CN1906488A - 涉及乙型肝炎感染的方法和工具 - Google Patents
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Abstract
本发明人发现了与来自患有HBV感染个体的样品中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗原PreSl组分的残基94－117反应的抗体的存在和干扰素(IFN)在治疗该个体中的有效性亲密相关。此处提供了基于该发现的方法和工具。
Description
本发明涉及干扰素(IFN)在治疗乙型肝炎(HBV)感染中的用途，并且尤其涉及鉴定IFN治疗可能对其有利的HBV病人。
乙型肝炎感染与高发病率和死亡率有关(Niederau C.等.(1996)The New England Journal of Medicine 334，1422-1427)。HBV感染与肝硬化、肝功能衰竭、肝细胞癌和死亡有关(Dudley FJ等.(1972)Lancet ii：1388-1393；Hoofnagle JH等.(1983)Chronic type Bhepatitis：Clinical course.In：Viral Hepatitis and Delta Infection.NewYork；Alan R Liss Inc，1983；41-53；Weissberg J等.(1984)AnnalInternal Medicine 101：613-616；Fattovich G.等.(1986)Hepatology 6：167-172；Popper H等。(1987)Hepatology 7：764-772)。
一些随机的临床试验已报道采用重组的干扰素α(IFN-α)的疗法提供了显著的临床益处。乙型肝炎e抗原(HBeAg)的消除速率随着IFN的治疗从百分之5-10的低的自发清除速率提高至大约百分之24-30(Hoofnagle JH等.(1988)Gastroenterology 95：1318-1325.；AlexanderGJM等.(1987)Lancet 2：66-69；Brook MG等.(1989)Gut：130：1116-1122；Saracco G等.(1989)Hepatology 10：336-341.；Perillo RP等.(1990)New England Journal of Medicine 323：295-301.；Tine F等.(1993)Journal of Hepatology 18：154-162；Cooksley WGE等.(2003)Journal of Viral Hepatitis 10：298-305)。干扰素-诱导的肝炎e抗原的消除伴随降低的肝细胞癌发生率(Yang H-I等.(2002)The NewEngland Journal of Medicine 347：168-174)。
考虑到与IFN治疗有关的副作用，鉴定很可能响应干扰素疗法的那些病人的能力在形成用于治疗的建议中将是有效的(Lau DT-Y等.(1998)Journal of Viral Hepatitis 5：105-114)。
已提议许多标志物用于预测患者是否响应干扰素的治疗，这些标志物包括转氨酶、HBV-DNA、HBeAg、HBVpreS1抗原和HBcAg或HBeAg的IgM抗体的血清水平。(Krogsgaard等.，1994 Journal ofhepatology 21：646-655；Brook等.，1989b Hepatology 10：761-763；Perillo等.，1988上述；Dienstag等.，1995，New Journal EnglandMedicine 333：1657-1661；Villeneuve等.，1996 Cancer JournalGastroenterology 10：21-25；Janssen等.，1999 Hepatology 30：238-243；Brunetto等.，1993 Journal of hepatology 19：431-436；Marinos等.，1994 Hepatology 19：303-311)。
PreS1抗原(PreS1Ag)在HBV感染期间在血清中是可检测到的并且已经被建议作为用于监测接受抗病毒治疗的慢性感染患者中残留的HBV复制的可靠标志物以及作为IFN响应的预报者(Petit MA等.(1990)Hepatology 11：809-814；Petit MA等.(1992a)Archieves ofVirology Suppl 4：105-112；Petit MA等.(1992b)Virology 187：211-222；Petit MA等.(1994)Journal of hepatology 20：47-56；Feng等.，1995 Zhonghua Yixue Jianyan Zazhi 18：154-157；Ibarra等.，1989 Liver9：153-158；Mi等.，1999 Chinese Medical Journal 112：321-324；Buffello-Le Guillou等.，2000 Journal of Viral Hepatitis 7：387-392)。
preS1抗原部分的合成肽类似物(preS1#21-47)由细胞受体和抗-HBV抗体识别。此外，该肽推导出与天然HBV反应的抗体。在preS1-特异性肽1-21、12-32、32-53和94-117中，仅肽12-32被人抗-HBV强烈地识别(Neurath等.，1986Cell46：429-436；Neurath AR(1988a)Advances Virus Research 34：65-142；Neurath AR(1988b)Ann.Inst.Pasteyr/Virol 139：13-38)。
preS1抗原的特异性血清抗体早些已被证实存在于急性HBV-感染中(Alberti等.，1978 British Medical Journal 14：1056-1058；Theilmann等.，1986 Hepatology 6：186-190；Hellstrom和Sylvan，1988 Progressin Medical Virology 35：76-106；Budowska等.(1990)Hepatology 12：1271-1277；Budowska等.(1992)Hepatology 15：26-32)。22.7％(15/66)患有慢性乙型肝炎的患者对C-末端(94-117)preS1序列的抗体是阳性的，其不同于急性期的抗-(21-32)和抗-(32-47)反应性，并不表现为沉淀病毒的抗体。19个急性乙型肝炎患者中一半以上在疾病康复期间产生抗-preS1(21-119)抗体，然而该应答仅在几个慢性患者中被发现(Wei等.(2002)Worid Journal of Gastroenterology 8：276-281)。
