CN104507485A - 蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物 - Google Patents

蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN104507485A
CN104507485A CN201380032460.6A CN201380032460A CN104507485A CN 104507485 A CN104507485 A CN 104507485A CN 201380032460 A CN201380032460 A CN 201380032460A CN 104507485 A CN104507485 A CN 104507485A
Authority
CN
China
Prior art keywords
adhesion
fraction
cranberry
xyloglucan
gal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380032460.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104507485B (zh
Inventor
阿兰·T·霍奇斯基
阿尔伯托·努涅斯
克里斯蒂娜·邱
加里·D·斯特拉恩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean Spray Cranberries Inc
US Department of Agriculture USDA
Original Assignee
Ocean Spray Cranberries Inc
US Department of Agriculture USDA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ocean Spray Cranberries Inc, US Department of Agriculture USDA filed Critical Ocean Spray Cranberries Inc
Publication of CN104507485A publication Critical patent/CN104507485A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104507485B publication Critical patent/CN104507485B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/45—Ericaceae or Vacciniaceae (Heath or Blueberry family), e.g. blueberry, cranberry or bilberry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

一种由蔓越莓花萼经酶处理的组合物制备的组合物，其能减少或抑制微生物与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附。

Description

蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物
技术领域
本发明提供一种新的木葡聚糖低聚糖组合物，该组合物被命名为抗微生物粘附抑制性级分A6，一种含有所述包含抗微生物粘附抑制性级分A6的低聚糖组合物的组合物，和使用所述组合物至少减少病原体粘附对动物细胞，特别是人和哺乳动物细胞粘附的方法。
背景技术
木葡聚糖是公知的在双子叶植物和非鸭跖草科单子叶植物中发现的Ⅰ型植物细胞壁中的主要交联多糖(Carpita和Gibeaut,Plant Journal,Volume 3,1-30,1993)。带一个β-(1-4)-葡聚糖骨架，木葡聚糖氢键结合到纤维素微纤维表面并且形成连接细胞壁中相邻微纤维的网络。该木葡聚糖网络与细胞壁基质多糖的胶质网络相互交错(Carpita和Gibeaut,1993，见前)。这使得木葡聚糖成为初生细胞壁生长和形成中的重要多糖(Carpita和McCann,Biochemistry and Molecular Biology of Plants,Buchanan B.B.,Gruissem,W.,Jones,R.L.,Eds.；American Society of Plant Physiologists,Rockville,MD.,52-108,2000)。木葡聚糖中存在似块状结构，其中6-11糖序列在整个多糖中重复。因此，碳水化合物结构对植物分类群是特异性的(Sims等,Carbohydrate Research,Volume 293,147-172,1996；Vierhuis等,Carbohydrate Research,Volume 332,285-297,2001；Ray等,CarbohydrateResearch,Volume 339,201-208,2004；Hoffman等,Carbohydrate Research,Volume 340,1826-1840,2005)。3种木葡聚糖结构已被描述具有岩藻半乳-木葡聚糖，岩藻糖半乳糖-木葡聚糖最常分布在单子叶植物分类学的目中约一半，和所有除茄目、唇形目、龙胆目、杜鹃花目外的双子叶植物目的植物中(Carpita和McCann 2000,见前；Hoffman等2005,见前)。来自这些后一目的木葡聚糖含有阿拉伯糖基-木葡聚糖结构。少量的第三种木葡聚糖结构同样在鸭跖草科单子叶植物中(禾本科植物草,凤梨科植物，棕榈,和柏树)作为在纤维素骨架上随机分布的单一木糖取代基存在(Carpita和McCann,2000,见前)。单一字母命名被开发用于描述木葡聚糖取代基的顺序(Fry等,Physiol.Plant.,Volume 89,1-3,1993)。
蔓越莓汁是酸性的(pH约2.6或更低)，富含花青素和赋予它涩味的丹宁酸(Holmes和Starr,Fruit Juice Processing Technology,Nagy,S.,Chen,C.S.,Shaw,P.E.(Eds.),AGSCIENCE,Auburndale,FL,515-531,1993)。果汁是在用热的市售果胶酶浸软(约50℃作用约1小时)浆果后经研磨和压榨而制备的。蔓越莓胶质具有非常高的甲氧基含量，在压榨后和果汁过滤和浓缩前需要二次的热的市售果胶酶处理。蔓越莓汁被认为是一种健康的果汁。原花色素具有抗氧化特性(Uri-Sarda等,Anal.Bioanal.Chem,Volume394,1545-1556,2009)，并且被报道能抑制P-伞状大肠杆菌与尿路上皮细胞的粘附(Howell等,Phytochem.,Volume 66,2281-2291,2005)。P-伞状大肠杆菌是引发尿路感染的主要原因，其造成每年830万的医院就次数(Zopf和Roth,Lancet,Volume 347,1017-1021,1996)。蔓越莓汁也被报道具有益生特性(Clifford等,美国专利申请号20090022849,2009)。
最近，Coleman等(于07/13/2010提交American Society ofPharmaconosy,St.Petersburg Beach,FL的报告)用蔓越莓汁粉喂猪并从尿中分离出低聚糖或氨基糖，其能够抑制由尿路致病性大肠杆菌引发的红细胞凝集。相同的α-Gal-(1-4)-β-Gal受体是红细胞凝集和P-伞状大肠杆菌与尿路上皮细胞粘附所必须的(Howell等2005,见前)。因此，非源自原花色素的碳水化合物，被报道具有细菌抗粘附特性(Coleman等2010,见前)。果胶的低聚糖抑制大肠杆菌的产维罗毒素菌株和肠道致病菌株与HT29细胞的粘附(Rhoades等J.Food Protect.,卷71,2272-2277,2008)。所以，植物细胞壁低聚糖优先地具有细菌抗粘附特性。然而，蔓越莓植物细胞壁低聚糖的结构仍然未知，且Coleman等(2010,见前)并未报道低聚糖如何在尿排泄前被胃肠道吸收。
对中和和/或从宿主机体，如人和家畜，去除细菌和细菌成分的现有治疗方案很大程度上基于抗生素的使用。自20世纪40年代引入抗生素药以来，抗生素药被证明对许多细菌相关疾病是有效的。然而，它们时常被滥用已导致抗生素耐药性细菌菌株的产生，这需要开发和使用越来越更强效的药物。医院内的细菌感染在不断增加，导致严重病患的病例激增，在某些情况下，甚至出现危急性命的症状。例如，尿路感染(UTI)是一个普遍的卫生保健问题。UTI通常定义为尿中出现>100,000细胞/毫升的细菌。UTI普遍地由革兰氏阴性细菌，特别是大肠杆菌(E.coli)引起，并主要感染女性。这种感染是由细菌与尿道上皮细胞粘附并定植所致。大肠杆菌的粘附是通过细菌细胞壁上的蛋白质性纤维(菌毛)进行的，蛋白质性纤维能够附着在尿路上皮细胞上特异性的低聚糖受体。抗生素是常规开处方用于治疗，但常常提高细菌的耐药性。四分之一的女性也出现感染复发且经常被发现更易于这些感染。能治疗和预防UTI的自然物质可被用于那些在许多情况下因抗生素治疗而导致患有这种病况的患者，如需要后续抗真菌治疗的继发性阴道酵母感染。
