JP4486647B2 - Ｂ型肝炎感染症に関連する方法及び手段 - Google Patents

Ｂ型肝炎感染症に関連する方法及び手段 Download PDF

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Description

本発明はB型肝炎（HBV）感染症を治療するためのインターフェロン（IFN）の使用、及びより詳細には、IFN治療が有益である可能性の高いHBV患者の同定に関する。
B型肝炎感染症は、高罹患率及び死亡率と関連する（Niederau C.ら(1996) The New England Journal of Medicine 334, 1422-1427）。HBV感染は肝硬変、肝機能不全、肝細胞癌及び死と関連する（Dudley FJら(1972) Lancet ii: 1388-1393; Hoofnagle JHら(1983) Chronic type B hepatitis: Clinical course. In: Viral Hepatitis and Delta Infection. New York; Alan R Liss Inc, 1983; 41-53; Weissberg Jら(1984) Annal Internal Medicine 101: 613-616.; Fattovich G.ら(1986) Hepatology 6: 167-172; Popper Hら(1987) Hepatology 7: 764-772）。
いくつかの無作為の臨床試験は、組み換えインターフェロンα（IFN-α）による治療が有意な臨床的有益性を付与することを報告している。B型肝炎e抗原（HBeAg）の除去率は、IFN治療によって、低率である5〜10％の自発的クリアランスから約24〜30％まで増加した（Hoofnagle JHら(1988) Gastroenterology 95: 1318-1325.; Alexander GJMら(1987) Lancet 2: 66-69; Brook MGら(1989) Gut: 130: 1116-1122; Saracco Gら(1989) Hepatology 10: 336-341.; Perillo RPら(1990) New England Journal of Medicine 323: 295-301.; Tine Fら(1993) Journal of Hepatology 18: 154-162; Cooksley WGEら(2003) Journal of Viral Hepatitis 10: 298-305）。肝炎e抗原のインターフェロン誘導除去は、肝細胞癌の発生率の低減を伴う（Yang H-Iら(2002) The New England Journal of Medicine 347: 168-174）。
IFN治療と関連した副作用を考えると、インターフェロン療法に応答する可能性の高い患者を同定する能力は、治療に関する忠告をする際に有用であろう（Lau DT-Yら(1998) Journal of Viral Hepatitis 5: 105-114）。
患者がインターフェロン治療に応答するか否かを予測する際に使用するための一連のマーカー（トランスアミナーゼ、HBV-DNA、HBeAg、HBV preS1抗原、及びHBcAg又はHBeAgに対するIgM抗体の血清レベルを含む）が提案されてきた（Krogsgaardら, 1994 Journal of hepatology 21: 646-655; Brookら, 1989b Hepatology 10: 761-763; Perilloら, 1988 前掲; Dienstagら, 1995, New Journal England Medicine 333: 1657-1661; Villeneuveら, 1996 Cancer Journal Gastroenterology 10: 21-25; Janssenら, 1999 Hepatology 30: 238-243; Brunettoら, 1993 Journal of Hepatology 19: 431-436; Marinosら, 1994 Hepatology 19: 303-311）。
PreS1抗原（PreS1 Ag）はHBV感染の間、血清中で検出可能であり、IFN応答の予測因子であることのみならず、抗ウイルス療法を受けている慢性的に感染した患者中に残存するHBVの複製をモニターする、信頼のあるマーカーであることが示唆されてきた（Petit MAら(1990) Hepatology 11: 809-814; Petit MAら(1992a) Archieves of Virology Suppl 4: 105-112; Petit MAら(1992b) Virology 187: 211-222; Petit MAら(1994) Journal of Hepatology 20: 47-56; Fengら, 1995 Zhonghua Yixue Jianyan Zazhi 18: 154-157; Ibarraら, 1989 Liver 9: 153-158; Miら, 1999 Chinese Medical Journal 112: 321-324; Buffello-Le Guillouら, 2000 Journal of Viral Hepatitis 7: 387-392）。
preS1 抗原の一部分の合成ペプチドアナログ（preS1 ♯ 21−47）は、細胞レセプター及び抗HBV抗体の両者によって認識される。さらに、このペプチドは天然のHBVと反応する抗体を誘起する。preS1特異的ペプチド1−21、12−32、32−53及び94−117の内、ペプチド12−32のみがヒト抗HBVによって強く認識される（Neurathら, 1986 Cell 46: 429-436; Neurath AR (1988a) Advances Virus Research 34: 65-142; Neurath AR (1988b) Ann.Inst.Pasteyr/Virol 139: 13-38）。
