CN1922315A - 硅(iv)化合物及其它金属(iv)化合物的酶合成和修饰及降解 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组silicatein－β或从天然来源中分离的silicatein－β以及silicatein－β－融合蛋白和silicatein－β相关的酶在二氧化硅(硅酸、硅酸盐的缩合产物)、硅酮和其它硅(IV)－或金属(IV)－化合物的合成、降解和修饰中的用途，及其技术应用。
Description
本发明涉及重组silicatein-β或从天然来源中分离的silicatein-β及silicatein-β融合蛋白和silicatein-β相关酶在二氧化硅(硅酸，硅酸盐的缩合产物)、硅酮和其它硅(IV)或金属(IV)化合物的合成、降解及修饰中的用途，及其技术应用。
1.技术领域
硅化合物，例如硅酸盐和硅酮(硅氧烷)是工业和医药中广泛使用的材料，以及从经济观点考虑也具有重要性。许多诸如光学和微电子仪器的高科技产品和催化剂都包含或由硅酸盐或硅酮化合物组成。
设计为四面体型的硅酸盐阴离子([SiO4]4-；单体)趋向于通过SiO4单位的连接来聚合，由此每两个Si原子通过O原子来互相连接。因此，从原硅酸中通过脱去水(缩合)产生第一个原二硅酸(焦硅酸，H6Si2O7)。通过聚硅酸的进一步缩合产生偏硅酸[(H2SiO3)n]。在较少量SiO4单位的情况下(n＝3，4or 6)，也可形成环形分子。随着缩合进一步进行，从首先得到的链或网中产生与组合物SiO2相应的三维结构(参见CDRÖmpp Chemistry lexicon-1.0版本，斯图加特/纽约：Georg ThiemeVerlag 1995)。
(聚合)二氧化硅(SiO2)可以以晶体和无定形的形式存在。其中，石英、鳞石英以及方石英是属于不同形式的晶体SiO2。除了其它的以外，无定形二氧化硅矿物还包括玛瑙、蛋白石以及燧石。通过生物矿化产生的许多骨骼结构由无定形SiO2(又名硅石)组成，例如硅质藻类(硅藻)的壳以及硅质海绵的针(骨针)。在所有这些SiO2形式中，硅具有配位数4，且四面体型被四个氧原子围绕。
通过使用不参与所述缩合过程的单键有机残基部分替换硅酸中OH-基团，可以产生不同的硅酮(硅氧烷)。它们可以分为线性的、支链的以及环状聚硅氧烷，以及交联聚合物(将链状或环状分子连接成二维或三维网)。
链状形态的硅酮(硅油)的粘度随着链的长度的增加而增加。低度交联的硅酮显示出天然橡胶弹性(硅酮天然橡胶)，高度交联的链类似于树脂(硅酮树脂)。
本发明涉及重组silicatein-β或从天然来源中分离的silicatein-β及silicatein-β-融合蛋白在无定形或晶体二氧化硅(硅酸和硅酸盐)、硅氧烷的合成和降解以及这些化合物的修饰中的用途，及其技术应用。
本发明还涉及重组silicatein-β或从天然来源中分离的silicatein-β及silicatein-β-融合蛋白在鉴别这些由酶催化的过程的活化剂或抑制剂中的应用。
1.1硅质海绵中的生物-矿化(生物源性二氧化硅的形成)
硅酸盐的技术合成需要剧烈的条件，例如高压及高温。相反，硅质海绵-例如硅质藻类-能够利用特异性酶，在温和条件下，即在相对低温及低压下，形成硅酸盐质支架。
所述硅质海绵的骨架的主要成分是针形的骨针，在寻常海绵(demosponges)(horn sponges(角海绵))及六放海绵纲(玻璃海绵)的种群中，该骨针由无定形非晶体二氧化硅构成。
关于所述骨针的形态学及生源论的现有知识的评论参见：Uriz等人(2003)Progr Molec Subcell Biol 33：163-193；Müller等人(2003)ProgrMolec Subcell Biol 33：195-221。海绵-骨针中的蛋白石二氧化硅包含6-13％水，因此大概的分子式为(SiO2)2-5·H2O(参见Schwab & Shore(1971)Nature 232：501-502)。在寻常海绵中，骨针的形成围绕轴丝开始，硅石在该轴丝周围由酶沉积。
描述了在形成硅酸盐的有机体中的SiO2-骨架的合成和/或降解中，两种所涉及的酶及其技术应用。
一种酶是silicatein-α(简单命名为silicatein)，另一种是产生轴丝的蛋白，该轴丝填充海绵-骨针(针状)的轴向槽。(参见PCT/US99/30601。Methods，compositions，and biomimetic catalysts，such as silicateins andblock co-polypeptides，used to catalyze and spatially direct thepolycondensation of silicon alkoxides，metal alkoxides，and their organicconjugates to make silica，polysiloxanes，polymetallo-oxanes，and mixedpoly(silicon/metallo)oxane materials under environmentally benignconditions.(方法，组合物及仿生催化剂，例如silicatein及封闭共聚多肽，用于在环境友好条件下催化及空间上指导硅醇盐、金属醇盐及其有机共轭体的缩聚，以产生硅石、聚硅氧烷、聚金属-环氧乙烷及混合的聚(硅/金属)环氧乙烷材料。)发明人/申请人：Morse DE，Stucky GD，Deming，TD，Cha J，Shimizu K，Zhou Y；DE 10037270 A1.(Silicatein-介导的无定形硅酸盐和硅氧烷的合成及其应用。)Silicatein-mediatedsynthesis of amorphous silicates and siloxanes and their use.德国专利局2000。申请人及发明人：Müller WEG，Lorenz B，Krasko A，SchrÖder HC；PCT/EP01/08423.Silicatein-mediated synthesis of amorphous silicatesand siloxanes and use thereof.(Silicatein-介导的无定形硅酸盐和硅氧烷的合成及其应用)申请人及发明人：Müller WEG，Lorenz B，Krasko A，SchrÖder HC)。此酶是从海产硅质海绵Suberites domuncula中被克隆(参见Krasko A，Batel R，SchrÖder HC，Müller IM，Müller WEG(2000)expression of silicatein and collagen genes in the marine sponge S.domuncula is controlled by silicate and myotrophin.(silicatein及胶原基因在海产海绵S.domuncula的表达是由硅酸盐和重组胰岛素样生长因子1(myotrophin)来调控)Europ J Biochem 267：4878-4887)。Silicatein能够从有机硅化合物(烷氧基硅烷)中合成无定形二氧化硅(聚硅酸和聚硅酸盐)(参见Cha JN，Shimizu K，Zhou Y，Christianssen SC，Chmelka BF，Stucky GD，Morse DE(1999)Silicatein filaments and subunits from amarine sponge direct the polymerization of silica and silicones in vitro.(来自海产海绵的Silicatein丝和亚基指导硅石和硅酮的体外聚合。)Proc Natl Acad Sci USA 96：361-365)。
第二种酶是silicase，其属于碳脱水酶类(参见DE 102 46 186.4号。Degradation and modification of silicates and silicones throughsilicase and use ofthe reversible enzyme.(通过silicase及可逆酶的使用，降解和修饰硅酸盐和硅酮。)德国专利局2002。申请人及发明人：MüllerWE G，Krasko A，SchrÖder HC)。此酶最初在海产海绵S.domuncula中发现，其主要与生物源性硅石的降解有关(参见SchrÖder HC，Krasko A，Le Pennec G，Adell T，Wiens M，Hassanein H，Müller IM，Müller WEG(2003)Silicase，an enzyme which degrades biogenous amorphous silica：Contribution to the metabolism of silica deposition in the demospongeSuberites domuncula.(Silicase，降解生物源的无定形硅石的酶：有利于在寻常海绵地中海寄居蟹皮海绵中硅石沉积的新陈代谢。)Progr MolecSubcell Biol，33，250-268)，但是也可在可逆反应中合成硅石。
2.发明内容
