CN1955190A - 抑制hiv病毒融合的多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一类抑制HIV病毒融合的多肽。根据HIV病毒在膜融合过程中与细胞膜表面的受体分子的作用机制，本发明设计了可以与病毒表面糖蛋白gp41相结合的活性多肽。所述多肽的作用位点位于gp41分子上三聚体NHR侧面的“长穴”及两端，能有效抑制HIV病毒的复制。本发明的多肽与现有药物相比，分子量小、活性高、水溶性好。用本发明所述多肽可以制备抑制多种包膜病毒感染的药物。
Description
技术领域：
本发明涉及一类抑制病毒融合的多肽，特别是涉及抑制HIV病毒融合的一类多肽。本发明还涉及所述多肽的用途。
背景技术：
一些具有包膜的病毒，如人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)、人呼吸道合胞病毒和B型肝炎病毒的生活整个周期可以分为四部分：病毒和细胞膜融合，遗传物质进入细胞内；逆转录出病毒的DNA并整合到宿主细胞的染色体上；病毒蛋白的转录，翻译，修饰；病毒颗粒的组装和出芽。这些病毒的共同点是生活周期中有膜融合过程，且融合过程中所参与的蛋白的结构有相似之处。
以治疗HIV感染的药物为例，目前临床上治疗HIV感染的药物可以分为逆转录酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和进入抑制剂(包括融合抑制剂)三类，分别针对上述病毒复制周期的不同环节(Jiang S.，et al.，Curr.Pharm.Des.，2002，8(8)：563-580)。
逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂类药物在使用中容易出现抗药性，是这两类药物目前使用受限的重要原因。另外，长期使用该两类抑制剂，诸如脂肪分布异常、骨质疏松等毒副作用也十分明显(周伟，等.中国艾滋病性病.2005，11(1)：73-75)。
HIV进入抑制剂可抑制HIV病毒进入细胞的过程，其中融合抑制剂作用于病毒和细胞膜融合过程。临床使用时发现，HIV病毒融合抑制剂单独应用即可以大大降低病毒的荷载量，并且副作用很低。HIV病毒融合抑制剂还可以与逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂联合使用，不仅可以降低这两种药物的使用量，从而降低副作用，还可以防止新的耐药株的出现。
进入抑制剂作用于病毒进入细胞前，即从病毒和细胞开始接触到膜融合的阶段。该阶段主要包括三个过程(Eckert D.M.，et al.，Annu.Rev.Biochem.2001，70：777-810)：首先，病毒的表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4分子高亲和力结合，构象发生变化使病毒吸附到宿主细胞上；然后，gp120与宿主细胞表面辅助受体(如：CCR5，CXCR4等)相互作用，构象进一步发生变化，并与gp41分离，gp41N端的融合肽插入宿主细胞膜；最后，gp41的CHR区(C-terminal heptad repeats)回折并靠近其NHR区(N-terminal heptadrepeats)形成的α-螺旋三聚体，形成六聚体α-螺旋，拉近了病毒和细胞的距离，导致病毒包膜与细胞膜的融合。
目前正在进行研究的HIV进入抑制剂主要针对上述过程中的病毒表面糖蛋白gp120/gp41以及细胞表面共同受体CCR5/CXCR4、CD4受体。
作用于gp120的进入抑制剂有(Thali M.，et al.，J.Virol.1993，67(7)：3978-3988；ShaunakS.，J.Pharmacol.，1994，113：151-158；Trkola A.，et al.，J.Virol.1996，70：1100-1108；Wang T.，et al.，J.Med.Chem.2003，46：4236-4239；Ferrer M.，et al.，J.Virol.1999，73(7)：5795-5802)：17b，2G12，PRO542，BMS-378806，12P1.
作用于gp41的进入抑制剂(融合抑制剂)有(Wild C.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，1994，91：9770-9774；Jiang S.，et al.，Curr.Pharm.Des.，2002，8(8)：563-580；Root M.J.，et al.，Science，2001，291：884-888)：DP107，T-20，T-1249，C34，IQN37，5-Helix.
作用于共同受体CCR5/CXCR4的进入抑制剂(Maeda K.，et al.，Curr.Opin.Pharmacol，2004，4(5)：447-452；Pierson T.C.，et al.，Rev.Med.Virol.2004，14：255-270.)：AOP-RANTES，PRO140，UK-427857，TAK-779，TAK-220.
