CN1938042B - 芳香族阳离子肽在制备用于减轻氧化性损伤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在有需要的哺乳动物、离体器官、或细胞中减少氧化性损伤的方法。该方法包括给予有效量的芳香族阳离子肽。该芳香族阳离子肽具有：(a)至少一个净正电荷；(b)最少三个氨基酸；(c)最多约二十个氨基酸；d)净正电荷的最小数目(pm)与氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；(e)芳香基的最小数目(a)与净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a或2a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1之外，pt也可以是1；以及(f)至少一个酪氨酸或色氨酸。

Description

芳香族阳离子肽在制备用于减轻氧化性损伤药物中的应用
本申请要求于2004年1月23日提交的美国临时申请第60/538,841号的优先权。将美国临时申请第60/538,841号的说明书的全部内容以引用方式结合于此作为参考。
本发明是在由国家药物滥用研究所提供的批准号为PO1DA08924的政府资助下完成的。在本发明中美国政府拥有一定的权利。
背景技术
线粒体作为ATP的主要生产者(经由氧化磷酸化)对于细胞存活是必需的。然而，线粒体呼吸链也是氧化性自由基的主要来源。例如，由于线粒体的电子载体(如泛醇)与氧形成超氧化物的反应，自由基生产可以发生。超氧化物通过歧化为过氧化氢起作用，其可以分解为羟基。另外，超氧化物与氧化氮起反应形成过氧化亚硝酸盐和其它活性氧化剂。
老化不仅与活性氧簇(reactive oxygen species)(ROS)的生产增加有关，而且与内源性抗氧化防御机制的降低有关。线粒体特别易受氧化应激损伤，原因是它们持续暴露于ROS。因此，线粒体衰退通常与老化有关。
自由基，包括ROS，以及活性氮簇(RNS)对生物分子(包括脂质、蛋白质、RNA和DNA)产生各种非特异性损伤。这些分子的这样的损伤涉及许多临床疾病，如动脉硬化症、先兆子痫、阿尔茨海默病、帕金森病以及关节炎。
抗氧化治疗可以潜在地延迟老化过程，并且在人类疾病和病症(例如上述的那些)的宿主中是有益的。然而，在体内将抗氧化性分子递送到线粒体的困难已经阻碍了特异性线粒体治疗的发展。例如，这些分子必须首先穿过质膜被吸收入细胞质，随后选择性地靶向线粒体。
目前没有可获得的特异性靶向线粒体的抗氧化化合物。内源性抗氧化剂、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶口服吸收很少、半衰期短、并且不能穿过血脑屏障。天然抗氧化剂(如，维生素E、辅酶Q、多酚)不是水溶性的并且容易在细胞膜内聚集，仅能缓慢穿过血脑屏障。
因此，需要具有可以穿过细胞膜的抗氧化性化合物的改进的减少氧化性损伤的方法。此外，特异性靶向线粒体的抗氧化性化合物将是有益的。
发明内容
这些和其它目的通过本发明得到满足，本发明提供了一种用于在有需要的哺乳动物中减轻氧化性损伤的方法。该方法包括给予哺乳动物有效量的芳香族阳离子肽。该芳香族阳离子肽具有以下特征：(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1之外，pt也可以是1；以及(f)至少一个酪氨酸或色氨酸。
在另一具体实施例中，本发明还提供了一种在哺乳动物的离体器官中减轻氧化性损伤的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的芳香族阳离子肽。该芳香族阳离子肽具有以下特征：(a)至少一个净正电荷；(b)最少4个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1之外，pt也可以是1；以及(f)至少一个酪氨酸或色氨酸。
在又一具体实施例中，本发明提供了一种在有需要的哺乳动物中减轻氧化性损伤的方法。该方法包括给予该哺乳动物有效量的芳香族阳离子肽。该芳香族阳离子肽具有以下特征：(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1之外，pt也可以是1；以及(f)至少一个酪氨酸或色氨酸。
在又一具体实施例中，本发明提供了一种在哺乳动物的离体器官中减轻氧化性损伤的方法。该方法包括给予该离体器官有效量的芳香族阳离子肽。该芳香族阳离子肽具有以下特征：(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1之外，pt也可以是1；以及(f)至少一个酪氨酸或色氨酸。
在又一具体实施例中，本发明提供了一种在有需要的细胞中减轻氧化性损伤的方法。该芳香族阳离子肽具有以下特征：(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1之外，pt也可以是1；以及(f)至少一个酪氨酸或色氨酸。
在又一具体实施例中，本发明提供了一种在有需要的细胞中减轻氧化性损伤的方法。该芳香族阳离子肽具有以下特征：(a)至少一个净正电荷；(b)最少3个氨基酸；(c)最多约20个氨基酸；(d)净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中3pm是小于或等于r+1的最大数；(e)芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数，除了当a是1之外，pt也可以是1；以及(f)至少一个酪氨酸或色氨酸。
附图说明
图1.(A)SS-02和(B)SS-05剂量依赖性地清除H2O2。
图2.(A)SS-02剂量依赖性地抑制由ABAP所致的亚油酸过氧化反应，以及(B)SS-02、SS-05、SS-29、SS-30、SS-31、SS-32以及Dmt降低了由ABAP所致的亚油酸过氧化反应的速率。
图3.(A)SS-02剂量依赖性地抑制由10mM CuSO4所致的LDL氧化，以及(B)SS-02、SS-05、SS-29、SS-30、SS-31、SS-32以及Dmt降低了LDL氧化的速率。
图4.(A)SS-02抑制在基础条件下以及在抗霉素的刺激下通过鲁米诺化学发光测量的线粒体产生的过氧化氢。(B)SS-02、SS-29、SS-30、和SS-31减少了由离体线粒体产生的过氧化氢的自然产生。
图5.(A)SS-31抑制通过离体线粒体的氢氢过氧化物的自然产生，以及(B)SS-31抑制由抗霉素刺激的过氧化氢产生。
图6.SS-31剂量依赖性地降低细胞内ROS(活性氧簇)(A)并提高暴露于高剂量的促氧化剂叔丁基氢过氧化物(t-BHP；0.5mM)的N2A细胞中的细胞存活(B)，(C)当N2A细胞暴露于1mM t-BHP时SS-02也剂量依赖性地增加细胞存活。
图7.SS-31剂量依赖性地防止由低剂量的t-BHP(0.05-0.1mM)在神经元(A)SH-SY5Y和(B)N2A细胞中导致的细胞存活能力的丧失。
图8.当在N2A细胞中用低剂量的t-BHP处理后，SS-31剂量依赖性地降低表现出增高的半胱天冬酶(caspase)活性的细胞的百分比。
图9.SS-31剂量依赖性地减少伴随0.1mM t-BHP超过4小时的N2A细胞中ROS聚集的速率。
图10.SS-31抑制由N2A细胞暴露于1mM t-BHP达1小时所致的脂质过氧化反应。(A)未处理的细胞；(B)用1mM t-BHP处理3小时的细胞；(C)用1mM t-BHP和10nM SS-31处理3小时的细胞。
图11.SS-31防止暴露于t-BHP的N2A细胞中的线粒体去极化和ROS聚集。
图12.SS-31防止由低剂量t-BHP所致的细胞凋亡。通过伴随荧光探针Hoechst 33342的共聚焦显微镜评估细胞凋亡。(A1)未用t-BHP处理的细胞的典型区域。(A2)荧光图像表明一些细胞具有密集的、片断状的染色体(表明凋亡细胞核)。(B1)用0.025mMt-BHP处理24小时的细胞的典型区域。(B2)荧光图像表明伴随凋亡细胞核的细胞的数量增加。(C1)用0.025mM t-BHP和1nM SS-31处理24小时的细胞的典型区域。(C2)荧光图像表明伴随凋亡细胞核的细胞的数量减少。(D)SS-31剂量依赖性地降低由低剂量t-BHP(0.05mM)处理24小时所致的凋亡细胞的百分数。
图13A.SS-02和SS-31减少了在短期缺血后经历暖再灌注的离体豚鼠心脏的脂质过氧化反应。对来自豚鼠心脏的石蜡切片中的4-羟基-2-壬烯醇(nonenol)(HNE)修饰的蛋白质进行免疫组织化学分析，该心脏被(a)缓冲液；(b)100nM SS-02；(c)100nM SS-20；以及(d)1nM SS-31有氧灌注30分钟，随后经历30分钟缺血，随后用相应肽再灌注90分钟。将组织薄片与抗HNE抗体孵育。(e)背景对照：没有初级抗体的染色。
图13B.SS-02和SS-31减少了在短期缺血后经历暖再灌注的离体豚鼠心脏的脂质过氧化反应。对来自豚鼠心脏的石蜡切片中的4-羟基壬烯醇(HNE)修饰的蛋白质进行免疫组织化学分析，该心脏被有氧灌注缓冲液30分钟；随后经历30分钟缺血，以及用(a)缓冲液；(b)100nM SS-02；(c)100nM SS-20；以及(d)1nM SS-31再灌注90分钟。将组织薄片与抗HNE抗体孵育。(e)背景对照：没有初级抗体的染色。
图14A.SS-31极大地提高了在延长的(18小时)冷缺血后经历暖再灌注的离体豚鼠心脏中的冠状动脉流量。阴影区代表在4℃缺血18小时。
图14B.豚鼠心脏灌注心脏停搏液(St.Thomas溶液)(没有(a)或存在(b)1nM SS-31)达3分钟，随后经历18小时冷缺血(4℃)，(c)用初级抗体进行的背景染色。随后心脏在34℃再灌注缓冲液90分钟。
图14C.SS-31防止了在延长的(18小时)冷缺血后经历暖再灌注的离体豚鼠心脏中内皮细胞和肌细胞的凋亡。豚鼠心脏灌注心脏停搏液(St.Thomas溶液)(没有或存在1nM SS-31)达3分钟，随后经历18小时冷缺血(4℃)。随后心脏在34℃再灌注缓冲液90分钟。通过TUNEL染色(绿色)评估凋亡，并且通过DAPI(蓝色)观察细胞核。
图15A.SS-31提高了通过线粒体电位测量的从小鼠胰腺中分离的岛细胞的存活。SS-31(1nM)被加入到整个分离过程中所用的全部分离缓冲液中。利用TMRM(红色)并通过共焦显微镜测量线粒体电位。
图15B.如通过流式细胞仪所测量的，SS-31减少了在从小鼠胰腺中分离的岛细胞中的凋亡并提高了存活能力。SS-31(1nM)被加入到整个分离过程中所用的全部分离缓冲液中。利用annexin V确定凋亡，并通过碘化丙啶(propidium iodide)(PI)确定坏死。
图16.SS-31减轻了由t-丁基氢过氧化物(t-butylhydroperoxide)(tBHP)所致的胰腺胰岛细胞中的氧化性损伤。小鼠胰腺岛细胞未处理(a)或用没有(b)或带有1nM SS-31(c)的25μM tBHP处理。通过TMRM(红色)测量线粒体电位，并利用共聚焦显微镜通过DCF(绿色)测量活性氧簇。
图17A.SS-31防止多巴胺细胞免受MPP+毒性。将SN-4741细胞用缓冲液、50μM MPP+或50μM MPP+和1nM SS-31处理48小时，通过荧光显微镜用Hoechst 33342的确定凋亡的发生率。通过MPP+处理，浓缩的片断状的细胞核的数量显著增加。同时用SS-31处理，减少了凋亡细胞的数量。
图17B.SS-31剂量依赖性地防止用MPTP处理的小鼠中多巴胺神经元的丧失。按2小时间隔给予小鼠(n＝12)三种剂量的MPTP(10mg/kg)。在每次MPTP注入前30分钟，以及在最后的MPTP注入后1小时和12小时施加SS-31。一周后杀死动物并免疫染色纹状体(striatal)脑区用于酪氨酸羟化酶活性(测定)(以黑色示出)。
图17C.SS-31剂量依赖性地增加用MPTP处理的小鼠中纹状体多巴胺、DOPAC(3，4-二羟基苯乙酸)、以及HVA(homovanillic acid，高香草酸)的水平。按2小时间隔给予小鼠(n＝12)三种剂量的MPTP(10mg/kg)。在每次MPTP注入前30分钟，以及在最后的MPTP注入后1小时和12小时施加SS-31。一周后杀死动物并通过高压液相色谱法定量多巴胺、DOPAC、以及HVA的水平。
具体实施方式
本发明是基于发明人的惊人发现：某些芳香族阳离子肽减轻了氧化性损伤。减轻氧化性损伤是很重要的，因为自由基，如ROS和RNS，对脂质、蛋白质、RNA和DNA产生各种非特异性损伤。由自由基导致的氧化性损伤与哺乳动物的多种疾病和病症相关。
肽
本发明中所用的芳香族阳离子肽是水溶性和高极性的。尽管有这些性质，但这些肽能够很容易穿过细胞膜。
本发明中所用的芳香族阳离子肽包括最少3个通过肽键共价连接的氨基酸，并且优选包括最少4个通过肽键共价连接的氨基酸。
本发明的芳香族阳离子肽中存在的氨基酸的最大数目为通过肽键共价连接的约20个氨基酸。优选的氨基酸的最大数目为约12个，更优选为约9个，最优选为约6个。最佳的状况是，存在于该肽中的氨基酸数目为4。
本发明中所用的芳香族阳离子肽中的氨基酸可以是任何氨基酸。术语“氨基酸”在本文中是指含有至少一个氨基和至少一个羧基的任何有机分子。优选地，至少一个氨基位于相对于羧基的α位。
