CN1939324A - 杠柳苷a和e的医学用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了天然化合物杠柳苷A和E的药用用途。通过实验证明,杠柳苷A和E具有明显的免疫抑制作用,且具有高效低毒的优点;因此,可以用于制备免疫抑制药物,且具有廉价、安全的特点。
Description
技术领域
本发明涉及天然产物杠柳苷A和E的药物用途,具体地说,本发明是关于天然产物杠柳苷A和E用于制备免疫抑制药物的用途。
背景技术
免疫抑制剂(immunosuppressor)是对免疫有抑制作用的药物,不同的具体药物分别作用于免疫反应及调节的不同环节免疫抑制剂。在临床上主要用于治疗自身免疫性疾病和防止脏器移植排斥。免疫抑制剂主要分为以下几种:(1)化学制剂类,如烷化剂类的氮芥。(2)激素类,如糖皮质激素。(3)真菌代谢产物,如环孢素A(cyclosporinA,CsA)。(4)中药及其有效成分。
免疫抑制药物大多具有明显的毒副作用,主要是骨髓抑制,肝、肾毒性等。由于免疫抑制药物的作用是非特异的,所以可导致机体免疫功能的下降,病原微生物感染增加,长期应用可能提高肿瘤发病率。由于免疫抑制剂大多数具有一定的毒副作用,因此,寻找新的高效低毒的免疫抑制剂具有重要的意义。
香加皮为萝藦科植物(Periploca sepium Bge.)杠柳的根皮。又名羊奶条,羊角桃,羊交叶。主产山西、河南、河北、山东、甘肃、湖南等省。香加皮多年来一直被当作五加皮入药,商品习称香加皮或者北五加。
化合物杠柳苷A为从杠柳中分离的到的一种孕烷苷类化合物(Periplocoside E),化学名为:Δ5-pregnene-3β,17α,20(S)-triol 3-O-(4’,6’-dideoxy-3’-O-methyl-Δ3’-D-2’-hexosuloside)20-O-(2-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosy(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→5)-3,7-dideoxy-4-O-methyl-α-D-gluco-2-heptulopyranosyl(2-4)-dioxy-(1→3)-β-D-canaropyranoside),是一种天然化合物,其分子式为:C72H114O27,据文献报导,杠柳苷A具有一定的抗肿瘤活性。
其化学结构如下:
化合物杠柳苷E为从杠柳中分离的到的一种孕烷苷类化合物(Periplocoside E),化学名为:Δ5-pregnene-3β,17α,20(S)-triol 20-(2-O-acetyl-β-D-digitalopyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→4)-β-D-cymaropyranosy(1→4)-β-D-cymaropyranosyl(1→5)-3,7-dideoxy-4-O-methyl-α-D-gluco-2-heptulopyranosyl(2-4)-dioxy-(1→3)-β-D-canaropyranoside),是一种天然化合物,其分子式为:C65H106O24,其化学结构如下:
目前尚未发现有天然产物杠柳苷A,E具有免疫抑制活性的报道。
发明内容
本发明的目的就在于提供天然产物杠柳苷A和E的药物用途,它们可以用于制备免疫抑制药物。
本申请的发明人通过研究发现,天然产物杠柳苷A和E具有免疫抑制作用。因此,杠柳苷A和E可以用来制备免疫抑制药物,如在无菌条件下制成液体剂型如针剂、溶液,或者是口服剂型如片剂和胶囊等。
附图说明
图1是杠柳苷E对ConA刺激的T淋巴细胞增殖的抑制作用。
图2是杠柳苷E对LPS刺激的淋巴细胞增殖的抑制作用。
图3是杠柳苷E对淋巴细胞的毒性。
图4是杠柳苷E对同种异体混合淋巴细胞增殖反映的抑制作用。
图5是杠柳苷E对小鼠迟发性超敏反应的抑制作用。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。
实施例1 北五加中活性成分杠柳苷E的免疫抑制作用
一.实验材料
