CN1946850B - 用于形成结构确定的有机分子的方法 - Google Patents

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CN1946850B CN2005800129628A CN200580012962A CN1946850B CN 1946850 B CN1946850 B CN 1946850B CN 2005800129628 A CN2005800129628 A CN 2005800129628A CN 200580012962 A CN200580012962 A CN 200580012962A CN 1946850 B CN1946850 B CN 1946850B
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Abstract

本发明提供了形成有机分子的方法，方法包括将水解酶与有机反应物接触。也提供了用于形成有机硅分子的方法，方法包括将角质酶与有机硅反应物接触。还提供了用于形成有机锗烷分子的方法，方法包括将水解酶与有机锗烷反应物接触。

Description

用于形成结构确定的有机分子的方法
本发明涉及用于形成有机分子的方法，更具体地，涉及用于形成有机分子的方法，该方法包括将水解酶与有机反应物接触。
许多有机分子的生物分子机制基本上是不确定的。特别是，含有硅的有机分子是多种植物、动物和微生物系统中的生长和生物功能所必需的，然而这些相互作用的分子机制实际上是未知的。二氧化硅生物合成领域内的自然系统的体外研究是复杂的。包括仿生方法在内的早期的机制研究常常不能识别硅酸及其类似物的化学。例如，据测定silicatein在二氧化硅微粒的形成过程中可催化四乙氧基硅烷的缩聚。然而，由于产品及随后的分析的限制，该研究不能区分silicatein在生物硅化过程中的水解和缩合反应中的作用。
因此，仍然需要形成结构确定的有机分子和材料，特别是有机硅分子的改良的方法。
因此，本发明贯注于形成有机分子的方法。方法包括将水解酶与有机反应物接触。有机反应物包含下式：
(R1)4-nX(OR2)n  或
Figure G05812962820061027D000011
或
Figure G05812962820061027D000012
其中，X选自硅和锗；R1选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、醇、环氧(epoxy)、醚、胺、-(OXR4 2)y-OXR4 3及其组合；R2选自烷基、氢、醚及其组合；R3选自烷基、不饱和烷基、芳基、氢及其组合；R4选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、氢、羟基、烷氧基、醇、环氧、醚、胺、-(OXR4 2)y-OXR4 3及其组合；n是0-4的整数；y是0或大于0的整数；和z是3或大于3的整数。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角质酶(cutinase)或其组合。水解酶催化有机反应物的水解和缩合从而形成有机分子。
在本发明的另一个实施方案中，提供了形成有机硅分子的方法。该方法包括将水解酶与有机硅反应物接触。该有机硅反应物包含下式：
(R1)4-nSi(OR2)n  或
Figure G05812962820061027D000021
或
Figure G05812962820061027D000022
其中，R1选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、醇、环氧、醚、胺、-(OSiR4 2)y-OSiR4 3及其组合；R2选自烷基、氢、醚及其组合；R3选自烷基、不饱和烷基、芳基、氢及其组合；R4选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、氢、羟基、烷氧基、醇、环氧、醚、胺、-(OSiR4 2)y-OSiR4 3及其组合；n是0-4的整数；y是0或大于0的整数；和z是3或大于3的整数。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角质酶或其组合。水解酶催化有机硅反应物的水解和缩合从而形成有机硅分子。
在本发明的另一个实施方案中，提供了形成有机硅中间体分子的方法。该方法包括将水解酶与有机硅反应物接触。该有机硅反应物包含下式：
(R1)4-nSi(OR2)n  或或
Figure G05812962820061027D000024
其中，R1选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、醇、环氧、醚、胺、-(OSiR4 2)y-OSiR4 3及其组合；R2选自烷基、氢、醚及其组合；R3选自烷基、不饱和烷基、芳基、氢及其组合；R4选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、氢、羟基、烷氧基、醇、环氧、醚、胺、-(OSiR4 2)y-OSiR4 3及其组合；n是0-4的整数；y是0或大于0的整数；和z是3或大于3的整数。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角质酶或其组合。水解酶催化有机硅反应物的水解和缩合从而形成有机硅中间体分子。
在本发明的另一个实施方案中，提供了形成有机硅分子的方法。
该方法包括将水解酶与有机硅中间体反应物接触。该有机硅中间体反应物包含下式：
(R1)4-nSi(OR2)n或
Figure G05812962820061027D000031
其中，R1选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、醇、环氧、醚、胺、-(OSiR4 2)y-OSiR4 3及其组合；R2是氢；R4选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、氢、羟基、烷氧基、醇、环氧、醚、胺、-(OSiR4 2)y-OSiR4 3及其组合；n是0-4的整数；和y是0或大于0的整数；a+b等于z；和z是3或大于3的整数。水解酶包括脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角质酶或其组合。水解酶催化有机硅中间体反应物的缩合从而形成有机硅分子。
在目前确定的反应条件下合成有机分子的能力是有利的，因为该反应条件有助于有机反应物水解并缩合从而形成有机分子。对于本领域技术人员来说，本发明的其它优势将会由于下面的详细描述而变得明显，其中显示并描述了本发明的备选示例性实施方案。正如将会认识到的，本发明可包括其它不同的、显而易见的方面和实施方案，它们全部都未背离本发明。因此，应该把附图和描述看作本质上是说明性的而并不是限制。
图1说明了胰蛋白酶原的一级结构；
图2说明了胰蛋白酶原的活化；
图3说明了三甲基乙氧基硅烷阴性对照反应的GC-FID色谱图；
图4说明了三小时后蛋白酶催化的缩合的研究；
图5说明了三小时后缩合对照反应；
图6说明了α-胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶不纯研究；
图7说明了三甲基硅烷醇的缩合的蛋白质抑制；
图8说明了温度对于胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇缩合的影响；
图9说明了胰蛋白酶在中性介质中的热变性作为胰蛋白酶浓度的函数的研究；
图10说明了在25℃下胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合；
图11说明了饱和的三甲基硅烷醇与胰蛋白酶的摩尔比研究；
图12说明了胰蛋白酶在25℃下的自解；
图13说明了提出的胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇缩合的反应机制；
图14说明了不同胰蛋白酶种类的活性的pH研究；
图15说明了pH对于胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇缩合的影响；
图16说明了三甲基硅烷醇和pH对于胰蛋白酶活性的影响；
图17说明了三小时后的水解和缩合对照反应；
图18说明了在10℃下胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷的水解和缩合；
图19说明了在10℃下胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷水解以及三甲基硅烷醇缩合的转化数。
图20说明了胰蛋白酶催化的三甲基烷氧基硅烷的水解和缩合；
图21说明了胰蛋白酶催化的乙氧基硅烷的水解和缩合；
图22说明了胰蛋白酶催化的1，1-二甲基-1-硅杂-2-氧杂环己烷的水解和缩合；
图23说明了三甲基乙氧基硅烷反应的蛋白质抑制；
图24说明了不同来源的胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷的水解和缩合；
图25说明了钙对于胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇缩合的影响；以及
图26说明了在25℃下14小时后角质酶催化的三甲基硅烷醇的缩合。
在形成有机分子中的水解和缩合反应的研究是复杂的。具体而言地，这样的反应由于二氧化硅、硅酸盐和硅酸对pH、浓度和温度的增强的敏感性而在生物硅化过程中是复杂的。因而，本发明通过利用水解酶来形成结构确定的有机分子(更具体地为有机硅分子)克服了这样的复杂性。具体而言，如在下列反应顺序中显示的，水解酶非特异性地促进了有机反应物(A)的水解从而形成有机中间体反应物(B)并随后选择性地催化有机中间体反应物(B)的缩合从而形成有机分子(C)  。