本发明人已经发现与来自患有HBV感染个体的样品中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)抗原PreS1组分的特定部分反应的抗体的存在与干扰素(IFN)在治疗该个体中的有效性亲密相关。本发明的一个方面提供预测感染了乙型肝炎病毒(HBV)的个体是否响应干扰素(IFN)治疗的方法，该方法包括；测定与获自该个体的样品中的preS1(94-117)肽反应的抗体的存在或其量。
与样品中的preS1(94-117)肽反应的抗体的存在指示该个体为对此治疗有利的响应者(即将会响应IFN治疗的某个人)。
随着IFN治疗对IFN治疗响应的个体(即响应者)，可能呈现HBV感染一种或多种症状的好转。例如，与HBV感染有关的一种或多种生物标记物的水平，如血清HBeAg水平，可通过响应该治疗的个体的IFN治疗而降低或消除。
此处所述的方法可用于测定是否患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的个体为干扰素(IFN)治疗的响应者。因此方法可包括鉴定具有与所述肽反应的抗体的个体作为IFN治疗的响应者。
适于利用本方法分析的个体可能患有慢性或急性乙型肝炎感染。该个体可能呈现HBV感染的一种或多种症状，例如该个体可能是HBeAg阳性的。
与preS1(94-117)肽反应的抗体为与preS1(94-117)肽结合或反应的抗体分子。
在一些实施方案中，与抗原如preS1(94-117)肽反应的抗体可能不呈现与除了该抗原外的分子的任何明显的结合(即其可能呈现特异性结合)。有时，抗体可特异性地结合至特定的表位，如preS1(94-117)表位，其由许多抗原携带，在这样情况下该抗体将能结合至携带该表位的各种抗原。因此，preS1(94-117)表位的抗体还可结合至包括preS1(94-117)表位的其他肽和多肽，如preS1抗原。
与preS1(94-117)反应的抗体分子，其存在是根据此处所述的方法测定的，可以是通过个体的免疫系统应答外源抗原而产生的任何免疫球蛋白分子，例如IgG、IgD、IgM、IgA或IgE。在优选的实施方案中，检测到了IgG分子。
preS1(94-117)肽可由HBVpreS1序列的残基94至117组成。HBVpreS1序列可以来自HBV的任何亚型，包括例如ayw、adyw、adw、adw2或adr亚型。preS1的肽序列在Neurath AR，Kent SB(1988)Advances Virus Research 34：65-142和Neurath AR等.(1988)Ann.Inst.Pasteur/Virol 139：13-38中被描述了。
在一些优选的实施方案中，preS1(94-117)肽可具有下列氨基酸序列；
PX1STNRQSGRQPTPX2SPPLRX3X4HP
其中X1、X2、X3和X4可以是任何氨基酸。
优选地，X1独立地为A或V。
优选，X2独立地为L或I。
优选，X3独立地为D、N或T，
优选，X4独立地为T或S。
在一些特别优选的实施方案中，preS1(94-117)肽可具有下列序列中的一种(X1、X2和X3以粗体显示)；
(i)PASTNRQSGRQPTPLSPPLRNTHP
(ii)PASTNRQSGRQPTPLSPPLRTTHP
(iii)PASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHP
来自其他HBV亚型的preS1序列(94-117)可利用公共数据库的常规序列分析进行鉴定。
与preS1(94-117)反应的抗体的存在可通过任何方便的方法测定并且许多合适的技术为本领域所知。例如，样品可以与包括preS1(94-117)表位或由preS1(94-117)表位组成的多肽接触。样品中抗体分子与多肽的preS1(94-117)表位的结合可随后例如通过测量preS1(94-117)肽和样品中抗体间形成的免疫复合物而测定。
抗体分子的结合可通过任何合适的方法测定。用单个的报道分子标记为一种可能。报道分子可直接或间接产生可检测的，优选可测量的信号。报道分子的连接可以是直接或间接的，共价的，例如通过肽键的，或非共价的。通过肽键的连接可以是编码抗体和报道分子的基因融合的重组表达的结果。
例如，抗体或preS1(94-117)肽可以用荧光基团如FITC或若丹明、放射性同位素或非同位素-标记试剂如生物素或地高辛配基标记；包含生物素的抗体可利用″检测试剂″如偶联至任何所希望的标记物如荧光染料的抗生物素蛋白来检测。另一种可能为例如在ELISA测定系统中利用二抗检测抗体与preS1(94-117)抗原的结合。该二抗可例如为结合至人抗体的非-人抗体。取决于所用的测定形式，二抗可以被固定或用可检测的标记物标记。
在一些实施方案中，标记的三抗可用于检测二抗的结合。
测定结合的方式不是本发明的特征并且本领域技术人员能根据其偏爱和常识来选择合适的方式。
用于测定如上所述抗体存在的合适的方法包括蛋白质印迹法、免疫荧光法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定法(IRMA)和免疫酶测定法(IEMA)，包括利用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定法。所有这些方法为本领域所熟知。
用于本发明方法中的如上所述的preS1(94-117)肽可全部或部分地通过化学合成或通过来自编码核酸的重组表达而产生。
PreS1(94-117)肽可根据大家公认的标准的液相或优选固相多肽合成方法很容易地制备，这些方法的常规说明是广泛可得的(参见，例如J.M.Stewart和J.D.Young中，Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)，M.Bodanzsky和A.Bodanzsky中，The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York(1984)；以及Applied Biosystems 430A用户手册，ABI Inc.，Foster City，California)，或其可通过液相方法或通过固相、液相和溶液化学的任何组合而在溶液中制备，例如通过首先完成各自的肽部分，并且随后如果需要和合适的，在除去任何存在的保护基后，通过经相应的碳酸或磺酸或其反应性衍生物的反应引入残基X而制备。