令人惊讶的是发明人发现-首先在海产海绵S.domuncula中-在形成硅的有机体的细胞中，不仅发现一种合成硅的酶(silicatein-α)，而且发现另外的形成硅的酶。因此，本发明所述的silicatein-β的特征在于其在催化能力和技术/医学应用方面的特别有利的性能，这些性能不能由技术人员从现有技术和类似的结论中获得。
这些有利性能基于：
a)不同的底物特异性
b)不同的动力学
c)不同的结合常数
d)不同的稳定性。
应用PCR方法(见下文)从S.domuncula中分离编码所述silicatein-β多肽的cDNA。也可从其它诸如Geodia cydonium的海绵体中分离相关的cDNAs。
此外，本发明的新颖之处在于，通过增加培养基中的硅浓度(通常到60μM硅酸盐或其它硅化合物，该硅化合物的水解导致相似的硅酸盐浓度)，所述silicatein-β-基因可在动物(海绵体)或从中获得的细胞/细胞团中被诱导。特别有利的是(实现甚至更强的诱导作用)，如果除硅之外，在该培养基中还存在增加的离子浓度(高铁离子或高铁盐或络合物，例如柠檬酸铁(+++)盐)。
根据本发明的另一方面，提供了通常用于体外或体内合成二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物)、硅酮和其它硅(IV)或金属(IV)化合物和这些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金属配合物用于降解，特征在于该多肽包含动物、细菌、植物或真菌的水解酶(silicatein-β)结构域，其与SEQ ID No.1中所述序列具有至少25％的序列相似性(见图1)。目前未知以及从现有技术中还未意识到，除silicatein-α之外，其它的酶，如这里描述的silicatein-β能产生硅酸盐或硅酮。由于这些过程的可逆性，本发明另一方面涉及降解无定形二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物)、硅酮和其它硅(IV)或金属(IV)化合物及这些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金属配合物用于合成，特征在于该多肽包含动物、细菌、植物或真菌的水解酶(silicatein或组织蛋白酶)结构域，其与SEQ ID No.1中所述序列具有至少25％的序列相似性(见图1)。
本发明所用方法，其特征在于化合物，例如硅酸、单烷氧基硅三醇、单烷氧基硅二醇、单烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、二烷氧基硅醇、三烷氧基硅醇、四烷氧基硅烷、烷基-、芳基-或金属-硅三醇、烷基-、芳基-或金属-硅二醇、烷基-、芳基-或金属-硅醇、烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅二醇、烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金属-二烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金属-三烷氧基硅烷、或其它金属(IV)化合物用作所述合成的反应物(底物)。通过使用所述化合物的确定混合物，其中可随意选择所述底物的比例，可产生确定组合物的混合-聚合物。
根据本发明的另一方面，可通过以所述多肽或多肽的金属配合物、或者多肽或多肽的金属配合物与其它分子或玻璃、金属、金属氧化物、塑料、生物聚合物或其它材料的表面的结合为模板来形成确定的二维和三维结构。
根据本发明的另一方面，提供了修饰包含硅酸或硅(IV)-或金属(IV)化合物的结构或表面的方法，其中多肽或多肽的金属配合物用于该修饰作用，其特征在于该多肽包含动物、细菌、植物或真菌水解酶(silicatein或组织蛋白酶)结构域，其具与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性。优选地，包含硅酸的结构或表面以宝石或半宝石的形式存在。
使用本发明所述方法，其中所述修饰类同于抛光、轻微蚀刻，或包括由所述多肽或多肽的金属配合物产生所述结构或表面的钻孔或凹口，该结构或表面包含硅酸或硅(IV)-或金属(IV)化合物。
本发明的另一方面涉及利用本发明方法获得的化合物或包含硅酸的结构或表面，，特别是以宝石或半宝石的形式获得。
本发明的另一方面也涉及按SEQ ID No.1记载的、来自Suberitesdomuncula的水解酶(silicatein-β)的多肽，或者其同源多肽，所述多肽的金属配合物或其部分，该同源多肽在水解酶(silicatein-β)结构域的氨基酸序列中显示与描述于SEQ ID No.1中的序列有至少25％的序列相似性。
本发明另一方面涉及核酸，特别是SEQ ID No.2的核酸，其特征在于其基本上编码本发明的多肽。本发明所述核酸可以DNA，cDNA，RNA或其混合物的形式存在，其特征在于该核酸的序列具有至少一个内含子和/或聚A序列。本发明另一方面涉及本发明的以其互补“反义”序列形式存在的核酸。
本发明的另一方面还涉及本发明的核酸，其具有(a)融合蛋白(嵌合蛋白)构建体、(b)含有分离蛋白-表达的构建体(蛋白酶裂解位点)或(c)具有分离蛋白-表达的构建体(表达盒)的形式。本发明所述核酸可合成产生。用于此目的的方法是本领域所公知的。
本发明另一方面涉及载体，优选为质粒、穿梭载体、噬粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或粒子、纳米微粒或脂质体的形式，其中所述载体包含本发明的核酸。此外，可提供用于蛋白质传递的载体，优选为包含本发明所述多肽的纳米微粒或脂质体形式。
本发明另一方面，提供宿主细胞，该宿主细胞用载体转染或感染或用本发明的粒子转导。该宿主细胞的特征是其表达了权利要求1所述的多肽、该多肽的金属配合物或其部分。适合的宿主细胞为公知的宿主细胞-有机体，例如酵母、真菌、海绵、细菌、CHO细胞或昆虫细胞。
本发明所述的多肽，除自然形式之外，还包括合成产生的或所述多肽或多肽的金属配合物存在于原核或真核细胞提取物或裂解产物中。该细胞提取物或该裂解产物可得自离体的或ex vitro细胞，例如重组的细菌细胞或海产海绵。
根据本领域技术水平中公知的常规方法纯化本发明所述的多肽，因此该多肽基本上不与其它肽共同存在。
于是，本发明另一方面还涉及用于鉴定按SEQ ID No.1记载的、来自Suberites domuncula的水解酶(silicatein-β)的多肽或其同源多肽的抑制剂或活化剂的方法，在该水解酶(silicatein-β)结构域的氨基酸序列中，该同源多肽显示与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性，其中a)提供了按SEQ ID No.1记载的、来自Suberites domuncula的水解酶(silicatein-β)的多肽、或其同源的多肽，在该水解酶(silicatein-β)域的氨基酸序列中，该同源多肽显示与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性，b)将来自步骤a)的多肽与潜在的抑制剂或活化剂接触，以及c)测定该多肽的合成或降解硅酸盐或硅酮的能力。利用这些方法，可检测有价值的物质，在某些情况下这些物质可适合作治疗剂(关于此，见下文)。用于鉴定这样的物质的方法是技术人员所公知的，以及例如包括采用放射性标记或酶标记的候选化合物。用于测定所述水解酶(silicatein-β)的活性的方法如下文所述，并可容易地由技术人员使其适应于特定的分析模式。因此，抑制剂基本上完全减少所述酶的活性，活化剂诱导活性或在基线水平上增强活性。
根据备选的方法，按SEQ ID No.1记载的、来自Suberitesdomuncula的水解酶(silicatein-β)的所述多肽或其同源多肽，可以以体内、原核或真核细胞提取物或裂解产物或纯化的形式提供，以用于分析，在该水解酶(silicatein-β)结构域的氨基酸序列中，该同源多肽显示与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性。
本发明另一方面还涉及用于产生药物组合物的方法，该方法包括a)根据权利要求24或25鉴定抑制剂或活化剂，以及b)将所鉴定的抑制剂或活化剂与药物可接受的载体或辅助剂混合。利用该组合物，所提供的诸如本发明所述多肽或核酸的有价值的药物可用于矽肺的预防或治疗。此外，本发明所述多肽或核酸或药物组合物可用于硅酮和硅酮-植入物的吸收或吸收性的调节。最后，本发明也可利用本发明所述核酸转染细胞，用于硅酮和硅酮植入物的吸收或吸收性的调节。本发明的用途和与其有关的方法是技术人员所公知的，以及可容易地被调整以适应本发明所提出的需要和需求。
本发明现通过以下实施例来进一步阐述，但不限于此。在附图和序列表中，显示了：
在下文中，列出了附图和序列表的图解说明。其显示：
SEQ ID No.1：来自S.domuncula的本发明的硅石代谢silicatein-β多肽的氨基酸序列(rSILICAβ_SUBDO)。
SEQ ID No.2：来自S.domuncula.的本发明的硅石代谢silicatein-β多肽的cDNA核酸序列。
图1：
来自S.domuncula.的本发明的硅石代谢silicatein-β多肽的cDNA核酸序列。衍生于开放阅读框架的核酸序列的氨基酸序列标示在核酸序列下方。