(反应I)
(反应II)
Figure G05812962820061027D000052
(反应III)
Figure G05812962820061027D000053
反应(I)、(II)和(III)的有机反应物(A)是水解酶选择性地催化有机反应物水解和缩合的可接受的底物。有机反应物(A)的反应位点含有促使有机反应物(A)的水解和缩合从而最终形成有机分子(C)的电正性原子(例如硅或锗)。因此，结构上确定的有机分子可使用反应(I)、(II)和(III)的有机反应物(A)来形成。
本领域的技术人员将会想到多种可在反应物中利用的无机元素X，在此可使用其中的任何一种。在一个实施方案中，X选自硅和锗。另外，本领域的技术人员将会想到在上述反应中可用作R1、R2、R3和R4的多种取代基，在此可使用其中的任何一种。同样，本领域技术人员将会理解，有机结构的R基团不必须是同一重复单元。而是，对于每一个重复单元可独立地选择R基团。
在一个实施方案中，R1选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、醇、环氧、醚、胺、-(OXR4 2)y-OXR4 3及其组合，其中R4选自烷基、卤烷基、不饱和烷基、芳基、氢、羟基、烷氧基、醇、环氧、醚、胺、-(OXR4 2)y-OXR4 3及其组合。在另一个实施方案中，R2选自烷基、氢、醚及其组合。在另一个实施方案中，R3选自烷基、不饱和烷基、芳基和氢。在上面详述的每个实施方案中，将会进一步理解，烷基、卤烷基、不饱和烷基和烷氧基可以是具有一个碳或多于一个碳的取代基。而且，在上述反应中，n定义为0-4的整数；y定义为0或大于0的整数；和z是3或大于3的整数。另外，整个本申请所使用的*表示环状结构，即没有确定的末端基团。
有机反应物(A)可以是单官能的或多官能的。例如，有机反应物(A)的式可选自(R1)4X、(R1)3X(OR2)1、(R1)2X(OR2)2、(R1)1X(OR2)3和X(OR2)4。双官能有机反应物的具体实例包括但不限于(CH3)2Si(OCH3)2、(CH3)(CF3CH2CH2)Si(OCH3)2、(C6H5)(CH3)Si(OCH3)2和(CH3CH2)2Ge(OCH2CH3)2。三-和四-官能有机反应物的具体实例分别包括但不限于(CH3)Si(OCH2CH3)3和Si(OCH2CH3)4。有机反应物还可以是线性的、分支的、树脂状的或环状的。在一个实施方案中，线性、环状和分支的有机分子在最初与水解酶相互作用后可以是完全羟基化的。环状、线性和分支的有机反应物的具体实例分别包括但不限于1，3，5，7-四甲基-1，3，5，7-四甲氧基-环四硅氧烷、1，3-双(羟基)四甲基二硅氧烷和[(HO)2(CH3)SiO]3SiCH3。
一旦确定合适的有机反应物，将该有机反应物与水解酶接触以便催化有机分子的形成。水解酶可源于细菌、真菌或哺乳动物来源，或者该水解酶可源于任何其它合适的来源。该酶通常作为可溶的溶液或异质的混悬液存在，并且该酶可以经冻干或固定化。在一个特殊的实施方案中，水解酶选自脂酶、蛋白酶、磷酸酯酶、酯酶、角质酶及其组合。在另一个实施方案中，水解酶包括脂酶例如南极假丝酵母(Candida antarctica)脂酶、南极假丝酵母脂酶B、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂酶、麦胚脂酶或其组合。在另一个实施方案中，水解酶包括蛋白酶例如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其组合。
在另一个实施方案中，水解酶是胰蛋白酶或与胰蛋白酶至少70％同源的酶。在Lys6-Ile7肽键水解并形成β-胰蛋白酶(即二硫化物交联的单多肽链)后胰蛋白酶原(图1-2)得以活化。与新的N-末端异亮氨酸残基的疏水性相互作用导致形成已知参与底物识别的区域，例如结合结构域和氧阴离子孔(oxyanion hole)。如这些区域所确定的，胰蛋白酶选择性地水解与碱性残基(即精氨酸＞赖氨酸＞＞天然氨基酸)邻接的肽键。活化后，Lys131-Ser132和Lys176-Asp177键的自溶解分别导致形成α-胰蛋白酶(即交联的两链结构)和假胰蛋白酶(pseudotrypsin)(即交联的三链结构)。
值得注意的是，活化反应和结构变化引起催化性三联体的区域(即Ser183-His46-Asp177，图1和SEQ ID NO：1)的细微变化。基于这些区域，胰蛋白酶由于口袋底部的天冬氨酸残基的静电引力而与底物中的碱性残基例如精氨酸和赖氨酸具有亲和力。在这些区域内，非共价相互作用参与了在整个酶促反应中的底物的稳定。商业的胰蛋白酶制剂含有占优的α-和β-胰蛋白酶及其他消化的酶污染物的混合物。基于一级结构，胰蛋白酶的分子量是23,305。而且，可向该反应加入钙以有助于水解酶的反应活性，特别是提高酶的稳定性。
除非另外说明，在本说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、特性例如分子量、反应条件等的所有数字应理解为在所有情况下是带有术语“约”的。因此，除非另外说明，在下面的说明书和权利要求书中列出的数字特性是近似值，其可根据在本发明的实施方案中所寻求获得的期望特性而改变。虽然，阐明本发明的宽范围的数字范围和参数是近似值，但在具体实施例中列出的数值是尽可能精确地报导的。可是，任何数值固有地含有在它们各自的测量中存在的误差必然引起的某些误差。
反应的浓度、温度和pH可如下面详细列出的而改变。具体而言，水解酶的浓度通常大于1mg/mL。在另一个实施方案中，水解酶的浓度为约10mg/mL-约80mg/mL。在另一个实施方案中，水解酶的浓度为约20mg/mL-约60mg/mL。在另一个实施方案中，水解酶的浓度是约40mg/mL。在一个实施方案中，有机反应物与酶的摩尔比小于或等于约40000∶1。在另一个实施方案中，有机反应物与酶的摩尔比小于或等于约1000∶1。
反应温度通常在约5℃和90℃之间。在另一个实施方案中，反应在约20℃-约50℃的温度下进行。在另一个实施方案中，反应在约25℃的温度下进行。反应的pH通常为约5.0-约8.0。在一个实施方案中，反应的pH为7.0。
另外，反应可以在无溶剂的(干净的(neat))条件下进行，或者反应可以利用含水溶液或溶剂进行。合适的溶剂包括但不限于，水可混溶的有机溶剂如THF和乙腈，以及相对无水的有机溶剂例如甲苯和己烷。
为了使本发明更容易理解，可参考下面的实施例，所述的实施例旨在举例说明本发明，而不是用于限制本发明范围。
实施例
材料
蛋白质和肽
黑曲霉(Aspergillus niger)脂酶(Amano脂酶A，#53，478-1)、N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE，#B4500)、N-苯甲酰基-L-酪氨酸乙酯(BTEE，#B6125)、牛胰α-胰凝乳蛋白酶(#C-4129)、用TLCK处理的牛胰α-胰凝乳蛋白酶(#C3142)、牛胰磷脂酶A2(P-8913)、牛胰胰蛋白酶(#T4665)、用TPCK处理的牛胰胰蛋白酶(#T1426)、牛血清白蛋白(BSA，#B4287)、南极假丝酵母脂酶(#62299)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)脂酶(#62303)、大西洋鳕(Gadus morhua)胰蛋白酶(#T9906)、猪胃胃蛋白酶(#P7012)、爪哇毛霉(Mucor javanicus)脂酶(#62304)、Novozyme 435(固定化的南极假丝酵母脂酶B，～1％蛋白质，#53，732-2)、番木瓜乳汁木瓜蛋白酶(#P4762)、娄地青霉(Penicillium roqueforti)脂酶(#62308)、猪β-球蛋白(#G2512)、猪胰羧肽酶B(#C9584)、猪胰弹性蛋白酶(#E0258)、猪胰脂酶(#L-3126)、猪胰胰蛋白酶(#T0303)、蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶，Carlsberg，#P8038)、洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)脂酶(Amano lipase PS，#53，464-1)、萤光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)脂酶(#62321)、米黑根毛霉脂酶(#62291)、来自大豆的胰蛋白酶抑制剂(来自大豆的Popcorn抑制剂，#T9128)、来自大豆的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂(Bowman-Birk抑制剂，#T9777)、盐酸N-α-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮(TLCK，#T7254)、N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK，#T4376)、麦胚脂酶(#62306)从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)购买。牛肾组织蛋白酶L(#219418)、人肝组织蛋白酶L(#219402)和Paramecium tetraurelia组织蛋白酶L(#219412)从Calbiochem，EMD Biosciences(San Diego，CA)购买。在玉米中表达的重组的牛的胰蛋白酶(#TRY，CAS#9002-07-7)从ProdiGene(College Station，TX)购买。角质酶变体由GenencorInternational，Inc.(Palo Alto，CA)提供。
水
