CN1939336A - 含有透明质酸作为活性成分的药物试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了含有透明质酸作为活性成分的药物组合物。优选的透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单位为－D－葡萄糖醛酸－β－1，3－D－N－乙酰基葡萄糖胺－β－1，4－。

Description

含有透明质酸作为活性成分的药物试剂

发明领域

本发明涉及含有透明质酸作为活性成分的药物试剂。更具体地，本发明涉及含有透明质酸作为活性成分的自身免疫性疾病治疗剂、炎症性疾病治疗剂和神经性疾病治疗剂、自身免疫性疾病预防剂、炎症性疾病预防剂和神经性疾病预防剂、细胞成活力增强剂、细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达抑制剂、突触传递促进剂和突触保护剂。本发明也涉及治疗脊髓损伤、哮喘和过敏症的药物。

发明背景

透明质酸是由二糖重复单位构建的长链多糖，每一重复单位由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成，透明质酸的寡糖形式也是众所周知的。透明质酸是从生物组织，如雄鸡冠、脐带、皮肤和关节液中提取的，或者是通过采用链球菌的发酵方法产生。因为不存在毒理学和免疫学效应，透明质酸用于药物或化妆品组分中，例如在公知的关节炎治疗中，采用向关节内注射透明质酸。在以下说明中，将四糖透明质酸指定为HA4。

据报道HA4在器官保存、肝功能紊乱和胃溃疡方面具有治疗和抑制作用(参见WO2002/004471)。也公知HA4具有应激蛋白表达增强作用和细胞凋亡抑制作用(参见Xu H，Ito T，Tawada A，Maeda H，Yamanokuchi H，Isahara K，Yoshida K，Uchiyama Y，Asari A.Effect ofhyaluronan oligosaccharide on the expression of heat shock protein 72(透明质酸寡糖对热休克蛋白72表达的作用)，J Biol.Chem.2002，10；277(19)；17308-14)。另外，据报道透明质酸寡糖具有多种生理学活性(参见Asari A，Novel Functions of Hyalutonan Oligosaccharides(透明质酸寡糖的新功能).In Science of hyaluronan Today，Editors：Vincent C.Hascall.Masaki Yanagishita Glycoforum，(http://www.glycoforum.gr.jp/science/hyaluroRan/HA.12/HA12J.html).2005)。另外，已知HA4在脊髓损伤模型中是治疗有效的(参见WO2004/084912)。

从青春期到四十多岁的过程中，经常发生多发性硬化症并伴随着以下症状，如走路不稳、视力模糊(dim vision)、复视、排尿困难及疼痛和麻木。当在儿童或少年时期发生时，有时伴随着癫痫。引起所述症状的一种或多种病理学病灶散布性地出现在大脑或脊髓中。此外，所述病理学病灶是散布性的，不仅是依据空间性散布而且是依据不时出现和消失的时间性散布。所述的多发性硬化症的病理学状况涉及免疫系统，并被认为是自身免疫性疾病或炎症。并且因为脊髓神经被损伤，所以认为是神经性疾病之一。

细胞成活力意为细胞的活性状态。因为一些疾病涉及细胞成活力的减少或细胞变性，所以预计细胞成活力的改善可对这种疾病提供治疗作用。根据以若丹明123染色性能作为指数，可确定细胞的成活力。线粒体在能量代谢中起关键作用，而若丹明123的荧光强度以线粒体膜电位-依赖性方式增加。因此，若丹明123染色性能用作线粒体活性的指数，因而，也就是细胞活性程度的指数。(参见Kim，M，Cooper DD，Hayes SF，Spangrude GJ，Rhodamine-123 staining in hematopoietic stemcells of young mice indicates mitochondrial action on rather than dyeefflux(在幼年小鼠的造血干细胞中的若丹明123染色而非染料流出物表示线粒体活性).Blood，1998 Jun 191(11)：4106-17)。

细胞因子是涵盖了蛋白质因子(大多数为糖蛋白)的通称，它们从细胞中释放并随后介导细胞间相互作用，例如免疫或炎性反应控制作用、抗病毒作用、抗肿瘤作用和细胞生长/分化调控作用。公知的这类细胞因子包括白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)等等。另一方面，趋化因子被定义为一族具有白细胞趋化能力的趋化性细胞因子。如这里所采用的，趋化因子定义为排除在细胞因子之外的概念。

细胞因子相关基因通常指编码细胞因子的基因以及调节所述基因表达的基因。许多种细胞因子相关基因为已知的，并提出了细胞因子相关基因表达的促进与疾病之间的关系。细胞因子相关基因表达的有效抑制对治疗多种疾病有着极大的作用。

发明概述

本发明的目的是提供自身免疫性疾病治疗剂、炎症性疾病治疗剂和神经性疾病治疗剂。本发明的另一目的是提供自身免疫性疾病预防剂、炎症性疾病预防剂和神经性疾病预防剂。

本发明的另一目的是提供新的细胞成活力增强剂。

因此，本发明的目的是提供新的细胞因子相关基因和趋化因子相关基因的表达抑制剂。

因此，本发明的目的是提供新的突触传递促进剂和突触保护剂。

实现上述目的的本发明的自身免疫性疾病治疗剂、炎症性疾病治疗剂和神经性疾病治疗剂含有透明质酸作为活性成分。同样地，实现上述目的的本发明的自身免疫性疾病预防剂、炎症性疾病预防剂和神经性疾病预防剂含有透明质酸作为活性成分。

实现上述目的的本发明的细胞成活力增强剂含有透明质酸作为活性成分。

实现上述目的的本发明的细胞因子相关基因和趋化因子相关基因的表达抑制剂含有透明质酸作为活性成分。因此，本发明是以此发现为基础建立的：透明质酸具有抑制细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达的新功能。

因此，本发明的细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达抑制剂含有透明质酸作为活性成分。本发明所用的透明质酸优选为含2个单位的四糖，单个的单位是-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。尤其是，它可抑制作为细胞因子相关基因的促炎性反应细胞因子相关基因的表达。

实现上述目的的本发明的突触传递促进剂和突触保护剂含有四糖透明质酸作为活性成分。

因为本发明的每一药物试剂、细胞成活力增强剂、细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达抑制剂、突触传递促进剂和突触保护剂含有透明质酸作为活性成分，所以其可有利地以相对低的成本大规模地顺利生产。也因为透明质酸几乎无毒性或抗原性，并增强对疾病的治疗和预防能力，以及是生物体本身具有的，所以预计可提供具有极少副作用的治疗剂、预防剂和抑制剂。因此，根据本发明，可提供对自身免疫性疾病、炎症和神经性疾病有效的新的药物试剂。另外，可提供在因细胞活性减弱引起的疾病的治疗中有效的新的药物试剂。可提供在因细胞因子相关基因和趋化因子相关基因的表达促进引起的疾病的治疗中有效的新的药物试剂。

附图简要说明

图1显示Hsp72在突触中的功能的示意图，左图显示患有病症的突触，以及右图显示被Hsp72保护的突触。

图2显示通过将在多发性硬化症模型动物中观察到的EAE神经症状得分的平均值进行绘图得到的图，该动物在接种后立即接受HA4的治疗，以此平均值为纵坐标，并以在接种第0天后的天数为横坐标。

图3显示通过将在多发性硬化症模型动物中观察到的EAE神经症状得分的平均值进行绘图得到的图，该动物在疾病发作后用HA4处理11天，以此平均值为纵坐标，并以在接种第0天后的天数为横坐标。

图4显示通过将在多发性硬化症模型动物中观察到的EAE神经症状得分的平均值进行绘图得到的图，该动物在接种后即刻用HA4处理一次，以此平均值为纵坐标，并以接种后的天数为横坐标。