已有大量文献报道蔓越莓植物营养素在预防和减轻尿路感染(UTI)中的作用，特别是革兰氏阴性尿路致病性细菌大肠杆菌，是UTI的最常见病因(Lavigne等,Clinical Microbiology and Infection,Volume 14,350-355,2008；Ofeck等,Advances in Experimental Medicine and Biology,Volume 408,179-183,1996；Ofeck等,New England Journal of Medicine,Volume 324,1599,1991)。已发现食用蔓越莓在解决UTI感染有一定的效果。蔓越莓产品能防止某些细菌菌毛与尿道的尿道上皮细胞的粘附，由此减少细菌产生感染的能力(DiMartino等,World Journal of Urology,2006)；(Liu等,Biotechnology Bioengineering,2006)。在蔓越莓汁中发现的原花色素，其是浓缩的丹宁酸，被证实抑制大肠杆菌粘附(Howell等,Journal of Medicine,1998)。于2009年公布的美国专利申请2009/0226548，指出一些大肠杆菌菌毛特异性地结合到D-甘露糖，不像蔗糖或果糖，D-甘露糖在人体内代谢非常慢，因此一旦摄入，D-甘露糖会进入血流并通过肾快速移动至排泄，接着进入膀胱中的尿中。D-甘露糖一旦出现在尿中将会导致对D-甘露糖结合敏感的细菌菌毛粘附于D-甘露糖，而不是上皮细胞。这使得机体从体内清除与D-甘露糖结合的大肠杆菌。另外，D-甘露糖能够逆转与上皮结合的大肠杆菌竞争性地阻断尿路感染的初发期。为了减轻现有的UTI和防止复发，定期摄取蔓越莓以及D-甘露糖将防止细菌粘附、定植并最终防止不可控的尿路感染。这个文献进一步认为为了实施这个策略，需要消费者的配合。
细菌和真菌感染的其他治疗有使用肉桂(Cinnamonmum cassia)提取物。肉桂的抗微生物作用可部分归功于存在主要抗细菌的肉桂醛、丁香酚、冰片、芳樟醇(linool)和麝香草酚，以及主要抗真菌的邻-甲基肉桂醛。
对于用于至少减少抑制细菌与人和哺乳动物细胞的粘附和用于减少或抑制致病性细菌入侵和感染人和哺乳动物细胞的营养和治疗组合物以及方法仍然存在着需求。以下描述的本发明包括这样的组合物和方法，它们与相关技术的组合物和方法不同。
发明内容
因此本发明的一个目的是提供一种制备自经酶处理的来自美洲蔓越橘(Viccinium Macrocarpon)的蔓越莓花萼的组合物，其至少减少微生物与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附。
本发明的另一个目的是提供一种制备自经酶处理的来自美洲蔓越橘的蔓越莓花萼的组合物，其中所述组合物包含乙酰化、富含中性糖的多糖，所述多糖的重均摩尔质量为约10.2×103±2.0Da，Z平均流体力学半径为约2.0±0.2nm，重量–平均特征粘度为约0.048±0.0001dL/g。
本发明的又另一个目的是提供一种用于防止细菌与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附的方法，其中将具有乙酰化、富含中性糖的多糖的组合物施用于具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞，所述多糖的重均摩尔质量为约10.2×103±2.0Da，Z平均流体力学半径为约2.0±0.2nm，重量–平均特征粘度为约0.048±0.001dL/g。
从下面的描述本发明的其他目的和有益效果将是显而易见的。
附图说明
图1为显示蔓越莓级分的低聚糖分析的图。木葡聚糖低聚糖的DP在每个峰的上方指示。
图2为蔓越莓的A6级分的MALDI-TOF质谱扫描。
图3A和B为m/z＝1055.32(A)的串联MALDI-TOF谱和m/z＝1217.37(B)的串联MALDI-TOF谱。
图4和图4插图为基于MALDI-TOF/TOF MS.的木葡聚糖碎片的图。
图5A-C是级分A6的NMR谱。
图6为显示来自美洲蔓越橘的蔓越莓级分的抗粘附活性的图。
具体实施方式
本发明提供了一种使用美洲蔓越橘由蔓越莓花萼经酶处理的组合物制备的组合物。本发明的组合物包含合适的载体和有效量的作为活性成分的分离的抗微生物粘附抑制性级分，所述组合物用作减少或抑制微生物与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附的药剂。
分离的粘附抑制性级分被命名为A6且表征为：A6包含乙酰化、富含中性糖的多糖，其重均摩尔质量为约10.2×103±2Da，Z平均流体力学半径为约2.0±0.2nm，重量–平均特征粘度为约0.048±0.001dL/g。A6的单糖组成主要为葡萄糖、阿拉伯糖和木糖以及存在非常少的半乳糖醛酸和鼠李糖，这指示多糖片段是半纤维素并且可能是木葡聚糖。
本发明的组合物可以通过口服施用于患者。通常分离的抗微生物粘附抑制性级分的浓度是减少细菌细胞与哺乳动物细胞，尤其是人细胞粘附的量，对其的确定在本领域技术人员的能力范围内。
鉴于发明的目的,以下为下文使用的某些术语的定义。
当在说明书和权利要求书中使用时,除非上下文另外明确指示，否则单数形式“一个”,“一种”,和“该”包含复数指代物。比如，术语“一个细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
当在本文中使用时，蔓越莓被理解为美洲蔓越橘。
术语木葡聚糖用于描述一组被称作半纤维素的多糖。木葡聚糖含有1,4-连接的β-D-吡喃葡萄糖基残基的骨架，在1,4-连接的β-D-吡喃葡萄糖基残基中O4处于赤道方位。
当在本文中使用时，术语分离的、纯化的或生物纯的，是指基本上或实质上不含当以其天然状态存在时正常与其共存的组分的材料。在一个示例性实施方案中，纯度和均质性使用分析化学技术如聚丙烯酰胺凝胶、电泳、或高效液相色谱来测定。
当在本文中使用时，术语病原体是指非有益细菌、病毒、真菌、单细胞或多细胞寄生虫，例如大肠杆菌，如产维罗毒素的大肠杆菌(VTEC)，肠道致病性大肠杆菌(EPEC),产肠毒素的大肠杆菌(ETEC),或聚集性大肠杆菌(EAggEC)，金黄色葡萄球菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，艰难梭菌，硫酸盐还原细菌如脱硫弧菌(Desulfovibrio sp.)，例如，脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)或Desulfovibrio piger。
当在本文中使用时，术语“控制”,或“控制的”，如在例如下列短语:大肠杆菌的控制,控制大肠杆菌，控制大肠杆菌菌群，或控制大肠杆菌感染或任何语法上等同的表述中，是指用于预防感染或侵袭，减少或消除已感染区域或有机体的群体，或消除大肠杆菌或期望进行控制的其他物种的群体的任何手段。如本文所用的控制是指成功预防、消除、减少或改善大肠杆菌、大肠杆菌感染或大肠杆菌菌群的任何指示。
本发明的药物、营养或药学组合物被定义为具有本发明的至少一种活性成份和适当的载体的组合物。适当的载体被定义为不会引起对活细胞或生物体明显刺激且不消除施用的本发明的活性成分的生物活性和特征的任意物质。
当在本文中使用时，治疗有效量是指引发期望生物反应所必须的量。如本领域普通技术人员所理解的，生物活性剂的有效量可以根据诸如下面的因素变化，所述因素如期望的生物终点、待递送的生物活性剂、包封基质的组成、靶组织等。
当在本文中使用时，术语“级分”意指来自蔓越莓花萼经酶处理的浓缩物的任意HPLC洗脱级分，所述HPLC洗脱级分能够控制在活生物体或活细胞群中的的大肠杆菌菌群。
术语“尿路感染”或“UTI”是指影响尿路的任何部分的细菌感染。当细菌进入膀胱或肾脏并于尿中繁殖时，它们引起UTI。UTI的最常见类型是膀胱感染，其也称膀胱炎。
术语粘附是指细菌通过细菌表面上的粘附分子与彼此，与其他细胞表面，和与非细胞表面的总体聚集。
除非以其他方式定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的相同含义。术语“约”定义为加或减10％；例如约100°F意指从90°F到110°F。尽管与本文所述的那些类似或等效的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明，但现在描述优选的方法和材料。
P-伞状粘附分子特异性地结合于一组被确认为P-血型抗原的受体。这种受体存在于多种类型的人细胞，如尿道上皮细胞和红细胞的表面上，其介导细菌的附着以及随后在尿道上皮的定植。P-伞状大肠杆菌导致人红细胞(RBC)聚集(HA)(Ofeck和Doyle，Bacterial Adhesion to Cells and Tissues,Chapman and Hall,Ltd.,London,357-365,1994)。
本发明提供一种用于通过施加处于合适的载体中的减少细菌粘附量的分离的被命名为A6的粘附抑制性级分来至少减少细菌的粘附的药物、营养或药学组合物和方法。这种组合物可以以适合于治疗的多种方式给药。活性成份，A6可以单独给药或作为与在药学上可接受的载体、稀释剂、辅料和媒介物组合的活性成份。组合物一般通过口服给药。常规方法，如将化合物作为片剂、混悬剂、溶液剂、乳剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂等施用是可用的。用于经口或静脉内递送抗粘附组合物并保留生物活性的已知技术是优选的。可以经皮下、局部或胃肠外或鞘内给药的制剂和输注技术以及栓剂和植入物也在本发明的考虑当中。