这些氨基酸可以是天然存在的。天然存在的氨基酸包括，例如在哺乳动物蛋白质中通常存在的20种最常见的左旋(L)氨基酸，即丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ileu)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
其它天然存在的氨基酸包括例如在与蛋白质合成无关的代谢过程中合成的氨基酸。例如，在产生尿素的过程中哺乳动物代谢中合成的鸟氨酸和瓜氨酸这些氨基酸。
本发明中所用的肽可以含有一个或多个非天然存在的氨基酸。这些非天然存在的氨基酸可以是左旋(L)、右旋(D)或它们的混合物。最佳的状况是该肽不含有天然存在的氨基酸。
非天然存在的氨基酸是那些通常不是在生物体正常代谢过程中合成，并且不是在蛋白质中天然存在的氨基酸。另外，本发明中所用的非天然存在的氨基酸优选也不被普通的蛋白酶识别。
非天然存在的氨基酸可以出现在该肽的任何位置。例如，该非天然存在的氨基酸可以位于N-末端，C-末端或在N-末端和C-末端之间的任何位置。
例如，该非天然存在的氨基酸可以包括烷基、芳基或烷芳基这些基团。烷基氨基酸的一些实例包括：α-氨基丁酸、β-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、δ-氨基戊酸和ε-氨基己酸。芳基氨基酸的一些实例包括邻、间和对氨基苯甲酸。烷芳基氨基酸的一些实例包括邻、间和对氨基苯乙酸，和γ-苯基-β-氨基丁酸。
非天然存在的氨基酸也包括天然存在的氨基酸的衍生物。天然存在的氨基酸的衍生物可以包括如向天然存在的氨基酸上添加一个或多个化学基团(的加成物)。
例如，一个或多个化学基团可以被添加到苯丙氨酸或酪氨酸残基的芳香环的2’、3’、4’、5’或6’位中的一个或多个位置上，或色氨酸残基的苯并环的4’、5’、6’或7’位中的一个或多个位置上。该基团是可以添加到芳香环上的任何化学基团。这些基团的一些实例包括支链或无支链的C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基或叔丁基，C1-C4烃氧基(即烷氧基)，氨基，C1-C4烷氨基和C1-C4二烷氨基(例如甲氨基、二甲氨基)，硝基，羟基，卤素(即氟基、氯基、溴基或碘基)。天然存在的氨基酸的非天然存在的衍生物的一些特殊实例包括正缬氨酸(Nva)，正亮氨酸(Nle)和羟脯氨酸(Hyp)。
本发明的方法中在所用肽中的氨基酸修饰的另一个实例是该肽的天冬氨酸或谷氨酸残基的羧基衍生化。衍生化的一个实例是用氨或用如甲胺、乙胺、二甲胺或二乙胺这些伯胺或仲胺酰胺化。衍生化的另一个实例包括用如甲醇或乙醇酯化。
另外一种这样的修饰包括赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基的氨基衍生化。例如，这些氨基可以被酰化。一些合适的酰基包括，例如包括任何上述C1-C4烷基的苯甲酰基或烷酰基，如乙酰基或丙酰基。
优选的是非天然存在的氨基酸对普通蛋白酶是有抗性的，更优选的是对其不敏感。对蛋白酶有抗性或不敏感的非天然存在的氨基酸的实例包括任何上述天然存在的L-氨基酸的右旋(D-)型，以及L-和/或D-型非天然存在的氨基酸。D-氨基酸通常在蛋白质中不存在，尽管在一些抗菌肽中发现过它们，这些肽是通过不同于细胞正常的核糖体蛋白合成器的方式合成的。本文中所使用的这些D-氨基酸可以认为是非天然存在的氨基酸。
为了使对蛋白酶的敏感性降到最低，本发明的方法中所用的肽应该具有少于5个，优选少于4个，更优选少于3个，且最优选少于2个毗邻的可以被普通蛋白酶识别的L-氨基酸，无论这些氨基酸是天然存在的或是非天然存在的。最佳的情况是，该肽仅含有D-氨基酸，而不含有L-氨基酸。
如果该肽含有蛋白酶敏感的氨基酸序列，则至少这些氨基酸中的一个优选为非天然存在的D-氨基酸，从而提供蛋白酶抗性。蛋白酶敏感序列的实例包括容易被普通蛋白酶如肽链内切酶和胰蛋白酶切开的两个或多个毗邻的碱性氨基酸。碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。
在芳香族阳离子肽中存在的氨基酸中的至少一个为酪氨酸或色氨酸残基，或其衍生物，这是很重要的。
在生理pH下该芳香族阳离子肽具有相对于该肽中的氨基酸残基的总数的最小数目的净正电荷是很重要的。生理pH下净正电荷的最小数目下文中表示为(pm)。该肽中氨基酸残基的总数下文中表示为(r)。
下文讨论的净正电荷的最小数目都是在生理pH条件下。术语“生理pH”在本文中是指哺乳动物身体的组织和器官的细胞中的正常pH。例如人的生理pH通常约为7.4，但是哺乳动物中正常的生理pH可以是从约7.0到约7.8之间的任意pH。
“净电荷”本文中是指由存在于肽中的氨基酸所携带的正电荷数和负电荷数的差值。在本说明书中，应当理解为净电荷是在生理pH下测量的。在生理pH下具有正电荷的天然存在的氨基酸包括L-赖氨酸、L-精氨酸和L-组氨酸。在生理pH下具有负电荷的天然存在的氨基酸包括L-天冬氨酸和L-谷氨酸。
通常，肽具有正电荷的N-末端氨基和负电荷的C-末端羧基。在生理pH下电荷彼此抵消。作为计算净电荷的一个实例，肽：酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-组氨酸-色氨酸-精氨酸(Tyr-Arg-Phe-Lys-Glu-His-Trp-Arg)具有一个负电荷氨基酸(即，谷氨酸)和四个正电荷氨基酸(即，两个精氨酸残基，一个赖氨酸和一个组胺酸)。因此上述肽含有3个净正电荷。
在本发明的一个实施例中，该芳香族阳离子肽在生理pH下净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基总数(r)之间的关系为：其中3Pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系如下：
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
(p<sub>m</sub>) 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一实施例中，该芳香族阳离子肽在净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系为：其中2pm是小于或等于r+1的最大数。在该实施例中，净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)之间的关系如下：
(r) 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
  (p<sub>m</sub>)   2   2   3   3   4   4   5   5   6   6   7   7   8   8   9   9   10   10
在一个实施例中，净正电荷的最小数目(pm)和氨基酸残基的总数(r)相等。在另一实施例中，该肽含有3或4个氨基酸残基并且具有最少一个净正电荷，优选为最少2个净正电荷以及更优选为最少3个净正电荷。
该芳香族阳离子肽具有相对于净正电荷总数(pt)的最少量的芳香基团也很重要。芳香基的最小数目在下文中表示为(a)。
具有芳香基的天然存在的氨基酸包括组氨酸、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这些氨基酸。例如，六肽：赖氨酸-谷胺酰胺-酪氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-色氨酸含有2个净正电荷(由赖氨酸和精氨酸残基提供)和3个芳香基(由酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基提供)。
在本发明的一个实施例中，本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽的芳香基的最小数目(a)和在生理pH下的净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中3a是小于或等于pt+1的最大数，除了当pt是1之外，a也可以是1。在该实施例中，芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系如下：
  (p<sub>t</sub>)  1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   16   17   18   19   20
(a) 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 4 5 5 5 6 6 6 7
在另一个实施例中，该芳香族阳离子肽的芳香基的最小数目(a)和净正电荷的总数(pt)之间的关系为：其中2a是小于或等于pt+1的最大数。在该实施例中，芳香族氨基酸残基的最小数目(a)和净正电荷总数(pt)之间的关系如下：
(p<sub>t</sub>) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
  (a)   1   1   2   2   3   3   4   4   5   5   6   6   7   7   8   8   9   9   10   10
在另一个实施例中，芳香基数目(a)和净正电荷总数(pt)是相等的。
羧基，尤其是C-末端氨基酸的末端羧基，优选用例如氨进行酰胺化形成C-末端酰胺。另一种可选的方案是，C-末端氨基酸的末端羧基可以用任何伯胺或仲胺酰胺化。该伯胺或仲胺可以是，例如烷基，尤其是支链或直链C1-C4烷基、或芳基胺。因此，该肽C-末端的氨基酸可以转化成酰胺基、N-甲基酰胺基、N-乙基酰胺基、N，N-二甲基酰胺基、N，N-二乙基酰胺基、N-甲基-N-乙基酰胺基、N-苯基酰胺基或N-苯基-N-乙基酰胺基。
即使天冬酰胺残基、谷氨酰胺残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基的自由羧基基团不位于本发明的芳香族阳离子肽的C-末端，不论它们位于该肽的任何位置都可以被酰胺化。这些内部位置的酰胺化可以用氨或任何上述的伯胺或仲胺进行。
在一个实施例中，本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽是一种具有两个净正电荷和至少一个芳香族氨基酸的三肽。在一个具体的实施例中，本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽是一种具有两个净正电荷和两个芳香族氨基酸的三肽。
本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽包括但不限于下述肽的实例：
赖氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Lys-D-Arg-Tyr-NH2)，
右旋酪氨酸-色氨酸-赖氨酸-NH2(D-Tyr-Trp-Lys-NH2)，
色氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Trp-D-Lys-Tyr-Arg-NH2)，
酪氨酸-组氨酸-右旋甘氨酸-蛋氨酸(Tyr-His-D-Gly-Met)，
酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-Glu-NH2)，
蛋氨酸-酪氨酸-右旋赖氨酸-苯丙氨酸-精氨酸(Met-Tyr-D-Lys-Phe-Arg)，
右旋组氨酸-谷氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-精氨酸(D-His-Glu-Lys-Tyr-D-Phe-Arg)，
赖氨酸-右旋谷氨酰胺-酪氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-色氨酸-NH2(Lys-D-Gln-Tyr-Arg-D-Phe-Trp-NH2)，
苯丙氨酸-右旋精氨酸-赖氨酸-色氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-组氨酸(Phe-D-Arg-Lys-Trp-Tyr-D-Arg-His)，
甘氨酸-右旋苯丙氨酸-赖氨酸-酪氨酸-组氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-NH2(Gly-D-Phe-Lys-Tyr-His-D-Arg-Tyr-NH2)，
缬氨酸-右旋赖氨酸-组氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-丝氨酸-酪氨酸-精氨酸-NH2(Val-D-Lys-His-Tyr-D-Phe-Ser-Tyr-Arg-NH2)，
色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸(Trp-Lys-Phe-D-Asp-Arg-Tyr-D-His-Lys)，