图5为实施例2中制备的每组细胞的照片。

图6显示表现实施例2中制备的每组细胞荧光强度的测量结果的特性。

图7显示在初级损伤部位处对HsP72进行免疫染色的结果，(a)为染色后每组的切片照片，以及(b)为表现对Hsp72的免疫染色中光强度的测量结果的特性。

图8显示在继发性损伤部位处对HsP72进行免疫染色的结果，(a)为染色后每组的切片照片，以及(b)为表现对Hsp72的免疫染色中光强度的测量结果的特性。

图9显示在初级损伤部位处对突触小泡蛋白进行免疫染色的结果，(a)为染色后每组的切片照片，以及(b)为表现对突触小泡蛋白的免疫染色中光强度的测量结果的特性。

图10显示在继发性损伤部位处对突触小泡蛋白进行免疫染色的结果，(a)为染色后每组的切片照片，以及(b)为表现对突触小泡蛋白的免疫染色中光强度的测量结果的特性。

图11(a)为对Hsp72和突触小泡蛋白双重染色后灰质和白质的照片，以及图11(b)为在用Hsp72和突触小泡蛋白双重染色后灰质的照片，右图为显示呈现红色的HsP72的照片，左图为显示呈现绿色的突触小泡蛋白的照片，以及中间图为被左图重叠的右图的照片。

图12为显示采用细胞因子阵列测量IL-1α和IL-1β生成的结果图。

图13为显示采用细胞因子阵列测量IL-6和TGF-β1生成的结果图。

图14为显示采用细胞因子阵列测量TNF-α和TNF-β生成的结果图。

图15为显示采用ELISA测量IL-6生成的结果图。

图16为表示所设想的HA4在多发性硬化症的治疗中的作用机理的示意图。

图17为表示所设想的HA4在脊髓损伤的治疗中的作用机理的示意图。

图18为表示所设想的HA4抗哮喘和过敏性疾病的作用机理的示意图。

具体实施方式

在下文中进一步详细描述本发明。本发明的细胞成活力增强剂为具有改善细胞成活力的功能的药物试剂。术语“改善细胞成活力”意为促进细胞的生理学成活力或者抑制细胞生理学成活力的减弱。细胞成活力的改善导致对减弱细胞活性的疾病或引起细胞变性的疾病的治疗或改善。

本发明的细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达抑制剂为具有抑制多种细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达的功能的药物试剂。短语“抑制细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达”意为当与未受处理的动物细胞中的相关基因的表达水平相比，在已用本发明的药物试剂处理的动物细胞中的相关基因的表达水平明显较低。可用通过将大量的探针DNA固定在底物上所形成的DNA芯片测定所述的表达水平。

本发明的突触传递促进剂显示了促进突触功能的作用。本发明的突触保护剂显示了恢复突触功能的作用。本发明的突触传递促进剂和突触保护剂可增强在前后突触之间的神经递质的传递水平。在前突触，存在着由热休克蛋白72(Hsp72)和神经递质组成的突触小泡。在后突触，存在着Hsp72和神经递质受体。本发明的突触传递促进剂和突触保护剂以这种方式起作用：图1中的左边所示的状态转化为右边所示的状态，因而以这种方式神经递质水平增加。

下文对本发明进行详细描述。在以下说明中，本发明的治疗剂和预防剂、细胞成活力增强剂、细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达抑制剂、突触传递促进剂和突触保护剂共同地称为药物试剂。

本发明的药物试剂中含有的透明质酸可以是任何二糖或更大的糖，该更大的糖包含至少一个β-D-葡萄糖醛酸的1位与β-D-N-乙酰基葡萄糖胺的3位结合的二糖单位，并且其基本上是由β-D-葡萄糖醛酸和β-D-N-乙酰基葡萄糖胺构建，即使这类成分结合到一个或多个这种结合在一起的二糖单元，及其衍生物，例如也可采用那些具有水解保护基团(例如酰基基团)的衍生物。这种糖可以是不饱和的，并且这种不饱和的糖可例如是未还原的末端糖，通常，葡萄糖醛酸在4位和5位的碳原子之间不饱和。本发明所用的透明质酸通常可以从诸如动物的天然存在材料中提取、通过微生物发酵获得、通过化学或酶学方法合成。例如，透明质酸可通过本领域内公知的提取方法和纯化方法从诸如冠、脐带、皮肤和关节液的生物组织中获得。另外，其也可采用链球菌通过发酵方法产生。

在本发明中，透明质酸寡糖也包括在透明质酸中，并且从低分子量透明质酸，例如由上述单一的二糖单元组成的二糖及其衍生物，到重均分子量高至约4,000,000的高分子量透明质酸均可用于本发明。优选地，可考虑使用在组织中有优良的渗透性并且重均分子量约380至约900,000的透明质酸，以及更优选含2至20个糖的透明质酸。

优选地，尤其采用公知的方法通过减少所述透明质酸的分子量产生低分子量的透明质酸，公知的方法例如为酶降解、碱降解、热处理和超声处理(参见Biochem.33(1994)p6503-6507)，或者通过化学或酶学方法合成以产生低分子量的透明质酸(参见Glycoconjugate J.，(1993)p435-439，WO93/20827)。例如，这种酶降解可以是此种方法：让能够降解透明质酸的酶，例如透明质酸降解酶(透明质酸酶(源于睾丸)、透明质酸酶(源于链霉菌)、透明质酸SD等等)、软骨素酶AC、软骨素酶ACII、软骨素酶ACIII和软骨素酶ABC对透明质酸起作用以产生透明质酸寡糖(参见，Shin-Seikagaku Jikkenkoza，“Saccharides II-Proteoglycansand glycosaminoglycans”(“糖II-蛋白聚糖和葡萄糖胺聚糖”)，p244-248，Published in 1991，Tokyo Kagaku Dozin Co.，LTD)。

碱降解方法可例如为此方法：将诸如约1N氢氧化钠的碱加入透明质酸的水溶液中，然后加温数小时以减少分子量，随后加入诸如盐酸的酸以便中和，从而获得低分子量透明质酸。本发明所用的透明质酸包括其盐形式，以及考虑到药物制剂，当需要时可使用药物可接受的盐。例如，其可以是诸如钠盐和钾盐的碱金属盐、诸如钙盐和镁盐的碱土金属盐、诸如三(正丁基)胺盐、三乙基胺盐、吡啶盐和氨基酸盐的胺盐。

本发明的药物试剂可以是单独的具有一定分子量的任意的透明质酸，或者是具有多种分子量的透明质酸制剂的组合，对此无任何限制。所述药物试剂含有透明质酸作为活性成分，并当以有效量对包括人在内的哺乳动物给药时，可改善至少一种选自自身免疫性疾病、炎症和神经性疾病的疾病，且对活体无不利影响。所述的自身免疫性疾病、炎症和神经性疾病可例如为多发性硬化症。但是，所述自身免疫性疾病和炎症不限于多发性硬化症，作为实例的还有风湿病、系统性红斑狼疮、炎症性结肠炎、眼色素层炎、肾炎、肾病、I型糖尿病、特应性皮炎、干燥综合征(Sjogren’s syndrome)、胰岛素受体异常、脉管炎、重症肌无力、多发性肌炎、哮喘和桥本病(Hasimoto’s disease)。所述的神经性疾病不限于多发性硬化症以及可例如为神经炎、神经痛、神经性麻痹、中风、脑性麻痹、抑郁、老年痴呆、帕金森病(Parkinson’sdisease)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)、雷克林豪森病(Recklinghausen′s disease)、Willis循环闭塞、克拉伯病(Krabbe disease)、急性弥散性脑脊髓炎、脊髓神经根病、急性播散性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、肾上腺脑白质营养不良、异染色性脑白质营养不良、肌萎缩性脊髓侧索硬化、周围神经病(周围神经损伤、Guillain-Barre综合征、嵌压性神经病、臂丛神经麻痹、糖尿病性神经病等等)。因此，含有透明质酸作为活性成分的药物试剂对上述的多种自身免疫性疾病、炎症性疾病和神经性疾病具有治疗作用和预防作用。