药学上可接受的载体、稀释剂、辅料和媒介物以及植入物载体一般是指惰性的、无毒的固体或液体填料、稀释剂，或不与本发明的活性成份反应的包封材料。适用于注射的药物制剂包括无菌水溶液或分散体和用于重构成无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可为溶剂或分散介质，包含例如水，乙醇，多元醇如甘油丙二醇、液体聚乙二醇等，及其适合的混合物和植物油。
适当的流动性可以通过使用如卵磷脂的涂层，在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂来保持。非水性媒介物如棉籽油，芝麻油，橄榄油，大豆油，玉米油，向日葵油，或花生油和酯，如肉豆蔻酸异丙酯也可被用做用于复合组合物的溶剂。另外，可以添加增强组合物的稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种的抗细菌剂和抗真菌剂，如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保阻止微生物的作用。可能合乎需要的是包括等渗剂，比如糖、氯化钠等。可注射药物形式的长效吸收可以通过使用延缓吸收的药剂，如单硬脂酸铝、明胶等来产生。使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂必须能与本发明的抗微生物粘附性级分A6配伍。对递送系统的选择也在本领域普通技术人员的能力范围内。
对在本发明的抗微生物粘附抑制性级分A6中的木葡聚糖的鉴定通过使用碳水化合物分析、高效尺寸排阻色谱法、MALDI-TOF/TOF MS和核磁共振光谱法进行。本发明的活性木葡聚糖制剂被命名为抗微生物粘附级分A6，其包括以SSGG结构为优势嵌段序列的阿拉伯糖-木葡聚糖。这是首个具有这种类型的木葡聚糖结构的杜鹃花目成员，但仅是在此目之下被表征有木葡聚糖的第二种植物。一种新的木葡聚糖七糖被表征为SSG和GSS低聚糖结构。在蔓越莓MALDI-TOF MS谱中SSG/GSS木葡聚糖七糖和SSGG木葡聚糖八糖是最丰富的离子。NMR确认了利用质谱法阐明的蔓越莓木葡聚糖结构。蔓越莓木葡聚糖低聚糖在阻断尿路致病性大肠杆菌和产维罗毒素大肠杆菌菌株与人上皮细胞的粘附方面是有活性的。
用于从蔓越莓中分离抗微生物粘附级分A6的方法包括用Klerzyme150果胶酶(DSM FoodSpecialities)或该酶家族中其他等效的果胶酶处理蔓越莓花萼的步骤。处理典型地是在100-140°F的范围内进行水果脱果胶。用于30-45min脱果胶过程的用量为大约为0.035至0.055重量％(即每100磅水果用0.035-0.055磅酶)，并且这可根据对蔓越莓脱果胶期间时间或酶量的变化进行调整。碎片和其他颗粒物经倾析、离心或其他相似方法除去。然后液体经喷雾干燥产生蔓越莓粉末并产生级分A1。A1的分级分离是利用Biotage FLASH-40系统完成的，系统改为接收装有SNAP KP-C18-HS12g样品的Biotage SNAP KP-C18-HS 120g柱。约20克级分A1溶解在约200ml去离子水(DI)中。约50ml(±5g)的溶液加样到预平衡的C18-柱中(柱子用约300ml甲醇洗脱接着再用约300ml DI水洗脱)。分级分离是从先用约500ml DI水洗脱柱子开始，接着用约500ml约15％甲醇/水(V/V)混合物洗脱柱子(流速为约35ml/min)，以产生级分A2。残留的酚类内容物用约500ml甲醇从柱子中洗去。柱子通过在再次加样更多的A1溶液(约50ml)前，用约500ml DI水洗涤进行再次平衡。这个过程重复总计4次并且混合约15％甲醇/水的各部分以制备级分A2。干燥级分A2；首先在真空状态(Buchi Laboratory Equipment)下去除甲醇，接着冷冻干燥水性溶液以产生约4.97g粉红色粉末。使用示差折光检测对A2进行分析，观察到从HPX-87C HPLC柱中在约6.7min时洗脱的一个未知的峰。使用Sephadex LH 20柱层析对级分A2作进一步纯化以消除残留的酚类色素。故将级分A2(约4.8g)溶解在约60ml DI水中，将混合物加样至45×300mm的Sephadex LH 20柱中(用约500ml DI水预处理)。柱子用约500ml DI水洗脱得到纯化的级分A6(使用Masterflex L/S泵-型号为7014-52，流速约为2.5ml/min)。残留的酚类内容物用约75％丙酮/水溶液(约500ml)从柱子中洗去。级分A6经冷冻干燥得到约4.32g灰白色结晶粉末(含粉红色的痕迹)。
实施例1
聚合度(DP)约为7～9的木糖葡萄糖低聚糖购自于Megazyme(伯雷，爱尔兰)。蔓越莓花萼经酶处理的命名为A1的浓缩级分是在蔓越莓脱果胶过程中使用Klerzyme 150果胶酶(DSM Food Specialties)生产的。经C18快速色谱法对A1的分级分离产生约15％甲醇级分(A2)。在A2级分中观察到一个未知的峰，此峰是使用示差折光检测从HPX-87C HPLC柱在约6.7m/in时洗脱出来的。存在与A2相关的粉红色，利用LH20凝胶柱色谱将其减少以消除酚类色素，产生A6。详细地，蔓越莓花萼用Klerzyme 150果胶酶(DSM Food Specialties)或这个酶家族中的其他等效果胶酶处理。处理典型地是在约100～140°F的范围内进行水果脱果胶。用于约30-45min脱果胶过程的用量为大约为0.035至0.055重量％(即每100磅水果用0.035-0.055磅酶)，并且这可由对该方法了解的人根据时间或酶的量的变化进行调整。碎片和其他颗粒物经倾析、离心或其他相似方法除去。然后液体经喷雾干燥产生蔓越莓粉末级分A1。A1的分级分离是利用BiotageFLASH-40系统完成的，系统改为接收装有SNAP KP-C18-HS 12g样品的Biotage SNAP KP-C18-HS 120g柱。A1(约20克)溶解在约200ml去离子水(DI)中。约50ml(±5g)的溶液加样到预平衡的C18-柱中(柱子用约300ml甲醇洗脱接着再用约300ml DI水洗脱)。分级分离是从先用约500ml DI水洗脱柱子开始，接着用约500ml约15％甲醇/水(V/V)混合物洗脱柱子(流速为约35ml/min)，以产生级分A2。残留的酚类内容物用约500ml甲醇从柱子中洗去。柱子通过在再次加样更多的A1溶液(约50ml)前，用约500ml DI水洗涤进行再次平衡。这个过程重复总计4次并且混合约15％甲醇/水的各部分以制备级分A2。干燥级分A2；首先在真空状态(BuchiLaboratory Equipment)下去除甲醇，接着冷冻干燥水性溶液以产生约4.97g粉红色粉末。使用示差折光检测对A2进行分析，观察到从HPX-87C HPLC柱中在约6.7min时洗脱的一个未知的峰。使用Sephadex LH 20柱层析对级分A2作进一步纯化以消除残留的酚类色素。因此，将级分A2(约4.8g)溶解在约60ml DI水中，将混合物加样至45×300mm的Sephadex LH 20柱中(用约500ml DI水预处理)。柱子用约500ml DI水洗脱得到纯化的级分A6(使用Masterflex L/S泵-型号为7014-52，流速约为2.5ml/min)。残留的酚类内容物用约75％丙酮/水溶液(约500ml)从柱子中洗去。级分A6经冷冻干燥得到约4.32g灰白色结晶粉末(含粉红色的痕迹)。
中性糖含量(NS)，半乳糖醛酸含量(GA)，酯化程度(DE)和乙酰化程度(DA)如以前报道那样测定(Fishman等2008)，除了NS(葡萄糖标准品)用作DA的基准而非GA。根据以前报道的程序(Zhao等，Alternative Therapies，卷14，34-38，2008)，通过高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测(HPAEC-PAD)接着进行甲醇分解来进行单糖分析。根据Rhoades等2008，见前报道的程序，也通过HPAEC-PAD分离未水解的低聚糖。
利用高效尺寸排阻色谱来进行对通过市售果胶酶处理蔓越莓花萼得到的A1级分的碳水化合物分析。约10-20mg/ml的蔓越莓样品溶解在含有约0.05M NaNO3和约0.01％NaN3的流动相中，置于冷室中搅拌过夜，在约50,000g转速下离心约10min且通过约0.22或0.45微米Millex HV滤器(Millipore公司，贝德福德，MA)过滤。用于溶剂递送系统，1000型串联脱气器，自动采样器和泵(Agilent公司)的流速设置约为0.7mL/min。注射容量约为200μL。样品一式三份地测试。柱子组由1个PL AquagelOH-40与2个OH-30尺寸排阻柱(Polymer Laboratories,Amherst,MA)串联构成。柱子的温度在设定在约35℃的水浴中进行控制。柱流出液用与Viscostar II型差压粘度计(DPV)(Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)和Optilab rEX干涉仪(RI)(Wyatt Technology)串联的HELEOS II多角度激光散射光度计(MALLS)(Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)检测。来自这3个探测器的电子输出由ASTRATM软件(Wyatt Technology)处理。