赖氨酸-色氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-NH2(Lys-Trp-D-Tyr-Arg-Asn-Phe-Tyr-D-His-NH2)，
苏氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-赖氨酸(Thr-Gly-Tyr-Arg-D-His-Phe-Trp-D-His-Lys)，
天冬氨酸-右旋色氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-赖氨酸-NH2(Asp-D-Trp-Lys-Tyr-D-His-Phe-Arg-D-Gly-Lys-NH2)，
右旋组氨酸-赖氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-谷氨酸-右旋天冬氨酸-右旋组氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-色氨酸-NH2(D-His-Lys-Tyr-D-Phe-Glu-D-Asp-D-His-D-Lys-Arg-Trp-NH2)，
丙氨酸-右旋苯丙氨酸-右旋精氨酸-酪氨酸-赖氨酸-右旋色氨酸-组氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸(Ala-D-Phe-D-Arg-Tyr-Lys-D-Trp-His-D-Tyr-Gly-Phe)，
酪氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸(Tyr-D-His-Phe-D-Arg-Asp-Lys-D-Arg-His-Trp-D-His-Phe)，
苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-NH2(Phe-Phe-D-Tyr-Arg-Glu-Asp-D-Lys-Arg-D-Arg-His-Phe-NH2)，
苯丙氨酸-酪氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-组氨酸-右旋赖氨酸-右旋赖氨酸-谷氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-苏氨酸(Phe-Tyr-Lys-D-Arg-Trp-His-D-Lys-D-Lys-Glu-Arg-D-Tyr-Thr)，
酪氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸-右旋酪氨酸-组氨酸-赖氨酸(Tyr-Asp-D-Lys-Tyr-Phe-D-Lys-D-Arg-Phe-Pro-D-Tyr-His-Lys)，
谷氨酸-精氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-右旋缬氨酸-苯丙氨酸-右旋组氨酸-色氨酸-精氨酸-右旋甘氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋蛋氨酸-NH2(Glu-Arg-D-Lys-Tyr-D-Val-Phe-D-His-Trp-Arg-D-Gly-Tyr-Arg-D-Met-NH2)，
精氨酸-右旋亮氨酸-右旋酪氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-右旋赖氨酸-精氨酸-右旋色氨酸-赖氨酸-右旋苯丙氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-甘氨酸(Arg-D-Leu-D-Tyr-Phe-Lys-Glu-D-Lys-Arg-D-Trp-Lys-D-Phe-Tyr-D-Arg-Gly)，
右旋谷氨酸-精氨酸-赖氨酸-右旋精氨酸-右旋组氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-右旋缬氨酸-酪氨酸-精氨酸-酪氨酸-右旋酪氨酸-精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Glu-Asp-Lys-D-Arg-D-His-Phe-Phe-D-Val-Tyr-Arg-Tyr-D-Tyr-Arg-His-Phe-NH2)，
天冬氨酸-精氨酸-右旋苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-右旋精氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋酪氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-酪氨酸-右旋苯丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸(Asp-Arg-D-Phe-Cys-Phe-D-Arg-D-Lys-Tyr-Arg-D-Tyr-Trp-D-His-Tyr-D-Phe-Lys-Phe)，
组氨酸-酪氨酸-右旋精氨酸-色氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋天冬氨酸-丙氨酸-精氨酸-半胱氨酸-右旋酪氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-酪氨酸-组氨酸-丝氨酸-NH2(His-Tyr-D-Arg-Trp-Lys-Phe-D-Asp-Ala-Arg-Cys-D-Tyr-His-Phe-D-Lys-Tyr-His-Ser-NH2)，
甘氨酸-丙氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-右旋赖氨酸-谷氨酸-精氨酸-酪氨酸-组氨酸-右旋精氨酸-右旋精氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-色氨酸-右旋组氨酸-色氨酸-组氨酸-右旋赖氨酸-天冬氨酸(Gly-Ala-Lys-Phe-D-Lys-Glu-Arg-Tyr-His-D-Arg-D-Arg-Asp-Tyr-Trp-D-His-Trp-His-D-Lys-Asp)，以及
苏氨酸-酪氨酸-精氨酸-右旋赖氨酸-色氨酸-酪氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-右旋赖氨酸-右旋精氨酸-组氨酸-苯丙氨酸-右旋酪氨酸-甘氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-右旋组氨酸-精氨酸-酪氨酸-赖氨酸-NH2(Thr-Tyr-Arg-D-Lys-Trp-Tyr-Glu-Asp-D-Lys-D-Arg-His-Phe-D-Tyr-Gly-Val-Ile-D-His-Arg-Tyr-Lys-NH2)。
在一个实施例中，本发明的方法中所用的肽具有μ-阿片样物质受体激动剂活性(即，激活μ-阿片样物质受体)。μ-阿片样物质受体的激活通常具有止痛作用。
在一些情况下，优选的是具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽。例如，在如急性疾病或病症这样的短期治疗过程中，使用可激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽是有益的。例如，这些急性疾病和病症可以与中度或重度疼痛相关。在这些情况下，该芳香族阳离子肽的止痛作用在对病人或其它哺乳动物的治疗方案中可能是有益的，尽管不能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽也可以根据临床需要与或不与止痛剂结合使用。
可选地，在其它情况下，不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽是优选的。例如，在如慢性疾病状态或病症这样的长期治疗过程中，使用能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽可能是不合适的。在这些情况下，该芳香族阳离子肽潜在的副作用或成瘾作用可能会妨碍具有μ-阿片样物质受体激活作用的芳香族阳离子肽在对病人或其它哺乳动物的治疗方案中的应用。
潜在的副作用可以包括镇静、便秘和神经系统抑制和呼吸抑制。在这些情况下，不能激活μ-阿片样物质受体的芳香族阳离子肽可能是合适的治疗药物。
急性病症的实例包括：心脏病发作、中风(脑卒中)和外伤。外伤可以包括脑外伤和脊髓外伤。
慢性疾病或病症的实例包括：如下所述的冠心病和任何神经退行性疾病。
本发明的方法中所用的具有μ-阿片样物质受体活性的肽通常是在N-末端(即，第一个氨基酸位置)含有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物的那些肽。优选的酪氨酸衍生物包括：2’-甲基酪氨酸(Mmt)；2’，6’-二甲基酪氨酸(2’6’Dmt)；3’，5’-二甲基酪氨酸(3’5’Dmt)；N，2’，6’-三甲基酪氨酸(Tmt)；以及2’-羟基-6’-甲基酪氨酸(Hmt)。
在一特别优选的实施例中，具有μ-阿片样物质受体活性的肽具有的分子式为：酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(为了方便以首字母缩写表示为：DALDA，在本文中称作SS-01)。DALDA具有由酪氨酸、精氨酸和赖氨酸这些氨基酸提供的3个净正电荷，以及由苯丙氨酸和酪氨酸提供的2个芳香基团。DALDA的酪氨酸可以是被修饰的酪氨酸衍生物如2’，6’-二甲基酪氨酸，从而生成具有分子式为2’，6’-二甲基酪氨酸-右旋精氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-NH2(2’，6’-Dmt-D-Arg-Phe-Lys-NH2)(即，Dmt1-DALDA，在本文中称作SS-02)的化合物。
不具有μ-阿片样物质受体活性的肽通常在N-末端(即，氨基酸的位置1)不含有酪氨酸残基或酪氨酸衍生物。在N-末端的氨基酸可以是除酪氨酸以外的任意天然存在的或非天然存在的氨基酸。
在一个实施例中，N-末端氨基酸是苯丙氨酸或其衍生物。优选的苯丙氨酸衍生物包括：2’-甲基苯丙氨酸(Mmp)、2’，6’-二甲基苯丙氨酸(Dmp)、N，2’，6’-三甲基苯丙氨酸(Tmp)和2’-羟基-6’-甲基苯丙氨酸(Hmp)。在另一优选的实施例中，N-末端的氨基酸残基为精氨酸。这样的肽的一实例为：D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2(在本说明书中称作SS-31)。
另一种不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽的分子式为：苯丙氨酸-右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-NH2(Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2)。可选地，该N-末端苯丙氨酸可以是苯丙氨酸的衍生物如2’，6’-二甲基苯丙氨酸(2’6’Dmp)。在氨基酸位置1含有2’，6’-二甲基苯丙氨酸的DALDA的分子式为2’，6’-Dmp-右旋精氨酸-Dmt-赖氨酸-NH2(2’，6’-Dmp-D-Arg-Dmt-Lys-NH2)。
在一优选实施例中，Dmt1-DALDA(SS-02)的氨基酸序列是重新排列的，使得Dmt不位于N-末端。这样的不具有μ-阿片样物质受体活性的芳香族阳离子肽的实例具有的分子式为：右旋精氨酸-2’6’Dmt-赖氨酸-苯丙氨酸-NH2(D-Arg-2’6’Dmt-Lys-Phe-NH2)(SS-31)。
DALDA、SS-31、和它们的衍生物可以进一步包括功能类似物。如果该类似物具有与DALDA或SS-31类似的功能，则该肽被认为是DALDA或SS-31的功能类似物。例如，该类似物可以是DALDA或SS-31的取代变体，其中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代。
DALDA或SS-31适宜的取代变体包括保守的氨基酸取代。氨基酸按照它们的物理化学性质可以分组如下：
(a)非极性氨基酸：丙氨酸(A)丝氨酸(S)苏氨酸(T)脯氨酸(P)甘氨酸(G)(Ala(A)Ser(S)Thr(T)Pro(P)Gly(G))；
(b)酸性氨基酸：天冬酰胺(N)天冬氨酸(D)谷氨酸(E)谷胺酰胺(Q)(Asn(N)Asp(D)Glu(E)Gln(Q))；
(c)碱性氨基酸：组氨酸(H)精氨酸(R)赖氨酸(K)(His(H)Arg(R)Lys(K))；
(d)疏水性氨基酸：甲硫氨酸(M)亮氨酸(L)异亮氨酸(I)缬氨酸(V)(Met(M)Leu(L)Ile(I)Val(V))；以及
(e)芳香族氨基酸：苯丙氨酸(F)酪氨酸(T)色氨酸(W)组氨酸(H)(Phe(F)Tyr(Y)Trp(W)His(H))。
