药学上可接受的无机碱盐。
8、根据权利要求7所述化合物的盐，其特征在于：所述的无机碱盐为钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、钡盐或镁盐。
9、根据权利要求1-8任一所述的化合物的溶剂合物，其特征在于所述溶剂为药学上可接受的溶剂。
10、一种用于治疗或预防胰岛素抗性糖尿病，高血压，动脉硬化，高血脂，脂质紊乱和肥胖症的药物组合物，该组合物包含有效量的活性物质和药物载体或稀释剂，其中的活性物质是权利要求1至5任意所述化合物。
11、一种抗糖尿病组合物，它的活性成分是权利要求6、7或8所述化合物的盐。
12、一种抗糖尿病组合物，它的活性成分是权利要求9所述化合物的溶剂合物。
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