超纯水从Dow Corning Corporation(Midland，MI)的Milli-Q系统获得。Trizma预调制的晶体pH 7.0(Tris-HCl，#T3503)、pH 7.5(Tris-HCl，#T4128)、pH 7.8(Tris-HCl，#T4503)、pH 8.0(Tris-HCl，#T4753)和pH 9.0(Tris-HCl，#T6003)从Sigma-Aldrich购买。缓冲液pH 4.00(邻苯二甲酸氢钾，#SB101)、pH 5(氢氧化钠-柠檬酸，#A015860101)，pH 6.00(一碱价的磷酸钾-氢氧化钠，#SB104)和pH10.00(碳酸钾-硼酸钾-氢氧化钾，#SB115)从Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)购买。
有机和无机分子
乙腈(#A996-4)、丙酮(#A929-4)、五氧化二磷(#A244)、2-丙醇(#A451-4)、四氢呋喃(#T427-1)和甲苯(#T291-4)从FisherScientific购买。乙酸(#A6283)、氯化钙(#C3881)、十二烷(#44010)、乙醇(#45，984-4)、己醇(#H13303)、盐酸(#33，925-3)、氢化铝锂(#19，987-7)、氯化钠(#20，443-9)和碳酸氢钠(#34，094-4)从Sigma-Aldrich购买。四乙二醇单甲基醚(#T1372)从TCI America(Portland，OR)购买。二乙基二乙氧基锗烷(#GED 3404.2)从Gelest，Inc.(Tullytown，PA)购买。HPLC级的有机溶剂在整个实施例中使用。
基于硅的分子
三甲基硅烷醇(CAS#1066-40-6，#12848-72)、七甲基羟基四环硅氧烷(#11050-134B)、六甲基环三硅氧烷(#E-459-80，cut#3)、八甲基环四硅氧烷(#E-1927-93-2，lot#2)、1，3，5-三甲基-1，3，5-三(3，3，3-三氟丙基)环三硅氧烷(LS Trimer)、1，3，5，7-四甲基-1，3，5，7-四(3，3，3-三氟丙基)环四硅氧烷(#H-1387-145)和2，4，6，8-三甲基-2，4，6，8-四苯基-环四硅氧烷(#1923-44A)从DowCorning Corporation获得。3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷(#SIA0603.0)、双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(#SIB1846.0)、二甲基二甲氧基硅烷(#SID 4123.0)、1，1-二甲基-1-硅杂-2-氧杂环己烷(#SID4234.0)、3-环氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷(#SIG5825)、六甲基二硅氧烷(#SIH6115.0)、三甲基乙氧基硅烷(#SIT8515.0)和三苯基乙氧基硅烷(#SIT8652.0)从Gelest，Inc.(Tullytown，PA)购买。六甲基二硅氮烷(#37921-2)和四乙氧基硅烷(#23620-9)从Sigma-Aldrich购买。苯基二甲基乙氧基硅烷(#P0161)从UnitedChemical Technologies，Inc.(Bristol，PA)购买。甲基三乙氧基硅烷(#M9050)从Huls America，Inc.(Bristol，PA)购买。
三甲基烷氧基硅烷的合成
合成了具有极性和非极性离去基团的两种三甲基烷氧基硅烷。用双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺将四乙二醇单甲基醚(TGME)和己醇甲硅烷基化，以分别获得目标极性(Me3SiO(CH2CH2O)4CH3)和非极性(Me3SiOC6H13)硅烷。
实施例1
生物催化研究
该研究贯注于酶在烷氧基硅烷的体外水解和缩合过程中催化硅氧烷键形成的能力的定量测试。由于在形成具有单个硅氧烷键的分子的过程中选择单官能的硅烷作为反应物，因此建立严格的方法来制备玻璃器皿，并通过气相色谱法(GC)分离和定量分析反应产物。
萃取效率的测量定义为反应物和产物的百分比产率。物料衡算(mass balance)等于萃取值的总和。根据色谱法结果，在25℃下THF的萃取效率与乙醚、二氯甲烷和甲苯相比较是优异的。基于两次萃取，通过THF通常获得大于98％的物料衡算。
基于一式三次的测量，分析物的响应系数得以计算并确定为相关于三个量级范围内的浓度(即0.1-10％(w/w))呈线性。如图3中显示的，将烷氧基硅烷、硅烷醇和二硅氧烷分析物通过色谱法进行解析。解析这些分析物的能力对于区分酶在生物硅化期间在水解和缩合反应中的作用来说是必需的。相较而言，因为产物及随后的分析的限制，甘桔荔枝海绵(Tethya aurantia)(即silicatein)和Equisetumtelmateia植物(即生物聚合体)研究，包括silicatein-模拟方法(即二嵌段多肽)，不能区分蛋白质或多肽在生物硅化期间在水解和缩合反应中的作用。
实施例2
酶催化的缩合研究
该研究贯注于用三甲基硅烷醇进行酶筛选以便评价各种酶催化硅氧烷键形成的能力。基于从甘桔荔枝海绵(silicatein)、Cylindrotheca fusiformis diatom(silaffin)和Equisetumtelmateia植物(生物聚合体提取物)分离的蛋白质的相似性，选择了一系列脂酶和丝氨酸-蛋白酶作为同源蛋白水解酶。除了催化相当的反应(即酰胺和/或酯键的水解)，水解酶中的活性位点由类似的丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸催化性三联体组成。与对照反应比较，用三甲基硅烷醇筛选了在表1中详细描述的哺乳动物、真菌和细菌的脂酶和蛋白酶。在该研究中，对照反应定义为非酶促反应。具体而言，将在不存在蛋白质的情况下进行的试验定义为阴性对照反应。蛋白质分子例如牛血清白蛋白和猪γ-球蛋白用于研究非特异性蛋白质催化。
表1：酶筛选
Figure G05812962820061027D000121
1南极假丝酵母脂酶B固定在丙烯酸类树脂珠(Novozyme
Figure G05812962820061027D000122
435)上。
反应之前，将玻璃小瓶用丙酮(×2)和乙醇(×2)漂洗，干燥，并将其于25℃在存在乙酸(0.2mmol)的情况下用六甲基二硅氮烷(1mmol)进行甲硅烷基化30分钟。随后，将所述小瓶用乙醇(×2)漂洗并在110℃的烘箱中干燥。确定甲硅烷基化的玻璃小瓶没有污染具有三甲基硅烷醇或六甲基二硅氧烷的反应体系。
在1.3mL甲苯或1.1mL水中以5∶1的三甲基硅烷醇(225mg)与蛋白质(45mg脂酶、蛋白酶或BSA)的重量比配制反应体系。将甲苯在氢化铝锂上干燥(‘干甲苯’，11ppm水)，和用Milli-Q水进行水合(‘湿甲苯’，467ppm水)。在Aquatest IV滴定器(PhotovoltCorporation，New York，NY)上进行Karl Fischer滴定来测量甲苯中的水含量。将Milli-Q水(‘水’)用50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0(‘缓冲的pH 7’)缓冲。三甲基硅烷醇在水中估计的溶解度是4.2％(即42.56mg/mL)。基于该配制，在水中进行的两相反应用三甲基硅烷醇(～200mg/mL)饱和。封闭的(用螺旋盖盖住的)反应于25℃并伴随磁力搅拌在惰性玻璃小瓶中进行6天。分离并通过GC定量分析反应产物。分析之前，将含水的反应体系在存在NaCl时用THF萃取(×2)并通过Whatman Autovial
Figure G05812962820061027D000131
50.45μm的Teflon过滤器(#AV115NPUORG)进行过滤。
结果总结于表2中。与阴性对照和非特异性蛋白(即BSA)反应相较而言，观察到所选择的脂酶以及胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶在温和条件下于形成六甲基二硅氧烷的过程中催化三甲基硅烷醇的缩合。据测定，在表2中用(√)选中的酶比阴性对照反应催化超过十倍的三甲基硅烷醇缩合；而且，在有机和含水介质中比BSA反应分别催化超过三倍或十倍的三甲基硅烷醇缩合。相反，在表2中未用(√)选中的酶催化模型缩合反应的能力与对照反应基本没有不同。总而言之，在水中相对的缩合速率增加。与脂酶相反，蛋白酶将仅与水溶性底物相互作用。三甲基硅烷醇估计的在水中的溶解度是4.2％(即42.56mg/mL)。
表2：六天后酶催化的缩合研究
Figure G05812962820061027D000133
1南极假丝酵母脂酶B固定在丙烯酸类树脂珠(Novozyme
Figure G05812962820061027D000141
435)上。
实施例3
蛋白酶-催化的硅烷醇反应
基于来自牛胰腺的胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的异常的活性(表2)，将蛋白酶确定为目标催化剂。因而，选择一系列丝氨酸-、半胱氨酸-、天冬氨酸-和金属-蛋白酶以评估它们在中性介质(pH 7.0)中催化具有硅氧烷键的分子形成的能力(方案1)。
方案1：蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合。
与对照反应比较，用三甲基硅烷醇筛选在表3中详述的蛋白酶催化硅氧烷缩合的能力。相较而言，在酶催化的缩合研究中进行的最初反应进行六天，而在本研究中进行3小时。
表3：蛋白酶筛选
Figure G05812962820061027D000143
反应之前，将玻璃小瓶甲硅烷基化。在0.5mL的50mM Tris-HCl缓冲的Milli-Q水，pH 7.0中以4∶1的三甲基硅烷醇(80mg)与蛋白质(20mg蛋白酶、BSA或γ-球蛋白)的重量比(～1000∶1硅烷醇与蛋白酶的摩尔比)配制反应体系。