肽可通过将-CONH-肽键用(CH2NH)还原键、(NHCO)后反转键、(CH2-O)亚甲基-氧基键、(CH2S)硫代亚甲基键、(CH2CH2)碳键、(CO-CH2)鲸蜡亚甲基键、(CHOH-CH2)羟基亚乙基键、(N-N)键、E-烯键或CH＝CH-键替换而产生对蛋白质水解的抗性。
还可通过在重组表达系统中表达编码核酸并且分离和/或纯化该表达的肽而方便地生产肽。用于所述表达的合适的技术为本领域所熟知。
用于此处所述方法中的包括preS1(94-117)表位的preS1(94-117)肽或多肽可以是固定化的或非固定化的，即游离在溶液中。
肽可以例如通过附着于用于免疫测定法中的固相支持物而被固定化。支持物可以是颗粒或固体形式并且可包括平板、试管、珠、球、滤器或薄膜。肽可例如被固定至适用于亲和层析中的不溶性支持物。用于固定肽至不溶性支持物的方法为本领域技术人员所知晓。固定化的肽可以是优选的例如以测定法的形式如ELISA。
固相支持物可以是作为不溶性基质的任何材料并且可具有刚性的或半刚性的表面。实例性的固相支持物包括，但不限于如硝酸纤维素(例如，以薄膜或微量滴定孔的形式)；聚氯乙烯(例如，层或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(例如，珠或微量滴定板)；聚偏二氟乙烯；重氮化的纸；尼龙膜；活化的珠、磁性响应珠等的基质。特定的支持物包括平板、小粒、盘、毛细管、中空纤维、针、销、固体纤维、纤维素珠、多孔-玻璃珠、硅胶、任选地与二乙烯基苯交联的聚苯乙烯珠、移植的共聚珠、聚丙烯酰胺珠、乳液珠、任选地与N-N′-双-丙烯酰基乙二胺交联的二甲基丙烯酰胺珠，以及涂有疏水性聚合物的玻璃颗粒。
如果需要的话，添加至固相支持物的分子可很容易地被功能化以产生苯乙烯或丙烯酸酯部分，因此使该分子能够掺入聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或其他的聚合物如聚酰亚胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚乙烯基、聚丁二炔、聚亚苯基-亚乙烯基、多肽、多糖、聚砜、聚吡咯、聚咪唑、聚噻吩、聚醚、环氧树脂类、硅石玻璃、硅胶、硅氧烷、多磷酸盐、水凝胶、琼脂糖、纤维素等。
本发明的另一个方面提供包括preS1(94-117)肽的免疫测定固相支持物。
优选的免疫测定固相支持物如上所述并且包括微量滴定板。
免疫测定固相支持物可通过包括：
(a)提供固相支持物；和
(b)将preS1(94-117)肽结合至所述支持物的方法来生产。
用于将肽结合至固相支持物的技术为本领域所熟知并且在以上更详细地描述了。
免疫测定固相支持物可用于实施本发明的方法。预测患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的个体是否响应干扰素(IFN)治疗的方法可包括：
(a)提供包括preS1(94-117)肽的免疫测定固相支持物，
(b)在这样的条件下将生物样品与所述的固相支持物混合：生物样品中存在所述的肽时，该条件允许与所述肽反应的抗体结合至所述肽；和
(c)检测和/或测量所述抗体和所述肽之间形成的复合物。
复合物可如上所述在复合物形成的条件下通过向来自步骤(b)的固相支持物中添加二抗而检测，其中所述二抗结合来自所述样品的抗体。例如，二抗可以是抗-IgG抗体。二抗可以被可检测地标记。
例如，此处所述的方法可以以ELISA形式进行。微量滴定板的孔可以包被肽并且随后将包含或怀疑包含抗体分子的生物样品添加至所述包被的孔。温育一段足以允许抗体结合至所固定的固相肽的时期后，可洗涤平板以除去未结合的部分并且添加可检测地标记的二级结合分子(例如标记的抗-IgG抗体)。允许这些分子与任何所捕获的结合至该肽的抗体反应，洗涤平板并且利用本领域熟知的方法检测所标记的抗体的存在。
本发明的另一个方面提供用于预测患有乙型肝炎的个体是否响应干扰素(IFN)治疗的试剂盒，该试剂盒包括preS1(94-117)肽。
该肽可以被固定于固相支持物，例如微量滴定板上。
试剂盒可包括用于测定待测样品中目的抗体存在的方法的使用说明书。试剂盒可包括该方法所需的一种或多种其他试剂，如二抗、检测试剂、缓冲溶液等。二抗可被标记。用于测定目的抗体存在或缺乏的试剂盒可包括用于实施该方法的一种或多种物品和/或试剂，如用于提供待测样品本身的工具，例如用于除去样品的注射器和处理样品的容器(所述部件通常为无菌的)。
本发明的另一个方面提供治疗患有乙型肝炎的个体的方法，包括；利用此处所述的方法鉴定响应干扰素(IFN)治疗的个体；和
将IFN给药至所述个体。
IFN可以是IFN-α，例如IFN-α2a/2b或pegIFN-α2a/2b，优选IFN-α2a或pegIFN-α2a(Cooksley等.(2003)J Viral Hepatitis 10：298-305，Manns等.(2001)Lancet 358：958-965)。
IFN-α可在执业医生根据标准操作的监督下给药。例如，通常使用每周三次2.5至5百万单位(MU)每平方米(/MSq)体表面积的干扰素-α的剂量。也可使用更高的干扰素剂量(直至10MU/MSq)并且一些研究表明更高的剂量具有改善的响应速率。或者，每天可给药5百万单位。IFN-α治疗为本领域所熟知并且通常持续4至6个月。
还可用皮质甾类如氢化强的松治疗个体。
鉴于目前公开的内容，本发明各种进一步的方面和实施方案对于本领域技术人员将是显而易见的。说明书中所有引用的文献在此处被引入作为参考。
技术人员将理解本发明可以以上述特征的不同组合和亚-组合来进行，并且所有这些组合和亚-组合，不管是具体描述的或举例说明的，都被本发明所包括。
现在将通过实施例的方式和参考下述附图和表对本发明的某些方面和实施方案进行说明。
图1a显示了采用来自一个响应者的血清样品在一定范围的肽浓度下进行的ELISA。
图1b显示了采用来自一个非响应者的血清样品在一定范围的肽浓度下进行的ELISA。
图2显示了表明该检测系统可重复再现性的ELISA数据。
图3显示了来自用于检测IgG抗-preS1(94-117)反应和与健康对照个体库(n＝20)(虚线)比较的三个HBeAg+波兰儿童(一个响应者和两个非响应者，实线)的预处理血清的分析结果。
图4显示了来自一个响应者(λ)和一个非响应者(ν)的HBeAg+瑞典成年患者的预处理血清的反应性。
图5a显示了来自一个患有慢性HBV-感染的HBeAg+患者血清的分析结果，其此后自发地血清转化为抗-HBe反应性。在添加至preS1(94-117)包被的ELISA平板之前用温育缓冲液而不是抑制剂(s虚线)、preS1(94-117，I虚线)或preS1(21-32，n虚线)温育血清。以405nm处的OD值形式提供数据。