肽中的氨基酸被同组的另外的氨基酸取代称作保守取代，并且可以保留原始肽的理化性质。相反，肽中的氨基酸被不同组的另外的氨基酸取代通常更有可能改变原始肽的性质。
在本发明的实施中所用的能激活μ-阿片样物质受体的类似物的实例包括但不限于表1中所示的芳香族阳离子肽。
1表1
氨基酸       氨基酸       氨基酸    氨基酸   氨基酸               C-末端
位置1        位置2        位置3     位置4    位置5(如果存在的话)  修饰
酪氨酸       右旋精氨酸   苯丙氨酸  赖氨酸                        NH2
酪氨酸       右旋精氨酸   苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)                   NH2
酪氨酸       右旋精氨酸   苯丙氨酸  Dab                           NH2
酪氨酸       右旋精氨酸   苯丙氨酸  Dap                           NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  赖氨酸                        NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  赖氨酸   半胱氨酸             NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  赖氨酸-NH(CH2)2-NH-dns        NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  赖氨酸-NH(CH2)2-NH-atn        NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  dns赖氨酸                     NH2
2’6’Dmt    右旋胞磷胆碱 苯丙氨酸  赖氨酸                        NH2
             (D-Cit)
2’6’Dmt    右旋胞磷胆碱 苯丙氨酸  Ahp                           NH2
             (D-Cit)
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)                   NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  Dab                           NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  Dap                           NH2
2’6’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  Ahp(2-氨基庚酸)               NH2
Bio-2’6’Dmt右旋精氨酸   苯丙氨酸  赖氨酸                        NH2
3’5’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  赖氨酸                        NH2
3’5’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)                   NH2
3’5’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  Dab                           NH2
3’5’Dmt    右旋精氨酸   苯丙氨酸  Dap                           NH2
酪氨酸       右旋精氨酸   酪氨酸    赖氨酸                        NH2
酪氨酸       右旋精氨酸   酪氨酸    鸟氨碱(Orn)                   NH2
酪氨酸     右旋精氨酸  酪氨酸       Dab                NH2
酪氨酸     右旋精氨酸  酪氨酸       Dap                NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  酪氨酸       赖氨酸             NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  酪氨酸       鸟氨碱(Orn)        NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  酪氨酸       Dab                NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  酪氨酸       Dap                NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  2’6’Dmt    赖氨酸             NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  2’6’Dmt    鸟氨碱(Orn)        NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  2’6’Dmt    Dab                NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  2’6’Dmt    Dap                NH2
3’5’Dmt  右旋精氨酸  3’5’Dmt    精氨酸             NH2
3’5’Dmt  右旋精氨酸  3’5’Dmt    赖氨酸             NH2
3’5’Dmt  右旋精氨酸  3’5’Dmt    鸟氨碱(Orn)        NH2
3’5’Dmt  右旋精氨酸  3’5’Dmt    Dab                NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  苯丙氨酸     Dap                NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  苯丙氨酸     精氨酸             NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  苯丙氨酸     赖氨酸             NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  苯丙氨酸     鸟氨碱(Orn)        NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     Dab                NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     Dap                NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     精氨酸             NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     赖氨酸             NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     鸟氨碱(Orn)        NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     Dab                NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     Dap                NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸     精氨酸             NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  酪氨酸       赖氨酸             NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  酪氨酸       鸟氨碱(Orn)        NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  酪氨酸       Dab                NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  酪氨酸       Dap                NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  酪氨酸       赖氨酸             NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  酪氨酸       鸟氨碱(Orn)        NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  酪氨酸       Dab                NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  酪氨酸       Dap                NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  2’6’Dmt    赖氨酸             NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  2’6’Dmt  鸟氨碱(Orn)       NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  2’6’Dmt  Dab               NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  2’6’Dmt  Dap               NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  苯丙氨酸   dnsDap            NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  苯丙氨酸   atnDap            NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  3’5’Dmt  赖氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  3’5’Dmt  鸟氨碱(Orn)       NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  3’5’Dmt  Dab               NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  3’5’Dmt  Dap               NH2
酪氨酸     右旋赖氨酸  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
酪氨酸     右旋鸟氨碱  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
           (Orn)
酪氨酸     右旋Dab     笨丙氨酸   精氨酸            NH2
酪氨酸     右旋Dap     苯丙氨酸   精氨酸            NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
2’6’Dmt  右旋鸟氨碱  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
           (D-Orn)