还有，所述药物试剂含有透明质酸作为活性成分，并当以有效量对包括人在内的哺乳动物给药时，可抑制细胞成活力的减少和/或可活化细胞，且对活体无不利影响。

所述药物试剂含有透明质酸作为活性成分，并当以有效量对包括人在内的哺乳动物给药时，可抑制一些活化的细胞因子和趋化因子相关基因的表达，且对活体无不利影响。

所述药物试剂含有透明质酸作为活性成分，并当以有效量对包括人在内的哺乳动物给药时，可促进突触传递和保护突触，且对活体无不利影响。

该药物试剂可自身或与用于形成口服或肠胃外给药(向组织给药(注射)，例如关节内、静脉内、肌内、皮下组织、或肠内给药及经皮给药)、鼻内给药、皮肤贴片给药、在皮肤上贴片给药的药物所需的载体、赋形剂和其它添加剂结合，组方成所需的剂型，且可通过任何给药方式给予患者。尤其是当用作细胞成活力增强剂时，优选口服制剂。此外，当尤其用作细胞因子相关基因和趋化因子相关基因的表达抑制剂时，希望为注射制剂和口服制剂。尤其当用作突触传递促进剂和突触保护剂时，优选硬膜内给药制剂。

口服制剂可例如为固体制剂，如粉末、颗粒、胶囊和片剂；液体制剂，如糖浆、酏剂和乳剂。粉末制剂可作为与赋形剂的混合物获得，该赋形剂例如为乳糖、淀粉、结晶纤维素、乳酸钙、磷酸氢钙、硅铝酸镁和硅酸酐。除上文所列的赋形剂之外还加入所需的粘合剂，如蔗糖、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等，诸如羧甲基纤维素和羧甲基纤维素钙的粘合剂以及诸如羧甲基纤维素和羧甲基纤维素钙的崩解剂，可通过湿法或干法制粒获得颗粒制剂。片剂制剂可通过将上述的粉末或颗粒自身或与诸如硬脂酸镁和滑石粉的润滑剂一起压缩来获得。上述粉末或颗粒可包被有肠溶包衣基质，例如羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸甲酯共聚物等等，或者可包被有乙基纤维素、巴西棕榈蜡和氢化油，从而组方成肠溶的或缓释制剂。可通过将上述粉末或颗粒填入硬胶囊中获得硬胶囊制剂。可通过将透明质酸或其盐与甘油、聚乙二醇、芝麻油、橄榄油等等混合，接着包被明胶膜来获得软胶囊制剂。可通过将诸如蔗糖、山梨醇和甘油的甜味剂和透明质酸或其盐溶于水中获得糖浆制剂。除甜味剂和水之外，还可加入挥发油或乙醇以形成酏剂、或者还可加入阿拉伯树胶、黄芪胶、聚山梨酯80或羧甲基纤维素钠以形成乳剂或悬浮剂。如果需要，这种液体制剂也可补加有调味剂、着色剂、防腐剂等等。

肠胃外制剂可例如为注射制剂、直肠制剂、阴道栓剂、皮肤敷用制剂、吸入剂、气雾剂、滴剂等等。可通过向透明质酸或其盐中加入pH调节剂，如盐酸、氢氧化钠、乳酸、乳酸钠、磷酸氢钠和磷酸二氢钠；诸如氯化钠和葡萄糖的渗透剂；以及用于注射的蒸馏水，接着过滤除菌，然后填充入安瓿内以获得注射制剂。另外，其可以补加有甘露醇、糊精、环糊精、明胶等等，并在真空下冻干以形成在使用重建的注射制剂。也可通过向透明质酸或其盐中加入乳化剂，例如卵磷脂、聚山梨醇酯80和聚氧乙烯氢化蓖麻油，接着在水中进行乳化以组方成用于注射的乳剂。

可通过向透明质酸或其盐中加入栓剂基质，如可可油脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯、或甘油三酯和聚乙二醇，接着通过加温溶化，然后注入模具内并冷却，或者通过将透明质酸或其盐与聚乙二醇、大豆油等等混合，接着包被明胶膜来获得直肠制剂。可通过向透明质酸或其盐中加入白凡士林、蜂蜡、液体石蜡、聚乙二醇等等，如果需要可加温，然后进行捏合可获得皮肤敷用制剂。可通过将透明质酸或其盐与诸如松香和烷基丙烯酸脂聚合物的黏合剂一起捏合，接着铺展在无纺织物等等上来获得带式制剂。可通过将透明质酸或其盐溶解或分散在诸如药物可接受的惰性气体的推进剂中，接着填充入耐压容器内获得吸入剂。

(给药方式)

虽然对本发明的含有透明质酸作为活性成分的药物试剂的给药方式没有特别限制，但是其可以是脊柱内、静脉内、关节内、硬膜内、口服或鼻内给药。

(剂量)

虽然剂量可根据欲治疗的疾病、患者的一般状态和体重等等因素适当选择，但是其通常是0.05至50mg/kg，一天一次或以分份剂量给药。

(毒性)

本发明所用的透明质酸在显示药物生物活性的剂量时显示了几乎或完全无细胞毒性。

参考以下实施例进一步地详细说明了本发明的药物试剂，所述实施例不应理解为对本发明的技术范围的限制。

[实施例1]

在本实施例中，以HA4对作为多发性硬化症模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)给药以检测其有效性。

购买用于多发性硬化症模型的四周龄Lewis大鼠，并当其五周龄时使用。根据Shibaki等人的方法(参见Shibaki K，Nomura K，Ono R，Shimazu K，Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis byNINJINEIYOTO(NINJINEIYOTO对实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用)，SHINKEICHIRYO 19(2)：159-166，2002)，将300μg/动物的豚鼠髓磷脂碱性蛋白(GPMBP，Sigma)溶于50μl PBS中，然后补加等量的弗氏完全佐剂(FCA，Difco)和以0.75mg/ml的浓度补加已灭菌的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MT，Difco)，将每50μl的溶液接种在该动物的两只后肢的每只脚掌内。

在此实施例中，所述的多发性硬化症模型动物在接种后立即或在神经性症状发病时接受HA4。

试验物质的给药

在本实施例中，将HA4制备成1mg/ml和10mg/ml的浓度。具体地，采用Tawada等人的方法制备HA4(参见Tawada A，Masa T，Oonuki Y，Watanabe A，Matsuzaki Y，Asari A.Large-scale preparation，purification，and characterization of hyaluronan oligosaccharides from 4-mers to52-mers(4聚体至52聚体的透明质酸寡糖的大规模制备、纯化和表征鉴定)。Glycobiology，2002；12(7)：421-6)。作为对照，使用生理盐水。

在两个时间点上，即在接种后立即和通过观察神经性症状确定的疾病发作时，将导管置于所述的多发性硬化症模型动物的髓腔内，在预定的时期内在此处完成硬膜内给药。对于连续给药，应用渗透泵(型号2004，Alzet)。将动物分成如表1所示的处理组。

表1

组	试验物质	剂量(μg/天)	剂量浓度(μg/ml)	给药开始	处理期	动物数目
							1234	生理盐水HA4HA4HA4	-6660	-1110	在抗原接种后立即在抗原接种后即刻发作时*发作时*	22天22天11天单次剂量	6644

^*：观察到1级EAE的时间点(尾紧张减少)。

EAE神经性症状评价

在所述抗原接种后，每天由两名观察人员采用以下5个等级分值之一对神经性症状进行评估。

EAE等级：

0：无症状

1：尾紧张损失

2：后肢虚弱

3：后肢麻痹，有时伴随大小便失禁

4：后肢和前肢麻痹

结果

1)在接种(激发)后立即及在其后以HA4脊柱内连续给药的作用(预防性)

与生理盐水相比，在所述抗原接种后，HA4脊柱内连续给药使得所述的神经性症状明显地缓和(图2)。图2显示了通过将上述EAE神经性症状得分的平均值与接种后的天数在坐标上绘图所得到的图。当比较EAE高峰期的神经性症状时，在所述抗原接种后第13天时生理盐水组的临床分值为2.2±0.41，而第13天时在HA4连续给药组中的临床分值为0.2±0.41，这明显更低(p＜0.001)，在HA4连续给药组中所述疾病发生情况仅为1/6。根据图2所示的结果，证实含有所述透明质酸作为活性成分的药物试剂对多发性硬化症的预防是有效的。

2)在疾病发作后即刻以HA4脊柱内连续给药的作用(治疗性)