图5b、6a和6b显示了三个患有急性溶解性HB-感染的HBeAg+患者的血清分析的结果。在添加至preS1(94-117)包被的ELISA平板之前用温育缓冲液而不是抑制剂(s虚线)、preS1(94-117，I虚线)或preS1(21-32，n虚线)温育样品。以405nm处的OD值形式提供数据。
图7显示了来自HBeAg+慢性患者的血清分析的结果，将血清用preS1(94-117，λ)、完整的preS1(11-117，σ)或对应于所谓的肝细胞受体(n)的preS1序列(21-47)预孵育。
图8显示了筛查24个中国人HBeAg+患者(图8a)、17个瑞典HBeAg+患者(图8b)和68个健康瑞典献血者(图8c)组的结果。在图中左侧给出了健康对照血清的本底水平(空心环)并且给出了平均值。对每个个体进行OD405nm水平的作图。
图9显示了筛查37个HBeAg+瑞典成人、36个HBeAg+波兰儿童和43个HBeAg+中国成人组的结果。将IgG抗-preS1(94-117)反应性与图右侧的对照血清作了比较。
图10显示了来自一个患有急性溶解性HBV-感染患者的血清样品的分析结果，其在急性感染之前和期间连续检测。X轴给出时间表(临床症状发作前后的天数)。实线给出了IgG抗-preS1(94-117)反应性。
图11显示证实了在十年时间期间连续收集的血清样品中IgG抗-preS1(94-117)反应性，在此期间患有慢性HBV-感染的患者从HBeAg自发地血清转化至抗-HBe反应性(随后的5年后)并且在随后的10年后从HBsAg自发地血清转化至抗-HBs反应性。
图12a显示了用α-IFN(Wellferm)治疗20周的一个响应者患者的IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。在治疗之前、期间和之后收集血清样品并且对抗-preS1的反应性(I实线)和HBV-DNA(I虚线)进行分析(图12b)。在采用健康对照血清库(n＝20)的ELISA平板中的本底水平用虚线(对照1-4)给出。
图12b显示了在来自响应者患者的预处理血清中HBV-DNA的水平。
图13a显示了用α-IFN(Wellferm)治疗20周的一个非响应者患者(图13a)的IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。在治疗之前、期间和之后收集血清样品并且对抗-preS1反应性(I实线，OD405nm))和HBV-DNA(I虚线，pg/ml)进行分析(图12b)。在采用健康对照血清库(n＝20)的ELISA平板中的本底水平用虚线给出(对照1-4)。
图13b显示了在来自非响应者患者的预处理血清中HBV-DNA的水平。
图14a显示了所述的一个响应者患者在用脱氢可的松和α-IFN治疗之前、期间和之后IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。实线给出了抗-preS1反应性的405nm处的OD值。
图14b显示了响应者患者的血清HBV水平。虚线给出了血清HBV-DNA定量测量的结果(pg/ml)。
图15a显示了所述的一个非响应者患者在用脱氢可的松和α-IFN治疗之前、期间和之后IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。实线给出了抗-preS1反应性的405nm处的OD值。
图15b显示了血清HBV-DNA水平的动力学反应。虚线给出了血清HBV-DNA定量测量的结果(pg/ml)。
表1显示了用于预测对IFN-α疗法响应的本方法与之前报道的方法的比较。
表2显示了在IFN治疗前利用本方法筛查HBV患者的结果。
表3显示了在IFN治疗前利用本方法筛查HBV患者的进一步的结果。
实施例
IgG抗-preSl#94-117ELISA
肽：
由HBV亚型adw、adw2和三个所述adr亚型中的两个的preSl#94-117序列组成的肽(即PASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHP)获自Sigma Genosys，London Road，Cambridge，UK。肽以冻干的形式提供，重悬浮于无菌蒸馏水中并且保持在-20℃。纯度为＞95％，由HPLC确定的。
ELISA平板：
微量滴定板；Immunolon 2、目录号011-010-3455的平底平板通过In vitro Sweden AB，Stockholm的瑞典代理从DynatechLaboratories Inc.，Chantilly，Virginia，USA获得。
包被缓冲液：
0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6[将1.59g Na2CO3(目录号S-2127，最低99％，Sigma-Aldrich)和2.93g NaHCO3(目录号S-8875最低99.5％，Sigma-Aldrich)用蒸馏水溶解至1000ml]用作包被缓冲液。将肽稀释至500、1000和2000ng/ml的终浓度。在另一个试验系列中，终浓度为800、1600和3200ng/ml。对于筛查过程，在整个研究过程中使用2000ng/ml的终浓度。每孔添加50μl。
包被过程：
对于最佳包被，通过在40℃温育4小时而装载平板并且此后在使用之前在4℃下过夜保存在冷藏库中。
在此处所述的整个筛查过程中，在用于测定法之前将平板在4℃下过夜储存(图1A)。
ELISA平板的洗涤：
在下列每个步骤：1)包被平板，2)用患者-或对照-血清温育，3)用偶联物温育后，用含有0.05％Tween的0.05M NaCl(目录号S-7653，Sigma Ultra最低99.5％，Sigma-Aldrich)洗涤平板。
将平板每次温育5-10分钟通过手工洗涤三次(例如无自动化的洗涤)。
用患者血清温育：
将患者血清稀释于包含0.05％ Tween20(聚氧化乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯，目录号P-1379，Sigma-Aldrich Sweden AB)和1％胎牛血清(FBS，56℃热-灭活90分钟)(目录号10106-151 Gibco BRL，Life Technologies)的0.05M磷酸缓冲盐(PBS)中至1/125稀释，用于筛查过程或在两步稀释中从1/125稀释至1/16000，用于滴定试验。将稀释的血清(50μl/孔)在平板上在4℃温育过夜。(对于该组实验期间，未分析较短的温育时间)。稀释试剂中的蛋白质含量是很重要的并且已较早地已经发现1％FBS在这类″位点特异性的″ELISA系统过程中是最优的。
与偶联物温育：
抗-人IgG偶联物：使用用碱性磷酸酶标记的从山羊亲和分离的人IgG抗体(γ-链特异的)(目录号A-3187，Sigma Aldrich)。