2’6’Dmt  右旋Dab     苯丙氨酸   精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋Dap     苯丙氨酸   精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋精氨酸  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋鸟氨碱  苯丙氨酸   精氨酸            NH2
           (D-Orn)
酪氨酸     右旋赖氨酸  酪氨酸     精氨酸            NH2
酪氨酸     右旋鸟氨碱  酪氨酸     精氨酸            NH2
           (D-Orn)
酪氨酸     右旋Dab     酪氨酸     精氨酸            NH2
酪氨酸     右旋Dap     酪氨酸     精氨酸            NH2
2’6’Dmt  右旋精氨酸  2’6’Dmt  精氨酸            NH2
2’6’Dmt  右旋赖氨酸  2’6’Dmt  精氨酸            NH2
2’6’Dmt  右旋鸟氨碱  2’6’Dmt  精氨酸            NH2
           (D-Orn)
2’6’Dmt  右旋Dab     2’6’Dmt  精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋Dap     3’5’Dmt  精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋精氨酸  3’5’Dmt  精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋赖氨酸  3’5’Dmt  精氨酸            NH2
3’5’Dmt  右旋鸟氨碱  3’5’Dmt 精氨酸            NH2
           (D-Orn)
Mmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  赖氨酸            NH2
Mmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)       NH2
Mmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  Dab               NH2
Mmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  Dap               NH2
Tmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  赖氨酸            NH2
Tmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)       NH2
Tmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  Dab               NH2
Tmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  Dap               NH2
Hmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  赖氨酸            NH2
Hmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)       NH2
Hmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  Dab               NH2
Hmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  Dap               NH2
Mmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  赖氨酸            NH2
Mmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)       NH2
Mmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  Dab               NH2
Mmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  Dap               NH2
Mmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Tmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  赖氨酸            NH2
Tmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)       NH2
Tmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  Dab               NH2
Tmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  Dap               NH2
Tmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Hmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  赖氨酸            NH2
Hmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  鸟氨碱(Orn)       NH2
Hmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  Dab               NH2
Hmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  Dap               NH2
Hmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Mmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Mmt        右旋鸟氨碱  苯丙氨酸  精氨酸            NH2
           (D-Orn)
Mmt        右旋Dab     苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Mmt        右旋Dap     苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Mmt        右旋精氨酸  苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Tmt        右旋赖氨酸  苯丙氨酸  精氨酸            NH2
Tmt    右旋鸟氨碱  苯丙氨酸  精氨酸                NH2
       (D-Orn)
Tmt    右旋Dab     苯丙氨酸  精氨酸                NH2
Tmt    右旋Dap     苯丙氨酸  精氨酸                NH2
Tmt    右旋精氨酸  苯丙氨酸  精氨酸                NH2
Hmt    右旋赖氨酸  苯丙氨酸  精氨酸                NH2
Hmt    右旋鸟氨碱  苯丙氨酸  精氨酸                NH2
       (D-Orn)
Hmt    右旋Dab     苯丙氨酸  精氨酸                NH2
Hmt    右旋Dap     苯丙氨酸  精氨酸                NH2
Hmt    右旋精氨酸  苯丙氨酸  精氨酸                NH2
Dab＝二氨基丁酸
Dap＝二氨基丙酸
Dmt＝二甲基酪氨酸
Mmt＝2’-甲基酪氨酸
Tmt＝N，2’，6’-三甲基酪氨酸
Hmt＝2’-羟基，6’-甲基酪氨酸
dnsDap＝β-丹磺酰基-L-α，β-二氨基丙酸
atnDap＝β-邻氨基苯甲酰基-L-α，β-二氨基丙酸
Bio＝生物素。
在本发明的实施中所用的不能激活μ-阿片样物质受体的类似物的实例包括但不限于表2所示的芳香族阳离子肽。
表2
氨基酸      氨基酸    氨基酸    氨基酸    C-末端
位置1       位置2     位置3     位置4     修饰
右旋精氨酸  Dmt       赖氨酸    苯丙氨酸  NH2
右旋精氨酸  Dmt       苯丙氨酸  赖氨酸    NH2
右旋精氨酸  苯丙氨酸  赖氨酸    Dmt       NH2
右旋精氨酸  苯丙氨酸    Dmt         赖氨酸          NH2
右旋精氨酸  赖氨酸      Dmt         苯丙氨酸        NH2
右旋精氨酸  赖氨酸      苯丙氨酸    Dmt             NH2
苯丙氨酸    赖氨酸      Dmt         右旋精氨酸      NH2
苯丙氨酸    赖氨酸      右旋精氨酸  Dmt             NH2
苯丙氨酸右  旋精氨酸    Dmt         赖氨酸          NH2
苯丙氨酸右  旋精氨酸    赖氨酸      Dmt             NH2
苯丙氨酸    Dmt         右旋精氨酸  赖氨酸          NH2
苯丙氨酸    Dmt         赖氨酸      右旋精氨酸      NH2
赖氨酸      苯丙氨酸    右旋精氨酸  Dmt             NH2
赖氨酸      苯丙氨酸    Dmt         右旋精氨酸      NH2
赖氨酸      Dmt         右旋精氨酸  苯丙氨酸        NH2
赖氨酸      Dmt         苯丙氨酸    右旋精氨酸      NH2
赖氨酸      右旋精氨酸  苯丙氨酸    Dmt             NH2
赖氨酸      右旋精氨酸  Dmt         苯丙氨酸        NH2
右旋精氨酸  Dmt         右旋精氨酸  苯丙氨酸        NH2
右旋精氨酸  Dmt         右旋精氨酸  Dmt             NH2
右旋精氨酸  Dmt         右旋精氨酸  酪氨酸          NH2
右旋精氨酸  Dmt         右旋精氨酸  色氨酸          NH2
色氨酸      右旋精氨酸  苯丙氨酸    赖氨酸          NH2
色氨酸      右旋精氨酸  酪氨酸      赖氨酸          NH2
色氨酸      右旋精氨酸  色氨酸      赖氨酸          NH2
色氨酸      右旋精氨酸  Dmt         赖氨酸          NH2
右旋精氨酸  色氨酸      赖氨酸      苯丙氨酸        NH2
右旋精氨酸  色氨酸      苯丙氨酸    赖氨酸          NH2
右旋精氨酸  色氨酸      赖氨酸      Dmt             NH2
右旋精氨酸  色氨酸      Dmt         赖氨酸          NH2
右旋精氨酸  赖氨酸      色氨酸      苯丙氨酸        NH2
右旋精氨酸  赖氨酸      色氨酸      Dmt             NH2
表1和表2中所示的肽中的氨基酸既可以是L-构象也可以是D-构象。
减轻氧化性损伤的方法
上文所述的肽可用于在有需要的哺乳动物中减轻氧化性损伤。需要减轻氧化性损伤的哺乳动物是患有与氧化性损伤相关的疾病、病症或经受与氧化性损伤相关的处理的那些哺乳动物。通常，氧化性损伤由自由基引起，如活性氧簇(ROS)和/或活性氮簇(RNS)。ROS和RNS的实例包括：羟基(HO·)、超氧阴离子基团(O2·-)、氧化氮(NO·)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HOCl)和过氧化亚石肖基阴离子(ONOO-)。
在一个实施例中，有需要的哺乳动物可以是经历与氧化性损伤相关的处理的哺乳动物。例如，该哺乳动物可以经历再灌注。再灌注是向减少或阻断血流的任意器官或组织中恢复血流。再灌注期间血流的恢复导致呼吸爆发和自由基形成。
减少或阻断的血流可能是由于缺氧或缺血。在缺氧或缺血期间的血流供应的损失或严重减少可以，例如，由于血栓栓塞性脑卒中、冠状动脉硬化、或外周血管疾病引起。
许多器官和组织经历缺血或缺氧。这样的器官的实例包括：脑、心脏、肾、肠和前列腺。受影响的组织通常为肌肉，如心肌、骨骼肌、或平滑肌。例如，心肌缺血或缺氧通常是由动脉粥样硬化性或血栓形成性阻塞引起的，它们导致通过心脏动脉和毛细血管血液供应输送到心肌组织的氧减少或丧失。这样的心肌缺血或缺氧可以导致受影响的心肌疼痛和坏死，并且最终可以导致心力衰竭。
骨骼肌或平滑肌中的缺血或缺氧可以由类似的原因引起。例如，在肠平滑肌或四肢骨骼肌中的缺血或缺氧也可以由动脉粥样硬化性或血栓形成性阻塞引起。
血流的恢复(再灌注)可以通过本领域技术人员已知的任意方法来实现。例如，局部缺血的心脏组织的再灌注可以通过血管成形术(血管重建术)、冠状动脉旁路移植或使用溶栓药物来实现。减轻与缺血/缺氧和再灌注相关的氧化性损伤很重要，因为与缺血/缺氧和再灌注相关的组织损伤与(例如)心肌梗塞、脑卒中(中风)和失血性休克有关。
在另一实施例中，有需要的哺乳动物可以是患有与氧化性损伤相关的疾病或病症的哺乳动物。氧化性损伤可以发生在哺乳动物的任何细胞、组织或器官中。细胞、组织或器官的实例包括，但不限于内皮细胞、上皮细胞、神经系统细胞、皮肤、心脏、肺、肾、以及肝。例如，脂质过氧化反应和炎性过程与疾病或病症的氧化性损伤相关。
脂质过氧化反应指的是脂质的氧化修饰。脂质可以存在于细胞的膜中。膜脂质的修饰通常导致细胞的膜功能的改变和/或损伤。此外，脂质过氧化反应还可以发生在细胞外面的脂质或脂蛋白中。例如，低密度脂蛋白对脂质过氧化反应敏感。与脂质过氧化反应相关的病症的实例是动脉粥样硬化。减轻与动脉粥样硬化相关的氧化性损伤很重要，因为动脉粥样硬化涉及，例如，心脏病发作和冠心病。
炎性过程涉及免疫系统的激活。通常，免疫系统被抗原物质激活。抗原物质可以是任何能被免疫系统识别的物质，包括自源性粒子和外源性粒子。产生自针对自源性粒子的炎性过程的疾病或病症的实例包括关节炎和多发性硬化。外来粒子的实例包括病毒和细菌。
该病毒可以是可以激活炎性过程并且与氧化性损伤相关的任何病毒。病毒的实例包括：甲型、乙型或丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、以及牛腹泻病毒。例如，肝炎病毒可以引发炎性过程和自由基形成，由此损伤肝。
该细菌可以是任何细菌，包括革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。革兰氏阴性细菌在细菌壁内包含脂多糖。革兰氏阴性细菌的实例包括埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、变形杆菌属(Proteus species)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙雷氏菌属(Serratia)、拟杆菌属(Bacteroides)。革兰氏阳性细菌的实例包括肺炎双球菌和链球菌属。
由细菌引起的与氧化压力相关的炎性过程的实例是败血症。通常，当革兰氏阴性细菌进入血流时发生败血症。
由毒剂引起的肝脏损伤是另一种与炎性过程和氧化压力有关的病症。该毒剂可以是任何导致肝脏损伤的试剂。例如，该毒剂可以引起肝脏细胞的凋亡和/或坏死。这样的试剂的实例包括：醇、和药物，如用于治疗疾病或病症的处方药和非处方药。
本发明的方法还可以用于减轻与任何神经退行性疾病或病症相关的氧化性损伤。神经退行性疾病可以影响中枢和外周神经系统的任何细胞、组织或器官。这样的细胞、组织和器官的实例包括：脑、脊髓、神经元、神经中枢、施万细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞以及小胶质细胞。
神经退行性疾病可以是急性疾病，如，如脑卒中或脑外伤或脊髓损伤。在另一实施例中，神经退行性疾病或病症可以是慢性神经退行性疾病。在慢性神经退行性疾病中，自由基可以，例如，引起蛋白质损伤。这样的蛋白质的实例是淀粉样β蛋白。与自由基引起的损伤相关的慢性神经退行性疾病的实例包括帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏舞蹈病和肌萎缩性侧索硬化病(ALS，也称作洛盖赫里格病)。
可以根据本发明治疗的其它疾病包括：先兆子痫、糖尿病、与老化相关的症状和疾病，如黄斑变性、皱纹。
在另一实施例中，本发明中所用的肽还可以用于减轻移植前哺乳动物器官中的氧化性损伤。例如，离体器官，在移植后经历再灌注时可能对氧化性损伤敏感。因此，所述肽可以用于减轻由移植器官的再灌注带来的氧化性损伤。
离体器官可以是任何适合移植的器官。这样的器官的实例包括：心、肝、肾、肺、以及胰岛。离体器官被置于合适的培养基中，如本领域中常用的标准缓冲液。
例如，离体心脏可以被置于含有上述肽的心脏停搏液中。本领域的技术人员可以容易地确定标准缓冲液中的肽的浓度。这样的浓度可以为，例如，在约0.01nM到约10μM之间，优选为约0.1nM到约10μM，更优选为约1μM到约5μM，甚至更优选为约1nM到约100nM。
在又一实施例中，本发明提供了一种用于减轻有需要的细胞中的氧化性损伤的方法。需要减轻氧化性损伤的细胞通常是其中该细胞的细胞膜或DNA已经被自由基(如ROS和/或RNS)损伤的那些细胞。能够经历氧化性损伤的细胞的实例包括本文所述的细胞。合适的细胞的实例包括：胰岛细胞、肌细胞、内皮细胞、神经元细胞、干细胞等。
该细胞可以为组织培养细胞。可选地，该细胞可以从哺乳动物中获得。在一个实例中，该细胞可以被损伤所致的氧化性损伤伤害。这样的损伤包括，例如，疾病或病症(如，糖尿病等)或紫外线辐射(如，太阳等)。例如，由糖尿病引起的氧化性损伤所损伤的胰岛细胞可以从哺乳动物中获得。
上述肽可以通过本领域技术人员已知的任何方法施加给细胞。例如，可以在合适的条件下将该肽与细胞孵育。本领域的技术人员可以容易地确定这样的条件。
由于氧化性损伤的减轻，处理后的细胞可以再生。作为疾病或病症的治疗性处理，这样的再生细胞可以在返回给予哺乳动物。如上所述，一种这样的疾病是糖尿病。
如果在给予有效量的上述芳香族阳离子肽后，哺乳动物、离体器官、或细胞中的氧化性损伤的量减少就认为氧化性损伤得以“减轻”。通常，如果氧化性损伤减少了至少约10％，优选至少约25％，更优选至少约50％，更优选至少约75％，最优选至少约90％，就认为氧化性损伤得以减轻。
肽的合成
本发明的方法中所用的肽可以通过本领域公知的任何方法来化学合成。合成该蛋白适宜的方法包括：例如由Stuart和Young在“Solid Phase Peptide Systhesis，”第二版，Pierce Chemical Company(1984)，以及在“Solid Phase Peptide Systhesis，”Methods Enzymol.289，Academic Press，Inc，New York(1997)中所描述的方法。
给药方法
将本发明的方法中所用的肽以减轻氧化性损伤的有效量给予哺乳动物。该有效量在临床前期试验和临床试验中用医师和临床医师熟悉的方法来测定。
在本发明的方法中所用的有效量的肽，优选在药物组合物中，通过给予药物化合物的众多公知方法中的任意一种来给予有需要的哺乳动物。
该肽可以全身给药或局部给药。在一个实施例中，该肽是静脉内给药的。例如，本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽可以通过快速静脉内推注来给药。然而，优选的是该肽以恒速静脉内灌注的方式来给药。
该肽可以在例如血管成形术或冠状动脉旁路手术中直接注射到冠状动脉中，或涂布到冠状动脉支架上。
该肽也可以口服给药、局部给药、鼻内给药、肌肉内给药、皮下给药或透皮给药。在一个优选实施例中，本发明方法中的芳香族阳离子肽的透皮给药是通过离子电渗疗法实现的，其中带电荷的肽是通过电流来透过皮肤输送的。
其它的给药途径包括脑室内或鞘内给药。脑室内给药是指给予到脑的腔室系统中。鞘内给药是指给予到脊髓的蛛网膜下的间隙中。因此，脑室内或鞘内给药可以优选用于影响中枢神经系统器官或组织的疾病和病症。在一优选实施例中，鞘内给药用于脊髓外伤。
本发明的方法中所用的肽还可以通过持续释放的方式给予哺乳动物，这在本领域是公知的。持续释放给药是在一定时间段达到一定药物水平的药物输送方法。该水平通常是通过血清或血浆浓度测定的。
用于通过可控释放递送化合物的方法的描述可以在PCT申请第WO02/083106中找到。通过引用方式将该PCT申请的全文结合于本文中。
制药领域中已知的任何剂型都适用于本发明的方法中所用的芳香族阳离子肽的给药。对于口服给药，可以使用液体或固体剂型。剂型的一些例子包括：片剂、凝胶胶囊、丸剂、锭剂、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂(wafers)、口嚼剂(chewing gum)等等。该肽可以与本领域技术人员公知的适宜的药物载体(媒介物)或赋形剂混合。载体和赋形剂的实例包括：淀粉、牛奶、糖、一些类型的粘土、凝胶、乳酸、硬脂酸或其盐(包括硬脂酸镁或硬脂酸钙)、滑石、植物油脂或植物油、树胶和乙二醇。
对于全身给药、脑室内给药、鞘内给药、局部给药、鼻内给药、皮下给药、或者透皮给药，本发明方法中所用的芳香族阳离子肽的剂型可以利用传统的如可以用本领域已知的稀释剂、载体或赋形剂等递送该肽。例如，该剂型可以含有一种或多种下述物质：稳定剂，表面活性剂，优选为非离子表面活性剂，以及可选的盐和/或缓冲剂。该肽可以以水溶液或冻干品的形式递送。
稳定剂可以是，例如甘氨酸这样的氨基酸；或如蔗糖、四元糖、乳糖或葡聚糖这样的寡糖类。可选地，该稳定剂可以是，例如甘露醇这样的糖醇；或者是它们的组合物。优选的是，稳定剂或稳定剂组合物的重量构成了肽的重量的约0.1％到约10％。
表面活性剂优选为非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯。适宜的表面活性剂的一些实例包括：吐温20、吐温80；聚乙二醇或聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(醚)(polyoxyethylene polyoxypropyleneglycol)，如约0.001％(w/v)到约10％(w/v)的Pluronic F-68。
盐或缓冲剂可以分别是任何如氯化钠或磷酸钠/钾的盐或缓冲剂。优选地，缓冲剂使药物组合物的pH维持在约5.5到约7.5的范围内。盐和/或缓冲剂也用来将摩尔渗透压浓度维持在适于给人或动物给药的水平。优选的是盐或缓冲剂以约150mM到约300mM的粗略的等渗压浓度存在。
在本发明的方法中所用的肽的剂型可以另外含有一种或多种常用的添加剂。这些添加剂的一些实例包括：如甘油这样的增溶剂；如苯扎氯铵(季铵化合物的混合物，称作“季铵混合物(quats)”)、苯甲醇、氯惹酮或氯丁醇这样的抗氧化剂；如吗啡衍生物这样的麻醉剂；或上述的等渗剂等。为了进一步防止氧化或其它损坏，该药物组合物可以用不渗透的塞子封装在小瓶中在氮气下保存。
根据本发明治疗的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括如农场动物，如羊、猪、牛和马；宠物，如狗和猫；实验动物，如大鼠、小鼠和兔。在一优选实施例中，该哺乳动物是人。
实施例
实施例1：[Dmt1]DALDA穿过细胞膜
利用人类肠上皮细胞系(Caco-2)研究[3H][Dmt1]DALDA的细胞摄入，并且用SH-SY5Y细胞(人类神经母细胞瘤细胞)、HEK293细胞(人类胚胎肾细胞)及CRFK细胞(肾上皮细胞)进行确认。在涂布有胶原的12孔板上(5×105细胞/孔)将单层细胞培养三天。在第四天，用预热的HBSS洗涤两次细胞，然后用0.2ml含有250nM[3H][Dmt1]DALDA的HBSS于37℃或4℃孵育不同的时间直至1小时。
早在5分钟时，在细胞裂解液中即可以观察到[3H][Dmt1]DALDA，并在30分钟时达到稳态水平。孵育1小时后在细胞裂解液中回收的[3H][Dmt1]DALDA的总量占总药量的大约1％。虽然[3H][Dmt1]DALDA的摄入在4℃时比37℃时变慢，但是在45分钟时可达到76.5％并在1小时时达到86.3％。[3H][Dmt1]DALDA的内在化并不限于Caco-2细胞，在SH-SY5Y细胞、HEK293细胞和CRFK细胞中也可以观察到。[Dmt1]DALDA的细胞内浓度估计比细胞外浓度大约高50倍。
在一独立的实验中，用一定浓度范围(1μM-3mM)的[Dmt1]DALDA于37℃下孵育细胞1小时。在孵育期结束后，用HBSS洗涤细胞4次，向各个孔中加入0.2ml含有1％SDS的0.1N NaOH。然后将细胞内容物转移到闪烁管中，并且进行放射性计数。为了将内在化的放射性和表面结合的放射性区分开，引入了酸洗步骤。在细胞裂解之前，将细胞用0.2ml的0.2M醋酸/0.05M NaCl于冰上孵育5分钟。
[Dmt1]DALDA摄入到Caco-2细胞中是通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)使用一种[Dmt1]DALDA的荧光类似物(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2)来确认的；其中dnsDap为β-丹磺酰基-1-α，β-二氨基丙酸)。细胞培养如前所述，并且于(35mm)玻璃底培养皿上(MatTek Corp.，Ashland，MA)平铺两天。弃去培养液(基)，将细胞用1ml含有0.1μM至1.0μM该荧光肽类似物的HBSS于37℃孵育1小时。然后用冰冷的HBSS洗涤细胞3次，并且用200μl的PBS覆盖，然后于室温下用具有C-复消色差63×/1.2W校正物镜的Nikon共聚焦激光扫描显微镜在10分钟内进行显微镜检查。在340nm通过UV激光进行激发，并于520nm处测量发射光。对Z-方向上的光学切片，将每2.0μm切5-10帧。
CLSM确认了用0.1μM的[Dmt1，DnsDap4]DALDA于37℃孵育1小时后，荧光Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-dnsDap-NH2摄入到Caco-2细胞中。37℃时与4℃时荧光肽的摄入是类似的。虽然荧光在整个胞质中出现了扩散，但是被完全排除于细胞核之外。
实施例2：[Dmt1]DALDA靶向定位到线粒体
为了检测[Dmt1]DALDA的亚细胞分布，制备荧光类似物[Dmt1，AtnDap4]DALDA(Dmt-右旋精氨酸-苯丙氨酸-atnDap-NH2；其中atn为β-邻氨基苯甲酰-1-α，β-二氨基丙酸)。该类似物含有β-邻氨基苯甲酰-1-α，β-二氨基丙酸以替代位置4上的赖氨酸残基。细胞培养如实施例1所述，并且于(35mm)玻璃底培养皿(MatTekCorp.，Ashland，MA)上平铺2天。弃去培养基，并且用1ml含有0.1μM[Dmt1，AtnDap4]DALDA的HBSS于37℃孵育细胞15分钟至1小时。
细胞也可以与四甲基若丹明甲酯(TMRM，25nM)，一种着染线粒体的染料，37℃下孵育15分钟。然后用冰冷的HBSS洗涤细胞3次，并且用200μl的PBS覆盖，并且于室温下用具有C-复消色差63×/1.2W校正物镜的Nikon共聚焦激光扫描显微镜在10分钟内进行显微镜检查。
对于[Dmt1，AtnDap4]DALDA，通过UV激光器于350nm处进行激发，在520nm处测量发射。对于TMRM，在536nm处进行激发，并于560nm处测量发射。
CLSM显示在37℃孵育仅仅15分钟后荧光[Dmt1，AtnDap4]DALDA摄入到Caco-2细胞内。虽然染料的摄入完全排除在细胞核之外，然而该蓝色染料在细胞质中显示出条纹状分布。用TMRM将线粒体标记成红色。通过叠加[Dmt1，AtnDap4]DALDA的分布和TMRM的分布来显示[Dmt1，AtnDap4]DALDA的线粒体分布。
实施例3：通过SS-02和SS-05清除过氧化氢(图1)
通过鲁米诺所致的化学发光来测量SS-02和SS-05(Dmt-D-Arg-Phe Orn-NH2)对H2O2的作用。将25μM鲁米诺和0.7IU辣根过氧化物酶加入到H2O2(4.4nmol)和肽的溶液中，并且在37℃通过Chronolog Model 560血小板凝集计(Havertown，PA)监视化学发光20分钟。
结果显示SS-02和SS-05剂量依赖性地抑制鲁米诺反应，表明这些肽可以清除H2O2。
实施例4：抑制脂质过氧化反应(图2)
通过水溶性引发剂，ABAP(2，2’-偶氮双(2-脒基丙烷)，2，2’-azobis(2-amidinopropane))诱导亚油酸过氧化反应，通过共轭二烯的形成在236nm处通过分光光度监视来检测脂质过氧化反应(B.Longoni，W.A.Pryor，P.Marchiafava，Biochem.Biophys.Res.Commun.233，778-780(1997))。
5ml的0.5M ABAP和浓度变化的SS-02在2.4ml亚油酸悬浮液中孵育，直到自动氧化率变成常数。结果表明SS-02剂量依赖性的抑制亚油酸的过氧化反应。
以100μM的浓度加入各种肽。数据以二烯形成的斜率表示。除SS-20(Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2)、SS-21(环己基-D-Arg-Phe-Lys-NH2)和SS-22(Ala-D-Arg-Phe-Lys-NH2)之外，所有其它的SS肽都降低了亚油酸过氧化反应的速率。注意SS-20、SS-21、SS-22均不包含酪氨酸残基或二甲基酪氨酸残基。SS-01(其包含Tyr而非Dmt)在防止亚油酸过氧化反应方面不那么有效。SS-29为Dmt-D-Cit-Phe-Lys-NH2，SS-30为Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2，SS-32为Dmt-D-Arg-Phe-Ahp(2-氨基庚酸)-NH2。
实施例5：抑制LDL氧化(图3)
从储存的血浆中制备新鲜的人类LDL(低密度脂蛋白)。通过加入10mM CuSO4催化性诱导LDL氧化，并且在37℃234nm处监视共轭二烯的形成达5小时(B.Moosmann and C.Behl，MolPharmacol 61，260-268(2002))。
(A)结果显示SS-02剂量依赖性地抑制LDL氧化速率(rate)。
(B)以100μM的浓度加入各种肽。除SS-20(Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2)、SS-21(环己基-D-Arg-Phe-Lys-NH2)和SS-22(Ala-D-Arg-Phe-Lys-NH2)之外，所有其它的SS肽都降低了亚油酸过氧化反应的速率(降低了共轭二烯形成的速率)。注意SS-20、SS-21、SS-22均不包含酪氨酸残基或二甲基酪氨酸残基。SS-29为Dmt-D-Cit-Phe Lys-NH2，SS-30为Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2，SS-32为Dmt-D-Arg-Phe-Ahp(2-氨基庚酸)-NH2。
实施例6：通过离体小鼠肝脏线粒体生产过氧化氢(图4)
因为线粒体是ROS产生的主要来源，所以检测在基础条件下和用抗霉素(复合体III抑制剂)处理后，SS-02对离体线粒体中H2O2形成的影响。从小鼠中提取肝脏并在冰冷的缓冲液中使其均化，然后在13800×g离心10分钟。将沉淀冲洗一次，随后重新悬浮在0.3ml冲洗缓冲液中，并置于冰上直到使用。利用前述的鲁米诺化学发光测量H2O2(Y.Li，H.Zhu，M.A.Trush，Biochim.Biophys.Acta 1428，1-12(1999))。在不存在或存在SS肽(100μM)的情况下，将0.1mg线粒体蛋白加入到0.5ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH8.0)中。加入25mM鲁米诺和0.7IU辣根过氧化物酶，并且在37℃用Chronolog Model 560血小板凝集计(Havertown，PA)监测化学发光达20分钟。产生的H2O2的量通过20分钟曲线下的面积(AUC)来量化，所有的数据归一化为单独的线粒体产生的AUC。
(A)在10μM的SS-02存在下产生的H2O2的量极大的减少了。抗霉素(1μM)的加入极大的增加了由离体线粒体产生的H2O2，该增加被10μM Dmt1-DALDA(在本说明书中也称作dDALDA)完全阻断。
(B)肽SS-02、SS-29、SS-30、SS-31极大地减少了产生的H2O2的量。SS-21和SS-22对H2O2的产生没有影响。注意SS-21和SS-22不包含酪氨酸残基和二甲基酪氨酸残基。单独的氨基酸Dmt(二甲基酪氨酸)也抑制H2O2的产生。
实施例7：SS-31抑制由离体线粒体产生的H2O2(图5)
利用前述的鲁米诺化学发光测量H2O2(Y.Li，H.Zhu，M.A.Trush，Biochim.Biophys.Acta 1428，1-12(1999))。在不存在或存在SS-31的情况下，将0.1mg线粒体蛋白加入到0.5ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH8.0)中。加入25mM鲁米诺和0.7IU辣根过氧化物酶，并且在37℃用Chronolog Model 560血小板凝集计(Havertown，PA)监测化学发光达20分钟。产生的H2O2的量通过20分钟曲线下的面积(AUC)来量化，所有的数据归一化为单独的线粒体产生的AUC。
(A)SS-31剂量依赖性地减少由离体线粒体自然产生的H2O2。
(B)SS-31剂量依赖性地减少离体线粒体中由抗霉素所致的H2O2的产生。
实施例8：SS-02和SS-31减少了细胞内ROS并增加了细胞存活(图6)
为了显示所要求的肽在施加给全细胞时是有效的，将神经元N2A细胞以1×104/孔的密度平铺在96孔板内，并且使其在用tBHP(0.5或1mM)处理40分钟前培养2天。冲洗细胞2次，并用单独的培养基或包含各种浓度的SS-02或SS-31的培养基替换4小时。通过羧基-H2DCFDA(Molecular Probes，Portland，OR)测量细胞内ROS。通过细胞增殖实验(MTS实验，Promega，Madison，WI)评估细胞死亡。
用tBHP孵育导致剂量依赖性地增加细胞内ROS(A)和细胞存活能力的减少(B和C)。这些细胞与SS-31或SS-02的孵育剂量依赖性减少细胞内ROS(A)并增加细胞存活(B和C)，并且EC50在nM范围内。
实施例9：SS-31防止了细胞存活能力的丧失(图7)
将神经元N2A细胞和SH-SY5Y细胞以1×104/孔的密度平铺在96孔板内，并且使其在存在或不存在SS-31(10-12-10-9M)时用叔丁基过氧化氢(tBHP)(0.05-0.1mM)处理24小时前培养2天。通过细胞增殖实验(MTS实验，Promega，Madison，WI)评估细胞死亡。
N2A细胞和SH-SY5Y细胞用低剂量的t-BHP(0.05-0.1mM)处理24小时导致细胞存活能力的降低。(A)0.05mM t-BHP在N2A细胞中导致50％细胞存活能力丧失，在SH-SY5Y细胞中导致30％的细胞存活能力丧失。(B)0.1mM t-BHP在SH-SY5Y细胞中导致细胞存活能力的极大降低。用SS-31同时处理细胞导致t-BHP所致的细胞毒性剂量依赖性地降低。通过1nM SS-31可以完全防止t-BHP。
实施例10：SS-31降低了半胱天冬酶活性(图8)
使N2A细胞在96孔板中培养，在37℃，不存在或存在SS-31(10-11M-10-8M)的情况下，用t-BHP(0.05mM)处理12-24小时。所有的处理以四份(quadriplicate)进行。在存在或不存在SS-31的情况下，37℃下，将N2A细胞与t-BHP(50mM)孵育12小时。通过细胞分离液(Accutase，Innovative Cell Technologies，Inc.，SanDiego，CA)将细胞从培养板上轻柔地提起并用PBS冲洗2次。利用FLICA  试剂盒(Immunochemistry Technologies LLC，Bloomington，MN)分析半胱天冬酶活性。根据生产商的建议，细胞重新悬浮在PBS中(约5×106细胞/ml)并用pan-半胱天冬酶抑制剂FAM-VAD-FMK在37℃、5％CO2、避光的情况下标记1小时。随后细胞被冲洗以除去未结合的试剂并固定。通过激光扫描血细胞计数器(Beckman-Coulter XL，Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)，利用对于绿光的标准发射滤光器(FL1)测量细胞中的荧光密度。对于每一轮(run)，收集10000个独立的结果(event)并储存在列表模式的文件中用于离线分析。
半胱天冬酶活化是凋亡过程(Apoptotic cascade)的开始触发器，我们的结果表明在SH-SY5Y细胞与50mM t-BHP孵育12小时后，半胱天冬酶活性显著增加，其中通过增加SS-31的浓度可以剂量依赖性地抑制t-BHP。
实施例11：SS-31降低了ROS聚集的速率(图9)
利用荧光探针DCFH-DA(5-(和-6)-羧基-2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯)评估细胞内ROS。DCFH-DA被动进入细胞，并且随后脱去乙酰基成为非荧光性DCFH。DCFH与ROS反应形成DCF，一种荧光产物。用HBSS冲洗96孔板中的N2A细胞，并在37℃下加载10mM DCFDA 30分钟。将细胞用HBSS冲洗3次，并暴露于0.1mM t-BHP(单独或带有SS-31)。通过荧光微孔板读取器(fluorescence microplate reader)(Molecular Devices)利用485nm激发并在530nm发射来实时监控DCFH到DCF的氧化。
在用0.1mM t-BHP处理的N2A细胞中的ROS聚集速率被SS-31的加入剂量依赖性地抑制。
实施例12：SS-31抑制暴露于氧化性损伤的细胞中的脂质过氧化反应(图10)
SS-31抑制用t-BHP处理的N2A细胞中的脂质过氧化反应。通过测量HNE Michael加合物来评估脂质过氧化反应。4-HNE是膜多不饱和脂肪酸的过氧化反应的主要醛类产物之一。在存在或不存在SS-31(10-8-10-10M)的情况下，在t-BHP处理(1mM，3h，37℃，5％CO2)前，将N2A细胞接种在玻璃底培养皿上1天。随后用PBS冲洗细胞2次，并将细胞用PBS中4％低聚甲醛在室温下(RT)固定30分钟，随后用PBS冲洗3次。随后将细胞透化处理(permeabilized)，用兔抗HNE抗体进行处理，随后用次级抗体(与生物素结合的山羊抗兔IgG)进行处理。在Vectashield内将细胞制成标本(固定，mount)，并通过利用460±20nm的激发波长，以及505nm的用于发射的长通滤光器(longpass filter)的Zeiss荧光显微镜成像。
(A)未处理的细胞；(B)用1mM t-BHP处理3小时的细胞；(C)用1mM t-BHP和10nM SS-31处理3小时的细胞。
实施例13：SS-02抑制暴露于过氧化氢的细胞内线粒体电位的丧失。
在SS-02(0.1μM)不存在或存在的情况下，用t-BHP(1mM)处理Caco-2细胞达4小时，随后将细胞与TMRM孵育，并在LSCM下检查。在对照细胞中，线粒体可以作为细条纹在整个细胞质中清楚得观察到。用t-BHP处理的细胞中，TMRM荧光大大地减少了，表明普遍的去极化。与之相比，同时用SS-02处理防止了由t-BHP所致的线粒体去极化。
实施例14：SS-31防止了由暴露于t-BHP所致的N2A细胞中线粒体电位的丧失和ROS聚集的增加(图11)。
用0.1mM t-BHP(单独或带有1nM SS-31)处理玻璃底培养皿中的N2A细胞达6小时。随后在37℃，5％CO2，用10μM的二氯二氢荧光素(ex/em＝485/530)加载细胞30分钟。随后细胞用HBSS冲洗3次并用20nM Mitotracker TMRM(ex/em＝550/575nm)在37℃染色15分钟，随后通过共焦激光扫描显微镜进行观察。
用t-BHP处理的N2A细胞导致TMRM荧光的丧失，表明线粒体去极化。并同时伴随DCF荧光的增加，表明细胞内ROS的增加。同时用1nM SS-31处理防止了线粒体去极化并减少了ROS聚集。
实施例15：SS-31防止了由氧化压力导致的细胞凋亡(图12)。
SH-SY5Y细胞在96孔板上培养，在37℃，缺乏或存在SS-31(10-12M-10-9M)情况下，用t-BHP(0.025mM)处理24小时。所有的处理一式四份(in quadriplicates)进行。随后用2mg/ml Hoechst33342染色20分钟，用4％低聚甲醛固定，并用装配有Zeiss Acroplan×20物镜的Zeiss荧光显微镜(Axiovert 200M)成像。通过350±10nm的激发波长和400nm用于发射的长通滤光器评估核形态。利用MetaMorph软件(Universal Imaging Corp.，West Chester，PA)处理并分析所有的图像。均一染色的细胞核被评为健康存活的神经元，而浓缩或碎片状的细胞核被评为凋亡。
SS-31防止了由低剂量t-BHP所致的凋亡。通过共焦显微镜和荧光探针Hoechst 33342评估凋亡。(A1)未用t-BHP处理的细胞的代表区域。(A2)荧光图像表明一些细胞具有表明凋亡细胞核的密集的、片断状的染色质。(A3)用0.025mM t-BHP处理24小时的细胞的代表区域。(A4)荧光图像表明伴随凋亡细胞核的细胞的数量增加。(A5)用0.025mM t-BHP和1nM SS-31处理24小时的细胞的代表区域。(A6)荧光图像表明伴随凋亡细胞核的细胞的数量减少。
(B)SS-31剂量依赖性地减少由低剂量t-BHP(0.05mM)处理24小时所致的凋亡细胞的百分比。
实施例16：SS-31防止了经历短暂间隔的缺血再灌注的心脏中的脂质过氧化(图13)。
使离体豚鼠心脏以逆行方式在Langendorff装置中灌注，并经历各种缺血再灌注间隔。随后将心脏立即固定并包埋在石蜡中。通过抗HNE抗体在石蜡切片中进行4-羟基-2-壬烯醇(HNE)修饰的蛋白质的免疫组织化学分析。
(A)对来自豚鼠心脏的石蜡切片中的4-羟基-2-壬烯醇(HNE)修饰的蛋白质进行免疫组织化学分析，该心脏被(a)缓冲液；(b)100nM SS-02；(c)100nM SS-20；以及(d)1nM SS-31有氧灌注30分钟，随后经历30分钟缺血，随后用同一肽再灌注90分钟。使组织薄片与抗HNE抗体孵育。(e)背景对照：没有初级抗体的染色。
(B)对来自豚鼠心脏的石蜡切片中的HNE修饰的蛋白质进行免疫组织化学分析，该心脏被有氧灌注缓冲液30分钟；随后经历30分钟缺血，以及用(a)缓冲液；(b)100nM SS-02；(c)100nMSS-20；以及(d)1nM SS-31用同样的肽再灌注90分钟。使组织薄片与抗HNE抗体孵育。(e)背景对照：没有初级抗体的染色。
实施例17：SS-31增加了经历延长的冷缺血以及随后的暖再灌注的心脏中的冠状动脉流量并减少了脂质过氧化和凋亡(图14)。
使离体豚鼠心脏在Langendorff装置中以逆行方式灌注心脏停搏液(St.Thomas溶液)(没有或存在SS-31)(1nM)3分钟，随后被夹紧并储存在4℃18小时。随后心脏被重新放置在Langendorff中并在34℃再灌注Krebs-Henseleit溶液90分钟。随后心脏被快速固定并用石蜡包埋。
(A)SS-31在18小时缺血储存后极大地提高了心脏中的冠状动脉流量。阴影区代表18小时的冷缺血。
(B)在没有(a)或带有(b)SS-31(1nM)情况下储存的豚鼠心脏的石蜡切片中HNE-修饰的蛋白质的免疫组织化学分析。(c)没有初级抗体的背景染色。
(C)SS-31防止了在延长的(18小时)冷缺血后经历暖再灌注的离体豚鼠心脏中内皮细胞和肌细胞的凋亡。通过TUNEL染色(绿色)评估凋亡，并且通过DAPI(蓝色)观察细胞核。
实施例18：SS-31提高了从小鼠胰腺中分离的岛细胞的存活(图15)。
(A)SS-31提高了从小鼠胰腺分离的岛细胞的线粒体电位。从小鼠中提取胰腺并根据标准方法制备岛细胞。在一些研究中，SS-31(1nM)被加入到整个分离过程中所用的全部分离缓冲液中。利用TMRM(红色)测量线粒体电位，并通过共焦显微镜观察线粒体电位。
(B)SS-31在从小鼠胰腺中分离的岛细胞中减少了凋亡，并提高了存活能力。从小鼠中提取胰腺，并根据标准方法制备岛细胞。在一些研究中，SS-31(1nM)被加入到整个分离过程中所用的全部分离缓冲液中。利用annexin V通过流式细胞仪确定凋亡，并通过碘化丙啶确定坏死。
实施例19：SS-31防止了胰腺胰岛细胞中的氧化性损伤(图16)。
小鼠胰腺岛细胞未处理(a)或用没有(b)或带有1nM SS-31(c)的25μM t-BHP处理。通过TMRM(红色)测量线粒体电位，并利用共聚焦显微镜通过DCF(绿色)测量活性氧簇。
实施例20：SS-31防止了帕金森病(图17)。
MPTP是选择性破坏纹状体多巴胺神经元的神经毒素，并且可以用作帕金森病的动物模型。MPP+(MPTP的代谢物)靶向线粒体，抑制电子传递链的复合体I，并提高ROS生产。MPP+被用在细胞培养研究中，因为细胞不能够将MPTP代谢为活性代谢物。将MPTP用于动物研究。
(A)SS-31防止多巴胺细胞经历MPP+毒性。将SN-4741细胞用缓冲液、50μM MPP+或50μM MPP+和1nM SS-31处理48小时，通过用Hoechst 33342通过荧光显微镜确定凋亡的发生率。通过MPP+处理，浓缩的片断状的细胞核的数量显著增加。同时用SS-31处理减少了凋亡细胞的数量。
(B)SS-31剂量依赖性地防止用MPTP处理的小鼠中多巴胺神经元的丧失。按2小时间隔给予小鼠(n＝12)三种剂量的MPTP(10mg/kg)。在每次MPTP注入前30分钟，以及在最后的MPTP注入后1小时和12小时施加SS-31。一周后杀死动物，并免疫染色纹状体脑区用于酪氨酸羟化酶活性。
(C)SS-31剂量依赖性地增加用MPTP处理的小鼠中纹状体多巴胺、DOPAC(3，4-二羟基苯乙酸)、以及HVA(高香草酸)的水平。按2小时间隔给予小鼠(n＝12)三种剂量的MPTP(10mg/kg)。在每次MPTP注入前30分钟，以及在最后的MPTP注入后1小时和12小时施加SS-31。一周后杀死动物，并通过高压液相色谱法定量多巴胺、DOPAC、以及HVA的水平。

Claims (30)

1.芳香族阳离子肽在制备用于在哺乳动物中减轻氧化性损伤的药物中的应用，所述芳香族阳离子肽是：
Dmt-D-Arg-Phe-Orn-NH2；
Dmt-D-Cit-Phe-Lys-NH2；
Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2；
D-Arg-2’，6’-Dmt-Lys-Phe-NH2；或者
D-Arg-Phe-(2-氨基庚酸)-NH2。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为口服给药剂型。
3.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为局部给药剂型。
4.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为鼻内给药剂型。
5.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为全身给药剂型。
6.根据权利要求3所述的应用，其中所述肽配制为静脉内给药剂型。
7.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为皮下给药剂型。
8.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为肌肉内给药剂型。
9.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为脑室内给药剂型。
10.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为鞘内给药剂型。
11.根据权利要求1所述的应用，其中所述肽配制为透皮给药剂型。
12.根据权利要求11所述的应用，其中所述肽配制为通过离子电渗疗法给药的剂型。
13.根据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物经受再灌注。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述再灌注用于治疗缺血。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述缺血是由中风引起的。
16.根据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物患有败血症。
17.根据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物经历炎性过程。
18.根据权利要求17所述的应用，其中所述哺乳动物患有关节炎。
19.根据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物患有糖尿病。
20.根据权利要求17所述的应用，其中所述哺乳动物患有多发性硬化。
21.根据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物患有肝脏损伤。
22.根据权利要求21所述的应用，其中所述肝脏损伤由病毒感染引起。
23.根据权利要求21所述的应用，其中所述肝脏损伤由毒剂引起。
24.根据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物患有神经退行性疾病或病症。
25.根据权利要求24所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是帕金森病。
26.根据权利要求24所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是阿尔茨海默氏症。
27.根据权利要求24所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是亨廷顿氏症。
28.根据权利要求24所述的应用，其中所述神经退行性疾病或病症是肌萎缩性侧索硬化症。
29.依据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物是人类。
30.芳香族阳离子肽在制备用于在哺乳动物的离体器官中减轻氧化性损伤的药物中的应用，所述芳香族阳离子肽是：
Dmt-D-Arg-Phe-Orn-NH2；
Dmt-D-Cit-Phe-Lys-NH2；
Phe-D-Arg-Dmt-Lys-NH2；
D-Arg-2’，6’-Dmt-Lys-Phe-NH2；或者
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