当与生理盐水组相比，在所述疾病发作后，HA4脊柱内连续给药使得所述神经性症状明显地缓和(图3)。图3显示了通过将上述EAE神经性症状得分的平均值与接种后的天数在坐标上绘图所得到的图。当比较EAE高峰期的神经性症状时，在所述抗原接种后第13天时生理盐水组的临床分值为2.2±0.41，而第13天时在HA4连续给药组中的临床分值为1.5±1.0，这明显更低。当比较患病期时，生理盐水组中为6.5±0.55天，在(glucNac-GlcA)₂连续处理组中为4.3±1.5天，这表明在后者中患病期明显缩短(P＜0.01)。根据图3所示的结果，证实含有HA4作为活性成分的药物试剂对多发性硬化症的治疗是有效的。

3)在疾病发作后即刻以HA4脊柱内单次给药的作用(治疗性)

与生理盐水组相比，在所述疾病发作后，HA4脊柱内单次给药使得所述神经性症状明显地缓和(图4)。图4显示了通过将上述EAE神经性症状得分的平均值与接种后的天数在坐标上绘图所得到的图。当比较EAE高峰期的神经性症状时，在所述抗原接种后第13天时生理盐水组的临床分值为2.2±0.41，而第13天时在HA4单次给药组中的临床分数为1.8±0.5，这明显更低。当比较患病期时，生理盐水组中为6.5±0.55天，在所述HA4单次处理组中为5.0±1.5天，这表明在后者中患病期明显缩短(P＜0.001)。根据图4所示的结果，证实含有HA4作为活性成分的药物试剂对多发性硬化症的治疗是有效的。

[实施例2]

在此实施例中，采用若丹明123测定本发明的药物试剂对细胞成活力的作用。若丹明123显示的荧光强度以依赖于线粒体的膜电位的方式增加，而线粒体在能量代谢中起关键作用。因此，若丹明123进行染色的程度可用作线粒体活性的指数，从而用作细胞活性的指数(参见，非专利参考文献2)。

待活化的细胞

在本实施例中，使用K562(称为人类红白血病细胞或人类成红细胞样(erythroblastoid)白血病细胞)。该K562购自日本RIKEN。

在本实施例中，涉及测试物质的制备，将HA4配制为100ng/ml。具体地，采用Tawada等人的方法制备HA4(参见Tawada A，Masa T，Oonuki Y，Watanabe A，Matsuzaki Y，Asaxi A.Large-scale preparation，purification and characterization of hyaluronan oligosaccharides from4-mers to 52-mers(4聚体至52聚体的透明质酸寡糖的大规模制备、纯化和表征鉴定)。Glycobiology，2002；12(7)：421-6)，并用生理盐水调节浓度。

实验方法

首先，在下述条件下孵育所述K562。用于该K562的培养基为RPMI-1640培养基。在此实施例中，在下文所示的组1至组3中孵育该K562。在下述条件下对每组进行培养。组3中的培养基补加有HA4(100ng/ml)。

组1：在37℃下孵育80分钟

组2：在43℃下孵育20分钟(热处理)，接着在37℃下孵育60分钟

组3：在43℃下孵育20分钟(热处理)，接着在37℃下孵育60分钟

孵育后，将溶于MI培养基中的若丹明123加入每组内。若丹明123的终浓度为1μg/ml。在加入该若丹明123后，接着在37℃下孵育10分钟，用RPMI培养基洗涤所述的K562。

洗涤后以1×10⁴细胞/ml将所述的K562接种在96孔板中，并用荧光显微镜(Nikon)进行照相。将图像发送至Adobe Photoshop(AdobeSystems)，在那里测量细胞的荧光强度。

每组的图像显示于图5中，以及测量的荧光强度显示于图6中。根据图5和图6中所示结果，在43℃下热处理20分钟引起该若丹明123染色性能的降低(组2)，而HA4的存在抑制这种降低(组3)。在组2和组3之间荧光强度差异是显著的。

讨论

从上述结果中显而易见的是HA4抑制所述线粒体膜电位的降低，即，抑制线粒体活性减少。这些发现表明HA4对于有害条件下(热处理)线粒体活性不可避免的减少具有抑制作用，或者具有恢复曾经减少的线粒体活性的作用，因而具有线粒体活化作用。因为线粒体是产生细胞能量(ATP)的细胞器，因此HA4具有细胞成活力增强作用。

参考文献

1.Martin W，Hoffmeisterher M，Rotte C，Henze K.An overview ofendosymbiotic models for the origins of eukaryotes，their ATP-producingorganelles(mitochondria and hydrogenosomes)，and their heterotrophiclifestyle(关于真核细胞起源、其产生ATP的细胞器(线粒体和氢化酶体)及其异养生活方式的内共生模型的综述).Biol Chem.2001 Nov；382(11)：1521-39.

2.Hatefi Y.ATP synthesis in mitochondria(线粒体中的ATP合成).EurJ Biochem.1993 Dec 15：218(3)：759-67.

[实施例3]

在本实施例中，采用能够监测基因表达促进/抑制作用的DNA芯片评估本发明的药物试剂的细胞成活力增强作用。

实验方法

首先，将所述K562以组1和组2在上述RP平板培养基中进行孵育。在42℃下将两组的细胞孵育20分钟，接着在37℃下孵育30分钟。组2的培养基中补加有HA4(10ng/ml)。

孵育后，以1000rpm通过离心除去所述培养基。将所得到的细胞于-60℃贮存在低温冷冻柜中。从所贮存的细胞中，根据标准方法提取RNA。提取的RNA经所述的DNA芯片分析基因表达。由DNA CHIPResearch Inc.进行所述的DNA芯片基因表达分析。具体地，使用由DNACHIP Research Inc.制造的商品名称为AceGene Human Oligo Chip 30K1Chip Version的产品。

结果

所述的DNA芯片表达分析结果显示在含有HA4的培养基中孵育的细胞在表2中所列的涉及细胞成活力的多种基因的表达谱方面表现了显著变化。

表2：HA4细胞成活力增强作用

	HAA+/-比值	功能
			<细胞凋亡-相关的>
STK17b(DARK2)	0.09	诱导凋亡信号
			Pawr(Par-4)	0.45	在预备凋亡的神经元中表达增加

Caspase 2	0.27	TNF-诱导的凋亡的执行因子
			粒酶H	0.38	丝氨酸蛋白酶诱导凋亡
<转录调控-相关的>
			DNAJ2	0.34	热诱导的转录阻遏蛋白(转录抑制)
TAF9L	0.43	转录因子(转录抑制)
			<热休克蛋白-相关的>
Dnaj(hsp40)同系物	2.62	热休克蛋白

如表2所示，HA4具有如下作用：(1)抑制凋亡相关基因的表达，(2)抑制转录抑制相关基因的表达和(3)促进热休克蛋白相关基因的表达。具体地，HA4抑制STK 17b(DDARK2)、Pawr(Par-4)、Caspase 2和粒酶H的基因表达，它们是涉及诱导或执行凋亡的因子。另外，HA4抑制DNAJ2和TAF9L的基因表达，DNAJ2和TAF9L是引起转录抑制的因子。此外，HA4促进热休克蛋白dnaj(hsp40)同系物的基因表达。

讨论

在上述结果中，因为在凋亡相关基因中STK17b(Dmm)和Pawr(Par4)是起诱导或促进凋亡作用的因子，这些基因表达的抑制导致凋亡的抑制。对于STK17b(DARK2)，参见Sanjo H，Kawai T，Akira S.DRAKs，novel serine/threonine kinases related to death-associated protein kinasethat trigger apoptosis(触发凋亡的涉及死亡相关蛋白激酶的新的丝氨酸/苏氨酸激酶).J Biol Chem.1998 273(44)：29066-71。对于Pawr(Par-4)，参见Johnstone RW，See RE，Sells SF，Wang J，Muthukkumar S，EnglertC，Haber DA，Licht JD，Sugrue SP，Roberis T.Rangnekar VM，Shi Y.Anovel repressor，par-4，modulates transcription and growth suppressionfunctions of the Wilms’tumor suppressor WT1(新的阻遏蛋白，par-4，调节Wilms’肿瘤抑制物WT1的转录和生长抑制功能).Mol Cell Biol.199616(12)：6945-56以及Mattson MP，Duan W，Chan SL，Camandola S.Par-4：emarerg pivotal player in neuronal apoptosis and neurodegenerativedisorders(在神经元凋亡和神经变性病症中关键的参与者Par-4).J Mol20 Neurosci.1999 Aug-oct；131-2：17-30。