对通过市售果胶酶处理蔓越莓花萼得到的A1级分的碳水化合物分析包含高甲氧基果胶片段和大量的富含中性糖的物质(表1)。A2级分通过甲醇洗脱从反相HPLC柱中由A1得到。明显地，甲醇并不能完全从此级分中除去，因为A6的甲醇明显多于果胶甲酯理论上可能的量(表1)。大多数纯化的蔓越莓级分(A6)由乙酰化的、富含中性糖且重均摩尔质量约为10,200Da的多糖构成(表2)。z-平均流体力学半径和重量–平均特征粘度与A6的低分子量保持一致(表2)。A1和A2分子量值也比大多数多糖要低，但A6的分子量是3种蔓越莓级分中最低的。
表1.蔓越莓级分的碳水化合物分析(摩尔％).
GA＝半乳糖醛酸，MeOH＝甲醇，HAc＝醋酸盐，DE＝酯化程度，DA＝乙酰化程度，NS＝中性糖
表2.蔓越莓级分的总体溶解性质
样品 Mwe-3 Rhz(nm) Ivw(dL/g)
A1 34.5(9) 3.3(.2) 0.61(.005)
A2 30.0(3) 3.2(.8) .043(.01)
A6 10.2(2) 2.0(.2) .048(.001)
Mwe-3＝重均摩尔质量×10-3Da
Rhz＝Z-平均流体力学半径
Ivw＝重量–平均特征粘度
A2和A6蔓越莓级分的单糖组成主要为葡萄糖，阿拉伯糖和木糖以及存在于这些级分中的非常少的半乳糖醛酸和鼠李糖(表3)。这表明多糖片段是半纤维素且可能是木葡聚糖。A1级分含有大量的同型半乳糖醛酸聚糖，但检测到的低水平的的鼠李糖表明存在的中性糖并不是果胶的侧链。
表3.蔓越莓级分分的单糖组成(摩尔％)
样品 Glc Ara Gal Xyl Rha Fuc GalA GlcA
A1 25.36 10.69 7.38 6.6 0.34 0.16 49.43 0.05
A2 45.97 28.49 4.56 16.95 0.48 0.35 3.16 0.04
A6 50.33 25.72 4.41 14.79 0.54 0.37 3.66 0.18
Glc＝葡萄糖，Ara＝阿拉伯糖，Gal＝半乳糖，Xyl＝木糖，Rha＝鼠李糖，Fuc＝岩藻糖，GalA＝半乳糖醛酸，GlcA＝葡糖醛酸
一系列低聚糖峰出现在A2和A6蔓越莓级分HPAEC-PAD色谱图中(图1)。木葡聚糖标准低聚糖与这些峰中的一些的保留时间一致。然而，Megazyme木葡聚糖低聚糖的结构是半乳糖-木葡聚糖。例如，DP7木葡聚糖由一个纤维四糖骨架和附接于三个葡萄糖残基的三个单一的木糖取代基组成。DP8和DP9木葡聚糖标准品具有1个或2个被半乳糖残基取代的木糖残基。这样的木葡聚糖结构是典型的不含岩藻糖的岩藻糖半乳糖-木葡聚糖。然而，在A2和A6的单糖组成中检测出相对少量的半乳糖。这表明蔓越莓的木葡聚糖结构可能与岩藻糖半乳糖-木葡聚糖不同，因为A2和A6低聚糖峰中的大多数与木葡聚糖标准品保留时间不一致。
实施例2
利用基质辅助激光解吸电离质谱与自动串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)确定木葡聚糖结构。低聚糖的选定离子的MALDI-TOF/TOF MS碎片由蛋白质组学分析质谱仪(Applied Biosystems,Framingham,MA)以正反射模式(positive reflectron mode)获取。分别通过在MS和MS/MS模式下平均大约100个和大约2500个获取的质谱获得质谱。利用空气在约1×10-6Torr、约1KeV加速电压下进行碰撞诱导解离(CID)以获取所选择的低聚糖的MS/MS质谱。单一同位素离子，[M+Na]+，其TOF与质量(Da)的转换是基于配套有肽标准品校准试剂盒(AppliedBiosystems)的仪器校准。低聚糖样品(约3-5mg)溶解在约1ml水中并用大概3mL，约250mg的CarboPrep 90石墨化碳筒(Restek,Bellefonte,PA)清洁。碳筒首先通过使约3mL乙腈：水(约50:50V/V)流过，然后用约3mL水洗涤约4次来进行处理。处理后，低聚糖溶液从石墨化碳筒流过，并用约3mL水洗涤约3次并弃置水洗涤液。用约1ml乙腈：水(约30:70v/v)和约0.1％三氟乙酸(TFA)洗脱低聚糖。从这个溶液中，取约2μL与约10μL 2,5-二羟基苯甲酸溶液(在乙腈：水(约50:50V/V)中约10mg/mL，约0.1％TFA)混合，并点样进MALDI板进行分析。
A6级分的MALDI-TOF质谱产生一系列准分子离子(图2)，这些准分子离子与木葡聚糖结构一致(表4)。在约m/z 791和923处的离子以前在具有SGG和/或XXG，以及SXG和/或XSG结构的烟草悬浮培养物木葡聚糖中被报道(Sims等,1996)。约在1085、1217、1379和1525处的离子被报道为分别具有Hex4Pent3、Hex4Pent4、Hex5Pent4和Hex5Pent4dHex组成的阿甘树(Ericlaes)木葡聚糖了(Ray等,2004,见前)。1525离子含有XUFG木葡聚糖结构(Ray等,2004,见前)。另外，报道了阿甘树木葡聚糖由岩藻糖半乳糖-木葡聚糖结构构成。1217离子大量出现在蔓越莓MALDI-TOF MS质谱中并被报道含有以前为夹竹桃和橄榄果木葡聚糖的XXSG结构(Vierhuis等,2001,见前；Hoffman等,2005,见前)。然而，用于XXSG结构的诊断离子没有出现在蔓越莓MALDI-TOF/TOF谱的m/z约1217.37处(Vierhuis等,2001,见前)(图3B)。因此,SSGG木葡聚糖结构似乎为主要的蔓越莓木葡聚糖结构，如在烟草中对m/z约为1217所报道的一样(Sims等，1996)。以前报道称约1127、1259、1289、1331和1421的离子为烟草中乙酰化的木葡聚糖低聚糖组合物(表4)。对于约1289和1331离子，如以前报道的，被分别指定为XLXG和/或XXLG,以及UXGGG和/或XUGGG结构(Sims等,1996)。然而,由于蔓越莓的木葡聚糖含有相对少量的半乳糖,这些离子可能含有XSGGG-Ac和XSGGG-Ac2结构。Hex2PentndHexHexAMe的木葡聚糖组合物系列以前从没见报道，但其相似于对阿甘树(Ericales)木葡聚糖所报道的XUFG结构和来自相同来源的含有4-O-甲基-葡萄糖醛酸的木聚糖低聚糖(Ray等2004，见前)。蔓越莓最富含的离子之一，约1055，先前也没见报道为木葡聚糖结构，且用其作进一步MS/MS结构分析研究。蔓越莓中的两种最富含的离子,约1055和1217,以它们的钾化形式([M+K]+)在m/z＝约1071和1233处分别被检测到。
通过MALDI-TOF/TOF MS对低聚糖分析产生一系列离子，所述离子为碳水化合物结构表征提供了必不可少的信息(Mechref和Novotony,Anal.Chem.,Volume 75,4895-4903,2003)。由于跨环碎片化使MS/MS谱出现二种类型的离子，跨环碎片化常常涉及在相同的糖残基上的两个键和位于两个糖残基之间的糖苷键断裂。当得到的碎片的电荷位于朝向低聚糖还原末端时，则将离子定义为：X离子为跨环碎片，Y离子和Z离子为糖苷键碎片。如果电荷位于非还原末端，则离子定义为：A离子为跨环碎片，B离子和C离子为糖苷键碎片。断裂键的位置由相对应的字母，下标数字，和指示涉及的分支链的希腊字母表示。在离子X或A前的上标数字表示位于糖环内的断裂键。
示于图3A的MS/MS谱与m/z在约1055.32的钠化的低聚糖,[M+Na]+,对应(图2)。这个前体离子与由4个戊糖和3个己糖形成的低聚糖结构一致。在MS/MS谱(图3A)中在m/z为约305.3处的离子提示两个戊糖作为侧链存在。在质谱中没有观察到与具有1、3或4个戊糖的侧天线对应的离子。在m/z约893处的离子表示从前体离子(1055-162)中失去一个己糖。这表示有一个己糖并没有连接到侧链上。然而，质谱并不由Y离子或B离子决定，而是由与出现在图4中的跨环碎片化一致的离子决定。如质谱所示，在戊糖末端处的跨环断裂(减少约104amu)产生在约951处的离子，其再失去一个戊糖则产生在约819处的离子，且失去一个己糖则产生在约657处的离子。这些离子也能通过标记在如图4的谱中的跨环碎片化形成。一些离子产生自约951碎片的随后碎片化，如在m/z约891(951-60)处的离子。在m/z约465处的明显的离子也能被解释为在约951处的离子在失去1个己糖，2个戊糖，和跨环碎片的后续断裂(951-162-132-132-60＝465)。因此，图3A中的几个离子能由多种碎片化模式产生。对碎片化模式的进一步分析提示示于图4插图中的同量异位结构也是存在的。支持此结构的证据发现于在m/z约921处的离子，这个离子对应于非还原端处的己糖的1,5X*2跨环断裂(图4插图)。因此，SSG和GSS两者的结构被呈现和归属(表4)。图3B的质谱与图4中的结构一致，除了额外的己糖。末端戊糖的跨环断裂产生在约1113(1217-104)处的离子，但同时从前体离子失去一个己糖则产生在m/z约1055处的离子，那个碎片与图3A中的质谱和结构一致。
表4.A6的MALDI-TOF质谱
Hex＝己糖,Pent＝戊糖,dHex＝脱氧己糖(鼠李糖或岩藻糖),Ac＝邻-乙酰基,
G＝β-D-葡萄糖,X＝在邻-6位具有末端α-D-木糖取代基的β-D-葡萄糖,
S＝在邻-6位具有α-L-Araf-(1-2)-α-D-Xylp的β-D-葡糖糖,L＝在邻-6位具有β-D-Galp-(1-2)-α-D-Xylp的β-D-葡萄糖,F＝在邻-6位具有α-LFucp-(1-2)-β-D-Galp-(1-2)-α-D-Xylp的β-D-葡萄糖,U＝在邻-6位具有β-D-Xylp-(1-2)-Xylp的β-D-葡萄糖。