图2：
显示了来自S.domuncula(SILICAaSUBDO[数据库登记号CAC03737.1]，和SILICAbSUBDO[AJ519940])和T.aurantium(SILICAaTETHYA[AAC23951.1]；SILICAbTETHYA[AF098670])的海绵-silicatein-序列silicatein-α和silicatein-β的比较(“序列比对”)。该序列中保守残基(其物理-化学特性是相似的或相关的)以黑底白字显示，以及至少两个序列中那些相同的以灰底黑字显示。在该silicatein-序列内特征性位置表示为：Ser(●)、His(■)和Asn(■)，将酶原转化为成熟酶的加工部位表示为(}{)和丝氨酸簇([Ser])。
图3：
海绵silicatein与原口动物的组织蛋白酶L-序列(黑腹果蝇(D.melanogaster)[果蝇属(DROSOPHILA)]BAA06738；秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)[新杆状线虫(CAENORHABDITIS)]NP 507199；丰年虾(Artemia franciscana)[卤虫(ARTEMIA)]AAD39513)、后口动物的组织蛋白酶L-序列(斑马鱼(Danio rerio)[鲐DANIO]AAN32912.1；人类(Homo sapiens)[人(HUMAN)]X12451)、以及来自S.domuncula的海绵序列([皮海绵(SUBERITES)]；AJ272013)和来自G.榅桲子(G.Cydonium)的海绵序列([GEODIA]；Y10527)的种系发生关系。为了显示组织蛋白酶和silicateins的聚类，该树保持“无根状”(无外部种群“根”)。在分枝上的数字表明该分枝的统计学显著性(1000对应100％显著性)。该标尺表示所谓的“进化距离”，其中该标尺的长度对应所述序列内每一位置上的0.1氨基酸取代的距离z。
图4：
在转移到补加硅酸盐/Fe(+++)的人造海水中后，S.Domuncula的组织中silicatein的表达量。RNA或者在添加硅酸盐/Fe(+++)后立即被提取(第零天)，或者两和六天后，进行RNA印迹分析。
图5：
海绵组织中silicatein阳性细胞的检测。(A)从保持在无硅酸盐/Fe(+++)的海水中的海绵产生冷冻切片，并与DIG标记的SDSILICAβ反义DNA杂交。随后，该样品用抗洋地黄毒苷/碱性磷酸酯酶进行孵育，并用NBT/X-磷酸盐检测信号。在含有硅酸盐/Fe(+++)的海水中保持2天(B)、4天(C)或6天(D)的动物的切片分析。显示了在中质(m)内的含水系统的通路(c)。该通路由扁平细胞形成的上皮层来定界限。放大倍率：×50。
编码silicatein-β的基因的克隆
从cDNA库中分离编码S.domuncula的silicatein-β的cDNA(图1)。对于silicatein-β，直到现在，仅知该酶是骨针(海绵针)的轴丝的蛋白组分，但是未发现其参与二氧化硅骨针的酶形成。
silicatein-β的cDNA的分离，例如从S.domuncula中的分离，按以下方式进行。对于同源性筛选，使用来自S.domuncula的Silicatein-α的洋地黄毒苷-11-dUTP标记的DNA探针(“DIG random primed DNA labelingkit”(DIG随机的引物DNA标记试剂盒)；罗氏公司)；公开了该cDNA的序列(数据库登记号AJ272013；Krasko等人(2000)Europ J Biochem267：4878-4887)。如文章所述(参见Kruse等人(1997)Mol Biol Evol14：1326-1334)，在用于“plaque lifts”的“低严紧”杂交条件下实施S.domuncula-cDNA-库的筛选。以BCIP/NBT为底物，利用碱性磷酸酯酶连接的抗洋地黄毒苷抗体鉴定阳性克隆(参见Blake等人(1984)AnalBiochem 136：75-179)。通过RNA印迹法，确定是否获得SDSILICAβ的全序列。可利用DNA自动测序仪(Li-Cor 4000S)完成该DNA序列测定。
对来自海产海绵S.domuncula的silicatein-β多肽进行编码的cDNA和源于所述核酸序列的多肽具有以下特征。该核酸序列包含1372个残基，具有从nt122-124至nt1271-1273(终止密码子)的开放阅读框架(图1)。衍生的具有383个残基的silicatein-β的氨基酸序列表示具有42,068大小的多肽(图1和图2)。
所述海绵-silicatein-β多肽是组织蛋白酶L亚家族的新成员(参见Shimizu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：6234-6238；Cha等人(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96：361-365；Krasko等人(2000)Europ JBiochem 267：4878-4887)。所述S.domuncula-Silicatein-β多肽与来自Tethya aurantium的silicatein-α(数据库登记号AAC23951.1；“期望值”[E；Blast-NCBI；(Coligan等人(2000)蛋白质科学中的流行方案(CurrentProtocols in Protein Science.)John Wiley & Sons，Chichester)]＝7e-58)、来自T.aurantium的silicatein-β(AF098670；E＝4e-57)和来自S.domuncula的silicatein-α(CAC03737.1；E＝2e-56)共享最大的相似性；该S.domuncula silicatein-β还与来自长红锥蝽(Rhodnius prolixus)的组织蛋白酶L(AF320565；E＝3e-55)略微相关。所有的四种silicatein序列显示了特征性的三氨基酸Ser(代替存在于所述组织蛋白酶中的Cys)、His和Asn，该三氨基酸构成半胱氨酸蛋白酶的催化三联体(参见Shimizu等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：6234-6238；Cha等人(1999)Proc NatlAcad Sci USA 96：361-365；Krasko等人(2000)Europ J Biochem267：4878-4887)；图2。作为自体分解或者由第二蛋白酶作用的结果，形成活性酶所必需的加工位点可根据：Nishimura等人((1988)ArchBiochem Biophys 261：64-71)来预测。根据与所述组织蛋白酶的比较，所述海绵-silicatein-β中的切割位点可定位在aa139(图2)；因此，具有42,068Da Mr的酶原将成熟为具有预测的26,205Da Mr的活性酶。同在其它半胱氨酸蛋白酶中一样，三个推测的二硫化物桥也存在于海绵silicatein-β中。
silicatein-β-多肽的种系发生分析
至于所述种系发生分析(图3)，将来自S.domuncula(silicatein-α和silicatein-β)和T.aurantium(silicatein-a和silicatein-β)的海绵silicatein、与来自原口动物(黑腹果蝇，秀丽隐杆线虫和丰年虾)和后口动物(人类和斑马鱼)的组织蛋白酶L序列、以及来自S.domuncula和G.Cydonium的组织蛋白酶序列进行比较(“序列比对”)。“无根”树[无外部种群“根”]显示组织蛋白酶L序列明显地与四种silicateins分离。
silicatein-β-多肽的上调
可通过向培养基中加入硅酸盐和Fe(+++)来上调silicatein-β-基因的表达。这可通过整体动物、组织、细胞或细胞聚集物(例如海绵细胞团(sponge-primmorphs))上的RNA印迹法或蛋白质印迹法来示例性显示。
所述后者细胞团是聚集物，其由增殖和分化细胞组成，并从个体海绵细胞中形成。关于细胞团-系统，已提交了专利(参见德国专利第19824384号。Production of primmorphs from dissociated cells fromsponges，corals and further invertebrates：Culturing-method of cells fromsponges and further invertebrates for the production and detection vonbioactive substances，for a detection of environmental toxins，and forculturing of these animals in aquaria and outdoor.(从来自海绵、珊瑚和其它无脊椎动物的游离细胞中产生细胞团：源于海绵和其它无脊椎动物的细胞的培养方法，以产生和检测生物活性物质、检测环境毒素和在水族馆和野外培养这些动物。)发明人和申请人：Müller WEG，BrümmerF)。
在如图4所示的实验中，测定了silicatein-β-基因的表达量，其响应所述培养基中的硅酸盐和Fe(+++)而强烈地上调。