另外，因为Caspase 2是凋亡执行因子，相关的基因表达抑制导致凋亡的抑制。对于Caspase 2，参见Zhivotovsky B，Orrenius S.Caspase-2functionin response to DNA damage(响应DNA损伤的Caspase-2功能).Biochem Biophyo Res Commun.2005 331(3)：859-67。

因为粒酶H是一种因子，通过它淋巴细胞诱导其它细胞凋亡，因此相关基因的表达抑制导致细胞凋亡的抑制。对于粒酶H，参见SedeliesKA，Sayers TJ，Edwards KM，Chen W，Pellicci DG，Godfrey DI，TrapaniJA Discordant regulation of granzyme H and granzyme B expression inhuman lymphocytes(在人淋巴细胞中粒酶H和粒酶B表达的不调和调控).J Biol Chem，2004 279(25)：26581-7.Epub 2004 Apr 6。

上述结果表明DNAJ2和TAFgL基因表达的抑制使得一度被抑制的转录活性恢复。对于DNAJ2，参见Terada K，Mori H.Human DnaJhomologs dj2 and dj3，and bag-1 are positive cochaperones of hsc70(人DnaJ同系物dj2、dj3和bag-1是hsc70的阳性辅伴侣分子).J Biol Chem，2000 275(32)：24728-34。对于TAFgL，参见see Chen Z，Manley J1，Invivo function a analysis of the histone 3-like TAF9L and a TAF9-relatedfactor，TAF9L(组蛋白3-样TAF9L和TAF9相关因子TAF9L的体内功能分析).J Biol Chem.2003 278(37)：35172-83。

我们已报告HA4具有促进热休克蛋白72(Hsp72)表达的作用(Xu H，Ito T，Tawada A，Maeda H，H，Yamanokuchi H，Isahara K，Yoshida K，Uchiyama Y，Asari A.Effect of hyaluronan oligosaccharides on theexpression of heat shock protein 72(透明质酸寡糖对热休克蛋白72表达的作用).J Biol Chem，2002 10；277(19)：17308-14)。在此实施例中，采用DNA芯片的分析表明HA4促进热休克蛋白danj(hsp40)同系物的基因表达。类似于Hsp72，所述的dnaj(hsp40)同系物具有细胞内蛋白变性抑制作用和细胞死亡抑制作用。

根据上文所述的本实施例的结果，揭示了HA4的新功能，例如凋亡抑制、转录活性恢复和蛋白变性抑制。因为这些功能均涉及细胞成活力，所以可得出HA4具有增强细胞成活力的作用的结论。

[实施例4]

在本实施例中，采用能够监测基因表达促进/抑制作用的DAN芯片评估本发明的药物试剂对细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达的抑制作用。

实验方法：首先，将K562以组1和组2在上述RPMI培养基中孵育。在42℃下将两组的细胞孵育20分钟，接着在37℃下孵育30分钟。组2的培养基中补加有HA4(10ng/ml)。

孵育后，以1000rpm通过离心除去所述培养基。将所得到的细胞于-60℃贮存在低温冷冻柜中。从所贮存的细胞中，根据标准方法提取RNA。将提取的RNA经DNA芯片分析基因表达。由DNA CHIP ResearchInc.进行所述DNA芯片基因表达分析。具体地，使用由DNA CHIPResearch Inc.制造的商品名称为AceGene Human Oligo Chip 30K 1 ChipVersion的产品。

结果

DNA芯片的表达分析结果揭示在含有HA4的培养基中孵育的细胞在表2中所列的涉及细胞成活力的多种基因的表达谱方面表现了显著变化。

表3

	HA4(+)/HA4(-)比值	功能
			IFN-γ	0.11	Th1-型细胞因子
Mig(CXCL9)	0.11	Th1-型C-X-C趋化因子
			IL-5	0.28	Th2-型细胞因子
IL-17b	0.31	Th1-型细胞因子
			IL-18RAP	0.32	结合IL-Li8以帮助受体结合

CCL28	0.32	趋化因子(上皮细胞，由KC产生)
			IL-1β	0.36	炎症细胞因子
IFN-ω1	0.5	NK细胞活化细胞因子

如表3所示，HA4处理导致了细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达的多种抑制。对于在表3所示的细胞因子相关基因和趋化因子相关基因中的IFN-γ基因，参见Schroder K，Hertzog PJ，Ravasi T，HomeDA.Interferon-gamma：an overview of signals，mechanisms andfunctions(干扰素-γ：信号、机理和功能的综述).J Leukoc Biol.200475(2)：163-89。对于Mig(CXCL9)基因，参见Farber JM.Mig and IP-10：CXC chemokines that target lymphocytes(Mig和IP-10：靶向淋巴细胞的CXC趋化因子).J Leukoc Biol.1997 61(3)：246-57。对于IL-5基因，参见Adachi T，Alam R.The mechanism of IL-5 signal transduction(IL-5信号转导机制)Am J Physiol.1998 275(3Pt 1)：C623-33。对于IL-17b，参见Li H，Chen J，Huang A，Stinson J，Heldens S，Foster J，Dowd P，GurneyAL，Wood WI.Cloning and characterization of IL-17B and IL-17C，twonew members of the IL-17 cytokine family(IL-17细胞因子家族的两个新成员：IL-17B和IL-17C的克隆和表征).Proc Natl Acad Sci USA.20001897(2)：773-8。对于IL-18RAP，参见Cheung H，Chen NJ，Cao Z，OnoN，Ohashi PS，Yeh WC.Accessory protein-like is essential forIL-18-mediated signaling(对于IL-18介导的信号途径，蛋白样辅助物是必要的).J Imnunol.2005 174(9)：5351-7。对于CCL28，参见Wang W，Soto H，Oldham ER，Buchanan ME，Homey B，Catron D，Jenkins N，Copeland NG，Gilbert DJ，Nguyen N，Abrams J，Kershenovich D，SmithK，McClanahan T，Vicari AP，Zlotnik A.Identification of a novelchemokine(CCL28)，which binds CCR10(GPR2)(新趋化因子(CCL28)的鉴定，其结合CCR10(GPR2)).J Biol Chem.2000 275(29)：22313-23。对于IL-1β，参见Okamura H.IL-1 family(IL-laipha/beta，IL-iRa，IL-18)，IL-16，IL-17(IL-1家族(IL-1α/β、IL-iRa、IL-18)、IL-16、IL-17).NipponRinsho.2005 63 Supp-14：226-33。对于IFN-ω1，参见Bekisz J，Schmeisser H，Hernandez J，Goldman ND，Zoon KC.Human interferonsalpha，beta and omega(人干扰素α、β和ω).Growth Factors.2004 22(4)：243-51。以及参见Adolf GK Maurer-Fogy I，Kalsner I，Cantell K.Purification and characterization of natural human interferon omega 1.Two alternative cleavage sites for the signal peptidase(天然的人干扰素ω1的纯化和表征鉴定。信号肽酶的两个可选择的剪切位点).J BiolChem.1990 265(16)：9290-5。

讨论

在此实施例中，HA4处理导致所述的细胞因子相关基因和趋化因子相关基因表达的抑制。因为在此处使用的K562细胞是白细胞来源的细胞，所以其自然地进行所述的细胞因子相关基因和趋化因子相关基因的表达。因为HA4促进Hsp72的表达(参见，Xu H，Ito T，Tawada A，Maeda H，Yamanokuchi H，Isahara K，Yoshida K，Uchiyama Y，Asari A.Effect of hyaluronan oligosaccharides on the expression of heat shockprotein 72(透明质酸寡糖对热休克蛋白72表达的作用)，J Biol.Chem，2002 10；277(19)：17308-14)，所以有可能Hsp72在体内被γδT细胞识别以产生IL-10，然后IL-10抑制多种炎症细胞因子和趋化因子的产生。但是，因为该γδT细胞并不包括在此实施例中，所以与炎症或自身免疫性疾病相关的所述细胞因子相关基因和趋化因子相关因子的表达直接为HA4处理所抑制。