将偶联物在包含0.05％Tween和1％FBS的PBS中稀释到1/1000并且在平板上在4℃温育过夜。
底物：
将在二乙醇胺HCl中的磷酸对硝基苯基酯用作底物：将Sigma 104磷酸酶底物(磷酸对硝基苯基酯二钠盐六水合物)5mg片剂溶于5ml二乙醇胺HCl，pH9.8[97ml二乙醇胺(目录号D-8885最低98％)，101mg MgCl26H2O(目录号M-0250，氯化镁六水合物，Sigma-Aldrich)和约160ml 1MHCl(盐酸，1mol/l，Riedel-de Haen，35328，Sigma-Aldrich 01780)溶于1000ml蒸馏水中以得到pH9.8]。
平板的读数：
在温育在5-60分钟范围内变化的不同时间后，在TITERTEKMultiskan Plus光度计(Flow Laboratories，Edinburgh，Scotland)中测量405nm处的吸光度(OD)值。在最优条件下在温育20-30分钟后读取平板的读数。
标准(N)值：
采集来自二十个健康献血者的血清并且用作对照血清(n＝20)。
用于筛查未知患者血清的目的，重要的是测试不同的对于IgG、IgM和IgA抗-肝炎(A、B、C、D和E)标志物是阴性的对照血清。在来自Abbott实验室的市场上可买到的检测系统中测试对照血清。避免在灰色区域的10-20％±截止值内具有反应性的血清。
在这些测定条件下，对照(n＝20)血清的平均OD405值±5SD相当于样品与标准(N)的比值(S/N)≥2.5。
具有阳性反应性的患者血清：
对于筛查过程，将患者血清和对照血清稀释到1/125并且测定反应性。S/N值≥2.5被认为是阳性的。
血清滴度：
将患者血清和对照血清从1/125稀释至1/16000并且测定反应性。此后可找到阳性反应性的边界点。
抑制实验：
将等体积的稀释的(PBS-Tween-1％FBS)患者血清和抑制剂(PBS-Tween-1％FBS)在4℃下温育4小时并且此后转移到包被的ELISA平板上，随后进行上述过程。
所用的抑制试剂：preS1#94-117、preS1#21-32、preS1#11-117、preS1#21-47。
统计学：
将无参数的Mann-Whitney U检验用于比较患者组之间的数据。
当组中的个体≥5时，使用卡方检验来比较不同患者组中反应性个体的数目。
当患者组小于5时使用Fisher精确检验。
用于固相(例如ELISA平板)装载的肽蛋白质的最佳浓度。
给固相(即ELISA平板)装载500、1000或2000ng肽/ml。对来自一个响应者(图1a)和一个非响应者(图1b)的HBeAg-反应性患者(实线)的血清样品与″健康的″对照血清(虚线)库(n＝20)进行了比较。将血清稀释到1/125并且分析IgG抗-preS1(94-117)反应性。给出405nm处的OD值。
对于响应者患者(瑞典成人)，在用α-IFN(Wellferm)治疗20周之前(-1周)、期间(4、6和18周)和之后(4、9和18个月)(图1a)收集血清样品。
对于非响应者患者(瑞典成人)，在治疗之前(时间0)、期间(4、10和14周)和之后(18个月)收集血清样品。
响应者患者具有IgG抗-preS1(94-117)反应性的预处理血清，而来自非响应者患者的预处理血清缺乏可检测的抗-preS1抗体水平。
200ng/ml的平板包被得到最低的本底水平。
此后在整个对于筛查过程的研究中使用2000ng/ml preS1(94-117)肽的固相载荷。
可重复再现性
该检测系统的可重复再现性在图2中显示。当每隔一个月检测相同的血清样品时，得到了上述响应者患者的反应性。
在测定系统中IgG抗-preS1(94-117)反应性的患者血清的曲线轮廓。
检测来自三个HBeAg+波兰儿童(一个响应者和两个非响应者，实线)的预处理血清的IgG抗-preS1(94-117)反应性并且与健康的对照个体(虚线)库(n＝20)相比较(图3)。分两步将血清从1/125稀释至1/16000并且数据呈现为405nm处的OD值。
与来自两个阴性的非响应者患者(▲和■)预处理血清相比，预处理的响应者患者血清(●)包含高滴度的(边界点4000)IgG抗-preS1(94-117)。
图4表明了来自一个响应者(●)和一个非响应者(■)的HBeAg+瑞典成人患者的预处理血清的反应性。
来自响应者患者的预处理血清为阳性的，具有高滴度的(2000)IgG抗-preS1(94-117)抗体，而来自非响应者的预处理血清缺乏可检测的抗体水平。
IgG抗-preS1(94-117)ELISA的特异性。
IgG抗-DreS1(94-117)反应性的抑制。
将来自一个患有慢性HBV-感染的HBeAg+患者(图5a)(该患者随后自发地血清转化为抗-HBe反应性)以及三个患有急性溶解性HB-感染的HBeAg+患者(图5b、6a和6b)的血清在添加至preS1(94-117)包被的ELISA平板之前与温育缓冲液而不是抑制剂(▲虚线)、preS1(94-117)(●实线)或preS1(21-32)(■虚线)一起温育。数据以405nm处的OD值提供。
可溶性的preS1(94-117)肽抑制100％的IgG抗-preS1(94-117)反应性，而来自preS1 N末端部分的preS1肽(21-32)不抑制。
将来自HBeAg+慢性患者的血清与preS1(94-117，●)、完整的preS1(11-117，▲)或对应于所谓的肝细胞受体(n)的preS1序列(21-47，■)一起预孵育(图7)。
可溶性的preS1(94-117)肽抑制IgG抗preS1(94-117)反应性达到100％。而无关的preS1肽不抑制。
在不同的随后的时间IgG抗-preS1(94-117)ELISA的灵敏度
在治疗结束后(表2)的12(Fu 12)至18(Fu 18)个月时，13个中的12个(92％)HBeAg+患者响应用α-IFN单独或与脱氢可的松结合的治疗。通过病毒复制的消除来判断响应，就如通过血清HBV-DNA的定量测量和/或从HBeAg至抗-HBe反应性的血清转化评估的那样。
在表2中被分类为阴性的响应者患者具有临界反应性并且在一些实验中为阳性，而在其他实验中为阴性。该患者的反应性模式可采用更多的血清样品重复检测。
相反，所有的非响应者患者(0/9，0％)缺乏可检测的IgG抗-preS1(94-117)水平(表3)。在响应者和非响应者患者之间，IgG抗-preS1(94-117)反应性的差异是显著的(p＜0.0005)。
对于另一组治疗后1、2、3或6个月的HBeAg+患者(表2和3)，与非响应者患者(p＜0.0005)相比，6/7(86％)的响应者患者具有可检测的IgG抗-preS1(94-117)水平的预处理样品。
预处理中的IgM抗-preS1(94-117)的反应性在响应者和非响应者患者之间的差异不显著(表2和3)。
与其他预示性的标志物比较。