实施例3
利用核磁共振光谱法对低聚糖进行结构分析以确定糖残基特性和连通性。获得自上述酶处理的蔓越莓花萼的分级分离的级分A6，溶于2H2O(约99.6％2H,Cambridge IsotopeLaboratories)中，冻干并再溶解在约0.6mL的约99.96％富集的2H2O中并转移至5mm NMR管以获得约5mM的浓度。在约40℃使用约5mm xyz-PFG QXI HCNP探针在Bruker Avance-II 700MHz光谱仪上记录到大多数光谱。数据处理使用NMRPipe(Delaglio等,1994)执行，并用Sparky(Goddard等)分析。所有光谱参照4,4’-二甲基-4-硅戊烷-1-磺酸(DSS)的内部1H和13C共振。一维1H NMR谱利用约5,000Hz的谱宽,约32,768个点,约70°脉冲宽度,和约2.5秒的循环时间(recycle time)获得。一维13C NMR谱在约176MHz下使用约65,536个数据点，约70°脉冲宽度，和约2.5秒的弛豫时间获得。运行以下实验的梯度增强形式：两个2D TOCSY(总相关光谱法)，第一个在约10ms混合时间和第二个在约20ms混合时间)，2D ROESY(旋转坐标系NOE谱，约200ms混合时间)，1H-13C HSQC(异核单量子相关),远程1H-13CHSQC,和JH-C–耦合HSQC。2D同核实验是在两个维度中利用约5,000Hz的光谱宽度，使用直接-检测的维度中的约8192个点，第二维度中的约512个增量，和扫描之间约2.5秒的延迟进行记录。这些实验使得对共振进行归属和对耦合常数进行测量以确定糖残基的特性和连通性。另外，约6MHz HMBC在Varian INOVA 500MHz上在约40℃使用z-PFGPentalProbe，约7,000Hz扫频宽度，直接-检测的维度中的约8,192个数据点，第二维度中约550个增量，每次采集约64个瞬态，和扫描之间约2.5秒的延迟进行。
对1D-1H谱内的异头区域的NMR分析(图5A)揭示约4.5ppm附近的共振具有约7-9Hz的JH1-H2的H1-H2耦合常数，指示轴向-轴向方位。这是β-D-Glc和β-D-Gal的指示。在4.94ppm处的共振具有JH1-H2～3.8Hz，在4.94,5.245.21,5.15,5.31,5.28处的峰有JH1-H2～3.8-4.7Hz；这些提示具有α-构象的单糖的轴向-赤道方位。同样地，在5.08处的峰有一个肩，这也是来自主峰的3.5Hz。这是呋喃糖、鼠李糖、岩藻糖和木糖的指示，即使还可能有其他糖。在1D-1H谱中，在约5.1-5.2ppm的区域中的几个峰有非常小，或难以擦觉的耦合。这些特征支持对α-L-Araf的归属。如这些的呋喃糖经历了它们的环的快速再起皱，导致J值的平均化。
有明显的证据显示级分中的一些糖的乙酰化作用(图5B)。HMBC和远程HSQC-实验的分析揭示与很多α-L-Araf残基的C2位的关联的羰基碳。
2D HSQC的分析表明初级糖残基是β-Glc,α-Xylp,和α-Araf，正如1D-1H谱和单糖组成分析所期望的那样。HSQC揭示在4.48-4.57ppm处的质子共振基于它们的13C共振被分割成两簇。一组位于～105ppm的13C频率中心，且对应于β-D-Glcp，而另一组在～107ppm且对应于β-D-Galp。这样的β-D-Glcp共振常见于SG或GS亚结构环境(CCRC木葡聚糖NMR数据库)。同样的，β-D-Galp共振典型地见于如XLF的序列中的L亚结构(CCRC NMR数据库)。该数据也允许对由α-Rha,和α-Fuc构成的二级成分的归属。由H6甲基共振，约1.26ppm，强烈指示α-L-Rha和α-L-Fuc的存在(图5C)，H6甲基共振具有与直接附着的糖环上的H5质子的TOCSY关联(约3.44-4.74ppm且具有JH5-H6＝约6-7Hz)。另外，1D-1H和HSQC谱揭示在4.49-4.65ppm和98.4-99.5ppm(分别为1H和13C)的大致范围中的β-二联体。这些共振很可能来自具有如XFG或LFG的环境的F亚结构中的β-D-GlcA,和/或β-D-Gal(CCRC NMR数据库)。
异头质子方位(α或β)是通过它们的约160Hz的C-H耦合常数JC1-H1来确定的，而带有赤道H-1的那些异头质子的值为约170Hz(Bock等,Tetrahedron Lett.Volume 13,1037-1040,1973)。对异头物的化学位移，它们的归属(带有方位)，和可能的亚结构的概述可见于表5。这些归属是基于可用的1H-1H耦合信息，并与1H和13C两者化学位移的文献值(Bock等,Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.Volume 41,27-66,1983和Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.Volume 42,193-225,1984；Hannify等,Carbohydr.Res.Volume 319,124-132,1999；Verhuis等,2001,见前；Hoffman等,2005,见前；Mazzola等,Carbohydr.Res.Volume 346,759-768,2011)完全一致。尽管耦合常数的使用被认为是归属糖共振的最可靠的方法(Coxon,Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.Volume 62,17-82,2009；Mazzola等,2001,见前)，但由于难以分析高度拥挤的光谱，化学位移表格的使用是可接受的归属方法。列出在表5中的可能的亚结构同样从化学位移信息确定，并用于确认用质谱法观察到的事物。
HMBC和HSQC实验表明具有在约7.5-9.7ppm之间的1H共振和在约90-180ppm范围内的13C共振的芳香族成分的存在。这些共振与多酚花青素或原花青素类化合物一致，尽管实际的结构还没构建好。光谱确实提示它们与好几种糖相关联，尽管如此，这仍没被验证。类似的化学物质已以被其他人鉴定(Yan等,J.Agric.Food Chem.,Volume 50,5844-5849,2002)。
表5.NMR异头物共振归属
基于1H-1H和1H-13C异头物耦合以及1H和13C化学位移的文献值
通过比较发表的低聚糖化学位移来确定
实施例4
为了测试本发明的抗微生物粘附抑制性级分A6的生物活性，将人膀胱上皮细胞T24(ATCC#HTB-4)和大肠杆菌1161(ATCC#BAA-1161)接种于24-孔板，并在约37℃在约5％CO2孵箱中生长至汇合。然后用紫外光处理细胞。每孔加入约1mL LB培养基(Muler Hinton II Broth)。级分A6样品溶解在DMSO中，并于约4℃在约3,000rpm离心约15分钟，向孔加入约50μL上清。用磷酸盐缓冲液(PBS)或DMSO作为阴性对照。向每孔加入约20μl大肠杆菌溶液。约3小时孵育后，将板中的溶液吸出。用PBS洗涤孔两次。结合于细胞膜的细菌用微生物活力缓冲液裂解。ATP水平，活细胞的指标，通过读板器进行光学读数。细菌粘附的抑制百分数通过下式计算：(ATP阴性对照-ATP样品)/ATP阴性对照)×100％
抗微生物粘附抑制性级分A6对细菌粘附的作用也通过使用早期报道的标准测定法(Rhoades等,2008,见前)利用大肠杆菌O157:H7(ATCC#BAA-1883)和人结肠上皮细胞HT29(ATCC#HTB-38)确定。
抗微生物粘附抑制性级分A6的生物活性通过使用尿路致病性大肠杆菌1161和产维罗毒素大肠杆菌O157.H7菌株的细菌粘附测定来确定。A6的最低浓度，约1.25-10mg/ml，阻断大肠杆菌1161对T24人膀胱上皮细胞的粘附，而约20mg/ml或更高浓度与PBS对照没有不同(表6)。
与A1相比，A6级分有高得多的抗粘附活性(图6)。蔓越莓浓缩粉末(A1)更多地富含果胶低聚糖，与之相比木葡聚糖低聚糖富含在A6级分。更高水平的木葡聚糖低聚糖与更高的抗粘附活性相关。
在早期由Rhoades等(2008,见前)报道的细菌粘附测定中对A6的抗粘附活性观察到类似的非剂量依赖性反应。在这个测定中，A6在约0.15-2.5mg/ml的浓度能阻断大肠杆菌O157:H7对人结肠上皮HT29细胞的粘附(表7)。大肠杆菌的尿路致病性菌株(P-伞状)和产维罗毒素菌株利用相同的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体与上皮细胞粘附(Hotchkiss和Buddington,Functional Food Review,Volume 3(3),119-134,2011)。因此，此第二种细菌粘附测定确认A6木葡聚糖低聚糖级分阻断这些病原体粘附到两种不同的人上皮细胞所需的特异性相互作用。
表6.使用级分A6的大肠杆菌1161粘附测定(干重mg/ml)
表7.在级分A6的存在下大肠杆菌O157:H7与HT29细胞的粘附(干重mg/ml).
菌株编号 A6(Mg/ml) 粘附与对照相比(％)
1 0.15 13.8％
2 0.3 5％
3 0.5 12.2％
4 2.5 15.5％
为了举例说明和描述本发明的目的，已经提出了上面的详述以及本发明的某些代表性实施方案和细节。其意并不在于穷尽或将本发明限制于公开的准确形式。在不背离本发明的范围的前提下，其中可以作出多种改动和变化，这对于本领域专业技术人员来说显而易见的。