[实施例5]

在本实施例中，将大鼠脊髓损伤模型连续地用生理盐水(盐水组)或含有HA4的生理盐水(HA4组)进行处理，接着对该脊髓组织取样，然后用抗-Hsp72抗体和/或抗-突触小泡蛋白抗体对其进行免疫染色。另外，在此实施例中，对已进行假手术的大鼠进行处理，作为完整的对照(假手术组)。

通过将Wistar大鼠进行如下所述的操作，制备所述的大鼠脊髓损伤模型(接受时11周龄，使用时12周龄)。首先，在用戊巴比妥麻醉的条件下，用电推剪剪掉试验大鼠的颈部至腰部区域的毛发，随后用70％乙醇和ISOGIN清洁该剪掉的区域。然后，将背部皮肤切除，以暴露第五至第十根胸椎，然后将第六根胸椎进行半-椎板切除术。随后轻轻地切开硬膜，并在用利多卡因麻醉的情况下，在脊椎后索的宽度(约1.5mm)上引入显微钳的尖端(制成0.3mm)直到该显微钳的尖端开始与腹侧椎体接触，并将该显微钳移动10秒钟，以完成该脊髓的扩创术(在下文中称为初级损伤位点)。在该大鼠的脊髓损伤模型中，形成继发性损伤位点，该继发性损伤位点定义为由于轴突变性的传播和所述的初级损伤位点的细胞死亡所形成的损伤位点。该继发性损伤位点被认为涉及到渗入该初级损伤位点的炎症细胞的作用。

在所述的脊髓扩创术后，即刻将试管的尖端(OD：0.3mm)放置在颅内所述的损伤位点处，然后连接到渗透泵(Alzet泵)，型号2004(Alza公司)，通过该渗透泵，在预定的时期内进行鞘内的连续给药。为了将所述的损伤位点与外围组织分离，放置明胶海绵(Gelform，Phamacia)并缝合伤口，然后将所述动物放回笼内。

通过将硬脊膜切开，接着缝合来制备假手术组中的大鼠。

将所制备的假手术组中的大鼠指定为组1。在所述的大鼠脊髓损伤模型的大鼠中，将接受生理盐水的连续鞘内给药的大鼠指定为组2。在所述的大鼠脊髓损伤模型的大鼠中，接受含有HA的4生理盐水的连续鞘内给药的大鼠指定为组3。所述分组显示于表4中

表4

组	试验物质	剂量(μg/天)	剂量浓度(mg/ml)	处理期	动物数目
						1	-	-	-	-	6
2	生理盐水	-	-	7天	6
						3	HA4	6	1	7天	6

采用Tawada等人的方法制备对组3给药的含有HA4的生理盐水(参见Tawada A，Masa T，Oonuki Y，Watanabe A，Matsuzaki Y，Asari A.Large-scale preparation，purification and characterization of hyaluronanoligosaccharides from 4-mers to 52-mers(4聚体至52聚体的透明质酸寡糖的大规模制备、纯化和表征鉴定).Glycobiology.2002 12(7)：421-6)。采用每组中的大鼠，制备初级和继发性损伤位点的组织切片，在福尔马林中固定，然后采用标准方法进行免疫染色。对于Hsp72，将抗-Hsp72抗体(Amersham)用作初级抗体，以及在双重染色的情况下，将过氧化酶标记的抗-兔IgG抗体或者将Texas Red-标记的抗-兔IgG抗体用作第二抗体。对于所述的突触小泡蛋白，将抗-突触小泡蛋白抗体(Funakoshi)用作初级抗体，以及在双重染色的情况下将过氧化酶标记的抗-小鼠IgG抗体或者将FITC标记的抗-小鼠IgG抗体用作第二抗体。

结果

在所述的初级和继发性损伤位点处的Hsp72的免疫染色测试结果分别显示于图7和图8中。在图7和图8中，上图显示了各组中的组织切片的照片，而下图显示通过NIH图像测定的各组的光强度。如图7和图8所示，虽然在组1中几乎未观察到的Hsp72，但是在组2中观察到少量染色，以及在组3中观察到更强的染色。这种染色性能在所述的初级和继发性损伤位点之间未表现出差异。

在所述的初级和继发性损伤位点处的突触小泡蛋白的免疫染色测试结果分别显示于图9和图10中。在图9和图10中，上图显示各组中的组织切片的照片。而下图显示通过NIH图像测定的各组的光强度。如图9和图10所示，在组1中所述的突触小泡蛋白在灰质中表现出高度表达并在白质中表现出中度表达，但是在组2中几乎未表现出表达。相反，在组3中，该突触小泡蛋白显示接近于组1中所观察到的表达。这种染色性能在所述的初级和续发性损伤位点之间未表现出差异。

在组3的大鼠中对Hsp72和所述突触小泡蛋白双重染色的结果显示于图11中。图11(a)为灰质和白质的照片。图11(b)中的右图为Hsp72呈现红色的照片(灰质)，左图是突触小泡蛋白呈现绿色的照片(灰质)，以及中间图为被左图重叠的右图的照片(灰质)。在图11(b)的中间图的照片中，HsP72与该突触小泡蛋白的共同位置呈现黄色。如图11(a)所示，在组3中观察到了普遍存在的对Hsp72染色。另一方面，图11(b)揭示了Hsp72和突触小泡蛋白之间的一致定位。

讨论

用HA4处理导致在所述的脊髓损伤位点处Hsp72的表达增加。在这种情况下，虽然Hsp72显示为广泛存在，但是值得注意的是其定位类似于所述的突触小泡蛋白的定位。该突触小泡蛋白存在于突触小泡中并参与突触传递。因此，HA4被认为通过促进该突触小泡中的Hsp72表达来保护该突触小泡和该突触小泡蛋白(图1中的左图)。虽然在海马突触中传递效率的长期促进被东莨菪碱所抑制，但是已知诱导Hsp70的所述海马的先前热处理防止这种抑制作用(参见Lin，YW，Yang HW，Min MY，Chiu TH.Heat-shock pretreatment prevents suppression oflong-tem potentiation induced by scopolamine in rat hippocampal CA1synapses(在大鼠的海马CA1突触中热休克预处理防止了由东莨菪碱诱导的对长期增强作用的抑制).Brain Res.2004：5；999(2)：222-6)。其表达为HA4所促进的Hsp72(Hsp70家族的一员)也用作伴侣分子以辅助涉及突触传递的蛋白功能，并被认为促进或恢复这种功能。另一方面，到目前为止还没有促进所述的突触小泡中Hsp72表达的药物试剂被报导。此实施例证明HA4作为促进所述的突触小泡中Hsp72表达的新的药物试剂。

根据上述结果和讨论，揭示HA4具有作为突触传递促进剂和突触保护剂的新功能。

[实施例6]

通过采用K562细胞的DNA阵列分析，证实在热休克存在下HA4抑制诸如IL-1β和IFNγ的多种细胞因子的产生。在本实施例中，已知的通过LPS刺激产生多种细胞因子的U937细胞用于检测HA4对细胞因子产生的作用。

材料

1.试验物质：根据Tawada等人的方法(1)制备的HA4。

2.细胞：购自Dainipon Sumitorno Seiyaku的U937细胞(人单核细胞系)。

3.培养基：RPMI培养基(含10％ FBS)。

4.LPS E.Coli，0111B4，Chemicon。

方法

以5×10⁵细胞/ml将U937细胞以2ml等份播种在6孔微量培养板内，补加终浓度为100至1000ng/ml的LPS，然后在存在或不存在HA4(100ng/ml)的条件下，在37℃和5％CO₂中孵育24小时。以3000rpm将培养物上清液离心5分钟，得到试验物质。将1ml等份的回收的上清液采用ELISA(ENDOGEN)经Human Cytokine Antibody array(人细胞因子抗体阵列)(Raybio)检测多种细胞因子的产生。