试验动物:纯系Balb/c雌性小鼠,6-8周龄。
RPMI-1640培养液(Gibco,pH7.2)添加10%胎牛血清(FBS),100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素,10mM HEPES,及50μM 2-ME。
刺激剂:伴刀豆蛋白(ConA),细菌脂多糖(LPS,来自Escherichia Coli O55:B5),临用前以RPMI-1640培养液稀释至合适浓度。
二.实验方法
[一]淋巴细胞毒性实验
1.脊椎处死小鼠,无菌取其脾脏,磨碎制成单细胞悬液,用MTT溶解液(10%SDS,50%二甲基甲酰胺;pH7.2)去除红细胞后,用含10%FBS的RPMI-1640培养液将细胞浓度调成5×106/ml。
2.96孔培养板中加入80μl的细胞悬液,40μl的样品,(补充样品的浓度,是什么样品?是A还是E?)40μl含10%FBS的培养液;对照加80μl培养液,总体积为160μl。并设空白对照。
3.放入37℃、5%CO2培养箱中培养48小时。在结束培养前6-7小时,每孔加5mg/ml MTT16μl。
4.结束培养时,每孔加80μl MTT溶解液(10%SDS,50%二甲基甲酰胺;pH7.2),在培养箱中放置6-7小时后,用酶标仪于570nm处测定OD570值。
[二]淋巴细胞增殖实验
1.脱脊椎处死小鼠,无菌取脾脏制成单细胞悬液,用含10%FBS的RPMI-1640培养液将细胞浓度调成4×106/ml。
2.于96孔板中加入100μl的细胞悬液,50μl的样品溶液,50μl ConA或LPS溶液,对照孔加50μl含10%FBS的培养液。总体积为200μl。
3.于37℃、5%CO2培养箱中培养48小时。在结束培养前7-8小时,每孔加0.5μCi[3H]-胸腺嘧啶核苷(25μl/孔)。
4.结束培养,用细胞收集仪(HARVESTER96,TOMTEC)收集细胞于玻璃纤维膜上,加入闪烁液,用液体闪烁记数仪(MicroBeta Trilux,PerkinElmer)检测细胞DNA中[3H]-胸腺嘧啶核苷的掺入量,反映细胞增殖情况。
[三]同种异体混合淋巴细胞增殖反应(MLR)
1.脱脊椎处死C57BL/6和Balb/c小鼠,无菌取其脾脏,磨碎制成单细胞悬液,去除红细胞后,用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞浓度调成6×106/ml。
2.C57BL/6脾细胞为反应细胞,Balb/c脾细胞(经钴60照射,3000rads)为刺激细胞,两种细胞等体积混合。
3.于96孔板中加入C57BL/6和Balb/c脾细胞混合液100μl,样品100μl,对照加100μl含10%血清的培养液。并做两种细胞的单独培养对照。
4.37℃,5%CO2培养箱中培养3,4,5天。在结束培养前1天,加入3H稀释液25μl(即,3.8×1010Bq的[3H]-胸腺嘧啶核苷)。
5.结束培养时,将培养板冻存于-20℃冰箱。
6.细胞收集仪(HARVESTER96,TOMTEC)收集细胞于玻璃纤维膜上,用液闪记数仪(MicroBeta Trilux,PerkinElmer)检测DNA对[3H]-胸腺嘧啶核苷的掺入量,反映细胞增殖情况。
[四]迟发性超敏反应动物模型(DTH)
1.Day0,Balb/c小鼠(雌性,6-8周龄)每组八只,每只后脚以20μl 0.5%DNFB致敏。次日加强。(DNFB溶于[丙酮∶橄榄油=4∶1]油剂中);
2.Day(7-9),鼠右耳内外两侧各10μl 0.4%DNFB进行攻击;
3.攻击前1天腹腔注射一次,攻击前腹腔注射一次,24小时后,再给药一次;
4.攻击后30-48小时,检测各指标。
三.实验结果
[一]五加皮提取物对淋巴细胞增殖的抑制活性及其毒性
免疫应答过程的效应表现主要是由以T细胞介导的细胞免疫反应和B细胞介导的体液免疫反应组成。我们在体外用T细胞丝裂原ConA和B细胞丝裂原LPS直接刺激细胞和细胞的活化分裂增殖来评价药物淋巴细胞增殖反应的抑制活性。在诸多五加皮提取物中,杠柳苷E和杠柳苷A表现出对淋巴细胞增殖有较好的抑制活性。在无淋巴细胞毒剂量1μM时,杠柳苷E对ConA刺激的T细胞增殖的抑制率是72%,对LPS刺激的B细胞增殖的抑制率是53%;杠柳苷A对ConA刺激的T细胞增殖的抑制率是47%,对LPS刺激的B细胞增殖的抑制率是26%。所以我们选择活性相对更强的杠柳苷E作经一步研究。