Claims (2)

1.一种抗微生物粘附的组合物，包含有效量的分离自蔓越莓的抗微生物的粘附抑制性级分A6作为活性成分，其中所述分离的级分含有乙酰化、富含中性糖的多糖，所述多糖的重均摩尔质量为约10.2×103±2.0Da，Z平均流体力学半径为约2.0±0.2nm，重量–平均特征粘度为约0.048±0.0001dL/g，且具有对尿路致病性菌和产维罗毒素菌有粘附抑制活性，其中所述有效量至少降低细菌与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附。
2.一种用于减少细菌与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附的方法，包括对所述细胞施用有效量的分离自蔓越莓的抗微生物的粘附抑制性级分A6作为活性成分，其中所述分离的级分含有乙酰化、富含中性糖的多糖，所述多糖的重均摩尔质量为约10.2×103±2.0Da，Z平均流体力学半径为约2.0±0.2nm，重量–平均特征粘度为约0.048±0.0001dL/g，且对尿路致病性菌和产维罗毒素菌有粘附抑制活性，其中所述有效量至少降低细菌与具有用于粘附的α-Gal-(1-4)-Gal末端低聚糖受体的细胞的粘附。
CN201380032460.6A 2012-05-25 2013-05-22 蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物 Active CN104507485B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/480,903 2012-05-25
US13/480,903 US9314494B2 (en) 2012-05-25 2012-05-25 Cranberry xyloglucan oligosaccharide composition
PCT/US2013/042217 WO2013177275A1 (en) 2012-05-25 2013-05-22 Cranberry xyloglucan oligosaccharide composition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104507485A true CN104507485A (zh) 2015-04-08
CN104507485B CN104507485B (zh) 2018-10-09