更具体地，应用以下操作通过细胞因子阵列和ELISA测定所述细胞因子的产生

细胞因子抗体阵列

将2ml等份的封闭缓冲液加入印有抗体的膜，然后振荡30分钟。除去该封闭缓冲液，加入1ml等份的所述的培养物上清液，在室温下振荡2小时，洗涤5次，然后和第一抗体溶液混合。在室温下搅拌1.5小时，接着洗涤5次，加入第二抗体溶液并在4℃搅拌过夜。在洗涤5次后，使其产生化学发光并用Polaroid照相。扫描该照片以获得其数字数据，该数字数据经过Image J处理以测定发光强度。根据放置在所述膜内6个位置上的内标的发光强度，计算比例。另外，根据未处理组(NT)的表达水平100，计算相对水平(％)。

ELISA(IL-6)

将50μl生物素化的抗体溶液和50μl所述培养物上清液加入微量培养板中，并在室温下静置2小时。在用洗涤缓冲液洗涤3次后，加入100μl链霉亲和素-HRP溶液，在室温下静置30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤3次。加入TMB，在室温下静置30分钟，然后加入淬灭剂以停止该反应，并测定在450nm的吸光度(参照：562nm)。根据平行测定的所述标准溶液，计算IL-6浓度(pg/ml)。

结果

在存在100ng/ml LPS的刺激作用时，加入100ng/ml的HA4导致炎性细胞因子IL-1α、β、IL-6、TGF-β、TNF-α和β的产生减少(FIGS.12至14(细胞因子阵列)，图15(ELISA))。在图12至图14所示的图中，纵坐标表示根据将所述未处理组(NT)的表达水平定为100计算的相对数值(％)。只有IL-6表示为相对浓度。

这些结果表明HA4具有作为炎性细胞因子产生抑制剂的药理学作用。

参考文献

1.Tawada A，Masa T，Oonuki Y，Watanabe A，Matsuzaki Y，Asari A.Large-scale preparation，purification，and characterization of hyaluronanoligosaccharides from 4-mers to 52-mers(4聚体至52聚体的透明质酸寡糖的大规模制备、纯化和表征鉴定).Glycobiology.2002 12(7)：421-6。

[实施例7]

在抗原接种(激发)后，HA4对作为多发性硬化症模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的鞘内给药导致显著抑制诸如麻痹的神经性症状的产生。另一方面，已知甲状腺素运载蛋白(transthyretin)表达的减少导致去甲肾上腺素表达的增加。去甲肾上腺素具有炎性细胞因子表达抑制作用和活性促进作用。根据这种认识，HA4对诸如麻痹的神经性症状表达的抑制被认为涉及所述的甲状腺素运载蛋白表达的减少。在实施例1中，描述了HA4对自身免疫性疾病/炎症和多发性硬化症(为神经性疾病)的作用。相应地，在本实施例中，用HA4或生理盐水(阴性对照)处理所述的作为多发性硬化症模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，并在所述处理后第14天、当所述症状变得最严重时，采集脑和脊髓组织，经DNA阵列检查作用机理。

<材料和方法>

将购买时为四周龄，使用时为五周龄的Lewis大鼠用作实验模型。作为试验物质，使用HA4(1mg/ml，10mg/ml)。采用Tawada等人的方法制备HA4(参见Tawada A，Masa T，Oonuki Y，Watanabe A，MatsuzakiY，Asari A.Large-scale preparation，purification，and characterization ofhyaluronan oligosaccharides from 4-mers to 52-mers(4聚体至52聚体的透明质酸寡糖的大规模制备、纯化和表征鉴定).Glycobiology.2002 12(7)：421-6)。

多发性硬化症模型的制备(EAE)

(1)试验物质

^*豚鼠髓磷脂碱性蛋白(GPMBP)，Sigma

^*已灭菌的结核分支杆菌(MT，Difco)

^*弗氏完全佐剂(FCA，Difco)

^*生理盐水(PS)

(2)模型制备

根据Shibaki等人的方法(参见Shibaki K，Nomura K，Ono R，Shimazu K，Inhibition of experimental autoimmune encephalomyelitis byNINJINEIYOTO(NINJINEIYOTO对实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用)，SHINKEICHIRYO 19(2)：159-166，2002)，将300μg/动物的豚鼠髓磷脂碱性蛋白(GPMBP，Sigma)溶于50μl PBS中，然后补加等量的FCA和补加的已灭菌的结核分支杆菌(浓度调整为0.75mg/ml)，将每50μl的溶液接种在该动物的两只后肢的每只脚掌内。

在所述抗原接种后，即刻将导管放置在髓腔内，在预定的时期内在髓腔内进行鞘内给药。对于连续给药，使用渗透泵(型号2004，Alzet)。将所述动物分为如下所示的两组，一组用HA处理，另一组用生理盐水处理，作为对照。

表5

组	试验物质	剂量(μg/天)	剂量浓度(mg/ml)	给药开始	处理期	动物数目
							1	生理盐水	-	-	抗原接种后即刻	14天	6
2	HA	6	1	抗原接种后即刻	14天	6

DNA阵列分析

在给药第14天时，对于每组，采集脑脊髓组织并集中，然后进行RNA提取，所提取的RNA样品由TAKARABIO进行DNA阵列分析。结果显示于下表中

表6

	表达水平比例(HA/生理盐水)
		甲状腺素运载蛋白	0.38
成纤维细胞生长因子受体底物2	2.3
		无死亡结构域的诱捕TRAIL受体	2.0

<讨论>

已知甲状腺素运载蛋白表达的减少导致去甲肾上腺素表达的增加(参见Caggiula M，Batocchi AP，Frisullo G，Angelucci F，Patanella AK，Sancricca C，Nociti V，Tonali PA，Mirabella M.Neurotrophic factors andclinical recovery in relapsing-remitting multiple sclerosis(在复发-缓解型多发性硬化症中的神经营养因子和临床复原).Scand J Immunol.2005Aug；62(2)：176-82)。所述的去甲肾上腺素具有炎性细胞因子表达抑制作用(参见Sousa JC，Grandela C，Fernandez-Ruiz J，de Miguel R，deSousa L，Magalhaes AI，Saraiva MJ，Sousa N，Palha JA.Transthyretin isinvolved in depression-like behaviour and exploratory activity(甲状腺素运载蛋白涉及抑郁样行为和探究活动).J Neurochem.2004；88(5)：1052-8)和搜寻行为/活动增加作用(参见Feinstein DL，Heneka MT，Gavrilyuk V，Dello Russo C，Weinberg G，Galea E.Noradrenergicregulation of inflammatory gene expression in brain(在脑中表达的炎性基因的去甲肾上腺素能调节作用).Neurochem Int.2002：41(5)：357-65.Review)。基于上述认识，HA4对自动力减少/麻痹的抑制作用被认为涉及上述的甲状腺素运载蛋白表达的减少。