表:五加皮活性提取物对淋巴细胞增殖的抑制活性及其毒性
化合物 | 浓度(μM) | Con A刺激的T淋巴细胞增殖的抑制率 | LPS刺激的B淋巴细胞增殖的抑制率 | 淋巴细胞毒性 |
杠柳苷E杠柳苷A | 1010.11010.1 | 83%72%26%84%47%21% | 76%53%23%36%26%13% | 50%无毒无毒42%无毒无毒 |
[二]杠柳苷E对淋巴细胞增殖的作用和毒性
杠柳苷E的TC50是10.1±1.4μM,在低于5μM时没有淋巴细胞毒性。对ConA刺激的T细胞增殖的抑制IC50是0.64±0.23μM;对LPS刺激的B细胞增殖的抑制IC50是0.90±0.17μM。综合以上结果,我们在体内和体外进一步检查其免疫抑制药理活性。
[二]杠柳苷E对同种异体混合淋巴细胞增殖反应(MLR)的作用
异体抗原是输血、器官移植后引起机体排异反应的主要原因。应答淋巴细胞和异源性淋巴细胞共培养时,表达在异源性淋巴细胞上的异体抗原,主要是组织相容性抗原MEC-I、MHC-II分子,刺激应答T细胞引发免疫增殖反应。我们通过药物对MLR的作用来评价药物对更接近生理的免疫系统应答的药理作用。杠柳苷E显著的抑制了MLR中应答淋巴细胞的增殖,其EC50是0.25±0.13μM。
[三]杠柳苷E对迟发性超敏反应动物模型(DTH)的作用
为了进一步检查在体内的免疫药理活性。我们选用了经典的小鼠DTH反应模型。DTH实验是一种体内检测细胞介导免疫功能的方法,与接触性超敏反应相似。DTH也包括致敏和触发两个阶段。致敏约需要6天,在触发后的24~48小时DTH的炎症反应达到高峰。在初始的致敏阶段有记忆性的抗原特异性细胞分布到外周各淋巴组织,在任何局部的抗原刺激会使这些细胞迅速活化引起DTH。结果显示,体内给药杠柳苷E在5mg/kg,20mg/kg时,能显著抑制耳肿胀程度(P<0.01)。与对照组相比抑制率分别53.9%和66.6%。
小结:天然产物杠柳苷A和E对于小鼠的T淋巴细胞与B淋巴细胞增殖具有明显的抑制作用,在体内实验中,杠柳苷A和E对于DTH反应模型的小鼠的耳肿胀程度都具有显著的抑制作用(P<0.01),且毒性较低。可以进一步将其开发成为高效低毒的免疫抑制药物,如在无菌条件下被制成液体剂型如针剂、溶液,或者是口服剂型如片剂和胶囊等。由于这些技术都是本领域的常规技术手段,因此不再赘述。
Claims (9)
2.根据权利要求1所述用于制备免疫抑制药物中应用,其特征在于制备治疗自身免疫疾病的药物中应用。
3.根据权利要求2所述用于制备免疫抑制药物中应用,其特征在于免疫性疾病为类风湿性关节炎、自身免疫性肝炎、胰岛素依赖性糖尿病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、硬皮病、重症肌无力、多发肌炎、自身免疫性血细胞减少症、脉管炎综合症或系统性红斑狼疮。
4.根据权利要求1所述用于制备免疫抑制药物中应用,其特征在于在制备治疗炎症反应、纤维化或由自身免役疾病及相关疾病所致具有组织损伤或感染的功能异常药物中应用。
5.根据权利要求1所述用于制备免疫抑制药物中应用,其特征在于在制备治疗过敏性疾病药物中应用。
6.根据权利要求5所述用于制备免疫抑制药物中应用,其特征在于过敏性疾病为支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎或花粉病。
7.根据权利要求1所述用于制备免疫抑制药物中应用,其特征在于在制备治疗排异反应的药物中应用。
8.根据权利要求1所述用于制备免疫抑制药物中应用,其特征在于在制备治疗由骨髓造血干细胞移植所致的移植物抗宿主疾病药物中应用。
9.权利1到8项中任一项的免疫抑制剂,其中所述的抑制剂包括具有权利要求9所列结构式的化学成分作为活性成分的植物提取物及复方药物。
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