为了测定硅和离子对所述基因表达的作用，在人造海水中培养动物两周，该人造海水包含氯化物(19.0g/kg)、钠(11.0)、镁(1.3)、硫酸盐(2.7)、钙(0.4)、钾(0.4)和碳酸氢盐(0.15)。然后，该动物转移至含有60μM硅酸盐(以硅酸钠的形式)和30μM Fe(+++)的人造海水中
RNA印迹法
利用TRIzol试剂(Fa.GibcoBRL)从在液氮中磨成粉的动物、组织、细胞和细胞聚集物中提取RNA。随后，按照制造商(Amersham公司)的技术说明书，将5μg量的总RNA在1％甲醛/琼脂糖凝胶上进行电泳分离，并印在杂交-N+尼龙-膜(Hybond-N+-nylon-membrane)上。利用cDNA SDSILICAβ进行杂交。可使用silicatein-β-探针，例如，该探针从nt676延伸至nt1198，因而跨越了所述衍生多肽中的特征区域，即富含丝氨酸簇。该簇在所述S.domuncula silicatein-β-多肽中发现位于aa309-aa329之间；该区域也显示了与silicatein-α-多肽的差别。可使用，例如，S.domuncula β-微管蛋白cDNA，SDTUB(数据库登记号AJ550806)为内标物。根据“说明书”(罗氏公司)用PCR-DIG-探针-合成试剂盒标记该所述探针。在洗涤后，用抗DIG Fab片断[与碱性磷酸酯酶连接；以1∶10,000稀释]检测该DIG标记的核酸，并根据制造商(罗氏公司)的技术说明书用CDP通过化学发光技术进行观察。随后，所述筛选例如可用GS-525分子图像仪(Bio-Rad公司)进行扫描分析。
所述RNA印迹检查显示在所述动物从不含硅酸盐//Fe(+++)的海水中转移至含硅酸盐//Fe(+++)的海水后，转录物的量强烈地增加(图4)。利用所述SDTUB(β-微管蛋白)基因进行的平行杂交研究显示在所述凝胶上装载着同等量的RNA。
根据这些结果，可得出在用硅酸盐//Fe(+++)对所述动物进行孵育后，在完整的动物体内形成silicatein-β阳性细胞的结论。
原位定位研究
还可利用在原位的杂交监测所述silicatein-β-基因的表达。为此，在室温下，将动物组织，例如，在硅酸盐/Fe(+++)培养基中孵育6天后，在含有30mM的乙二胺四乙酸(EDTA)的海水中处理30分钟。随后通过沉降获得所述骨针，并进一步处理来进行在原位的杂交。
在下文中，采用基于由Polak & McGee描述的操作步骤(参见“原位杂交”(In situ hybridization)0xford University Press，牛津，1998)的方法，有改动(参见Le Pennec等人(2003)J Biotechnol 100：93-108)。在-30℃时借助低温恒温器来获得8-μm厚度的冷冻切片。利用多聚甲醛将该冷冻切片进行固定，随后在室温下用1×PBS洗涤两次。该切片用蛋白酶K进行孵育，接着再用多聚甲醛固定。为了除去所述海绵的颜色，该切片用乙醇，最后用异丙醇进行孵育。用1×PBS再水化后，将洋地黄毒苷(DIG)标记的DNA探针加入到杂交溶液中。在45℃下于玻璃容器中过夜进行该杂交；在50℃下，如
等人所述(参见
等人(2003)Evo & Devo 5：240-250)，进行随后的洗涤步骤。在封闭后，该切片，例如，用与碱性磷酸酯酶连接的抗洋地黄毒苷抗体进行孵育。为了观察所述信号，可使用显色剂NBT/X-磷酸盐。
用于原位定位研究的DNA-探针的产生
所述原位杂交，例如，可用洋地黄毒苷标记的ssDNA探针来实施。该探针，例如，用所述“PCR DIG探针合成试剂盒”(罗氏公司)来标记。根据所述S.domuncula cDNA-序列设计该DNA探针。应用线性化的cDNA通过聚合酶链式反应(PCR)产生反义的和有义的探针。该反义探针通过使用在5’至3’有义方向的“正向引物”来获得；互补有义探针通过使用3’至5’方向的反向引物来获得。SDSILICAβ-探针跨越520bp(nt676至nt1198)长度的开放阅读框架内一片段。所述PCR，例如，借助GeneAmp9600热循环仪(Perkin Elmer)来进行。以下反应条件已证明适用于该PCR：在95℃时初始变性进行3分钟，随后进行35次扩增循环，每次扩增循环通过在95℃进行30秒、58℃-30秒，74℃-4分钟来完成，以及在72℃时最终的延长步骤进行20分钟。例如，可用“DIG寡聚核苷酸标记试剂盒”(罗氏公司)来进行标记。
Silicatein-阳性细胞
在如图5所示的实验中，通过使用所述原位杂交研究，显示在不含有硅酸盐/Fe(+++)海水中保存的海绵组织中不存在Silicatein-阳性细胞。有趣地是，利用所述silicatein-探针(B-D)发现该Silicatein-阳性细胞首先出现在上皮层(扁平细胞)，以及仅稍后，在硅酸盐/Fe(+++)暴露四天后，发现在中质中的细胞也是阳性的。
3silicatein-β-多肽的产生
silicatein-β-多肽可以从组织或细胞中纯化，或者可以重组产生。
3.1.天然来源的silicatein-β-多肽的纯化
可以从分离的海绵骨针中，便利地完成所述silicatein-β的纯化。通过使用这种操作，除了其它的以外，silicatein-β-多肽还可从S.domuncula中进行纯化。
为此，骨针(由无定形硅酸盐组成)可以从海绵，例如Suberitesdomuncula中通过在无Ca++-和Mg++的海水中分离组织，以及沉降而得到。该骨针的无定形硅酸盐在诸如稀氢氧化钠溶液的碱性环境中被除去。包含silicatein-β的骨针的有机原纤维通过离心(例如20,000xg；1小时；4℃)来获得。所述蛋白由诸如1M NaCl的高盐浓度，也可由“蛋白质重折叠试剂盒”被带入溶液中。
随后，所述silicatein-β在亲和基质上进行纯化。由于silicatein-β-特异性抗体固定在固相上(CNBr活化的琼脂糖或其它适当的载体)而产生该亲和基质。作为抗体，使用标准方法所产生抗silicatein-β的单克隆或多克隆抗体(参见Osterman，L.A.“蛋白和核酸研究的方法”(Methods of protein and Nucleic Acid Research)第2卷；Springer-Verlag[柏林]1984)。根据制造商(医药公司)的技术说明书，进行所述抗体与所述柱基质的偶联。利用pH的变化或离子强度的改变进行纯silicatein-β的洗脱。
3.2.重组体silicatein-β-多肽的产生
3.2.1.来自海产海绵的cDNA的克隆
上文已描述了来自海产海绵S.domuncula的silicatein-β-cDNA的克隆。
所述silicatein-β基因也可利用PCR技术，使用来自诸如ZapExpress和大肠杆菌XL1-Blue MRF‘的cDNA库的适合的简并引物来鉴定；为此，可使用各自的载体特异性引物。所获得的合成产物用于筛选各自的cDNA库。然后，所鉴定的克隆在载体(例如，pGem-T)内被亚克隆，随后测序。
3.2.2.重组silicatein-β-多肽的表达和分离
重组silicatein-β-多肽的产生优选地在E.coli中发生。然而，在酵母和哺乳动物细胞中也可能产生并已成功地完成。为此，所述cDNA被克隆进诸如pQE-30的相应的载体内。转化E.coli后，所述silicatein-β-多肽的表达通过用IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)的诱导作用来完成(参见Ausubel等人(1995)“”Current Protocols inMolecular Biology(分子生物学的流行方法)John Wiley and Sons，NewYork)。所述silicatein-β-多肽的表达和例如通过存在于所述重组蛋白中的组氨酸-标签的重组蛋白的纯化，在诸如Ni-NTA-基质的相应的亲和柱上进行(参见Skorokhod等人(1997)Cell.Mol.Biol.43：509-519)。
在以下的实例中公开了应用“GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合”-系统(Amersham公司)，在E.coli中表达S.domuncula的silicatein-β-基因。在该实例中，使用仅包含aa48至aa383氨基酸的插入片段(短形式)；也可使用包含衍生的完全蛋白的插入片断。相应的克隆克隆进诸如质粒pGEX-4T-2的载体，该载体包含日本吸血虫(Schistosomajaponicum)的GST-基因。已发现其它表达载体也是适合的。在E.coli的转化后，所述silicatein-β-多肽的表达通常由IPTG来诱导并在37℃中进行4或6小时(参见Ausubel FM，Brent R，Kingston RE，Moore DD，Smith JA，Seidmann JG，Struhl K(1995)Current Protocols in MolecularBiology.(分子生物学的流行方法)John Wiley and Sons，New York)。所获得的GST-融合蛋白通过，例如谷胱苷肽-琼脂糖4B上的亲合色谱来纯化。为了从所述重组海绵-silicatein-β-多肽中分离谷胱苷肽-S-转移酶，用凝血酶(10单位/mg)剪切所述融合蛋白。随后在2-巯基乙醇的存在下，所述蛋白进行凝胶电泳。该凝胶电泳可在含0.1NaDodSO4的10％聚丙烯酰胺凝胶上来完成(聚丙烯酰胺凝胶电泳法；PAGE)。该凝胶用考马斯亮蓝进行染色。在裂解、纯化以及后来的PAGE后获得所述重组蛋白的截短形式。