基于三甲基硅烷醇在水中估计的溶解度(42.56mg/mL)，三甲基硅烷醇的浓度(～160mg/mL)饱和了含水介质并产生两相反应混合物。将反应产物分离，并如图4中所说明的通过GC进行定量分析。在分析之前，将含水反应体系在存在NaCl时用THF萃取(×2)并通过WhatmanAutovial50.45μm Teflon
Figure G05812962820061027D000152
过滤器进行过滤。
胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶在温和条件下优先催化三甲基硅烷醇的缩合。将中性介质(pH 7.0)用于区分酶催化和化学催化。因为催化区域的特异性，蛋白酶是底物选择性的。选取三甲基硅烷醇作为模型硅烷醇来研究酶在具有单个硅氧烷键的分子的形成中的作用。值得注意的是，三种来源的组织蛋白酶L不催化缩合反应。相反，尽管证明silicatein与组织蛋白酶L是高度同源的，但silicatein催化微粒二氧化硅和硅倍半氧烷的形成。酶的活性取决于非天然有机硅底物的官能度。
与原材料比较，在阴性对照、非特异性蛋白(即BSA、γ-球蛋白)、小分子(即CaCl2、咪唑、N-甲基咪唑)和多肽(即聚L-赖氨酸)反应中未观察到实质性的三甲基硅烷醇缩合(图5)。除了蛋白质之外，还选取了小分子来基于催化活性的胰蛋白酶的官能度独立地评估非特异性催化。由于需要钙来使胰蛋白酶的活性和稳定性最大化，所以将胰蛋白酶用氯化钙处理。类似于在胰蛋白酶表面上的氨基-官能性残基，将咪唑、N-甲基咪唑和聚L-赖氨酸用于评估在中性介质中的碱催化(base catalysis)。同样，在含水介质(pH＝6.8)中未观察到BSA和聚L-赖氨酸催化四乙氧基硅烷的缩聚。
实施例4
不纯研究
因为对碱性残基如精氨酸和赖氨酸的增强的偏好性，盐酸N-α-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮选择性地且不可逆地抑制胰蛋白酶活性而不影响α-胰凝乳蛋白酶的活性。TLCK通过烷基化催化性三联体中的组氨酸残基来抑制胰蛋白酶。用TLCK处理α-胰凝乳蛋白酶后，在重复的缩合试验中产物收率明显减少(图6)。
基于TLCK对照反应的产物收率(图6)，α-胰凝乳蛋白酶不催化三甲基硅烷醇的缩合。备选地，将经N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(一种不可逆的胰凝乳蛋白酶抑制剂)处理的胰蛋白酶用于补充经TLCK处理的α-胰凝乳蛋白酶试验。因为胰凝乳蛋白酶对疏水性残基如苯丙氨酸有特异性，因TPCK通过烷基化催化性三联体中的组氨酸残基来抑制胰凝乳蛋白酶。基于色谱法结果(图6)和弹性蛋白酶的无活性(图4)，确定与α-胰凝乳蛋白酶相反，胰蛋白酶催化三甲基硅烷醇的缩合。此外，在最初的酶催化的缩合研究中观察到胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的异常活性(表2)是因为胰蛋白酶不纯。
实施例5
胰蛋白酶催化的硅烷醇的缩合
在反应之前，将玻璃小瓶甲硅烷基化。分离反应产物并通过GC进行定量分析。分析之前，将含水的反应体系在存在NaCl时用THF萃取(×2)，并通过Whatman Autovial
Figure G05812962820061027D000161
50.45μm的Teflon
Figure G05812962820061027D000162
过滤器进行过滤。在这些研究中，对照反应定义为非酶促反应。具体而言，在不存在蛋白质时进行的试验定义为阴性对照反应。
蛋白质抑制研究
进行蛋白质抑制研究以研究酶活性位点在模型硅烷醇缩合反应中的作用。具体来说，用来自大豆的两种截然不同的天然多肽抑制剂抑制胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶，所述的抑制剂是：来自大豆的胰蛋白酶-胰凝乳蛋白酶抑制剂(即Bowman-Birk抑制剂，BBI)和胰蛋白酶抑制剂(即Kunitz大豆胰蛋白酶抑制剂或Popcorn抑制剂，PCI)。
所述大豆抑制剂是具有非常确定的抑制位点的高度稳定的蛋白质。尽管这些蛋白质抑制剂来自相同来源，但多肽的氨基酸序列、三级结构和特性是不同的。BBI和PCI蛋白质分别含有71个(MW＝7,975)和181个(MW＝21,700)氨基酸。BBI含有选择性地抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的双重独立的区域。这些区域内的反应位点确定为Lys16-Ser17(胰蛋白酶)和Leu43-Ser44(胰凝乳蛋白酶)。抑制反应的动力学和平衡是独立的。PCI通过与Arg63-Ile64反应位点相互作用来选择性地抑制胰蛋白酶。
反应前，在加入三甲基硅烷醇之前，在搅拌的中性介质(pH 7.0)中将酶用过量的抑制剂(即分别地，＞1∶1(w/w)或4∶1的BBI对蛋白酶的摩尔比，和2∶1的PCI对蛋白酶的摩尔比)抑制2小时。用4∶1的单体与酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇与蛋白酶的摩尔比)配制反应体系，并在25℃下反应3小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图7)。
基于标准的酶活性测定法，BBI(98％)和PCI(91％)完全抑制了胰蛋白酶，而BBI(63％)部分抑制α-胰凝乳蛋白酶。与对照反应比较，蛋白质抑制剂完全抑制了蛋白酶催化的缩合反应。因为α-胰凝乳蛋白酶受PCI抑制，所以证实了在α-胰凝乳蛋白酶中存在胰蛋白酶。此外，尽管BBI部分抑制α-胰凝乳蛋白酶，但未观察到缩合。虽然不希望受理论束缚，但看起来，活性位点的三级结构、官能度以及胰蛋白酶的催化性三联体直接涉及三甲基硅烷醇的体外缩合。
温度研究
研究了温度对于胰蛋白酶以及对酶催化的缩合反应的影响。反应之前，搅拌缓冲的含水胰蛋白酶溶液(pH 7.0)并将其在恒温水浴(+/-0.1℃)中在设定的温度下平衡20分钟。用4∶1的单体与酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇与胰蛋白酶的摩尔比值)配制反应体系，并在设定的温度下反应3小时。在热变性试验中，在25℃下进行缩合反应之前，将胰蛋白酶在50mM Tris-HCl缓冲的Milli-Q水(pH 7.0)中独立地沸腾20分钟和3小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图8)。
与对照反应比较，胰蛋白酶在宽的温度范围内显示出催化活性。反应的最适温度是约25℃。在让胰蛋白酶溶液(40mg/mL)沸腾不同的时间(即20分钟对3小时)后，胰蛋白酶催化的缩合反应的速率由于热变性程度而减少。尽管酶促反应的速率可随温度而增加，但已经报道，由于分解，在水中高温使酶(包括胰蛋白酶)可逆地去折叠并不可逆地失活。
因为反应速率取决于热变性程度，所以在中性介质(pH 7.0)中，将天然的底物N-α-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)用于研究作为浓度的函数的煮沸过的胰蛋白酶溶液的活性。在0.5mL的50mMTris-HCl缓冲的Milli-Q水(pH 7.0)中制备不同浓度的胰蛋白酶(即2-40mg/mL)。在测量煮沸过的胰蛋白酶的活性之前将该溶液沸腾20分钟，所述胰蛋白酶活性的测量通过记录在253nm时由于N-α-苯甲酰基-L-精氨酸的形成而引起的吸光度的变化来进行。所述经分光光度法测量的活性数据在图9中说明。
如通过BAEE的水解速率测量的，煮沸过的胰蛋白酶溶液的活性在低浓度时由于增加的变性而降低。相较而言，硅烷醇缩合速率的相对减少(图8)与在高蛋白质浓度时胰蛋白酶的稳定性增强(图9)相关联。基于热重量分析，胰蛋白酶在从室温到100℃时经历了小的质量损失，和在225℃时经历了严重的质量损失。热特性曲线(thermalprofile)支持在物理分解之前可能的水分损失。可见，回收的样品是显著炭化的。在差示热分析图中，由于酶中的结晶相或有序相，在40℃时观察到不可逆的吸热熔化(Tm)。尽管不希望受理论束缚，但看起来，在第二次热循环过程中胰蛋白酶由于缺少重复的吸热熔化而不可逆地变性。
时间研究
在25℃下，经24小时的时间，研究了胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合。在中性介质(pH 7.0)中以4∶1的单体与酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇与胰蛋白酶的摩尔比)配制独立的反应体系，并以指定的24小时的时间进行反应。在25℃下，胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合在三小时后基本上完成。基于该缩合反应的化学计量，产生每摩尔的六甲基二硅氧烷(HMDS)消耗两摩尔的三甲基硅烷醇(物料衡算，图10)。相反，在中性介质(pH 7.0)以及有机溶剂(甲苯)中，用六甲基二硅氧烷研究了胰蛋白酶催化的缩合反应的可逆性。因为在色谱法结果中未观察到三甲基硅烷醇，所以在任一介质中未观察到胰蛋白酶催化硅氧烷键的水解。虽然胰蛋白酶理论上由于微观可逆性定律而催化硅氧烷键的水解，但在这些条件下逆反应是不利的。
基于三甲基硅烷醇在水中估计的溶解度(42.56mg/mL)，三甲基硅烷醇(～160mg/mL)的浓度饱和了含水介质并产生两相的反应混合物。因为蛋白酶将只与水溶性的底物反应，所以胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合要求在水相中发生。虽然该缩合反应在水中进行，但通过产物的相分离促进了酶催化的反应。在存在水时，产物即六甲基二硅氧烷的不可混溶性改变平衡并促进缩合反应。因为三甲基硅烷醇饱和了含水介质，因此反应物由于缩合反应的动态平衡将继续进入水相。此外，由于二硅氧烷产物在水相中的不可混溶性，水解或逆反应将会受到严重的妨碍。