作用于CD4受体的进入抑制剂有(Reimann K.A.，et al.，ADIS Res.Hum.Retroviruses.，1997，12(11)：933-943)：TNX-355
上述的几类进入抑制剂中，作用于共同受体CCR5/CXCR4的抑制剂现在认为有着内在的缺陷。众所周知，CCR5/CXCR4是存在正常细胞表面的分子，除在HIV病毒进入过程作为共同受体外，还是趋化因子和炎症因子等的受体，因此长期的使用抑制剂竞争性的结合会引起问题，一些小分子的拮抗剂在临床研究的时候就发现了对心脏的副作用(MaedaK.，et al.，Curr.Opin.Pharmacol，2004，4(5)：447-452)。
作用于gp120的进入抑制剂主要是筛选或者从感染者体内得到的抗体，小分子较少。目前仅得到17b和2G12两个具有广泛中和活性的抗体，其他的抗体有的在体外实验中具有中和活性，但是在体内则没有。目前的小分子抑制剂有BMS-378806，它结合于gp120上一个疏水口袋，另外通过肽库筛选得到的小肽(12P1)可能具有与之相同的结合部位。
作用于CD4受体的进入抑制剂目前研究的最少，因为在体内它是一个很重要的分子，对它的抑制很可能出现严重的副反应。
目前仅有一种多肽类融合抑制剂T-20(商品名为Fuzeon)应用于临床。
T-20衍生于HIV-1 LAI毒株gp41的CHR区，由36个氨基酸组成(Wild，C.T.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1994，91：9770-9774)。gp41融合前构象可以持续约30分钟的时间，在这一段时间T-20可以作用于三个gp41分子的NHR区形成的α-螺旋三聚体(Melikyan G.B.，J.Cell.Biol.，2000，151：413-423)。T-20的竞争性结合使gp41的CHR区不能结合NHR区，抑制螺旋六聚体的形成，病毒和宿主的细胞膜因此也不能相互靠近，膜融合过程受阻。
最近的研究结果认为，T-20不能和衍生于gp41的NHR区多肽N36在溶液中形成稳定的螺旋六聚体，因此其可能和gp41、gp120的多个位点相互作用(Liu S.，et al.，J.Biol.Chem，2005，280(12)：11259-11273)，这与其设计原理相异。
T-1249是T-20的第二代产品，由39个氨基酸组成，衍生于HIV-1 LAI，HIV-2 NIHZ，SIV mac251三种毒株的CHR区(Schneider S.E.，et al，J.Pept.Sci.2005，11(11)：744-753)。在临床使用过程中发现gp41的CHR区仅仅一个氨基酸的突变就可以造成毒株对T-20的抗性，但是这些毒株仍然对T-1249敏感，这被认为可能与其可以与膜相互作用的能力相关(Veiga A.S.，et al，J.Am.Chem.Soc.，2004，126(45)：14758-14763)。
罗氏公司及其合作者于2004年起转而研究TR-290999和TR-291144(13th CROIConference on Retroviruses and Opportunistic Infections Denver，Colorado，Feb 5-8，2006)，这两个多肽分别由38个和36个氨基酸组成，据称活性均高于T-20。
尽管T-20、T-1249、TR-290999和TR-291144是目前效果最好的多肽类HIV融合抑制剂，但它们的共同缺点是分子量相对其它抗HIV药物来说较大，因而合成相对困难。
因此迫切需要有较短氨基酸序列的多肽类抑制病毒融合剂，以便于合成；另外，融合剂还需要有与T-20的作用位点不同，以对抗T-20耐药的病毒；增加药物的溶解性和稳定性，以加强疗效并减少药物用量。
发明内容：
本发明的目的是提供一种新型的抑制HIV病毒融合的多肽。该类多肽的氨基酸序列较短，作用位点与现有药物不同，并且水溶性较好，活性高。
本发明提供的新型多肽的设计原理
HIV-1的表面糖蛋白gp41的NHR区由于其高度的保守性可以作为理想的药物作用靶点，而衍生于CHR区的多肽因为可以与NHR区相互作用成为该类药物的先导多肽。本发明所提供的病毒融合抑制剂衍生于在中国内地流行面积最广和感染人数最多的B′亚型的RL42毒株的gp41的一段CHR序列，该段序列具有如下的氨基酸排列顺序：
EIWNNMTWMEWEREIDNYTREIYTLIEESQNQ
对HIV-1的表面糖蛋白gp41的序列分析结果显示，在NHR区存在有两个非常保守的区域，其一是“GIVQQQ”(Rimsky L.T.，et al，J.Virol.，1998，72：986-993)，该区域任何一个氨基酸的改变即可造成T-20的耐药，因此是T-20的主要作用位点；另外一个是Leu-565，Leu-566，Leu-568，Thr-569，Val-570，Trp-571，Gly-572，Ile-573，Lys-574，Leu-576，Gln-577等11个高度保守的氨基酸组成的长的疏水结构域“Cavity”(Eckert D.M.，et al，Cell，1999，99：103)。
在设计与NHR区结合的多肽抑制剂中，发明者重点考虑了与gp41的三聚体NHR区上的“Cavity”结构域及其两端相结合的序列，以往的抑制剂只考虑CHR序列中Trp628，Trp631，而忽略Trp623的作用。另外，发明者设计了与“Cavity”C端结合的螺旋序列，以增加与gp41NHR区域的疏水作用力；除去了对gp41的三聚体NHR结合能力较弱的序列，并引入亲水氨基酸以增加抑制剂的水溶性，在多肽序列中的“I”及“I+4”位引入可产生离子键的酸性或碱性氨基酸，以增加自身形成螺旋的能力，最终形成本发明。
本发明发现具有通式I的新型多肽具有抑制病毒融合作用，通式I多肽一级结构如下：
α-X1-X2WN-X3-X4-TWMEWER-X5-IE-X6-YTKLIY-X7-IL-X8-SQEX9-β
通式I
其中：