Family

ID=49621805

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380032460.6A Active CN104507485B (zh) 2012-05-25 2013-05-22 蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物

Country Status (6)

Country Link
US (1) US9314494B2 (zh)
EP (1) EP2854827B1 (zh)
CN (1) CN104507485B (zh)
AU (1) AU2013266351B2 (zh)
CL (1) CL2014003194A1 (zh)
WO (1) WO2013177275A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108367030A (zh) * 2015-10-28 2018-08-03 麦太宝根有限公司 普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌用于治疗或预防糖尿病和肠病
CN109187940A (zh) * 2018-07-27 2019-01-11 南京谱利健生物技术有限公司 用于多糖分析的一种同位素标签试剂的制备和应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9895341B2 (en) * 2011-04-01 2018-02-20 Ocean Spray Cranberries, Inc. Inflammation and immunity treatments
WO2018183369A1 (en) * 2017-03-27 2018-10-04 Rhode Island Council On Postsecondary Education Cranberry-derived compositions for potentiating antibiotic efficacy against bacterial persistence
US20210069088A1 (en) * 2018-03-08 2021-03-11 Plexus Worldwide, LLC. Compositions and methods for skin renewal
GR1009632B (el) * 2018-07-09 2019-10-25 Ιουλια Κλεωνος Τσετη Διατροφικο συμπληρωμα για την απο του στοματος χορηγηση συνδυασμου λακτοφερινης, ξυλογλυκανης, προανθοκυανιδινων και σιμεθικονης, χρησιμων για την προληψη λοιμωξεων του γαστρεντερικου και ουροποιητικου συστηματος