时间实施例过程中的缩合速率
分析了在时间研究过程中的缩合速率，以便开始研究在25℃下由胰蛋白酶催化的反应的动力学。基于所提出的反应的时间-独立的化学计量，定义了缩合速率(V)的等式(等式1)和理论速率的等式(等式2)。
V＝-0.5*(δ[Me3SiOH]/δt)＝1*(δ[HMDS]/δt)(等式1)
V＝kR[Me3SiOH]α[胰蛋白酶]β(等式2)
在等式1中，缩合速率定义为反应物或产物的浓度(即[摩尔浓度]＝摩尔/升)随时间的变化(例如δ[HMDS]/δt)。在等式2中，定义了每种反应物的试验速率常数(KR)和分反应级数(即α和β)。总反应级数是分级数的总合(即α+β)。由于在缩合反应过程中未消耗胰蛋白酶(即催化剂)，因而将该项包含在速率常数(KR’)内，并将理论的速率方程(等式2)如等式3定义中定义的进行简化。一般的速率方程如等式4所描述。
V＝KR’[Me3SiOH]α，KR’＝KR[胰蛋白酶]β  (等式3)
V＝-0.5*(δ[Me3SiOH 1/δt)＝kR’[Me3SiOH]α，α＝1或2  (等式4)
因为在大多数缩合反应过程中三甲基硅烷醇饱和了溶液，所以三甲基硅烷醇的绝对量实际上可能是恒定的。若给定恒定浓度的三甲基硅烷醇和胰蛋白酶(即催化剂)，则这些反应条件将导致零-级的理论速率方程(等式2)。换而言之，缩合的速率近似于恒定。由于HMDS的缩合或形成的最初(＜3小时)和最终(＞3小时)的速率是常数或线性的，因而数据集(data set)显示支持该估计。基于胰蛋白酶的浓度(即[Et]＝[胰蛋白酶]＝1.7mM)和缩合速率(即V＝-δ[Me3SiOH]/δt＝0.0064M/m～2δ[HMDS]/δt＝0.0072M/m)，当用底物完全饱和酶时，在单位时间内由酶分子将底物分子转化为产物的转化数(Kcat)或数目的相对值经计算为在25℃下每分钟(m-1)4.0次反应或每秒钟(s-1)0.066次反应。
因为胰蛋白酶由于三甲基硅烷醇在水中有限的溶解度而可能是不饱和的，因而将转化数处理为相对值。若相对转化数等于0.066s-1，胰蛋白酶催化的每次缩合反应之间的时间间隔经计算为15s。较于其他酶和它们的生理学底物的最大转化数，在25℃时胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合的转化数比所引用的值低几个数量级(即～10-10,000,000)。例如，胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合的转化数比天然胰凝乳蛋白酶催化的水解反应慢约1500倍。
实施例6
单体与酶的摩尔比的评估
将三甲基硅烷醇的缩合速率作为单体与酶的摩尔比的函数进行研究。在缓冲的水中(pH 7.0)用恒定量的三甲基硅烷醇(160mg/mL)和不同量的胰蛋白酶(2-198mg/mL)配制摩尔比。封闭的(用螺旋盖盖住的)反应在25℃下在磁力搅拌的同时进行3小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图11)。
基于色谱法的结果，测定出反应速率依赖于胰蛋白酶的量。此外，由于在稀浓度的胰蛋白酶(即＜20mg/ml)时可能自解，这些试验变量之间的相互作用是复杂的。由于稀胰蛋白酶溶液的稳定性降低(图12)，因而在整个缩合研究中在40mg/mL的胰蛋白酶溶液中配制1000∶1的单体与酶的摩尔比。
由于反应用恒定浓度的三甲基硅烷醇进行，则使用简化的理论速率方程(等式5)来初步评估关于胰蛋白酶的分反应级数。如果胰蛋白酶的分反应级数是一级(β＝1)，则缩合速率(V)与胰蛋白酶浓度的比值是恒定值(等式6)。
V＝KR’[胰蛋白酶]β，KR’＝KR[Me3SiOH]α(等式5)
KR’＝V/[胰蛋白酶]1(等式6)
因为缩合反应以固定的时间(即3小时)进行，所以形成的六甲基二硅氧烷的量(μmole)与缩合速率相关(即V＝[HMDS]3小时)。总结色谱法的结果显示，计算出的六甲基二硅氧烷与胰蛋白酶的摩尔比确实近似于常数。换而言之，缩合速率似乎与胰蛋白酶的浓度成正比(理论上的黑线，图11)。
如所观察到的，若以10为系数减少胰蛋白酶的量，则产物收率以10为系数减少。该试验观察证明胰蛋白酶在位于中性介质中的三甲基硅烷醇的缩合中的催化剂作用，并证明其通过简单的酶-底物中间体进行。
实施例7
胰蛋白酶催化的不饱和三甲基硅烷醇溶液的缩合的动力学研究
由于蛋白酶只与水溶性底物相互作用，所以在不饱和介质中减少三甲基硅烷醇的浓度(＜42.56mg/mL)以研究作为单体浓度的函数的缩合速率。调节三甲基硅烷醇的量(～10-40mg/mL，～60-222μmole)以在40mg/mL中性(pH 7.0)胰蛋白酶溶液中产生均质溶液。反应在25℃和15℃下在磁力搅拌的同时进行。淬灭独立的反应后，一小时内每15分钟分离反应产物并通过GC进行定量分析。
将差异法(differential method)用于测定关于三甲基硅烷醇的分反应级数。计算理论速率方程(等式3)的对数以产生线性方程(等式7)，其中斜率(α)等于三甲基硅烷醇的分反应级数。
Log(V)＝αLog[Me3SiOH]+Log(kR’)     (等式7)
画出在25℃(α＝0.9)和15℃(α＝1.0)时的Log(V)对Log[Me3SiOH]的图之后，估计三甲基硅烷醇的分反应级数为一级。三甲基硅烷醇的不同速率方程(differential rate equation)的图是线性的。相关系数(R2)值分别是94％和98％。由于确定反应速率线性地依赖于三甲基硅烷醇在40mg/mL的中性(pH 7.0)胰蛋白酶溶液中的可溶量，因而所述反应关于三甲基硅烷醇似乎是一级的。正如所推测的，缩合速率显示出与三甲基硅烷醇和胰蛋白酶的浓度都成比例。
此外，将利-伯二氏方程(Lineweaver-Burk equation)用于研究胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇缩合的能力以拟合Michaelis-Menten动力学模型。于在25℃和15℃下的时间研究过程中获得的色谱法数据集产生了线性的利-伯二氏曲线。基于试验的利-伯二氏曲线的线性方程，计算出相对的米氏(Michaelis constant)常数(Km)和最大速率(Vmax)值(表4)。
表4：相对的Michaelis-Menten动力学值。
尽管Michaelis-Menten动力学值是相对的，但大的Km值说明酶-底物中间体的结合强度弱。相较而言，这些Km值比其他酶的Km值大几个数量级(即～1,000-25,000,000)。例如，在25℃下胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇缩合的相对Km值比胰凝乳蛋白酶催化的乙酰基-L-色氨酰胺水解约大1200倍。
因为相对Km值大并且Vmax值低，所以在缩合反应中胰蛋白酶-硅烷醇中间体的形成显示为限速步骤。这与这样的事实是一致的，即在含水介质中三甲基硅烷醇未使胰蛋白酶饱和。因此，胰蛋白酶-硅烷醇中间体的缩合或水解的速率必定比酶中间体的形成要快。
基于硅烷醇缩合反应的化学计量和缩合速率，推测胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合具有与酰胺和酯键的蛋白水解类似的反应机制(图13)。由于被催化性三联体的电荷中继系统活化和稳定，认为丝氨酸的亲核氧原子攻击三甲基硅烷醇的电正性硅原子。等价于酰基-酶复合物，将会形成甲硅烷基化的胰蛋白酶中间体，随后失去水。另外，组氨酸的氮原子能与中间体中的硅原子形成稳定的五价配位物。基于速率方程以及大的相对Km值和低的Vmax值，胰蛋白酶-硅烷醇中间体的形成显示为限速步骤。这与这样的事实是一致的，即有机硅分子比类似的烃类胰蛋白酶底物大。随后，甲硅烷基化的胰蛋白酶中间体可以参与与三甲基硅烷醇或水的缩合或水解反应，导致分别形成六甲基二硅氧烷(产物)或三甲基硅烷醇(反应物)。因为在含水介质中三甲基硅烷醇未使胰蛋白酶饱和，所以胰蛋白酶-硅烷醇中间体的缩合或水解的速率必定比酶中间体的形成快。无论如何，将会在任一反应完成时回收胰蛋白酶。
实施例8
胰蛋白酶pH研究
实际上，胰蛋白酶催化的水解的最适pH值为约8。然而，这是种类依赖性的。如用天然底物(BAEE)所测量的，作为pH值的函数研究了不同来源的胰蛋白酶的活性(图14)。
基于分光光度法的数据，哺乳动物的胰蛋白酶活性(包括重组酶)作为pH值的函数的特性曲线是相似的。在pH 7.0时观测到哺乳动物来源的牛的胰蛋白酶具有最高的活性。相较而言，大西洋鳕的胰蛋白酶的最适pH值显示为更酸性。由于需要钙以获得胰蛋白酶的最大活性和稳定性，因而相对活性的差别可能是由于钙的不同水平。基于电感偶合等离子-原子发射光谱分析，商业来源的胰蛋白酶中存在的钙的量显示出明显不同。
胰蛋白酶的钙活化引起酶的三级结构改变。具体来说，钙由于增加了螺旋含量或改变了β-结构而产生一个紧凑的结构。已经推测该构象变化是经证明的增强的酶活性和热稳定性的原因。由于胰蛋白酶活性在存在＞10mM(理想地，20mM或400ppm)的钙时是最佳的，因而与牛胰胰蛋白酶相比较，猪胰胰蛋白酶和重组的牛的胰蛋白酶中钙水平减少与它们的活性相关联。
随后，将牛胰胰蛋白酶催化三甲基硅烷醇缩合反应的能力作为pH值的函数进行研究。在缓冲于pH 4.0-pH 10.0的含水介质中，以4∶1的单体与酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇与胰蛋白酶的摩尔比)配制反应体系，并在25℃下反应3小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图15)。基于色谱法的结果，酶催化的缩合反应依赖于pH值。硅烷醇的缩合反应在pH 7.0时最适宜。相较而言，在阴性对照反应中观测到酸和碱催化的硅烷醇缩合；主要地，在pH值小于4和大于10时观测到(图15)。