还分析了与非响应者患者相比来自响应者的预处理样品的IgM抗-HBc(样品/截止，S/CO)、转氨酶(ALT，μkat/L)、血清HBV-DNA(pg/ml)的含量和组织学(CPH或CAH)(表2和3)。
这些参数已较早地在搜索预示性标志物的内容中讨论过。对于在该研究中检测的患者，在两个患者组之间没发现显著性差异。
对肝细胞受体的第一个或第二个部分具有特异性的IgM和IgG抗体；preS1(12-32)或preS1(32-47)，在响应者和非响应者患者之间差异不显著(表2和3)。
来自患有慢性HBV-感染患者(瑞典人，波兰人和中国人)的HBeAg 反应性血清组的血清中IgG抗-preS1(94-117)的反应性。
为了筛查，将患者和对照血清稀释到1/125。来自三个不同实验的结果被描述在图8a-c中。在图中左侧给出了健康对照血清的本底水平(空心圆圈)并且给出了平均值。
对24个中国HBeAg+患者(图8a)、17个瑞典HBeAg+患者(图8b)和68个健康瑞典献血者(图8c)组中的每个个体的OD405nm水平进行作图。
在另一组实验中(图9)对37个HBeAg+瑞典成人、36个HBeAg+波兰儿童和43个HBeAg+中国成人组的每个个体的405nmOD值进行作图。将IgG抗-preS1(94-117)的反应性与图右侧的对照血清的这种反应性作了比较。
样品(S)与标准(N)的比值＞2.5被判断为阳性反应性的截止值。其相当于平均对照值±5-6SD。
HBeAg+患者组(22-25％)血清中具有可检测的IgG抗-preS1(94-117)水平。不管人种的来源(例如中国人或瑞典人)，来自HBeAg+患者的IgG抗-preS1(94-117)反应性血清的频率是相同的。
在急性HBV-感染期间血清中IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学 反应。
对来自患有急性溶解性HBV-感染的一个患者的血清样品在急性感染之前和期间进行连续检测(图10)。X轴给出时间表(临床症状发作前后的天数)。实线给出IgG抗-preS1(94-117)反应性。在临床症状发作之前血清样品对IgG抗-preS1(94-117)是阴性的而在临床症状发作后为反应性的。在HBeAg/抗-HBe血清转化(36天)时IgG抗-preS1(94-117)反应性到达峰值但是在HBsAg/抗-HBs血清转化(162天)时衰减了。
虚线给出了具有健康的对照血清库(n＝20)的平板的本底值。
自发地血清转化为抗-HBe并且随后转化为抗-HBs的HBeAg慢性患 者中IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。
图11证实了在十年时间期间连续收集的血清样品中IgG抗-preS1(94-117)的反应性，在此期间患有慢性HBV-感染的患者从HBeAg自发地血清转化为抗-HBe反应性(在随后的5年后；月/年4/83))并且在随后的10年后(月/年1/88)从HBsAg自发地血清转化为抗-HBs反应性。在HBe-抗血血症期间血清IgG抗-preS1(94-117)反应性波动，在血清转化至抗-Hbe后达到峰水平并且在血清转化至抗-HBs反应性的时期内下降。
与非响应者患者相比，在响应者中用α-IFN治疗期间IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。
用α-IFN(Wellferm)治疗20周的一个响应者(图12a)和一个非响应者(图13a)患者的IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。在治疗之前、期间和之后收集血清样品并且对抗-preS1反应性(I实线)(图12a和13a)和HBV-DNA(I虚线，pg/ml)(图12b和13b)进行分析(图12b)。在采用健康对照血清库(n＝20)的ELISA平板中的本底水平用虚线给出(对照1-4)。
来自响应者患者的预处理血清包含抗-preS1抗体和HBV-DNA(图12a和12b)，而来自非响应者患者的预处理血清具有高水平的HBV-DNA但是缺乏可检测的IgG抗-preS1(94-117)水平(图13a和13b)。
对PreSlN的末端部分具有特异性的血清抗体的存在是动态的并且在治疗日程期间波动。对于响应者患者，反应性在从HBeAg血清转化至抗-HBe反应性时达到峰值。
在结合脱氢可的松、α-IFN治疗期间，IgG抗-preS1(94-117)反应性 的动力学反应。
描述了用脱氢可的松和α-IFN治疗之前、期间和之后一个响应者(图14a)和一个非响应者(图15a)患者的IgG抗-preS1(94-117)反应性的动力学反应。实线给出抗-preS1反应性的405nm处的OD值(图14a和15a)并且虚线为血清HBV-DNA的定量测量的结果(pg/ml)(图14b和15b)。响应者患者的抗-preS1的阳性预处理水平(图14a)。
预示性的标志物对有或没有结合氢化强的松治疗的α-IFN治疗是有效的。
与已知的预示性标志物的比较
基于预处理数据的对IFN-α疗法的预示性的反应已预先通过利用各种统计学模型进行了研究。
Lau等.，1998 Journal of Viral Hepatitis 5：105-114给出了33％响应者和67％非响应者的随机预测，参见表1.通过利用具有预处理变量(性别、肝纤维化、ALT水平)的二级逻辑模型其将响应者的数目从33％提高至61％(例如灵敏度和从67％至76％的非响应者(例如特异性))。通过Smiles逻辑回归，响应者对非响应者的数目分别增至77％和87％。
Brook等.，1989 Hepatology 10：761-763通过利用预处理变量AST水平和急性肝炎的病史将灵敏度从33％提高至77％并且将特异性从67％提高至79％。
Perillo等.，1993 Hepatology 18：1306-1312利用了使用预处理变量HBeAg和ALT水平的分步Cox回归分析。灵敏度和特异性分别被提高到81％和46％。
Lindh等和S_derstr_m等使用预处理变量HBV-DNA(分别＜500百万拷贝/ml和160百万拷贝/毫升)。灵敏度分别为51％和67％并且特异性分别为74％和89％。以结合的方式，第一组(Lindh等.)治疗成人，而后者组(S_derstr_m，等.)治疗儿童。
从此处所述的非-侵袭性测定法获得的数据表明在随后的12-18个月，灵敏度从33％提高至92％并且特异性从67％提高至100％(表1和2)。
| 随机预测 | 响应者 | 非响应者 |
| Lau等.，1998利用预处理变量(性别、肝纤维化和ALT水平)的二步逻辑模型 | 33％ | 67％ |
| 灵敏度 | 特异性 | |