α选自氨基、乙酰基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基或脂肪酰基；
X1选自V、L、I、M中任意一个氨基酸或空缺；
X2选自E、D、N中任意一个氨基酸或空缺；
X3选自E、D、N中任意一个氨基酸；
X4选自K、M、Q或L中任意一个氨基酸；
X5选自K或E；
X6选自N、E或D中任意一个氨基酸；
X7选自D、E、K或R中任意一个氨基酸；
X8选自D、E、K或R中任意两个相同或不同氨基酸；
X9选自Q或L；
β选自酰胺基、羧基或羧基衍生物；
上述其它字母表示如下氨基酸：
D-天冬氨酸；E-谷氨酸；I-异亮氨酸；K-赖氨酸；L-亮氨酸；M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-丝氨酸；T-苏氨酸；V-缬氨酸；W-色氨酸；Y-酪氨酸。
本发明的多肽的一个或多个氨基酸可以用构象为D-型的氨基酸、自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸替换，以增加生物利用度及提高抑制活性。其中D-型的氨基酸指与组成蛋白质的L-型的氨基酸相对的氨基酸；自然界存在的稀有氨基酸包括组成蛋白质的不常见氨基酸和不组成蛋白质的氨基酸，如：5-羟基赖氨酸，甲基组氨酸，γ-氨基丁酸，高丝氨酸等；人工修饰的氨基酸指经过甲基化，磷酸化等修饰的组成蛋白质的常见L-型氨基酸。
本发明所述多肽可与大分子的载体或者多肽联接，这些载体或者多肽包括但是不局限于：蛋白质，聚乙二醇，脂类物质等。
本发明所述多肽包括其截断部分及其截断部分的修饰物。上述的多肽的截断部分为包括含15-32个氨基酸的肽。截断部分的修饰物指的是使用聚乙二醇修饰、化学小分子(如马来酰亚胺)以及蛋白质的修饰物。截断部分的修饰物指的是多肽的某个或某些氨基酸连接聚乙二醇、化学小分子(如马来酰亚胺)以及蛋白质后产生的衍生物。
本发明所述多肽还包括上述通式加入单个和多个氨基酸插入物，替换物和/或缺失物。
本发明所述多肽还包括上述多肽(通式I)及其截断物多聚体，即几个(1-4个)相同的多肽通过氨基酸，如赖氨酸、半胱氨酸，或者其他的分子连接在一起形成多聚体。
通式I多肽中，优选的是下列18个多肽，它们的结构分别如下：
多肽1：NH2-SEQ ID No：1-CONH2
SEQ ID No：1＝VEWNNKTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ
多肽2：NH2-SEQ ID No：2-CONH2
SEQ ID No：2＝VEWNNMTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ
多肽3：NH2-SEQ ID No：3-CONH2
SEQ ID No：3＝VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ
多肽4：Ac-SEQ ID No：4-CONH2
SEQ ID No：4＝VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ
多肽5：Ac-SEQ ID No：5-CONH2
SEQ ID No：5＝VEWNNKTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ
多肽6：NH2-NEKDLLEWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2
多肽7：NH2-RINNIPWSEAMWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CONH2
多肽8：NH2-YDINYYTWMEWERKIEEYTKLIYEILKKSQEQ-CONH2
多肽9：NH2-(CEKNEQELLWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQCONH2)2
多肽10：NH2-SEQ ID No：6-CO NH2
SEQ ID No：6＝WNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ
多肽11：Ac-SEQ ID No：7-CO NH2
SEQ ID No：7＝WNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ
多肽12：NH2-SEQ ID No：8-CO NH2
SEQ ID No：8＝VEWNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ
多肽13：NH2-SEQ ID No：9-CO NH2
SEQ ID No：9＝LEWNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ
多肽14：NH2-SEQ ID No：10-CO NH2
SEQ ID No：10＝LEWNEMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEL
多肽15：NH2-WNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEQ-CO NH2
多肽16：NH2-WNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEL-CO NH2
多肽17：NH2-VEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEL-CO NH2
多肽18：NH2-LEWNNMTWMEWEREIENYTKLIYKILEESQEL-CO NH2
在上述18个多肽中，特别优选的是多肽1、2、3、4、5、10、11、12、13、14。