由于给出用BAEE测量的天然水解活性特性曲线(图14)，其在pH 7以上时显示出活性，则进一步研究了在pH值＞7.0时的产率减少。正如通过BAEE的水解速率所测量的，在缓冲于pH 7.0-pH 9.0的含水介质中，在用三甲基硅烷醇进行的缩合反应的开始(t＝5分钟)和结束(t＝3小时)时分析了牛胰胰蛋白酶的活性。该分光光度法测量的活性数据在图16中说明。
与天然的pH值活性特性曲线(牛的胰蛋白酶，图16)比较，在碱性的缓冲的水(pH 7.5-pH 9.0)中，三甲基硅烷醇几乎立即部分地抑制(＞50％)胰蛋白酶。尽管在中性介质(pH 7.0)中三甲基硅烷醇不抑制胰蛋白酶，但含水溶液的碱性使反应物的抑制作用增强了50-65％。由于胰蛋白酶在存在三甲基硅烷醇的情况下不变性，推测在碱性介质中水解(BAEE，图16)和缩合(三甲基硅烷醇，图15)反应的抑制是由于催化性区域的其他羟基-官能性残基的甲硅烷基化。这将直接或间接地减少与活性位点的接近以及胰蛋白酶的活性。当pH减少时，这些种类将易于水解(酸催化作用)，该水解会使得活性位点能够参与胰蛋白酶的催化功能。相反，在高的pH值时，甲硅烷基化的酶的更长的寿命将抑制BAEE的水解和三甲基硅烷醇的缩合。这些结果进一步证明，胰蛋白酶的活性位点在三甲基硅烷醇的体外缩合中的催化剂作用。
实施例9
胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷的水解和缩合
研究了在模型烷氧基硅烷即三甲基乙氧基硅烷的体外水解和缩合过程中胰蛋白酶在形成具有单个硅氧烷键的分子中的作用。
反应前，由于可能存在残留的氯-官能性硅烷，用碳酸氢钠预处理烷氧基硅烷。在中性介质(pH 7.0)中以4∶1的三甲基乙氧基硅烷与蛋白质的重量比(～1000∶1的烷氧基硅烷与胰蛋白酶的摩尔比)配制反应体系，并在25℃下反应3小时。基于三甲基乙氧基硅烷在水中的估计的溶解度(1mg/mL)，三甲基乙氧基硅烷(～160mg/mL)的浓度饱和了含水介质并产生两相的反应混合物。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图17)。
虽然观察到各种不同的水解速率，但与原材料比较，在阴性对照、非特异性蛋白(即BSA、γ-球蛋白)、小分子(即CaCl2、咪唑、N-甲基咪唑)和多肽(即聚L-赖氨酸)反应中未观察到实质性的三甲基乙氧基硅烷缩合。尽管未观察到BSA和聚L-赖氨酸催化四乙氧基硅烷或三甲基乙氧基硅烷的缩合(图17)，但在中性介质(pH 7.0)中BSA和聚L-赖氨酸以不同速率促进了三甲基乙氧基硅烷的水解以及三甲基硅烷醇的形成。
在存在胰蛋白酶时，3小时内在25℃下于中性介质(pH 7.0)中，三甲基乙氧基硅烷在六甲基二硅氧烷的形成过程中得以水解(100％)和缩合(84％)(图17)。由于在温度＜25℃时缩合的相对速率减小(图8)，因而在10℃下以规定的3小时的时间进行三甲基乙氧基硅烷反应的时间研究。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图18)。
基于水解和缩合反应的化学计量，形成2摩尔的三甲基硅烷醇时消耗2摩尔的三甲基乙氧基硅烷，这产生了1摩尔的六甲基二硅氧烷(物料衡算，图18)。分析在时间研究过程中获得的色谱法数据集以便研究在10℃下胰蛋白酶催化的水解和缩合反应的动力学。比较而言，三甲基乙氧基硅烷在最初的30分钟内容易水解，随后在形成六甲基二硅氧烷过程中缩合。
计算了水解和缩合反应中关于反应物的分反应级数以及转化数(kcat)。因为胰蛋白酶由于三甲基乙氧基硅烷在水中的有限溶解度而可能是不饱和的，所以将转化数处理为相对值。由于相对转化数等于0.53s-1，因而在10℃时胰蛋白酶催化的每次水解反应之间的时间经计算为约2s或者每分钟30次反应。尽管这与溶菌酶的最大转化数相当，但在10℃时胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷水解的转化数比胰凝乳蛋白酶催化的水解反应慢大约200倍。由于相对转化数等于0.048s-1，因而在10℃时胰蛋白酶催化的缩合反应之间的时间间隔经计算为约20s或每分钟3次反应。
基于相对转化数，在10℃下胰蛋白酶催化的三甲基乙氧基硅烷水解的速率(0.53s-1)比三甲基硅烷醇的缩合(0.048s-1)快一个数量级(10倍)(图19)。相较而言，在25℃下胰蛋白酶催化的三甲基硅烷醇的缩合速率(kcat＝0.066s-1)比在10℃下进行的反应快约38％。
实施例10
烷氧基硅烷研究
因为胰蛋白酶催化硅氧烷键的形成，因而选择备选的单官能的烷氧基硅烷作为底物以研究在温和条件下胰蛋白酶选择性地催化有机-官能性(organo-functional)烷氧基硅烷的体外水解和缩合的能力。最初，选择两种另外的具有相当极性(即四乙二醇单甲基醚)和非极性(即己醇)离去基团的三甲基烷氧基硅烷，用于在中性介质(pH 7.0)中研究作为反应物的溶解度的函数的胰蛋白酶活性。
以4∶1的单体与酶的重量比(＞400∶1的烷氧基硅烷与胰蛋白酶的摩尔比)配制两相反应体系，并在25℃下反应3小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图20)。相较而言，在水中乙二醇-官能性硅烷显示出比三甲基己氧基硅烷更易混溶。基于色谱法的结果，胰蛋白酶催化三甲基己氧基硅烷部分水解而不缩合。尽管胰蛋白酶在乙二醇-官能性硅烷的水解中的作用是不确定的，但胰蛋白酶催化了产物即三甲基硅烷醇的缩合。在3个小时的反应过程中不同的水解和缩合反应的相对速率是未知的。
随后，选取四种有机-官能性烷氧基硅烷，用于研究胰蛋白酶的活性怎样由于不同的与底物的空间和电子相互作用而变化。该四种有机-官能性烷氧基硅烷是苯基二甲基乙氧基硅烷(PhMe2SiOEt)、三苯基乙氧基硅烷(Ph3SiOEt)、3-环氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷((环氧)Me2SiOEt)和氨丙基二甲基乙氧基硅烷((H2N(CH2)3)Me2SiOEt)。
以4∶1的单体与酶的重量比(＞300∶1的烷氧基硅烷与胰蛋白酶的摩尔比)配制两相反应体系，并在25℃下反应3小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图21)。基于色谱法的结果，观察到胰蛋白酶优先催化三甲基乙氧基硅烷和3-环氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷的水解和缩合。相较而言，在存在胰蛋白酶时，苯基二甲基乙氧基硅烷水解但不缩合，而三苯基乙氧基硅烷既不水解也不缩合。由于胰蛋白酶催化区域内的结合结构域的证明了的特质，酶活性降低看来是由于苯基-官能性底物的疏水性和空间体积的增加。尽管胰蛋白酶对碱性残基的亲和力，但当存在和不存在胰蛋白酶时氨丙基二甲基乙氧基硅烷都完全水解和缩合。碱性氨基-官能性烷氧基硅烷催化二硅氧烷产物的形成，其通过具有伯胺的额外配位(extra-coordinate)中间体而稳定。
备选地，选取两种具有环状结构的硅-官能性分子以进一步研究胰蛋白酶催化Si-O键的裂解和形成的能力。以4∶1的单体与酶的重量比配制两相反应体系，并在25℃下反应3小时(方案2-3)。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图22)。
Figure G05812962820061027D000281
方案2：胰蛋白酶催化的1，1-二甲基-1-硅杂-2-氧杂环己烷的水解和缩合。
R＝甲醇(carbinol)(即(CH2)4OH)。
Figure G05812962820061027D000282
方案3：胰蛋白酶催化的七甲基羟基四环硅氧烷的缩合。
基于色谱法的结果，在形成甲醇-官能性二硅氧烷的过程中，胰蛋白酶催化1，1-二甲基-1-硅杂-2-氧杂环己烷的开环水解以及羟丁基二甲基硅烷醇的缩合(方案2)。胰蛋白酶不催化的七甲基羟基四环硅氧烷的缩合。不管它们的环结构，这些有机硅分子以及得到的中间体和产物是不同的。相较而言，环硅氧烷在空间上比环烷氧基硅烷大。类似于碱性残基(方案4)，甲醇-官能性硅烷醇中间体据推测是一种可接受的底物，因为其具有与在胰蛋白酶催化性区域内的结合结构域中的天冬氨酸残基形成氢键的能力。
Figure G05812962820061027D000291
方案4：已确定的(赖氨酸和精氨酸)和提出的(硅烷醇)在胰蛋白酶的结合结构域内的氢键键合。
与对照反应比较，据报道在pH 6.8的含水介质中胰蛋白酶不催化硅酸前体即四乙氧基硅烷的缩聚。在该研究中，在以4∶1的单体与酶的重量比配制并于25℃下进行3小时的重复反应中未观察到反应产物。具体而言，在3个小时的反应过程中胰蛋白酶不水解或缩合四乙氧基硅烷。相较而言，7天的反应后，在形成含有二氧化硅和胰蛋白酶的固体复合物的过程中观察到胰蛋白酶催化四乙氧基硅烷的缩聚。在该研究中胰蛋白酶的活性位点在四乙氧基硅烷的缩聚中的作用是不确定的。总而言之，观察到了胰蛋白酶在温和条件下选择性地催化有机-官能性烷氧基硅烷的水解和缩合。
实施例11
蛋白质抑制研究
进行了蛋白质抑制研究以研究酶活性位点在三甲基乙氧基硅烷的水解和缩合中的作用。反应前，在搅拌的中性介质(pH 7.0)中用过量的Bowman-Birk抑制剂(4∶1的BBI与胰蛋白酶的摩尔比)和Popcorn抑制剂(2∶1的PCI与胰蛋白酶的摩尔比)独立地抑制胰蛋白酶2小时。基于标准的酶活性测定法，BBI(98％)和PCI(91％)完全抑制了胰蛋白酶。以4∶1的单体与酶的重量比(～1000∶1的三甲基乙氧基硅烷与胰蛋白酶的摩尔比)配制反应体系，并在25℃下反应3小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图23)。