| 61％ | 76％ | |
| Smiles逻辑回归掺入了参数间的相互作用 | 77％ | 87％ |
| Brook等.，1989预处理参数(AST水平和急性肝炎的病史) | 77％ | 79％ |
| Perillo等.，1993分步Cox回归分析(预处理参数HbeAg浓度和ALT水平) | 81％ | 46％ |
| Lindh等.，2001(联合治疗)预处理参数HBV-DNA(＜500百万拷贝/ml) | 51％ | 74％ |
| S_derstr_m等.，2003(联合治疗，儿童)预处理参数HBV-DNA(160百万拷贝/ml) | 67％ | 89％ |
| Hellstr_m和Sylvan(新数据)预处理血清中IgG抗-preSl(94-117)抗体的存在随后的12-18个月时间 | 92％ | 100％ |
| Lau等(Journal of Viral Hepatitis 5：105-114，1998)Brook等(Hepatology 10：761-763，1989)Perillo等(Hepatology 18：1306-1312，1993)Lindh等(Journal of Viral Hepatitis 8：349-357，2001)S_derstr_m等.，2003(论文) |
表1
| 响应者患者OreS1 | 预处理抗-PreS1标志物 | |||||||||||||
| IgG抗-preS1 | IgM抗-p | IgM | a-HBc ALT | HBV-DNA | 组织学 | |||||||||
| 名称 | 年龄 | 性别 | 治疗 | 随后 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | ||||
| 2442246124212482*Kanafekα-10Dziewa33732111950209010172324n＝13 | 瑞典成年人瑞典成年人瑞典成年人瑞典成年人波兰人2 1/4中国人35波兰人5 1/2波兰人12 1/2波兰人4波兰人5 5/12波兰人5波兰人4波兰人2 | MMMMMFFFMFMMM | IFNIFNIFNIFNIFNST/IFNST/IFNIFNIFNIFNIFNIFNIFN | Fu18Fu18Fu18Fu18Fu18Fu18Fu12Fu12Fu12Fu12Fu12Fu12Fu12 | 阴性的阴性的阳性的阴性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的10阳性的77％ | 阳性的阴性的阳性的阴性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阴性的阴性的阳性的9阳性的69％ | 阳性的阳性的阳性的阴性的*阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的12阳性的92％ | 阳性的阳性的阴性的阴性的阳性的阳性的阳性的阳性的阴性的阴性的阳性的阳性的阳性的9阳性的69％ | 阳性的阳性的阴性的阴性的阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阴性的阳性的阳性的阳性的10阳性的77％ | 阳性的阳性的阴性的阴性的阳性的阳性的阳性的阳性的阴性的阴性的阳性的阳性的阳性的9阳性的69％ | 2.30.61.52.20.61.54.21.40.50.40.30.31.91.4±0.3 | 583366542202335114534450134±42 | 19812690691535361077781640±721 | CAHCAHCAHCAHCAHCAHCAHCAHCAH9CAH100％ |
| *有时是阳性的/有时是阴性的 | a) | b) | c) | d) | e) | f) | g) | h) | i) | k) | ||||
表2a
| 非响应者患者 | 预处理抗-PreS1标志物 | |||||||||||||
| IgG抗-preS1 | IgM抗-preS1 | IgM | a-HBc ALT | HBV-DNA | 组织学 | |||||||||
| 名称 | 年龄 | 性别 | 治疗 | 随后 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | ||||
| 24622443SuchanDunczykZyfertGorbacz71831α-6n＝13 | 瑞典成年人瑞典成年人波兰人4 1/12波兰人2 1/6波兰人5 2/3波兰人6 1/2波兰人1 1/3波兰人13 5/12中国人33 | MMMMMMMFM | IFNIFNIFNST/IFNST/IFNST/IFNIFNIFNST/IFN | Fu18Fu18Fu18Fu12Fu12Fu12Fu12Fu12Fu12 | 阴性的阴性的阳性的阳性的阴性的阳性的阳性的阴性的阴性的4阳性的44％a)NS | 阳性的阳性的阳性的阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的阴性的5阳性的56％b)NS | 阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的0阳性的0％c) | 阴性的阴性的阴性的阳性的阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的3阳性的33％d)NS | 阴性的阴性的阴性的阴性的阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的2阳性的22％e)NS | 阴性的阴性的阴性的阴性的阳性的阴性的阴性的阴性的阴性的1阳性的11％f)NS | 5.92.11.90.50.80.60.30.40.51.4±0.6g)NS | 575713613697±23h)NS | 306413,8801607805503686±2598i)NS | CAHCAHCAHCAHCAHCAHCAH6CAH86％k)NS |
P＜0.0005
表2b
| 表3响应者患者 | 预处理抗-PreS1标志物 | ||||||||||||
| IgG抗-preS1 | IgM抗-preS1 | IgM | a-HBc ALT | HBV-DNA | 组织学 | ||||||||
| 名称 | 年龄 | 性别 | 治疗随后 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | ||||