成纤维细胞生长因子受体底物2是成纤维细胞生长因子(GFG)和诸如神经生长因子的神经性生长因子的受体底物。因此，成纤维细胞生长因子受体底物2的增加意谓着对在所述多发性硬化症中表达的神经性生长因子的敏感性增加(参见Caggiula M，Batocchi AP，Frisullo G，Angelucci F，Patanella AK，Sancricca C，Nociti V，Tonali PA，MirabellaM.Neurotrophic factors and clinical recovery in relapsing-remittingmultiple sclerosis(在复发-缓解型多发性硬化症中的神经营养因子和临床复原).Scand J Immunol.2005 Aug；62(2)：176-82；Triaca V，TirassaP，Aloe L.Presence of nerve growth factor and TrkA expression in theSVZ of EAE rats：evidence for a possible functional significance(在EAE大鼠的SVZ中神经生长因子的存在和TrkA表达：可能的功能重要性的证据).Exp Neurol.2005：191(1)：53-64.；Laudiero LB，Aloe L，Levi-Montalcini R，Buttinelli C，Schilter D，Gillessen S，Otten U.Multiple sclerosis patients express increased levels of beta-nerve growthfactor in cerebrospinal fluid(多发性硬化症患者在脑脊液中表达增加水平的β-神经生长因子).Neurosci Lett.1992 Nov 23；147(1)：9-12)。因此，可推测所述的HA4处理提供了神经性生长因子的作用，如神经元死亡抑制作用、神经元分化和轴突生长，通过它们所述的多发性硬化症的症状被抑制(参见Villoslada P，Genain CP.Role of nerve growthfactor and other trophic factors in brain inflammation(神经生长因子和其它营养因子在脑炎中的作用).Prog Brain Res.2004；146：403-14.Review.；Gielen A，Khademi M，Muhallab S，Olsson T，Piehl F.Increasedbrain-derived neurotrophic factor expression in white blood cells ofrelapsing-remitting multiple sclerosis patients(在复发-缓解型多发性硬化症患者的白血细胞中脑源性神经营养因子的表达增加).Scand JImmunol.2003；57(5)：493-7.；Villoslada P，Hauser SL，Bartke I，UngerJ，Heald N，Rosenberg D，Cheung SW，Mobley WC，Fisher S，Genain CP.Human nerve growth factor protects common marmosets againstautoimmune encephalomyelitis by switching the balance of T helper celltype 1 and 2 cytokines within the central nervous system(通过在中枢神经系统内扭转T辅助细胞1型和2型细胞因子的平衡，人神经生长因子保护普通狨猴防止自身免疫性脑脊髓炎).J Exp Med.2000 15；191(10)：1799-806.；Boutros T，Croze E，Yong VW.Interferon-beta is apotent promoter of nerve growth factor production by astrocytes(干扰素β通过星形胶质细胞有效地促进神经生长因子的产生).J Neurochem.1997；69(3)：939-46.；Massaro AR，Soranzo C，Bigon E，Battiston S，Morandi A，Carnevale A，Callegaro L.Nerve growth factor(NGF)incerebrospinal fluid(CSF)from patients with various neurologicaldisorders(来自于患有多种神经障碍症患者的脑脊液(CSF)中的神经生长因子(NGF)).Ital J Neurol Sci.1994；15(2)：105-8.；Althaus HH，Kloppner S，Schmidt-Schultz T，Schwartz P.Nerve growth factor inducesproliferation and enhances fiber regeneration in oligodendrocytes isolatedfrom adult pig brain(神经生长因子在从成年猪脑中分离的少突神经胶质细胞中诱导增殖并增强纤维再生).Neurosci Lett.19923；135(2)：219-23)

无死亡结构域的诱捕TRAIL受体表现出竞争性抑制TRAIL与其受体的结合(参见Pan G，Ni J，Wei YF，Yu G，Gentz R，Dixit VM.Anantagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor forTRAIL(TRAIL的拮抗物诱捕受体和含有死亡机构域的受体).Science.19978；277(5327)：815-8)。因此，HA4被认为通过无死亡结构域的诱捕TRAIL受体的增加，经由TRAIL抑制神经元和少突神经胶质细胞(髓磷脂)的细胞死亡(urewicz A，Matysiak M，Andrzejak S，Selmaj K.TRAIL-induced death of human adult oligodendrocytes is mediated byJNK pathway(TRAIL诱导的人成熟少突神经胶质细胞的死亡是通过JNK途径介导的).Glia.2006 15；53(2)：158-66)。

综述

<HA4对多发性硬化症、脊髓损伤和哮喘/过敏性疾病的作用>

如上所述，当HA4对作为多发性硬化症模型的大鼠EAE(实验性变应性脑脊髓炎)模型给药时，观察到神经性症状的抑制。

另外，根据使用所述大鼠脑脊髓组织的DNA阵列分析、采用K562细胞的线粒体电位活性和DNA阵列分析以及在脊髓损伤模型中的突触小泡蛋白/Hsp72免疫染色，揭示HA4具有(1)炎症抑制作用，和(2)通过突触保护作用、少突神经胶质细胞(髓磷脂)细胞死亡抑制作用和神经元死亡抑制/神经元分化/轴突延长具有改善神经功能的作用(抑制神经传递的减少)(图16)。

在采用K562细胞的DNA阵列分析中，观察到IL-1β表达的抑制。已知IL-1β是一种恶化脊髓损伤的因子(参见Yang L，Jones NR，Blumbergs PC，Van Den Heuvel C，Moore EJ，Manavis J，Sarvestani GT，Ghabriel MN.Severity-dependent expression of pro-inflammatorycytokines in traumatic spinal cord injury in the rat(在大鼠的外伤性脊髓损伤中促炎细胞因子的严重性-依赖性表达).J Clin Neurosci.2005 Apr；12(3)：276-84)。上述的HA4作用(1)和(2)也有助于抑制脊髓损伤恶化/对其进行治疗的作用。上述讨论的事实表明HA4也对脊髓损伤具有治疗作用。

采用K562细胞的DNA阵列分析显示了IL-5表达的抑制。已知IL-5是一种恶化诸如哮喘的变应性疾病的因子(参见Hamelmann E，GelfandEW).IL-5-induced airway eosinophilia-the key to asthma？(IL-5诱导的气道嗜酸性粒细胞增多-引发哮喘的关键？)Immunol Rev.2001 Feb；179：182-91)。另外，因为其导致去甲肾上腺素的产生增加和支气管扩张，所以HA4减少甲状腺素运载蛋白的作用产生抑制哮喘或变应性疾病的恶化或对其进行治疗的作用。上述讨论的事实表明HA4也对哮喘和变应性疾病具有治疗作用(图18)。

Claims (30)

1.用于炎症和神经功能紊乱的治疗剂或预防剂，其包含透明质酸作为活性成分。

2.如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，其中所述透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单位为-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。

3.如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于自身免疫性疾病。

4.如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于神经性疾病。

5.如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于脊髓损伤。

6.如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于哮喘。

7.如权利要求1所述的治疗剂或预防剂，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于多发性硬化症。

8.治疗或预防炎症的方法，包括将有效量的透明质酸对需要治疗的个体给药的步骤。

9.如权利要求8所述的治疗或预防自身免疫性疾病的方法，其中所述透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单位为-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。

10.如权利要求8所述的治疗或预防自身免疫性疾病的方法，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于自身免疫性疾病。

11.如权利要求8所述的治疗或预防自身免疫性疾病的方法，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于神经性疾病。

12.如权利要求8所述的治疗或预防自身免疫性疾病的方法，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于脊髓损伤。

13.如权利要求8所述的治疗或预防自身免疫性疾病的方法，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于哮喘。

14.如权利要求8所述的治疗或预防自身免疫性疾病的方法，其中所述炎症和所述神经功能紊乱归因于多发性硬化症。

15.细胞因子相关基因表达抑制剂，其包含透明质酸作为活性成分。

16.如权利要求15所述的细胞因子相关基因表达抑制剂，其中所述透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单元为-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。

17.如权利要求15所述的细胞因子相关基因表达抑制剂，其中所述的细胞因子相关基因为与炎性细胞因子相关的基因。

18.如权利要求15所述的细胞因子相关基因表达抑制剂，其为注射制剂和口服制剂。

19.趋化因子相关基因表达抑制剂，其包含透明质酸作为活性成分。

20.如权利要求19所述的趋化因子相关基因表达抑制剂，其中所述透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单位为-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。

21.如权利要求19所述的趋化因子相关基因表达抑制剂，其为注射制剂和口服制剂。

22.细胞成活力增强剂，其包含透明质酸作为活性成分。

23.如权利要求22所述的细胞成活力增强剂，其中所述透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单位为-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。

24.如权利要求23所述的细胞成活力增强剂，其为口服制剂。

25.突触传递促进剂，其包含透明质酸作为活性成分。

26.如权利要求25所述的突触传递促进剂，其中所述透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单位为-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。

27.如权利要求25所述的突触传递促进剂，其为硬膜内用制剂、皮下用制剂、静脉内用制剂或口服用制剂。

28.突触保护剂，其包含透明质酸作为活性成分。

29.如权利要求28所述的突触保护剂，其中所述透明质酸为含有2个单位的四糖，单个单位为-D-葡萄糖醛酸-β-1，3-D-N-乙酰基葡萄糖胺-β-1，4-。

30.如权利要求28所述的突触保护剂，其为硬膜内用制剂、皮下用制剂、静脉内用制剂、鼻内用或口服用制剂。

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