3.2.3.来自其它有机体的重组silicatein-β-多肽的表达和分离
对应于上述操作步骤，也可完成来自其它有机体的，例如来自(产生二氧化硅)六放海绵纲(例如，Rhabdocalyptus dawsoni)的silicatein-β-cDNA的分离，克隆和表达。
3.3.利用抗体的silicatein-β-多肽的分离和纯化
继根据上述方法之一进行提取或部分纯化之后，所述silicatein-β-在抗体-亲和基质上进行纯化。该操作步骤对应3.1节中所述的那些操作。(“从天然来源的silicatein-β多肽的纯化”)
也成功地使用了其它诸如聚合硅酸盐或共聚物硅酸盐/锗酸盐(germinate)
4.silicatein-β-活性的检测和硅-烷氧基-化合物的合成
在下文中，仅提供了重组海绵silicatein-β-多肽的短形式的活性。
4.1.Silicatein-β-活性
4.1.1.形成聚合物(例如硅石)的活性
为了检测重组体silicatein-β的酶活性，可使用分析法，该分析法基于在四乙氧基硅烷(TEOS)的水解和随后的聚合作用后，测定聚合的和沉淀的硅酸盐。
所述重组体silicatein-β的酶合成活性的测定通常如下进行。利用适合所述反应的缓冲液，例如，50mM MOPS，pH 6.8，将该重组体silicatein-β透析过夜[其它pH为4.5-10.5的缓冲液也适合]。
将1-50μg重组silicatein-β溶解在1ml适当的缓冲液中，例如50mM MOPS(pH 6.8)，加入1-4.5mM四乙氧基硅烷溶液。该酶促反应可在室温下进行。在60分钟的孵育期中，通常每100μg silicatein-β合成200nmol的无定形硅酸盐(作为钼酸盐-反应性的，可溶的硅酸盐)。为了检测该硅酸盐产物，该材料在台式离心机中进行离心(12000xg；15分钟；+4℃)，用乙醇洗涤，并空气干燥。随后，将所述沉淀物用1MNaOH水解。在得到的溶液中，用诸如硅酮-分析(Merck)的钼酸盐支持的检测方法对硅酸盐进行定量测定。
令人惊讶地，发现除底物四乙氧基硅烷之外，silicatein-β也聚合另外的硅醇盐。
以下化合物可用作羧肽酶介导的合成的反应物(底物)：四烷氧基硅烷、三烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、单烷氧基硅三醇、二烷氧基硅醇、单烷氧基硅二醇、单烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金属-三烷氧基硅烷、烷基-、芳基-或金属-硅醇、烷基-、芳基-或金属-硅二醇、烷基-、芳基-或金属-硅三醇、烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅二醇、烷基-、芳基-或金属-二烷氧基硅醇、或其它金属(IV)化合物(镓(IV)、锡(IV)或铅(IV)的烷氧化合物)。这些底物的混合物也可为所述酶识别并聚合。因此，也可产生混合-聚合物。
将诸如四乙氧烷基硅烷的底物在二甲基亚砜中溶解，成为通常为500mM的储备液，随后稀释至所需要的最终浓度。
所述silicatein反应也可与硅化学中公知的其它反应结合，例如氯-甲基甲硅烷的Müller-Rochow-合成、较长链硅烷的合成(例如Si8-硅烷)和硅-氮-化合物(例如四氮化三硅，Si3N4)。后者化合物通过硅烷经氮或空气(空气-氮)的燃烧来产生。较长链的硅由热解产生，例如，在500℃，铜的存在下进行。聚甲基硅氧烷的大规模的技术合成主要通过Müller-Rochow-方法发生(催化剂：铜；温度为250-300℃)。这些方法是本领域的现有技术。较低级的硅烷非常不稳定且极易燃-在剧烈爆炸下-在空气中或与水接触时，而不自燃的较高级的(较长链)硅烷(从正庚硅烷开始)代表有前景的能源(可燃物或燃料)。这些硅烷的燃烧产物是无毒的四氮化三硅(Si3N4)。因为由silicatein催化的酶促反应将前体输送至这些硅烷，这极大促进和改进了这些硅烷的合成效率和特异性。
作为不限制本专利所要保护范围的实施例，提供以下反应方案：具有n＞8的Sin链长度的短链硅烷由生物催化剂silicatein产生。这些短链硅烷中的羟基在用氢、释放氢的还原剂的电诱导水解中，或通过由路易斯酸(Lewis-acids)催化的氢化而被置换。通过适合的方法或通过蒸馏方法从所述反应混合物中除去所释放的水，该适合的方法对应于本领域知识的用于减少和干燥的方法。所述反应方案形式上如下所示：
(1)
(室温中～中性pH)
(2)
(除去水并电活化)
根据本发明，可设计两步法。氢可从水中电化学地产生。关于这方面有公知许多方法。与此平行的，在一个仪器但分开的部分中，具有n≥7的Sin(OH)2n+2寡硅酸盐在非常温和的条件下-与本领域现有技术相反-由本发明的催化多肽silicatein α和β形成。在随后的反应中用活化的氢新生的除去所述反应溶液后，该寡硅酸盐可经氢化转化为寡硅烷，对应的分子式为n≥7的Sin(H)2n+2。因为其活化势能随着数目n的增加而增加，因而从n＝7开始的并对应分子式为Sin(OH)2n+2的硅烷不再自发地与空气或水中的氧反应，所以该反应设计是可能的。相反，因为低的活化势能，较低级的硅烷发生自发反应。
本发明也促进了节能和环保方法的引进，因为，除了其它因素以外，目前所用的氯代硅酸盐化合物变得不重要。此外，可在非常温和的反应条件实施全部的反应方案。利用本发明，寡硅酸盐(oligosilicates)可用作氢源，该氢源可普遍地运输和保存，具有较低的危险度和低技术要求。
根据本发明，如前所述利用silicateinα和β为催化多肽，可产生n＞2的短链寡硅酸盐。与本领域所用的＞200℃的温度和常压以上的压力相反，在此，50℃以下的温度和常压已是足够的。此外，所述反应可在水介质中进行，这在本领域的知识水平中是不可能的。这构成了对环境影响、安全性的实质改善、以及费用的减少。在以下反应方案中，该寡硅酸盐形成了许多目前所用的产品基础，例如硅烷、硅酮或其它有机硅化合物。
因为其可逆性，如上所阐明的，所述silicatein-反应可允许混合-醚-产生(形成Si-O-C键)。从这些化合物开始-根据本领域的知识-卤素化合物(例如，含氯)可用其它催化剂来形成，从该卤素化合物，可在氢氛中获得不同的硅烷-化合物。
Silicatein，特别地，能合成和降解锗和钛化合物，以及也适用于Si-Ti、Si-Ge或Si-Ge-Ti混合结构的产生，该混合物结构对芯片的生产具有重要性。
4.1.2降解聚合物(例如硅石)的活性(溶解硅石的活性)
Silicatein-β也可溶解硅石，特别是如果反应在抗坏血酸或其它儿茶酚或含有1，2-联苯酚的化合物的存在下发生。作为silicatein-β的底物，例如，可使用S.domuncula的骨针(无定形二氧化硅)。
在乙二胺四乙酸的存在下(20mM，PBS中；PBS＝磷酸盐缓冲溶液，包含1.15mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、137mM NaCl和2.7mMKCl)，所述骨针可通过12小时的孵育从海绵组织中获得。用蒸馏水和乙醇(两次)洗涤后，干燥该骨针(56℃)，然后在乳钵中研磨成粉。
随后可如下检测所述溶解硅石的活性。通常，在2ml Eppendorf-管中，将100μg所干燥的骨针(粉)加入到适合的诸如50mMTris-HCl-缓冲液(pH 7.2；10mM DL-二硫苏糖醇、100mM NaCl)的缓冲液和0.5mM ZnSO4中。随后，通常加入50μl所述重组silicatein-β多肽，并在25℃进行孵育(该孵育也可在大约5℃-65℃的其它温度下进行)。平均孵育时间为60分钟。为了定量检测所溶解的二氧化硅，将未溶解的骨针进行离心(14000xg；15分钟；4℃)。所释放的可溶解的硅酸，例如，可通过使用钼酸盐-支持的检测法，例如比色“硅测试”(Merck；1.14794)来定量检测。在此情况下，根据硅标准品的校准曲线(Merck1.09947)，从810nm处的消光值中计算硅酸的量。
4.1.3合成硅(IV)化合物的活性
所述silicatein-β(但也可以是其它silicateins，例如silicatein-α)的水解烷氧基硅烷活性的可逆性也可用于合成其它硅(IV)化合物或其它金属(IV)化合物，即由于引入基团，优选为亲核基团，所以添加烷氧基硅烷(烷氧基-金属(IV)-化合物)和包含反应混合物的酶。除了诸如四乙氧基硅烷(TEOS)的四烷氧基硅烷之外，还可使用三烷氧基硅烷、二烷氧基硅烷和单烷氧基硅烷以及三烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、二烷氧基硅醇、单烷氧基硅三醇、单烷氧基硅二醇、单烷氧基硅醇和烷基、芳基或卤素取代的硅(IV)的烷氧化合物。
所述silicatein-β的合成硅(IV)-化合物活性也可与这些底物或这些底物的混合物或从这些底物中产生的产物的聚合作用结合，其中可能在同一制备中同时进行所述反应。因此，可产生不同的聚合物或混合-聚合物。
4.1.4用于测定所述silicatein-反应的耦合光学试验