本发明所提供的多肽与T-20、C34、T-1249等在序列结构上显著不同。T-20的序列为：Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-CONH2(Wild，C.T.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1994，91：9770-9774)；C34的序列为Ac-WMEWDREINNYTSLHISLIEESQNQQEKNEQELL-CONH2(Lu，M.，et al，J.Biomol.Struct.Dyn.，1997，15：465-471)；T-1249的序列为WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(SchneiderS.E.et al，J.Pept.Sci.2005，11(11)：744-753)。
本发明根据HIV病毒在膜融合过程中与细胞膜表面的受体分子的作用机制，设计了可以与病毒表面糖蛋白gp41相结合的活性多肽。本发明的作用位点位于gp41分子上三聚体NHR的疏水“Cavity”结构域及两端，可以在低至纳摩尔浓度完全抑制病毒的复制。
本发明所提供的多肽的优点是：
1、易于合成
T-20和T-1249分别由36个和39个氨基酸组成，合成时采用分段合成然后再连接的方法。本发明提供的抗HIV融合多肽可以仅由30-32个氨基酸组成，但仍具有高于T-20和T-1249的活性，且合成容易。
2、多肽序列和作用位点与现有药物不同
本发明的多肽序列和T-20、T-1249及其它已报道的融合多肽序列不同(Jiang S.，et al.，Curr.Pharm.Des.，2002，8(8)：563-580)，作用位点也不同，已报道的多肽，如T-20，C34等主要作用于gp41的NHR疏水“Cavity”及其N端结合，本发明提供的多肽与gp41的疏水“Cavity”结构域及两端结合。
3、与天然肽和现有药物相比活性更高
我们合成了本发明多肽C端的25肽，其在1μM仍不能抑制病毒和细胞的融合，这与文献中报道的与本发明C端的25肽相似的天然序列肽抑制融合的活性低的结果一致(EC50为2.8±1.4μM(Marc F，et al.Nature structural biology.1999，6(10)：953-960)。我们还合成了本发明的前端12个氨基酸的四聚体，其抑制病毒融合的IC50为2.6±0.1μM。文献中报道的与本发明的N端相似的序列肽(SLEQIWNNMTWMQWDK)没有检测到活性(Hovanessian A G.，etal.Immunity，2004，21：617-627)。
本发明在进行肽链设计时重点考虑了与gp41的三聚体NHR区上的“Cavity”结构域及其两端相结合的序列相结合的序列，除去了结合能力较弱的序列。同时引入了亲水氨基酸以增加本发明的水溶性，并在多肽序列中的“I”及“I+4”位引入可产生离子键的酸性或碱性氨基酸，使设计的序列具有较强的形成α-螺旋的能力，以更好的与上述区域结合。经上述设计得到的本发明多肽较天然肽的活性有了很大的提高(约500倍)，其中多肽3、4、10等的活性高于现有多肽药物T-20(见实施例4中表3)，且对T-20的耐药毒株依然有效(见
实施例5)。
4、水溶性好
由于在多肽分子中引入亲水氨基酸，本发明的多肽均易溶于水，水溶性的提高便于提高药物疗效及药物剂型开发。
本发明的多肽不仅可抑制HIV病毒与细胞的膜融合，实际上，对一些具有相似的膜融合过程的包膜病毒进入细胞同样都有抑制作用，如：人呼吸道合胞病毒(RSV)、肝炎病毒等。
本发明多肽的制备方法
本发明的多肽可以通过多种方法生产：如固相合成，液相合成，工程菌表达等。例如，和T-20的合成路线相似，先在树脂上分段合成，然后在液相连接个多肽，以形成本发明的多肽；合成或提取可以表达本发明多肽的DNA序列，连接到某一载体上，并转染到真核或者原核生物的细胞中，表达含有本发明所提供的多肽序列的蛋白质或者多肽，经提取和纯化得到本发明的多肽。
本发明多肽的使用方法
本发明的多肽可以直接单独用于HIV感染治疗，也可以与一种或多种抗HIV药物联合使用，以达到提高整体治疗效果的目的。这些抗HIV药物来自于(但不局限于)逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂和进入和融合抑制剂中的一种或几种。上述的逆转录酶抑制剂包括：AZT、3TC、ddI、ddT、d4T、Abacavir、Nevirapine、Efavirenz和Delavirdine的一种或几种。上述的蛋白酶抑制剂包括：Saquinavir mesylate、Idinavir、Ritonavir、Amprenavir、Kaletra和Nelfinavir mesylate的一种或几种。上述的进入和融合抑制剂包括：T-20、T-1249、C34、IQN37、5-Helix、TAK-779、SCH-C及天然提取的蛋白质等具有抑制病毒进入的功能的多肽。
可以将含有本发明的多肽或其截断物、衍生物及组合物的药物直接给予病人，或者与适宜的载体或者赋型剂混合后给予病人，以达到治疗HIV病毒感染的目的。这里的载体材料包括：水溶性载体材料，如聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，有机酸等；难溶性载体材料，如乙基纤维素，胆固醇硬脂酸酯等；肠溶性载体材料，如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等，优选的是水溶性材料。使用这些材料，可以制成如下的剂型：片剂、栓剂、溶液、胶囊、气雾剂、泡腾剂和滴剂等，优选的是溶液和气雾剂。
使用上述的剂型，本发明所提供的抗HIV药物及其衍生物、截断物和类似物及组合物可以：经注射给药，包括静脉注射、皮下注射、腔内注射等；呼吸道给药，如鼻腔给药；粘膜给药，如鼻腔，在局部起效或经粘膜吸收全身发挥作用；腔道给药，如经直肠和阴道给药，局部起效或者经吸收全身发挥作用。上述给药途径优选的是经注射给药。
附图说明：
图1是N36与多肽3的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变，图中，▲是复合物，●是多肽3，■是N36；
图2是N36与多肽6的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变，▲是复合物，●是多肽6，■是N36；
图3是N36与多肽7的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变，▲是复合物，●是多肽7，■是N36；
图4是N36与多肽9的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变；▲是复合物，●是多肽9，■是N36；
图5是多肽3的HPLC分析图；
图6是多肽4及其与N36形成的复合物的凝胶HPLC分析，图中，1是复合物，2是多肽4，3是N36；
图7是多肽6及其与N36形成的复合物的凝胶HPLC分析，图中，1是复合物，2是多肽6，3是N36。
图8是N36与多肽10的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变，图中，▲是复合物，●是多肽10，■是N36；
图9是N36与多肽12的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变，▲是复合物，●是多肽12，■是N36；
图10是N36与多肽13的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变，▲是复合物，●是多肽13，■是N36。
具体实施方式：
实施例1多肽的合成和纯化
本发明提供的多肽可以在美国应用系统生物的ABI 433型固相合成仪上合成，多肽的修饰手工完成。该合成使用的氨基酸以Fmoc保护(美国Advanced Chemtech公司产品)，使用的树脂为Rink树脂(美国Advanced Chemtech公司产品)。合成时使用1-羟基苯并三唑(HoBt)(美国Advanced Chemtech公司产品)溶解在N-甲基吡咯烷酮(NMP)(PE公司)中作为活化剂，使用二环己基碳二亚胺(DCC)(Acros公司)作为偶联剂，使用哌啶(Piperidine)(上海吉尔生化)除去保护基。氨基酸均具有L-型化学结构，它们被依次偶联在Rink树脂上。
Rink树脂的使用量与Fmc保护氨基酸的使用量按1∶5进行，保护氨基酸如下：Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Cys(Trt)-OH，Fmoc-Asp(OtBu)-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-LYs(Boc)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Gln(Trt)-OH，Fmoc-Arg(Pbf)-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH。氨基酸的偶联按照仪器操作规程的进行。
用人工方法将N-末端乙酰化。在反应腔中加入肽树脂、N-甲基吡咯烷酮(NMP)(用量为肽树脂重量的8-15倍)、醋酸酐(1g树脂上用0.5ml)，二异丙基乙酰胺(DIEA)(1g树脂上用0.7ml)，在室温反应2小时，过滤，树脂用二氯甲烷、甲醇及N-甲基吡咯烷酮(NMP)各洗涤三次。
上述合成后的树脂用裂解液(组成：二巯基苏糖醇(DTT)5％，水(5％)，三氟乙酸(TFA)88％，和三异丙基硅烷(TIPS)2％)(树脂与裂解液的用量比例为：0.5-1.0克树脂/10毫升裂解液)裂解2.5～3.0小时，过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸去大部分三氟乙酸后，用预冷的无水乙醚进行沉淀，过滤得到初肽，用稀氨水溶解固体，滤液冻干。
上述冻干粗肽用反相HPLC进行纯化，纯化柱为反相C18半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)，梯度洗脱液为含有不同梯度的乙腈(含0.1％TFA)/水(含0.1％TFA)，收集目标峰，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽。用基质辅助激光解析电离飞行质谱(MALDI-TOF-MS Reflex III，Micromass公司)测定各多肽的分子量，结果与理论计算值相符。
多肽3的合成具体步骤如下：称取0.17gRink树脂(0.1mmol，取代率0.6g/mmol)，各Fmoc保护氨基酸的用量为0.5mmol，以1-羟基苯并三唑(HoBt)及二环己基碳二亚胺(DCC)(Acros公司)为缩合剂，哌啶(Piperidine)(上海吉尔公司)脱保护剂，按美国应用系统生物的ABI 433型固相合成仪的操作说明，适当延长偶合时间(60-90min)及脱保护试剂时间(20-30min)，合成肽-树脂。得肽树脂0.52g。
取上述肽-树脂0.52g，放入10ml裂解液中(组成：0.5g二巯基苏糖醇(DTT)，0.5ml水，8.8ml三氟乙酸(TFA)，0.2ml三异丙基硅烷(TIPS)，裂解3.0小时，用G3玻璃砂芯漏斗过滤，用旋转蒸发仪蒸去大部分滤液至残余液体约2ml后，用100ml预冷的无水乙醚进行沉淀，静置1小时，G4玻璃砂芯漏斗过滤得到初肽，用1％的稀氨水溶解固体，滤液冻干得粗肽0.33g，纯度约为60％。
取粗肽0.1g用HPLC纯化，色谱柱为反相C18半制备柱(Zorbax，300SB-C18，9.4mm×25cm)。流动相：A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脱梯度为：1-5min10-45％A；5-30min，45-65％A，流速3ml/min，UV 214nm检测，每次上样5mg。收集目标组份，旋转蒸发除去大部分乙腈，冻干得到纯肽20mg。质谱测定分子量为4163.20Da(理论计算值4162.67Da)。
多肽3的纯度分析见附图5，分析条件如下：
色谱柱：Kromasil C-18柱(北京分析仪器厂，5μm，4.6×250mm)。流动相：A，乙腈(含0.1％TFA)；B，水(含0.1％TFA)。洗脱梯度为：1-5min 10-35％A；5-30min，35-65％A，流速1ml/min，UV 214nm检测
各多肽HPLC的保留时间见表1。
表1 9个多肽的HPLC分析的出峰时间
| 多肽编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 保留时间(min) | 16.36 | 16.86 | 18.71 | 19.24 | 18.45 | 17.34 | 17.21 | 17.12 | 15.98 |
注：多肽6、8、9的洗脱条件同多肽3，其余5个多肽的分析条件除洗脱梯度(为1-5min10-25％A；5-32min，25-80％A)和色谱柱(Kromasil C-18柱，5μm，4.6×250mm)外均相同。
实施例2多肽二级结构的CD谱测定
1.实验目的
通过测定本发明提供的多肽与N36(来自于HIV gp41的NHR区的一段序列，含有本发明多肽及T20等的作用位点)各自及二者复合物的二级结构(如螺旋含量)的改变来分析本发明多肽与N36二者之间的分子间相互作用。相互作用强的其活性可能也较高，反之亦然。
2.实验仪器、试剂和方法
仪器：JASCO J-715-150L型
参数选择：分辨率0.1nm，波宽5.0nm，响应时间4.0s，波长200-250nm
溶解缓冲液：50mM NaH2PO4(含150mM NaCl)pH＝7.2
多肽浓度：10μM
对本发明提供的18个多肽在水溶液中的二级结构测定依下述方法进行：
将N36及本发明提供的每种多肽分别用水溶解，浓度为2.5mM，然后以磷酸盐缓冲液稀释至10μM，在上述的参数下分别测定二级结构。然后将等量的N36及本发明混合后以磷酸盐缓冲液稀释至各自浓度均为10μM，37℃水浴中温育30min，取温育后的混合物在上述的参数下分别测定混合物的二级结构。
3.实验结果
附图1-8分别示出了N36与多肽3、6、7、9、10、12、13二者相互作用后螺旋构象的改变及上述多肽的HPLC分析图。
典型的α-螺旋在CD图上显示为208nm和222nm处有双负峰，附图1～4及附图8～10是N36与本发明多肽的螺旋构象及二者相互作用后构象的改变。从图中可以看出，本发明的多肽与衍生于HIV gp41 NHR区的N36有相互作用，二者的复合物在220nm处形成明显的负峰。复合物的摩尔旋光率[θ]按如下公式计算：
其中：θ为在圆二色谱仪上测得的椭圆度值(单位为mdeg)；n为多肽的残基数目，(复合物的残基数目按二个肽残基数之和的1/2计算)；C为多肽的摩尔浓度(复合物的浓度按10μM计算)；L为石英杯的光径，单位为厘米。
4.结论
本发明提供的大部分多肽在溶液中与N36相互作用后螺旋的含量增加，说明这些多肽与N36有相互作用，并形成复合物，该复合物的螺旋形成趋势增加。
实施例3凝胶HPLC检测本发明的多肽和N36的结合作用
1.实验目的和原理
目的是通过检测本发明多肽是否与N36结合，证明二者之间是否有较强的相互作用。
在凝胶柱中，物质依分子量大小进行分离，分子量大的物质首先被洗脱出来。本实验中，若多肽与N36形成复合物，分子量增大后会先被洗脱出来，若不能形成复合物则其混合物会形成两个等高的峰，分别对应本发明提供的多肽和N36。
2.实验仪器、试剂和方法
凝胶柱：TSK-G3000SWxl，5μm，7.8mm×300mm(日本TOSOH公司产品)
仪器：Bio-Rad 13507泵，Bio-DimensionTM UV/VIS检测器
流动相：50mM NaH2PO4(含150mM NaCl)pH＝7.2
梯度：0.8ml/min等梯度洗脱
检测波长：UV 214nm
步骤：将N36及本发明的多肽4先以去离子水溶解，浓度为2.5mM。然后分别用50mMNaH2PO4(含150mM NaCl，pH＝7.2)稀释至0.208mM，稀释后的溶液各取30μl分别进样分析，按照上述条件进行洗脱。取稀释后的各溶液30μl，混合后在37℃水浴中温育30min，取全部混合物上样，分析条件同上。
3.实验结果
在本试验中，本发明的多肽和N36形成复合物后分子量增大，先被洗脱出来，后洗脱的为单体分子。图6显示的第一峰(t＝12.2min)是多肽4及其与N36形成的复合物的洗脱峰；图7显示的第一峰是多肽6及其与N36形成复合物的洗脱峰(t＝12.50min)。
表2 各多肽及与N36形成的复合物的保留时间
| 多肽编号 | ||||||||||
| N36 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | |
| 单体多肽保留时间(min) | 14.94 | 13.18 | 13.08 | 14.98 | 14.68 | 14.71 | 13.51 | 15.40 | 14.10 | 12.59 |
| 复合物保留时间(min) | - | 12.95 | 12.82 | 12.25 | 12.28 | 12.39 | 12.03 | 12.50 | 13.42 | 11.38 |
4.结论
本发明提供的多肽可以在磷酸盐缓冲液中与N36形成多聚体复合物，说明二者之间有较强的相互作用。
实施例4本发明的多肽对HIV病毒抑制作用
本发明提供的多功能HIV进入抑制剂具有抑制病毒和细胞膜融合的作用，通过以下实验进行测定。所用细胞和病毒均来自于美国NIH AIDS Research and Reference ReagentProgram。
实验一：对HIV-1介导的细胞间的融合抑制作用
HIV-1 IIIB病毒感染的人淋巴细胞H9以荧光染料Calcein-AM(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)染色，然后与人淋巴细胞MT-2按一定的比例混合后加在96孔板上，分别加入本发明的9个多肽(见表3)，在37℃培养2小时，以未加本发明的多肽的细胞作为对照。在带有标尺的荧光倒置显微镜(Zeiss，Germany)下观察融合和未融合的细胞并计数，使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)计算融合百分率和半数抑制剂量(IC50)、90％抑制剂量(IC90)。(Jiang S，et al.Procedings of SPIE.2000，3926，212-219.及Jiang S，et al.J.Virol.Meth.1999，80，85-96.)结果见表3。
实验二：病毒中和作用
以含10％胎牛血清(Gibco Laboratories)的RPMI-1640培养基(Gibco Laboratories，Grand Island，NY)悬浮人淋巴细胞MT-2，细胞密度为5×104个/毫升，然后铺板，每孔体积为200μl。以100倍TCID50(半数感染剂量)浓度的HIV-1 IIIB病毒进行感染。本发明的多肽孔经梯度稀释后加入上述经感染的病毒培养基中，以未加本发明的多肽的孔作为对照，然后培养过夜。第二天换为新鲜的培养基。37℃经过四天的培养后，收集培养物上清100μl，加入等体积的含5％Triton X-100的水，ELISA方法检测p24的含量(Jiang，S，et al.J.Exp.Med.1991，174，1557-1563)。
结果见表3，CF和VN(p24)分别为实验一和实验二的实验结果。
表3 18个多肽对HIV病毒的抑制活性
| IC50(nM)±SD | IC90(nM)±SD | |||
| 测定方式 | CF | VN(p24) | CF | VN(p24) |
| 多肽1 | 27.12±4.03 | - | - | - |
| 多肽2 | 18.12±0.15 | - | - | - |
| 多肽3 | 16.43±0.56 | 7.43±1.67 | 24.61±1.03 | 29.28±2.70 |
| 多肽4 | 14.16±2.94 | - | - | - |
| 多肽5 | 42.09±6.39 | - | - | - |
| 多肽6 | 17.47±0.17 | 73.39±9.11 | 26.72±0.29 | 145.96±33.28 |
| 多肽7 | 70.31±6.26 | 55.82±4.01 | 109.92±4.17 | 158.66±13.46 |
| 多肽8 | 54.45±8.83 | - | - | - |
| 多肽9 | 98.91±3.23 | 237.65±84.72 | 175.511±7.89 | 591.29±64.44 |
| 多肽10 | 7.01±0.59 | - | 12.18±0.85 | - |
| 多肽12 | 12.72±0.17 | - | 16.57±0.22 | - |
| 多肽13 | 10.62±0.49 | - | 15.24±0.40 | - |
| 多肽14 | 16.77±1.73 | - | 27.37±0.90 | - |
| 多肽15 | 97.85±7.88 | - | 133.95±4.25 | - |
| 多肽16 | 85.18±3.76 | - | 97.85±7.88 | - |
| 多肽17 | 29.32±3.13 | - | 52.80±2.62 | - |
| 多肽18 | 24.10±0.39 | - | 33.80±0.17 | - |
| T-20 | 18.48±1.30 | 12.25±1.94 | - | 22.63±3.73 |
对表3的说明：
1、名词解释
CF：细胞融合/cell fusion； VN：病毒中和试验/viral neutralization；
2、多肽的纯度：细胞融合和中和实验所用的多肽均经纯化，除多肽4外(纯度70％)纯度大于90％。试验中以T-20作为对照，后者的纯度大于95％。
3、上述每个数值均测四次，并取平均值。
实施例5本发明的多肽对T-20耐药性HIV细胞株的融合抑制作用
方法同实施例4的实验一，所不同的是使用临床分离的T-20抗性毒株(92US657)感染细胞，其余相同。
本发明所提供的多肽3可以在1.0uM完全抑制病毒在细胞内的复制，而T-20则在3.2uM仍不能抑制病毒的复制。
结论：多肽3抑制病毒的复制活性高于对照药物T-20。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>抑制HIV病毒融合的多肽及其用途
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Val Glu Trp Asn Asn Lys Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Glu Ile Leu Lys Lys Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>2
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Val Glu Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Lys Ile Glu
1 5 10 15
Glu Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Glu Ile Leu Lys Lys Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>3