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303125B1 (en) * 1996-12-19 2001-10-16 Ramot-University Authority For Applied Research And Industrial Development Ltd. Anti-microbial-adhesion fraction derived from vaccinium
WO2010078660A1 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Use of proanthocyanidins as an anti-apoptotic agent and anti-adhesive bacterial agent

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6210681B1 (en) * 1999-09-07 2001-04-03 Jlb, Inc. Plant proanthocyanidin extracts
DE10006989A1 (de) 2000-02-16 2001-08-23 Nutricia Nv Antiadhäsive Kohlenhydratmischung
US6960360B2 (en) * 2000-08-31 2005-11-01 Phenolics, Llc Efficient method for producing compositions enriched in total phenols
US7306815B2 (en) * 2000-08-31 2007-12-11 Phenolics, Llc Compositions enriched in phenolic compounds and methods for producing the same
JP3837497B2 (ja) 2002-03-25 2006-10-25 独立行政法人産業技術総合研究所 新規なキシログルカンオリゴ糖分解酵素、それをコードする遺伝子、ならびに該酵素の製造方法
GB0321996D0 (en) 2003-09-19 2003-10-22 Novartis Nutrition Ag Organic compounds
US20050175762A1 (en) * 2003-10-23 2005-08-11 Richards Mark P. Methods and compositions to inhibit lipid oxidation
US7270837B2 (en) * 2003-11-10 2007-09-18 Rutgers, The State University Of New Jersey Anti-inflammatory cranberry flavonol extract preparations
GB0405540D0 (en) 2004-03-11 2004-04-21 Glaxo Group Ltd Novel use
JP2007291322A (ja) 2006-03-31 2007-11-08 Maruha Corp 新規多糖およびオリゴ糖
GB2453671B (en) 2007-10-11 2009-09-16 Fayrefield Foods Ltd Preparation for use in the treatment of Clostridium difficile and Salmonella
US20090226548A1 (en) 2008-01-11 2009-09-10 U.S. Nutraceuticals, Llc D/B/A Valensa International Method of preventing, controlling and ameliorating urinary tract infections using a synergistic cranberry derivative and d-mannose composition
FR2930730B1 (fr) 2008-05-05 2011-03-04 Tournay Biotechnologies Procede d'obtention d'un extrait de marc de canneberge utilisable notamment dans la prevention et le traitement d'affections telles que caries, gingivites, maux de gorge
US20100028469A1 (en) 2008-06-04 2010-02-04 Herbalscience Group, Llc Extracts of Cranberry and Methods of Using Thereof
US10004242B2 (en) 2010-04-06 2018-06-26 Ocean Spray Cranberries, Inc. Infusion methods and products

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6303125B1 (en) * 1996-12-19 2001-10-16 Ramot-University Authority For Applied Research And Industrial Development Ltd. Anti-microbial-adhesion fraction derived from vaccinium
WO2010078660A1 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Use of proanthocyanidins as an anti-apoptotic agent and anti-adhesive bacterial agent

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HOWELL,A B ET AL: ""A-type cranberry proanthocyanidins and uropathogenic bacterial anti-adhesion activity"", 《PHYTOCHEMISTRY》 *
刁骧: "蔓越莓预防尿路感染", 《中国循证医学杂志》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108367030A (zh) * 2015-10-28 2018-08-03 麦太宝根有限公司 普氏粪杆菌和惰性脱硫弧菌用于治疗或预防糖尿病和肠病
CN109187940A (zh) * 2018-07-27 2019-01-11 南京谱利健生物技术有限公司 用于多糖分析的一种同位素标签试剂的制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013266351B2 (en) 2018-03-01
EP2854827A1 (en) 2015-04-08
CN104507485B (zh) 2018-10-09
EP2854827A4 (en) 2015-11-18
US20130316025A1 (en) 2013-11-28
AU2013266351A1 (en) 2015-01-29
EP2854827B1 (en) 2019-05-08
CL2014003194A1 (es) 2015-07-10
US9314494B2 (en) 2016-04-19
WO2013177275A1 (en) 2013-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104507485B (zh) 蔓越莓木葡聚糖低聚糖组合物
Vidanarachchi et al. Phytobiotics: alternatives to antibiotic growth promoters in monogastric animal feeds
CN107427528A (zh) 聚糖治疗剂和其相关方法
TWI488636B (zh) 藥用植物霍山石斛〈dendrobium huoshanense〉多醣體及寡聚物之結構及生物活性
JP2015533166A (ja) 糖尿病性腎症および関連障害の処置のためのガラクトース分枝炭水化物化合物
CN101282732A (zh) 含有岩藻多糖或岩藻多糖水解产物和免疫赋活材料的组合物
WO2009152089A2 (en) Prebiotic composition and methods of making and using the same
US20220160012A1 (en) Method for producing a polysaccharide
CZ70896A3 (en) Pharmaceutical preparation and the use of galacturonides for preparing thereof
Sivignon et al. Heteropolysaccharides from S. cerevisiae show anti-adhesive properties against E. coli associated with Crohn's disease
Lei et al. Structural characterization and in vitro analysis of the prebiotic activity of oligosaccharides from lotus (Nelumbo nucifera Gaertn.) seeds
Liu et al. Extraction, purification and structural characterization of polysaccharides from Apocynum venetum L. roots with anti-inflammatory activity
Maity et al. Structural study of an immunoenhancing polysaccharide isolated from an edible hybrid mushroom of Pleurotus florida and Lentinula edodes
Mendonça-Previato et al. Investigations on polysaccharide components of cells of Herpetomonas samuelpessoai grown on various media
CN106749439B (zh) 岩藻聚糖硫酸酯低聚糖及其制备方法与应用
US9351515B2 (en) Nutritional composition and methods of making and using same
Sørum et al. Structural studies of the major polysaccharide in the cell wall of Renibacterium salmoninarum
JPH0245501A (ja) 竹節ニンジン多糖およびその用途
RU2795463C2 (ru) Полисахарид, обладающий иммуностимулирующей активностью в отношении врожденного иммунитета, и агент, стимулирующий врожденный иммунитет, или продукт питания и напиток, содержащий его
Fischer et al. The structure of the extracellular teichoic acids from the allergy-protective bacterium Lactococcus lactis G121
AVRĂMIA et al. Research on obtaining high β-glucans content from different sources of yeast by harnessing their biologically active potential
Zuo et al. Structure characterization of a highly branched galactan from the slug Vaginulus alte and its utilization by human gut microbiota
EP1341544B1 (de) Blockierung der anlagerung von keimen bei vögeln
JP2004352672A (ja) 新規な二糖類、それを含有する組成物及びその製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant