CN1934932A

CN1934932A - 一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法

Info

Publication number: CN1934932A
Application number: CNA2006101390912A
Authority: CN
Inventors: 刘孟军; 王娜; 赵锦; 秦子禹
Original assignee: Hebei Agricultural University
Current assignee: Hebei Agricultural University
Priority date: 2006-10-09
Filing date: 2006-10-09
Publication date: 2007-03-28

Abstract

一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法，即通过冬枣花药的组织培养获得其愈伤组织，愈伤组织诱导率达86.23％，包括外植体采集、消毒、初始诱导、增殖培养。在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d。流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl₂溶液中8min，无菌水冲洗3～4次后剥取花药，启动培养时将无菌花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_{0.5－1.0mg/L}+NAA_0－0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000Lux)培养。花药逐渐产生黄绿色的、松散颗粒状的愈伤组织，且随培养时间的延长逐渐增多。增殖培养时将获得的初始愈伤组织转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_{0.1－0.5mg/L}+NAA_0－0.5mg/L的培养基中进行增殖培养，愈伤组织可快速增殖。以上培养基基本培养基为MS培养基，麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。光照周期为15小时光照、9小时黑暗。光照强度800～1000Lux。温度控制在27±1℃。该方法可在70d左右获得大量冬枣花药愈伤组织。

Description

一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法

技术领域

本发明涉及一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法。

背景技术

单倍体育种，主要是指通过花药培养或游离小孢子培养(以下简称小孢子培养)的方式得到单倍体植株，然后经秋水仙素等处理加倍为双单倍体，从而直接获得纯合的品系。无论是花药培养还是小孢子培养，从开始培养到获得完全纯合的品系一般只需要1年左右的时间。对果树来说，单倍体育种有可能使某些原来无性繁殖的果树也能用种子繁殖，并为基因型高度杂合的果树遗传性研究提供纯系材料，从而促进果树遗传理论工作的研究。因此，该项技术若应用于育种实践，必将大大加快育种的速度，节省大量的人力物力，是一项对育种工作极其有用的生物技术。

1953年，Tuleck用银杏花粉在人工培养基上第一次成功地诱导形成单倍体愈伤组织Guha和Maheshwari(1964)首次成功地从毛叶曼陀罗(Datura inoxia)花药培养中获得单倍体植株，随后证实是由胚状体途径获得的单倍体花粉植株，从此开创了利用花粉培育单倍体的新途径，近30年来，利用花药培养产生单倍体植株的技术已被广泛应用到10个科，24个属，34个种的250多种植物上。果树花药培养单倍体的研究起步较晚，20世纪70年代末到80年代初先后在柑橘、苹果、葡萄、草莓、荔枝、龙眼等树种上取得了成功。我国至今已经培育出了40余种由花粉或花药发育成的单倍体植株。枣(Ziziphus jujuba Mill.)是我国特色优势果树，关于枣的花药培养，迄今只在金丝小枣上有过报道，但存在愈伤组织诱导率较低(43.1％)的问题，在离体诱导冬枣花药愈伤组织方面尚未见相关报道，因此提高枣花药愈伤组织诱导率，将大大加快枣的单倍体育种进程。

发明内容

本发明建立了冬枣花药愈伤组织诱导技术体系，能保证获得冬枣花药的愈伤组织，并实现其增殖，为深入开展枣的单倍体育种研究提供了一种新的技术平台。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：首先建立合适的冬枣花药外植体的消毒方法，再对外植体进行初始愈伤组织的诱导，通过不同基本培养基、不同碳源，不同植物生长调节剂的调控，筛选出最适冬枣花药愈伤组织诱导培养基，获得花药的初始愈伤组织；然后在此基础上进行花药愈伤组织的增殖培养基筛选，以达到使愈伤组织快速增殖的目的。

本发明的具体内容，即离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法如下：

外植体采集与消毒在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d。流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl₂溶液中8min，无菌水冲洗3～4次后剥取花药。

培养条件基本培养基为MS培养基，麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。光照周期为15小时光照、9小时黑暗。光照强度800～1000Lux。温度控制在27±1℃。

启动培养将无菌花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.5-10mg/L+NAA_0-0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000Lux)培养。花药逐渐产生黄绿色的、松散颗粒状的愈伤组织，且随培养时间的延长逐渐增多。

增殖培养将获得的初始愈伤组织转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.1-0.5mg/L+NAA_0-0.5mg/L的培养基中进行增殖培养。

本发明专利的有益效果是，通过对冬枣花药外植体的消毒、初始愈伤组织诱导、愈伤组织的增殖培养，可快速获得大量花药愈伤组织，诱导率高达86.23％，从而攻克了枣花药不易获得愈伤组织这一大技术难题，并大大提高了花药愈伤组织的诱导率(86.23％)。该发明可用于获得大量冬枣花药愈伤组织，为冬枣单倍体育种奠定基础，并可为其他枣品种的花药培养提供参考。

附图说明

图1中是冬枣花药在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.5-1.0mg/L+NAA_0-0.5mg/L的培养基上培养40～50d时获得的初始愈伤组织。

图2中是初始愈伤组织在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.1-0.5mg/L+NAA_0-0.5mg/L的培养基中的增殖培养。

具体实施方式

在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d。流水冲洗1～2h，超净工作台上将花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl₂溶液中8min，无菌水冲洗3～4次后剥取花药。启动培养时将无菌花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.5-1.0mg/L+NAA_0-0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000Lux)培养。花药逐渐产生黄绿色的、松散颗粒状的愈伤组织，且随培养时间的延长逐渐增多。增殖培养时将获得的初始愈伤组织转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.1-0.5mg/L+NAA_0-0.5mg/L的培养基中进行增殖培养，愈伤组织可快速增殖。以上培养基基本培养基为MS培养基，麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0。光照周期为15小时光照、9小时黑暗。光照强度800～1000Lux。温度控制在27±1℃。

Claims

1.一种离体诱导冬枣花药愈伤组织的方法，其特征在于通过对冬枣花药进行组织培养，获得其愈伤组织，愈伤组织诱导率达86.23％。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下培养步骤：

(1)在5～6月选取田间直径为0.3～0.6cm、花萼尚未张开的冬枣未成熟花蕾，4℃冰箱预处理1～3d后流水冲洗1～2h，在超净工作台上将流水冲洗后的花蕾放入70％乙醇30s，再转入0.1％HgCl₂溶液中8min，然后用无菌水冲洗3～4次，获得无菌花蕾；

(2)经步骤(1)将获得的无菌花蕾剥取花药接种在MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.5-1.0mg/L+NAA_0-0.5mg/L的培养基上进行暗培养三周，然后转至弱光下(800～1000 Lux)培养，培养30～50d后产生初始愈伤组织；

(3)经步骤(2)获得的初始愈伤组织，转接到MS+麦芽糖15～20g/L+TDZ_0.1-0.5mg/L+NAA_0-0.5mg/L的增殖培养基中进行增殖培养。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于基本培养基为MS，含麦芽糖15～20g/L，琼脂3.5g/L，培养基灭菌前pH为5.8～6.0，光照周期为15小时光照、9小时黑暗，光照强度800～1000Lux，温度控制在27±1℃。