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Val Glu Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>4
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Val Glu Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>5
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Val Glu Trp Asn Asn Lys Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>6
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Trp Asn Glu Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu Asn Tyr
1 5 10 15
Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>7
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Trp Asn Glu Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu Asn Tyr
1 5 10 15
Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>8
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>8
Val Glu Trp Asn Glu Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>9
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>9
Leu Glu Trp Asn Glu Met Thr Trp Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Gln
20 25 30
<210>10
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
<400>10
Leu Glu Trp Asn Glu Met Thr Thr Met Glu Trp Glu Arg Glu Ile Glu
1 5 10 15
Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Tyr Lys Ile Leu Glu Glu Ser Gln Glu Leu
20 25 30
Claims (9)
1.通式I多肽：
α-X1-X2WN-X3-X4-TWMEWER-X5-IE-X6-YTKLIY-X7-IL-X8-SQEX9-β
通式I
其中：
α选自氨基、乙酰基、马来酰基、琥珀酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基或脂肪酰基；
X1选自V、L、I、M中任意一个氨基酸或空缺；
X2选自E、D、N中任意一个氨基酸或空缺；
X3选自E、D、N中任意一个氨基酸；
X4选自K、M、Q或L中任意一个氨基酸；
X5选自K或E；
X6选自N、E或D中任意一个氨基酸；
X7选自D、E、K或R中任意一个氨基酸；
X8选自D、E、K或R中任意两个相同或不同氨基酸；
X9选自Q或L；
β选自酰胺基、羧基或羧基衍生物；
上述其它字母表示如下氨基酸：
D-天冬氨酸；E-谷氨酸；I-异亮氨酸；K-赖氨酸；L-亮氨酸；M-蛋氨酸；N-天冬酰胺；Q-谷氨酰胺；R-精氨酸；S-丝氨酸；T-苏氨酸；V-缬氨酸；W-色氨酸；Y-酪氨酸。
2.权利要求1所述的通式I多肽，其中α选自氨基或乙酰基；β选自酰胺基。
3.权利要求1所述的通式I多肽，其中X1是V、L或空缺；X2是E或空缺；X3是E或N；X4选自K或M；X5选自K或E；X6选自E或N；X7选自E或K；X8选自E和K中两个相同或不同氨基酸。
4.权利要求1所述的通式I是以下多肽：
多肽1：NH2-SEQ ID No：1-CONH2
多肽2：NH2-SEQ ID No：2-CONH2
多肽3：NH2-SEQ ID No：3-CONH2
多肽4：Ac-SEQ ID No：4-CONH2
多肽5：Ac-SEQ ID No：5-CONH2
多肽10：NH2-SEQ ID No：6-CO NH2
多肽11：Ac-SEQ ID No：7-CO NH2
多肽12：NH2-SEQ ID No：8-CO NH2
多肽13：NH2-SEQ ID No：9-CO NH2
多肽14：NH2-SEQ ID No：10-CO NH2
5.用权利要求1、2、3或4中任一权利要求所述的多肽制备抑制病毒包膜融合的药物的用途。
6.权利要求5所述的用通式I多肽制备抑制病毒包膜融合的药物的用途，所述病毒是HIV病毒、人呼吸道合胞病毒或肝炎病毒。
7.用权利要求1、2、3或4中任一权利要求所述的多肽制备治疗HIV感染药物的用途。
8.一种抑制病毒包膜融合的药物组合物，其特征是含有权利要求1、2、3或4中任一权利要求所述的多肽。
9.权利要求8所述抑制病毒包膜融合的药物组合物，所述病毒是HIV病毒、人呼吸道合胞病毒或肝炎病毒。
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Granted publication date: 20090128 Termination date: 20160614 |
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