虽然观察到经处理的酶催化三甲基乙氧基硅烷的水解，但与对照反应相比较，三甲基硅烷醇的缩合完全受到抑制。特别是，在存在BBI-(24％)和PCI-(6％)抑制的胰蛋白酶时水解百分比减少。热变性后，胰蛋白酶活性相当于蛋白质抑制和先前的变性试验。从而，看起来与胰蛋白酶(包括活性位点)的非特异性相互作用促进了三甲基乙氧基硅烷的水解。然而，测定出胰蛋白酶的活性位点在温和条件下选择性地催化三甲基硅烷醇的体外缩合。
实施例12
用不同来源的胰蛋白酶的三甲基乙氧基硅烷的水解和缩合
尽管多种来源(例如，哺乳动物、鱼)的胰蛋白酶是相似的(例如，三级结构)，但它们的选择性和活性可能不同。因此，在25℃下于中性介质(pH 7.0)中评估了猪胰腺、大西洋鳕和重组的牛的胰蛋白酶催化三甲基乙氧基硅烷的水解和三甲基硅烷醇的缩合的能力。尽管该pH对于这些不同来源的胰蛋白酶可能不是最佳的，但使用了中性pH来使酸和碱催化的水解和缩合最小化。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图24)。
基于色谱法的结果，观测到来自猪胰腺(即哺乳动物)的胰蛋白酶与大西洋鳕(即鱼)的胰蛋白酶相反，催化了水解和缩合反应。与用天然底物测量的pH特性曲线(图14)类似，在中性介质(pH 7.0)中来自牛胰腺的胰蛋白酶的活性大于其他来源的胰蛋白酶(包括重组酶)的活性。来自大西洋鳕的胰蛋白酶的失活看起来是由于pH(图14)。由于需要钙来获得胰蛋白酶的最大活性和稳定性，因而这些观测结果可能是由于不同的最适pH范围和/或钙水平。
胰蛋白酶的钙活化引起酶的三级结构的变化。由于在存在＞10mM的钙时胰蛋白酶的活性是最佳的，因而在含有20mM CaCl2的中性介质(pH 7.0)中研究了胰蛋白酶催化三甲基硅烷醇缩合的能力。以4∶1的单体与酶的重量比(～1000∶1的硅烷醇对胰蛋白酶的摩尔比)配制反应体系，并在25℃下反应三小时。分离反应产物并通过GC进行定量分析(图25)。
较于初始来源的胰蛋白酶，通过重组牛和猪胰腺的胰蛋白酶催化的反应的产率测量的活性分别增加了65％和125％。相较而言，牛胰腺和大西洋鳕的胰蛋白酶催化的反应的产率没有变化。在不存在氯化钙时(图24)，在三甲基硅烷醇形成过程中猪胰腺的胰蛋白酶和重组的牛的胰蛋白酶催化了三甲基乙氧基硅烷的完全水解。在存在氯化钙时，猪胰腺的胰蛋白酶和重组的牛的胰蛋白酶的活性增加提供了间接的证据表明，催化性区域的三级结构直接参与了三甲基硅烷醇的体外缩合。基于水解和缩合反应的产率，商业来源的牛胰胰蛋白酶(即886ppmCa)显示出在中性介质(pH 7.0)中是最佳的。相较而言，当在商业来源的大西洋鳕胰蛋白酶中存在2.1％的钙时，20mM的氯化钙的可能的影响是可忽略不计的。胰蛋白酶来源的底物选择性和活性显示出是不同的，尽管它们有相似的三级结构。
实施例13
基于硅的单体的酶催化的缩聚和开环聚合
研究了在温和条件下，胰蛋白酶在基于硅的单体的体外缩聚和开环聚合过程中催化硅氧烷键形成的能力。
胰蛋白酶催化的甲基三乙氧基硅烷的缩聚
既知了胰蛋白酶在模型硅氧烷缩合反应中的催化作用，则将胰蛋白酶在三官能的烷氧基硅烷即甲基三乙氧基硅烷于温和条件下的缩聚中用作催化剂。以4∶1的甲基三乙氧基硅烷(0.091g，511μmol，3.25mmol Si)对胰蛋白酶(0.022g，0.9μmol)的重量比(～500的单体对酶的摩尔比)在中性介质(pH 7.0)中配制反应体系，并在25℃下反应七天(方案5)。
Figure G05812962820061027D000321
方案5：胰蛋白酶催化的甲基三乙氧基硅烷的缩聚。
分离固体和液体反应产物，并通过红外光谱法、显微术和质谱法技术选择性地进行表征。
基于胰蛋白酶和固体反应产物的漫反射红外傅立叶变换光谱，确定分离的固体为含有甲基硅倍半氧烷树脂和胰蛋白酶的混合物的复合物质。相较而言，在存在用胰蛋白酶获得的对照光谱时，观测到甲基硅倍半氧烷树脂的光谱峰。具体而言，在存在与胰蛋白酶相关的光谱峰时，观测到对称的甲基变形(deformation)(MeSiO3/2，靠近1270cm-1)、硅氧烷不对称拉伸(stretch)(SiOSi，靠近1000-1130cm-1)以及不对称甲基摇摆(rock)和硅-碳拉伸(MeSiO3/2，778cm-1)。观测到该固体含有大小在约200μm-1.5mm范围内的稠的附聚物。附聚物颗粒的粗糙表面由亚微细粒的圆颗粒组成。基于能量色散光谱学(SEM-EDS)分析，颗粒表面据测定含有硅、氧、碳和硫。这些元素与甲基硅倍半氧烷和胰蛋白酶的官能度一致。由于在萃取过程中使用盐(NaCl)，因而该表面也含有钠和氯。基于缩聚反应的硅(Si)的化学计量，胰蛋白酶催化的缩聚反应产生12％的固体(0.011g，0.39mmolSi)。相较而言，在阴性对照反应中没有观测到固体沉淀。
分离液体反应产物并通过电喷雾电离质谱法(ESI MS)进行表征。尽管在光谱结果中没有观测到甲基三乙氧基硅烷，但在不存在胰蛋白酶时没有观测到相当的甲基三乙氧基硅烷的水解和缩合。主要地，在ESI MS谱中观测到了乙氧基-官能性低分子量寡聚物(例如，二聚体、三聚体、四聚体)和环状硅氧烷。较之阴性对照反应，胰蛋白酶促进甲基三乙氧基硅烷的完全水解以及随后的缩聚。线性的、环状的和分支的硅氧烷分子完全被羟基化了。尽管胰蛋白酶促进烷氧基-官能性硅树脂的水解，但在该研究中没有确定胰蛋白酶的活性位点在这些分子中的缩聚反应中的作用。
尽管ESI MS结果是定性的，但固相和液相中的反应产物完全清楚地说明了该缩聚反应。存在胰蛋白酶时附聚的硅倍半氧烷沉淀之前，在甲基三乙氧基硅烷的缩聚期间线性的、环状的和分支的寡聚物的形成类似于二氧化硅的聚合行为。
胰蛋白酶催化的环状硅氧烷的开环聚合
探究了在温和条件下胰蛋白酶在环状硅氧烷的开环聚合期间催化Si-O键的裂解和形成的能力。具体而言，选取了五种环状硅氧烷用于研究胰蛋白酶的活性由于与底物的不同空间和电子相互作用而如何变化，这五种环状硅氧烷是：六甲基环三硅氧烷、八甲基环四硅氧烷、三甲基三(三氟丙基)环三硅氧烷、四甲基四(三氟丙基)环四硅氧烷和四甲基四苯基环四硅氧烷。
以4∶1的单体对酶的重量比配制两相的反应体系，并在中性介质(pH 7.0)中于25℃反应8天。分离反应产物并通过GC进行定性分析(表5)。
表5：25℃下胰蛋白酶催化的环状硅氧烷的开环聚合
Figure G05812962820061027D000331
1 GC环状面积百分比的值是定性的。
基于色谱法的数据，没有观测到胰蛋白酶催化环状硅氧烷键的水解。如先前报道的，在25℃下在中性介质(pH 7.0)中胰蛋白酶不能水解六甲基二硅氧烷。由于蛋白酶仅与水溶性底物相互作用，因而水解反应会由于环状硅氧烷在水相中的不可混溶性而受到严重的阻碍。尽管胰蛋白酶理论上由于微观可逆性定律而催化硅氧烷键的水解，但逆反应是不利的。
实施例14
角质酶催化的三甲基硅烷醇的缩合
进行了一种模型研究，其中选取了单官能的硅烷来集中于在三甲基硅烷醇的体外缩合过程中的具有单个硅氧烷键的分子的形成(方案6)。该生物催化的反应体系以5∶1的三甲基硅烷醇对蛋白质的重量比(即～1,300∶1的三甲基硅烷醇对角质酶的摩尔比，0.3μmol角质酶)并以～10∶1的溶剂对单体的重量比在50mM Tris-HCl缓冲的Milli-Q水(pH 7.0)中配制。封闭的(用螺旋盖盖上的)两相反应在惰性玻璃小瓶中于25℃下伴随磁力搅拌进行14小时。特别是，该反应在甲硅烷基化的玻璃器皿中进行。因为硅烷醇-官能性的玻璃表面可以与三甲基硅烷醇反应，所以需要经甲硅烷基化的玻璃器皿来产生惰性的玻璃表面。分析前，用THF在存在NaCl时萃取含水反应体系，并通过Whatman Autovial
Figure G05812962820061027D000341
50.45μm Teflon过滤器进行过滤。反应产物通过气相色谱-火焰电离检测(GC-FID)进行定量分析(图26)。
在该研究中，对照反应定义为非酶促反应。在不存在蛋白时进行的试验定义为阴性对照反应。蛋白质分子例如牛血清白蛋白(BSA)和猪γ-球蛋白(球蛋白)用于研究非特异性蛋白质催化。较于原材料(三甲基硅烷醇，Me3SiOH)，在阴性对照和非特异性蛋白质反应中没有观测到实质性的三甲基硅烷醇的缩合。总而言之，角质酶在温和条件下在六甲基二硅氧烷(HMDS)的形成过程中催化了三甲基硅烷醇的缩合。虽然该缩合反应在水中进行，但通过产物的相分离可促进该酶催化的反应。在存在水时，产物即六甲基二硅氧烷的不可混溶性改变了平衡并促进缩合反应。由于三甲基硅烷醇饱和了含水介质，因而反应物将会由于缩合反应的动态平衡而继续进入水相中。
方案6：生物催化的三甲基硅烷醇的缩合。
实施例15
角质酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和缩合
选取二甲基二甲氧基硅烷(DMDM)作为模型底物来探究角质酶在温和条件下催化多官能的烷氧基硅烷的体外水解和缩合的能力(方案7)。由于反应混合物中增加的硅烷醇的浓度，温和反应条件(即低温，中性pH)使化学催化的缩合最小化。该生物催化的反应最初在50mMTris-HCl缓冲的Milli-Q水(pH 7.0)中以～60％的容积效率用～10∶1的烷氧基硅烷对角质酶的重量比(即～1,800∶1的DMDM对角质酶的摩尔比，～5μmol角质酶)进行配制。容积效率定义为测量为反应体系中液体总重量(即DMDM+水)的百分比的单体的重量％。封闭的(用螺旋盖盖上的)两相反应在惰性玻璃小瓶中于25℃下伴随磁力搅拌进行24小时。特别是，反应在甲硅烷基化的玻璃器皿中进行。因为在该研究中硅烷醇-官能性的玻璃表面可以与烷氧基硅烷反应，所以需要经甲硅烷基化的玻璃器皿来产生惰性的玻璃表面。分析前，用THF在存在NaCl时萃取含水反应体系，并通过Whatman Autovial50.45μmTeflon过滤器进行过滤。反应产物通过GC-FID进行定性分析(即面积百分比，表6)。