提供了用于测定所述silicatein的酶活性的简单试验。该试验为用于测定通过由silicatein介导的酶促反应，从底物(烷氧基硅烷和衍生物)中释放的醇的耦合光学实验。为此，需要光度计(例如Eppendorf光度计1101M)。使用以下缓冲溶液：
溶液1
2mmol/l ABTS(连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))缓冲溶液，如下产生：
步骤a：从溶液A(8.16g KH2PO4溶于重蒸馏水中，加至600ml)和溶液B(68.4g K2HPO4溶于重蒸馏水中，加至300ml；＝10倍的制备)中制备0.1M磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，即300ml溶液A与溶液B产生pH 7.5。
步骤b：将320ml步骤a中产生的溶液用O2饱和30分钟；随后将352mg ABTS溶解于该溶液中(注意：ABTS对光和空气敏感，不要使用超过1小时的缓冲液)。
溶液2
POD(过氧化物酶，罗氏公司)；10mg蛋白/ml，比活度大约为5U/mg。
溶液3
醇氧化酶(Sigma公司)溶液，如下制备：
步骤a：将100mg BSA溶解在0.1M磷酸钠缓冲液中(pH 7.5)。
步骤b：将10mg醇氧化酶冻干物溶解在1ml步骤a中制备的(冷的)BSA-0.1M磷酸钠缓冲液中。
步骤c：将135μl步骤b中制备的醇氧化酶溶液用10ml步骤a中制备的BSA-0.1M磷酸钠缓冲液稀释。
H2O2
5μl H2O2(莫克公司)用重蒸馏水稀释至50ml。
例如，可将在MOPS缓冲液(100mM NaCl、5mM CaCl2、0.1mMZnSO4，pH 6.8)中的4.5mM四乙氧基(TEOS)用作底物溶液。
所述分析如下实施：
移入试管：
2.8ml缓冲液/ABTS
10μl POD
50μl AO
然后混合，并随后加入
10μl H2O2
再混合，将光度计归零(调至0.1)。然后
加入100μl底物溶液或底物溶液中的酶(silicatein)，混合，
接着至少消光2分钟(滤光器405nm)。
不同的醇(例如乙醇)浓度用作阳性对照并用于校准曲线。
5.silicatein-β的cDNA与其它蛋白的一个或多个cDNA(s)的连接
5.1.silicatein-β融合蛋白的产生
为了产生与所述silicatein-β-多肽的融合蛋白，使用适当的表达载体(例如pQE-30载体，Qiagen)。产生所述silicatein-β-cDNA，该silicatein-β-cDNA的5′-端具有，例如，BamHI-限制性位点以及在3′-端具有，例如，SalI-限制性位点。除去在该silicatein-β-cDNA中的终止密码子。为此，使用所述PCR技术，为了扩增，使用了具有各自限制性位点的引物。分别获得第二蛋白的cDNA，其中在5′-端上具有与silicatein-β-cDNA 3′-端上相同的限制性位点(在SalI实例中)，以及在3′-端上具有一个不同于其它位点的位点(例如，HindIII-位点)。如果内部的限制性位点存在于各自的cDNAs中，可使用备选的限制性内切酶。另外，也可将街头引入两个cDNAs之间。
根据常规方法，可将两个cDNAs连接、纯化并连接至所述pQE-30-载体内。在组氨酸-标记后(大约6个组氨酸-密码子)发生所述连接作用。通过，例如，存在于所述重组蛋白中的组氨酸标签，可在相应的亲和层析柱，例如，Ni-NTA-基质上(Skorokhod A，Schcke H，Diehl-Seifert B，Steffen R，Hofmeister A，Müller WEG(1997)Cell MolBiol 43：509-519)进行所述融合蛋白的表达和纯化。
5.2分离表达I(蛋白酶-裂解位点)
作为5.1所述的方法的选择，可在所述silicatein-β-多肽的cDNA和附加蛋白的cDNA之间克隆蛋白酶-裂解位点(例如，肠激酶位点)。在此情况下，可将新起始物-蛋氨酸的密码子插入在所述附加蛋白的基因的编码区之前。表达和纯化后，所述融合蛋白被蛋白水解地切割。现在，两种蛋白均分别存在。
5.3分离蛋白II(DNA序列组件表达(表达盒))
可选择地，两种蛋白均可在一个构建体上分别进行表达。为此，在表达载体中将所述silicatein-β-基因设在在组氨酸标签(His-tag)之后。在所述silicatein-β-cDNA的末端，插入终止密码子。在所述silicatein-β-多肽的cDNA和所述附加蛋白的cDNA之间，克隆具有起始物-蛋氨酸的密码子的核糖体结合位点。再一次，将组氨酸标签设在在该附加蛋白的cDNA之前。该基因也得到终止密码子。
当在各自宿主细胞中所述蛋白用于功能性分析时，可删除所述组氨酸标记。
5.4.延长
细菌细胞和真核细胞可用于5.1-5.3所述的表达。
5.1-5.3所述的表达也可用于三个和多个开放阅读框架。
6.silicatein-β-多肽和silicatein-β-融合蛋白的应用
本发明的另一方面是如下所述的重组silicatein-β-多肽、从不同来源中纯化的silicatein-β以及silicatein-β-融合蛋白的应用。构成这些用途的基础的方法可容易地由技术人员从此处和上文所公开的内容、各自的文献中并利用普遍技术衍生出。
1)用于生物材料的表面修饰(改进生物相容性)。除了其它的以外，表面修饰的生物材料还用于，例如，影响细胞粘附和生长，改进血液-相容性或控制蛋白质吸附(例如，减少隐形眼镜的吸附)。文献综述参见：Ratner BD等人(Eds.)“生物材料科学-医学材料绪论”学术出版社，圣地亚哥(Biomaterials Science-An Introduction to Materials inMedicine.Academic Press，San Diego)1996年。事实上，问题在于用于产生这些修饰的条件通常对所用的生物材料具有有害(破坏)作用。与所用的物理/化学方法相比，“温和的”和保护生物材料的方法由所述表面修饰来提供，该修饰仅依赖于生物化学/酶促反应，该生物化学/酶促反应在本发明所述方法的协助下成为可能(在所述重组体/纯化的silicatein-β-多肽的协助下，silicatein-β介导的酶合成和-作为可逆反应-酶降解含SiO2或硅氧烷的表面)。特别地，所述重组体或从天然来源中纯化的silicatein-β用于产生硅酮材料的表面修饰(在包被过程中)。例如硅酮-乳房-埋植物、内置假体或金属埋植物(改善骨与金属埋植物间的连接，生物学化该金属埋植物)和隐形眼镜/塑料眼镜。用途还涉及用作骨置换材料的胶原涂层，和诸如用于“组织工程”的胶原羊毛状物的涂层。在此处，目的是增加稳定性和多孔性以及改进再吸收性。
2)通过聚硅酸盐、硅酮或混合-聚合物的共合成，用于产生诸如骨置换材料或牙置换材料的新生物材料。
3)用于(硅)-半导体或硅-芯片的表面修饰(接触区-处理)。
4)用于无定形二氧化硅的纳米结构的修饰或合成。利用所述重组体silicatein-β、所述重组体silicatein-β-融合蛋白或所述纯化的silicatein-β，可以在纳米水平中修饰或合成无定形二氧化硅的特异性二维和三维结构。所形成的结构可用在纳米技术中。
5)用于含硅宝石和半宝石的表面修饰。除了其它的以外，玛瑙、碧玉和缟玛瑙属于SiO2的无定形或微晶变体。因为在控制条件下借助所述silicatein-β对这些矿石的表面进行修饰，所以本发明所述方法用于产生或加工这些宝石/半宝石。在此，也可以选择性地引入外来分子/原子。
6)用于产生金属、金属氧化物、塑料和其它材料的涂层；特别用于在这些材料上产生单分子层。
7)用于产生诸如碳纤维的用于消防的技术纤维材料的涂层，以更好地加工或进一步修饰这些材料的特性。
碳纤维(碳纤维)具有极大的技术重要性，因为与金属相比，使用该碳纤维可产生实质上更轻，但更坚固和更硬的组分(在航空和航天上特别重要)。
8)用于产生毛线或棉线的涂层以获得这些材料的新特性，特别是抗过敏特性，改进其纯化或进一步修饰其特性。特别地，因为这些材料对目前方法所需要的剧烈条件敏感，所以该情况表明了酶促方法的优势。在二氧化硅涂层的协助下，可避免所用的部分溶液粘附所述材料。
9)用于产生包衣/层以减少诸如药剂(片剂)的添加剂(例如淀粉)的过敏性反应。
10)用于产生硅-氮-化合物。
11)用于合成硅-有机化合物。
12)用于与多磷酸盐产生硅复合物，该硅复合物也可由二价阳离子来连接。
13)用于产生触变材料。Silicatein也可用于(酶促或部分的酶促)产生触变材料。这些材料显示了在摇动或搅拌过程中，其粘度减少(或增加)的特征-具有稍微时间延迟(chronological delay)。在此，位于硅酸盐(硅酸)纳米颗粒的表面上的亲水OH基间的氢键的形成和断裂起作用。通过适当地选择反应条件，利用silicatein可产生高度分散的硅酸(硅酸盐)。现有技术中，高度分散的硅酸代表有效的触变剂。触变液体和材料具有极大的技术重要性(例如，用于有色油漆)。
14)通过silicatein介导的包被或包囊进二氧化硅中，促进药剂或RNAs和DNAs的膜传送性。
序列表
<110>海洋生物技术有限公司
<120>硅(IV)化合物及其它金属(IV)化合物的酶合成和修饰及降解
<130>U30063PCT
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>383
<212>PRT