| KaminskaWalasik1462337A3Zlotek*B1 | 波兰人1y 9/12波兰人12 1/2波兰人12波兰人2中国人40波兰人4 1/2中国人36 | FMMMFMM | IFN Fu6IFN Fu6IFN Fu6IFN Fu6IFN Fu6ST/IFN Fu6IFN Fu3 | 阳性的阳性的阴性的阳性的阳性的阳性的阳性的 | 阳性的阳性的阴性的阳性的阴性的阳性的阴性的 | 阳性的阳性的阳性的阳性的阳性的阴性的*阳性的 | 阴性的阴性的阴性的阳性的阳性的阴性的阴性的 | 阳性的阳性的阴性的阴性的阳性的阴性的阳性的 | 阳性的阳性的阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的 | 2.60.90.41.91.11.10.5 | 12667195 | 708246 | CPHCAHCPHCAHCAHCAHCAH |
| n＝7 | 6阳性的86％a) | 4阳性的57％b) | 6阳性的86％c) | 2阳性的29％d) | 5阳性的71％e) | 4阳性的57％f) | 1.2±0.3g) | 129±37h) | 477±231i) | 5CAH71％k) | |||
*关闭该患者是R或NR很困难
表3a
| 非响应者患者 | 预处理抗-PreS1标志物 | |||||||||||||
| IgG抗-preS1 | IgM抗-preS1 | IgM | a-HBc ALT | HBV-DNA | 组织学 | |||||||||
| 名称 | 年龄 | 性别 | 治疗 | 随后 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | 21-32 | 32-47 | 94-117 | ||||
| Firlagα-96989605504083229541683572535A11A4B4 | 波兰人8中国人37波兰人2 5/6波兰人3 4/12波兰人1岁8/12波兰人2波兰人4 5/12波兰人2波兰人6岁4个月波兰人8岁3个月中国人39中国人38中国人28 | MMMFMMMFMFMMM | ST/IFNST/IFNIFNIFNIFNIFNIFNIFNIFNIFNIFNIFNIFN | Fu6Fu6Fu6Fu6Fu6Fu6Fu3Fu3Fu3Fu3Fu2Fu1Fu1 | 阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阳性的阳性的阳性的 | 阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的阳性的阳性的阴性的阴性的阴性的阳性的阴性的阳性的 | 阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的 | 阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阳性的阴性的阳性的阳性的阳性的阴性的阴性的阴性的 | 阴性的阴性的阴性的阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的阴性的 | 阴性的阴性的阴性的阳性的阴性的阳性的阴性的阴性的阴性的阳性的阳性的阴性的阴性的 | 0.30.80.20.20.30.31.10.50.50.41.76.1 | 4015711922583192273855140 | 21014.310157 | CPHCAHCAHCAHCAHCAHCAHCPHCPHCAHCAHCAHCAH |
| n＝13 | 5阳性的38％a)NS | 6阳性的46％b)NS | 0阳性的0％c) | 4阳性的31％d) | 2阳性的15％e)NS | 4阳性的31％f)NS | 1.0±0.5g)NS | 10±33h)NS | 4892±4708i)NS | 10CAH77％k)NS | ||||
p＜0.0005
表3b
Claims (23)
1.预测患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的个体是否响应干扰素(IFN)治疗的方法，该方法包括：在获自该个体的样品中测定与(preSl94-117)肽反应的抗体的存在或不存在，所述样品中所述抗体的存在指示所述个体将响应所述的治疗。
2.根据权利要求1的方法，包括检测所述样品中所述抗体的存在，因此确定该个体将响应IFN治疗。
3.根据权利要求1的方法，包括检测所述样品中所述抗体的缺乏，因此确定该个体不响应IFN治疗。
4.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所述的个体患有慢性HBV感染。
5.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所述的个体为HBeAg阳性的。
6.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所述的个体为HBeAg阴性的。
7.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所述的抗体为IgG或IgM抗体。
8.根据前述权利要求中任何一项的方法，其中所述的样品为血液、血清或血浆样品。
9.根据前述权利要求中任何一项的方法，包括：将样品与preSl(94-117)肽接触；和测定所述抗体与所述肽的结合。
10.根据权利要求9的方法，其中所述的肽包括可检测的标记。
11.根据权利要求9的方法，其中所述肽被固定化。
12.根据权利要求9至11中任何一项的方法，其中采用标记的二抗来检测所述的结合。
13.用于预测患有乙型肝炎的个体是否响应干扰素(IFN)治疗的试剂盒，该试剂盒包括preSl(94-117)肽。
14.根据权利要求13的试剂盒，其中所述肽被固定于固相支持物上。
15.根据权利要求14的试剂盒，其中所述固相支持物为微量滴定板。
16.根据权利要求13至15中任何一项的试剂盒，进一步包括结合至人抗体的标记的二抗。
17.根据权利要求13-16的任何一项的试剂盒，进一步包括用于检测所标记的二抗的结合的试剂。
18.根据权利要求13-17的任何一项的试剂盒，进一步包括洗涤缓冲液。
19.根据权利要求13-18的任何一项的试剂盒，进一步包括处理样品的容器。
20.治疗个体中乙型肝炎感染的方法，包括：利用权利要求1至12的任何一项的方法鉴定响应干扰素(IFN)治疗的个体；和将IFN给药至所述个体。
21.根据权利要求20的方法，其中IFN为α-IFN。
22.根据权利要求20或权利要求21的方法，其中将皮质甾类给药至所述的个体。
23.预测患有乙型肝炎病毒(HBV)感染的个体是否响应干扰素(IFN)治疗的方法，其基本上如参考附表和附图在此处所述的那样。
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