概而言之(表6)，在24-小时期间～5μmol角质酶催化的缩聚程度不显著大于在不存在角质酶时进行的阴性对照反应。因此，角质酶催化的缩聚反应用增加量的酶(即～500∶1的DMDM对角质酶的摩尔比，～20μmol角质酶)以更长时期的时间(5天)重复进行。基于经过延长的时间(5天对24小时)以两种酶浓度(20μmol对5μmol)获得的缩聚程度，观测到角质酶催化DMDM的水解和缩合(表7)。虽然该缩合反应在水中进行，但通过产物的相分离可促进该酶催化的反应。基于DMDM在水中的估计溶解度(～32mg/mL)，DMDM的浓度(～1500mg/mL)饱和了含水介质并产生两相反应混合物。由于线性硅氧烷分子的链长度增加或环状硅氧烷形成，这些分子相分开进入有机相。
方案7：角质酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和缩合。
表6：在25℃下24小时后角质酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和缩合
Figure G05812962820061027D000362
1 标准化的面积百分比的值从定性色谱法数据(GC)中计算得到。
2 Lx＝二甲基线性硅氧烷x＝ZO-(Me2SiO)x-Z，其中x＝1-6，和Z＝H和/或Me，Me＝CH3。
Dy＝二甲基环状硅氧烷y＝[Me2SiO]y，其中y＝3-4，Me＝CH3。
表7：在25℃下5天后角质酶催化的二甲基二甲氧基硅烷的水解和缩合
Figure G05812962820061027D000371
1标准化的面积百分比的值从定性色谱法数据(GC)中计算得到。
2Lx＝二甲基线性硅氧烷x＝ZO-(Me2SiO)x-Z，其中x＝1-7，和Z＝H和/或Me，Me＝CH3。
Dy＝二甲基环状硅氧烷y＝[Me2SiO]y，其中y＝3-4，Me＝CH3。
实施例16
胰蛋白酶催化的二乙基二乙氧基锗烷的水解和缩合
选取二乙基二乙氧基锗烷作为备选底物以探究牛胰胰蛋白酶在温和条件下催化烷氧基-官能性锗分子的体外水解和缩合的能力(方案8)。由于反应混合物中的增加的羟基浓度，温和反应条件(即低温，中性pH)使化学催化的缩合最小化。在50mM Tris-HCl缓冲的Milli-Q水中以～5∶1的溶剂对单体的重量比并用～5∶1的单体对酶的重量比(～500∶1的二乙基二乙氧基锗烷与胰蛋白酶的摩尔比，～1μmol胰蛋白酶)配制反应体系。封闭的(用螺旋盖盖上的)两相反应在惰性玻璃小瓶中于25℃下伴随磁力搅拌进行24小时。特别是，反应在经甲硅烷基化的玻璃器皿中进行。由于硅烷醇-官能性的玻璃表面可以与单体反应，因而需要经硅烷基化的玻璃器皿来产生惰性玻璃表面。分析之前，将含水的反应体系在存在NaCl时用THF萃取，并通过WhatmanAutovial
Figure G05812962820061027D000372
50.45μm的Teflon
Figure G05812962820061027D000373
过滤器进行过滤。反应产物通过气相色谱-质谱(GC-MS)和电喷雾电离质谱(ESI MS)进行分析。较于在不存在酶时进行的阴性对照反应，观测到胰蛋白酶在优先形成六乙基环三锗氧烷([Et2GeO]3，其中Et＝CH2CH3)的过程中催化二乙基二乙氧基锗烷的水解和缩合。
Figure G05812962820061027D000381
方案8：胰蛋白酶催化的二乙基二乙氧基锗烷的水解和缩合。
序列表
<110>Brandstadt，Kurt F
 
<120>用于形成结构确定的有机分子的方法
 
<130>40218-132
 
<140>10/791,951
<141>2004-03-03
 
<160>1
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>229
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>胰蛋白酶原
 
<400>1
Val Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Thr Val Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Tyr His Phe Cys Gly
            20                  25                  30
Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Tyr
        35                  40                  45
Lys Ser Gly Ile Gln Val Arg Leu Gly Asn Asp Asn Ile Asn Val Val
    50                  55                  60
Glu Gly Asn Gln Gln Phe Ile Ser Ala Ser Lys Ser Ile Val His Pro
65                  70                  75                  80
Ser Tyr Asn Ser Asn Thr Leu Asn Asn Asp Ile Met Leu Ile Lys Leu
                85                  90                  95
Lys Ser Ala Ala Ser Leu Asn Ser Arg Val Ala Ser Ile Ser Leu Pro
            100                 105                 110
Thr Ser Cys Ala Pro Ala Gly Thr Gln Cys Leu Ile Ser Gly Trp Gly
        115                 120                 125
Asn Thr Lys Ser Ser Gly Thr Ser Tyr Pro Asp Val Leu Lys Cys Leu
    130                 135                 140
Lys Ala Pro Ile Leu Ser Asn Ser Ser Cys Lys Ser Ala Tyr Pro Gly
145                 150                 155                 160
Gln Ile Thr Ser Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Leu Glu Gly Gly Lys
                165                 170                 175
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Ser Gly Lys
            180                 185                 190
Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Ser Gly Cys Ala Gln Lys Asn Lys
        195                 200                 205
Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Ser Trp Ile Lys Gln
    210                 215                 220
Thr Ile Ala Ser Asn
225

Claims (9)

1.形成有机分子的方法，所述的方法包括将水解酶与有机反应物接触，其中：
有机反应物选自(CH3)2Si(OCH3)2；(CH3)(CF3CH2CH2)Si(OCH3)2；(CH3CH2)2Ge(OCH2CH3)2；(CH3)Si(OCH2CH3)3；Si(OCH2CH3)4；1，3-双(羟基)四甲基二硅氧烷和[(HO)2(CH3)SiO]3SiCH3；三甲基乙氧基硅烷；(Me3SiO(CH2CH2O)4CH3)；3-环氧丙氧基丙基二甲基乙氧基硅烷；1，1-二甲基-1-硅杂-2-氧杂环己烷；三甲基硅烷醇；氨丙基二甲基乙氧基硅烷；或其组合；
水解酶包括选自南极假丝酵母脂酶、南极假丝酵母脂酶B、米黑根毛霉脂酶、麦胚脂酶或其组合的脂酶；选自胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶或其组合的蛋白酶；和角质酶；并且
水解酶催化有机反应物的水解和缩合从而形成有机分子，其中水解酶的浓度是20mg/mL-60mg/mL，和其中反应在5.0-8.0的pH下进行。
2.根据权利要求1的方法，其中水解酶选自角质酶。
3.根据权利要求1的方法，其中水解酶的浓度是40mg/mL。
4.根据权利要求1的方法，其中有机反应物与酶的摩尔比小于或等于40000∶1。
5.根据权利要求1的方法，其中反应在7.0的pH下进行。
6.根据权利要求1的方法，其中反应在含水溶液、溶剂中或在无溶剂条件下进行，其中所述含水溶液选自水和缓冲液，和其中所述溶剂选自THF、乙腈、甲苯和己烷。
7.根据权利要求1的方法，其中反应在5℃至90℃之间的温度下进行。
8.根据权利要求7的方法，其中反应在20℃至50℃之间的温度下进行。
9.根据权利要求8的方法，其中反应在25℃的温度下进行。
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