<213>Suberites domuncula
<400>1
Met Ser Ala Leu Lys Phe Val Val Ala Leu Cys Val Val His Thr Ser
1 5 10 15
Leu Gly Ile Ala Glu Ser Val Gly Lys Ser Lys Thr Ala Gly Leu Ser
20 25 30
Asp Asp Gly Asn Tyr Thr Ala Val Thr Lys Ser Val Arg Leu Thr Pro
35 40 45
Val Leu Glu Phe Glu Glu Asp Trp Lys Gln Trp Thr Thr Asp His His
50 55 60
Lys Val Tyr Ser Asp Val Arg Glu Arg Val Asp Lys Tyr Thr Val Trp
65 70 75 80
Arg Ala Asn Lys Glu Tyr Ile Asp Gln His Asn Gln Asn Ala Gln Arg
85 90 95
Leu Gly Tyr Thr Leu Lys Met Asn Lys Phe Gly Asp Leu Thr Thr Lys
100 105 110
Glu Phe Ile Glu Gly Tyr His Cys Val Gln Asp Tyr Gln Pro Thr Asn
115 120 125
Ala Ser His Leu Asn Lys Lys His Lys Thr His Ala Phe Val Asp Tyr
130 135 140
Gly Asp Phe Val Arg Gly Gly Thr Gly Glu Gly Val Arg Gly Val Gly
145 150 155 160
Asn Met Pro Glu Thr Met Asp Trp Arg Thr Ser Gly Val Val Thr Lys
165 170 175
Val Lys Asp Gln Leu Arg Cys Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ser Ala Met
180 185 190
Ala Ser Leu Glu Gly Ile Asn Ala Leu Ser Tyr Gly Ser Leu Val Thr
195 200 205
Leu Ser Glu Gln Asn Ile Val Asp Cys Ser Val Thr Tyr Gly Asn His
210 215 220
Gly Cys Ala Cys Gly Asp Val Asn Arg Ala Leu Leu Tyr Val Ile Glu
225 230 235 240
Asn Asp Gly Val Asp Thr Trp Lys Gly Tyr Pro Ser Gly Gly Asp Pro
245 250 255
Tyr Arg Ser Lys Gln Tyr Ser Cys Lys Tyr Glu Arg Gln Tyr Arg Gly
260 265 270
Ala Ser Ala Arg Gly Ile Val Ser Leu Ala Ser Gly Asp Glu Asn Thr
275 280 285
Leu Leu Thr Ala Val Ala Asn Ser Gly Pro Val Ser Val Tyr Val Asp
290 295 300
Ala Thr Ser Thr Ser Phe Gln Phe Tyr Ser Asp Gly Val Leu Asn Val
305 310 315 320
Pro Tyr Cys Ser Ser Ser Thr Leu Ser His Ala Leu Val Val Ile Gly
325 330 335
Tyr Gly Lys Tyr Ser Gly Gln Asp Tyr Trp Leu Val Lys Asn Ser Trp
340 345 350
Gly Pro Asn Trp Gly Val Arg Gly Tyr Gly Lys Leu Ala Arg Asn Lys
355 360 365
Gly Asn Lys Cys Gly Ile Ala Thr Ala Ala Ser Phe Pro Thr Leu
370 375 380
<210>2
<211>1372
<212>DNA
<213>Suberites domuncula
<400>2
acttagtata ttatggtagt gtacaatacc tatctccata gaggcatgca taactaggtt 60
tattgaatag ctgctggcac aatttgttct caagttggtg ctattagatt tgtgttctag 120
aatgtcagca ttgaagtttg tagttgcctt gtgtgtagtt cacacaagct taggaatagc 180
tgagtcagtt ggtaagagca agactgcagg cctaagtgac gatggcaact acacagctgt 240
caccaaatct gtaagactga ctccagttct agagtttgag gaagattgga agcaatggac 300
aactgatcat cacaaggtct actctgatgt gagggagaga gtggacaagt acactgtatg 360
gagagctaat aaagagtaca ttgatcaaca caaccagaac gcacagagat tgggatacac 420
actcaaaatg aacaaatttg gagatttgac taccaaggag ttcattgaag gctatcactg 480
tgttcaggac taccaaccta ccaatgcatc acatttgaat aagaaacaca aaacgcacgc 540
gtttgtcgac tatggtgact ttgtgagggg tggaactggt gagggtgtga ggggtgtagg 600
aaacatgccg gagactatgg actggagaac ttctggagtt gtcacaaaag ttaaagatca 660
gcttcgttgt ggtagcagct atgcgttctc tgccatggct tcattggaag gaataaatgc 720
tctttcctac ggatctttgg tgacactcag tgaacaaaac attgtagact gctcggttac 780
ctatggcaac catggttgcg cctgtggtga tgtaaaccgt gctctactgt atgtgataga 840
gaatgatggc gttgacacgt ggaagggtta tccttctggt ggggatcctt atcgatcaaa 900
gcaatactct tgcaaatacg agagacagta tcgtggggcc tctgctagag gtatagtcag 960
tctagctagt ggtgatgaga acacattgtt gacagcagta gctaactctg gaccagtgag 1020
tgtgtatgtg gacgctactt caacatcctt ccagttttac agtgatggag tgttgaatgt 1080
tccctattgc tcctctagca cgctgagtca tgccttggtt gtcattggtt acgggaagta 1140
cagcggacaa gattactggc ttgttaaaaa cagctggggt cctaactggg gagtgcgggg 1200
ctatgggaag ttggcaagaa acaagggcaa caaatgtgga atagccacag cggctagttt 1260
cccaacatta tgacacttta gttgatcaaa caattaatca taaattatta caacatgtag 1320
tataatgatg cccccccatt gctcaatagc ttatctttga acaagaaaaa aa 1372
Claims (40)
1.用于体外或体内合成二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物，也称为硅石)、硅酮和其它硅(IV)或金属(IV)化合物及这些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金属配合物用于所述合成，其特征在于所述多肽包含动物、细菌、植物或真菌的silicatein-β-结构域，其与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于化合物例如硅酸、单烷氧基硅三醇、单烷氧基硅二醇、单烷氧基硅醇、二烷氧基硅二醇、二烷氧基硅醇、三烷氧基硅醇、四烷氧基硅烷、烷基-、芳基-或金属-硅三醇、烷基-、芳基-或金属-硅二醇、烷基-、芳基-或金属-硅醇、烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅二醇、烷基-、芳基-或金属-单烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金属-二烷氧基硅醇、烷基-、芳基-或金属-三烷氧基硅烷、或其它金属(IV)化合物用作所述合成的反应物(底物)。
3.如权利要求3所述的方法，其中通过使用所述化合物的确定混合物，产生确定组成的混合-聚合物。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中确定的二维和三维结构的形成通过以所述多肽或所述多肽的金属配合物或所述多肽或所述多肽的金属配合物与其它分子或玻璃、金属、金属氧化物、塑料、生物聚合物或其它材料的表面的结合为模板来产生。
5.用于降解无定性二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物，也称为硅石)、硅酮和其它硅(IV)或金属(IV)化合物及这些化合物的混合-聚合物的方法，其中多肽或多肽的金属配合物用于所述降解，其特征在于所述多肽包含动物、细菌、植物或真菌的silicatein-β-结构域，其与SEQID No.1中所述序列具有至少25％的的序列相似性。
6.用于修饰含硅酸或硅(IV)-或金属(IV)-化合物的结构或表面的方法，其中多肽或多肽的金属配合物用于所述修饰，其特征在于所述多肽包含动物、细菌、植物或真菌的silicatein-β-结构域，其与SEQ ID No.1中所述序列具有至少25％的的序列相似性。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述含硅酸的结构或表面以宝石、半宝石或无定性硅酸盐的形式存在，例如人造玻璃或天然硅酸盐。
8.化合物或含硅酸的结构或表面，其根据以上权利要求所述的方法来获得。
9.如权利要求8所述的含硅酸的结构或表面，其以宝石、半宝石或无定性硅酸盐的形式存在，例如人造玻璃或天然硅酸盐。
10.按SEQ ID No.1记载的来自Suberites domuncula的silicatein-β的多肽或其同源多肽、所述多肽的金属配合物或其部分，在所述silicatein-β-结构域的氨基酸序列中，所述同源多肽显示与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性。
11.核酸，特别是按SEQ ID No.2记载的核酸，其特征在于其基本上编码如权利要求10所述的多肽。
12.如权利要求11所述的核酸，其特征在于其以DNA、cDNA、RNA或其混合物的形式存在。
13.如权利要求11或12所述的核酸，其特征在于所述核酸序列具有至少一个内含子和/或polyA-序列。
14.如权利要求11-13中任一权利要求所述的以其互补“反义”序列形式存在的核酸。
15.如权利要求11-14中任一权利要求所述的核酸，其以(a)融合蛋白-(嵌合蛋白)构建体，(b)具有分离蛋白-表达的构建体(蛋白酶-裂解位点)或(c)具有分离蛋白-表达的构建体(表达盒)。
16.如权利要求11-15重任一权利要求所述的核酸，其特征在于所述核酸为合成产生。
17.优选为质粒、穿梭载体、噬粒、粘粒、表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或粒子、纳米微粒或脂质体形式的载体，其包含权利要求11-16中任一权利要求所述的核酸。
18.优选为纳米微粒或脂质体形式的载体，其包含权利要求10所述的多肽。
19.宿主细胞，其经权利要求17或18的载体转染或粒子感染或转导。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞表达权利要求1所述的多肽、所述多肽的金属配合物或其部分。
21.如权利要求10所述的多肽，其特征在于所述多肽为合成产生。
22.如权利要求10所述的多肽，其特征在于所述多肽或所述多肽的金属配合物存在于原核或真核细胞提取物或裂解物中。
23.如权利要求22所述的多肽，其特征在于所述纯化的多肽或所述多肽的金属配合物基本上不与其它蛋白共同存在。
24.用于鉴定按SEQ ID No.1记载的来自Suberites domuncula的silicatein-β多肽或其同源多肽的抑制剂或活化剂的方法，在silicatein-β-结构域的氨基酸序列中，所述同源多肽显示与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性，其中a)提供按SEQ ID No.1记载的来自Suberites domuncula的silicatein-β多肽或其同源多肽，在silicatein-β-结构域的氨基酸序列中，所述同源多肽显示与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的的序列相似性，b)来自步骤a)的所述多肽与潜在的抑制剂或活化剂接触，以及c)测定所述多肽合成或降解硅酸盐或硅酮的能力。
25.如权利要求24所述的方法，其中按SEQ ID No.1记载的来自Suberites domuncula的silicatein-β多肽或其同源多肽以体内细胞提取物或裂解物或者纯化的形式提供，在silicatein-β-结构域的氨基酸序列中，所述同源多肽显示与SEQ ID No.1中所述序列有至少25％的序列相似性。
26.产生药物组合物的方法，所述方法包括a)鉴定权利要求24或25所述的抑制剂或活化剂，以及b)将所鉴定的抑制剂或活化剂与药物可接受的载体或辅助剂混合。
27.前述任一权利要求所述的多肽或核酸或药物组合物在硅酮和硅酮-埋植物的再吸收或再吸收的修饰中的用途。
28.前述任一权利要求所述的核酸在用于硅酮和硅酮-埋植物的再吸收或再吸收修饰的细胞转染中的用途。
29.特别是通过Silicatein-β和Silicatein-α酶促产生的二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物，也称为硅石)或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物用作金属、金属氧化物、塑料和其它材料的涂层；特别是用于在这些材料上产生单分子层。
30.特别是通过Silicatein-β和Silicatein-α酶促产生的二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物，也称为硅石)或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物用作诸如碳纤维的用于消防的技术纤维材料的涂层，以改进加工性或进一步修饰这些材料的特性。
31.特别是通过Silicatein-β和Silicatein-α酶促产生的二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物，也称为硅石)或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物作为毛线或棉线的涂层以获得这些材料的新特性，特别是抗过敏性，改进其纯化或进一步修饰其特性。
32.特别是通过Silicatein-β和Silicatein-α酶促产生的二氧化硅(硅酸或硅酸盐的缩合产物，也称为硅石)或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物的用途，所述二氧化硅或其它硅(IV)化合物或金属(IV)化合物作为包盖/包衣，用于减少药剂(片剂)的添加剂(例如，淀粉)的过敏反应。
33.Silicatein-β和Silicatein-α的用途，其特征在于其用于产生单体的或交联的硅-氮-化合物。
34.Silicatein-β和Silicatein-α的用途，其特征在于其用于产生单体的或交联的硅-有机化合物。
35.Silicatein-β和Silicatein-α的用途，其特征在于其用于与多磷酸盐产生线性的或交联的的硅复合物，所述硅复合物也可通过二价阳离子来连接。
36.本发明所述的方法，其特征在于在50℃以下的温度和常压下，在水溶液和/或水/有机溶液中，使用Silicatein-β和Silicatein-α进行具有n≥2的Sin(OH)2n+2的寡硅酸盐的合成。
37.如权利要求36所述的本发明的方法，其特征在于使用Silicatein-β和Silicatein-α进行具有n≥2的Sin(OH)2n+2的寡硅酸盐的合成，以及随后这些反应产物用于硅烷、硅酮和硅-有机化合物的合成，所述硅烷和硅酮包括它们的交联结构，所述硅-有机化合物包括酯、醚、氮、硫和其环状化合物。
38.如权利要求36所述的本发明的方法，其特征在于用Silicatein-β和Silicatein-α进行具有n≥7的Sin(OH)2n+2的寡硅酸盐的合成，以及随后使用路易斯酸、氢化催化剂和/或电化学方法，用氢进行这些化合物的氢化，以用作氢储库、能源、易燃物或燃料。
39.如权利要求1-36所述的方法，其特征在于使用Silicatein-β和Silicatein-α来进行触变材料的生产。
40.如权利要求1-36所述的方法，其特征在于通过使用Silicatein-β和Silicatein-α，所述药剂、RNA和DNA或多肽的膜传送性和/或耐受性的增加由Silicatein-介导的、利用和/或在硅石内的完全或部分包被或包囊来完成。
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