preS1抗原に対する特異性を持つ血清抗体は、急性HBV感染症で早期から証明されてきた（Albertiら, 1978 British Medical Journal 14: 1056-1058; Theilmannら, 1986 Hepatology 6: 186-190; Hellstrom及びSylvan, 1988 Progress in Medical Virology 35: 76-106; Budowskaら(1990) Hepatology 12: 1271-1277; Budowskaら(1992) Hepatology 15: 26-32）。慢性B型肝炎に罹患した22.7％（15/66）の患者は、C末端（94-117）preS1配列に対する抗体（急性期抗（21−32）及び抗（32−47）反応性とは異なり、ウイルス沈降性抗体として挙動しない抗体）に関して陽性であった。19人の急性B型肝炎患者の半数以上が疾患の回復の間に抗preS1(21-119)抗体を生じたが、この応答はわずかな慢性患者でのみ認められた（Weiら(2002) World Journal of Gastroenterology 8: 276-281）。
本発明者らは、HBV感染症に罹患した個体由来のサンプルにおける、B型肝炎表面抗原（HBsAg）抗原のPreS1成分の特定の部分に反応性の抗体の存在が、個体を治療する際のインターフェロン（IFN）の有効性と密接に相関することを見出した。
本発明の一態様は、B型肝炎ウイルス（HBV）に感染した個体がインターフェロン（IFN）治療に応答するか否かを予測する方法であって、該方法が、該個体から得たサンプルにおいてpreS1(94-117)ペプチドと反応性の抗体の存在又は量を決定することを含む、上記方法を提供する。
サンプルにおけるpreS1（94-117）ペプチドと反応性の抗体の存在は、この個体が前記治療が有益であろう応答者（すなわち、IFN治療に応答するであろう人）であることを示す。
IFN治療に応答する個体（すなわち応答者）は、IFN治療に応答して、HBV感染症の1以上の症状の改善を示し得る。例えば、HBV感染症と関連する1以上のバイオマーカーのレベル（血清HBeAgレベル等）は、該治療に応答する個体のIFN治療によって低減又は除去され得る。
本明細書に記載される方法は、B型肝炎ウイルス（HBV）感染症に罹患している個体がインターフェロン（IFN）治療に対する応答者であるか否かを判定することに使用し得る。したがって、方法には、前記ペプチドと反応性の抗体を有する個体をINF治療に対する応答者として同定することが含まれ得る。
この方法を用いて分析するのに適当な個体は、慢性又は急性B型肝炎感染症を有し得る。個体はHBV感染症の1以上の症状を示してもよく、例えば、個体はHBeAg陽性であり得る。
preS1(94-117)ペプチドと反応性の抗体は、preS1(94-117)ペプチドと結合又は反応する抗体分子である。
いくつかの実施形態では、preS1(94-117)ペプチド等の抗原と反応性の抗体は、この抗原以外の分子との任意の有意な結合を示さなくてもよい（すなわち、特異的な結合を示してもよい）。ある場合では、抗体はいくつかの抗原に保有される特定のエピトープ（preS1(94-117)エピトープ等）と特異的に結合してもよく、この場合、この抗体はこのエピトープを保有する様々な抗原と結合することができよう。したがって、preS1(94-117)エピトープに対する抗体は、preS1抗原等のpreS1(94−117)エピトープを含む他のペプチド及びポリペプチドとも結合し得る。
本明細書に記載される方法に従ってその存在が判定されるpreS1(94-117)と反応性の抗体分子は、外来の抗原に応答して、個体の免疫系によって産生される任意の免疫グロブリン分子（例えば、IgG、IgD、IgM、IgA又はIgE）であり得る。好適な実施形態では、IgG分子が検出される。
preS1(94-117)ペプチドはHBV preS1配列の残基94〜117から構成し得る。HBV preS1配列は、HBVの任意のサブタイプ（例えばサブタイプayw、adyw、adw、adw2又はadrを含む）に由来し得る。preS1のペプチド配列はNeurath AR, Kent SB (1988) Advances Virus Research 34: 65-142及びNeurath ARら(1988) Ann.Inst.Pasteur/Virol 139: 13-38に記載される。
いくつかの好適な実施形態では、preS1(94-117)ペプチドは以下のアミノ酸配列を有し得る；
Figure 0004486647
[ここで、X1、X2、X3及びX4は任意のアミノ酸であり得る]
X1が独立にA又はVであることが好ましい。
X2が独立にL又はIであることが好ましい。
X3が独立にD、N又はTであることが好ましい。
X4が独立にT又はSであることが好ましい。
いくつかの特に好適な実施形態では、preS1(94-117)ペプチドは以下の配列の1つを有し得る（X1、X2及びX3は太字で示される）；
Figure 0004486647
他のHBVサブタイプに由来するpreS1(94-117)の配列は、公開データベースの慣用的な配列分析を用いて同定し得る。
preS1(94-117)と反応性の抗体の存在は、当技術分野で公知の任意の慣用的な手段及び多くの適当な技術によって決定し得る。例えば、サンプルはpreS1(94-117)エピトープを含むか又はpreS1(94-117)エピトープからなるポリペプチドと接触され得る。次いで、サンプル中の抗体分子とこのポリペプチドのpreS1(94-117)エピトープとの結合を、例えばpreS1(94-117)とサンプル中の抗体との免疫複合体形成を測定することによって測定し得る。
抗体分子の結合は、適当な任意の手段によって測定し得る。個々のレポーター分子によるタグ付けが1つの可能性である。レポーター分子は、直接的に又は間接的に、検出可能な及び好ましくは測定可能なシグナルを形成し得る。レポーター分子の結合は、直接的若しくは間接的、共有（例えば、ペプチド結合を介する）又は非共有結合であり得る。ペプチド結合を介した結合は、抗体及びレポーター分子をコードする遺伝子融合の組み換え発現の結果であり得る。
例えば、抗体又はpreS1(94-117)ペプチドは、FITC若しくはローダミン等の蛍光団、放射性同位体、又はビオチン若しくはジゴキシゲニン等の非同位体標識試薬（non-isotopic-labelling reagent）で標識してもよく、ビオチンを含む抗体は「検出試薬」（蛍光発色団等の所望の任意の標識とコンジュゲートしたアビジン等）を用いて検出し得る。別の可能性は、例えばELISAアッセイ系において、二次抗体を用いて抗体とpreS1(94-117)抗原との結合を検出することである。二次抗体は、例えばヒト抗体に結合する非ヒト抗体であり得る。使用するアッセイ方式に応じて、二次抗体は固定化し得るか、又は検出可能な標識で標識され得る。
いくつかの実施形態では、標識した三次抗体を二次抗体の結合を検出するために使用し得る。
結合を測定する様式は本発明の特徴ではなく、当業者は自身の好み及び一般的な知識に従って適当な様式を選択することができる。
上述される抗体の存在を判定するための適当なアプローチには、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光法、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、免疫放射定量測定法（IRMA）及び免疫酵素アッセイ（IEMA）（モノクローナル及び/又はポリクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイを含む）が含まれる。これらの全てのアプローチは当技術分野で周知である。
本発明の方法に使用するための、上述のpreS1(94-117)ペプチドは、化学合成によって又はコード核酸からの組み換え発現によって完全に又は部分的に作製し得る。
preS1(94-117)ペプチドは、十分に確立された標準的な液体又は、好ましくは固相ペプチド合成法（その全般的な記述は広く利用可能である（例えば、J.M. Stewart及びJ.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 第2版, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), M. Bodanzsky及びA. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984);並びにApplied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California）参照）に従って容易に調製することができ、あるいはこれらは、液相法によって溶液中で、又は固相、液相及び溶液化学の任意の組み合わせによって（例えば、最初に各ペプチド部分を完成させて、その後、所望かつ適切な場合には、存在する任意の保護基の除去後、各炭酸若しくはスルホン酸又はその反応性誘導体の反応による残基Xの導入によって）調製し得る。
ペプチドは、(CH2NH)還元化結合、(NHCO)レトロインバーソ（retro inverso）結合、(CH2-O)メチレン-オキシ結合、(CH2S)チオメチレン結合、(CH2CH2)炭素結合、(CO-CH2)セトメチレン（cetomethylene bond）、(CH0H-CH2)ヒドロキシエチレン結合、(N-N)結合、E-アルセン（alcene）結合又はCH=CH結合による-CONH-ペプチド結合の置換によって、タンパク質分解に対して耐性とし得る。
ペプチドはまた、組み換え発現系においてコード核酸を発現させ、発現されたペプチドを単離及び/又は精製することによって都合よく作製し得る。かかる発現に適切な技術は当技術分野で周知である。
本明細書に記載される方法で使用するための、preS1(94-117)エピトープを含むpreS1(94-117)ペプチド又はポリペプチドは、固定化されても又は固定化されなくても（すなわち溶液中に遊離していても）よい。
ペプチドは、例えば、イムノアッセイに使用するための固体支持体との結合によって固定されてもよい。この支持体は、微粒子又は固体形態であってもよく、プレート、試験チューブ、ビーズ、球、フィルター又は膜を含み得る。ペプチドは、例えばアフィニティーカラムクロマトグラフィーにおける使用に適当な不溶性支持体と固定されてもよい。不溶性支持体へペプチドを固定する方法は当業者に公知である。固定化したペプチドは、例えばELISA等のアッセイ方式を好み得る。
固体支持体は不溶性マトリックスでありかつ硬質又は半硬質の表面を有し得る任意の物質であり得る。例示的な固体支持体には、これに限定されるものではないが、ニトロセルロース（例えば、膜又はマイクロタイターウェル形式で）；ポリビニルクロライド（例えば、シート又はマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズ又はマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビリニデン（polyvinylidine fluoride）；ジアゾ化ペーパー；ナイロン膜；活性化ビーズ；磁気反応性ビーズ（magnetically responsive bead）等の支持体が含まれる。特定の支持体には、プレート、ペレット、ディスク、毛管、中空繊維、針、ピン、固体繊維、セルロースビーズ、多孔性ガラスビーズ、シリカゲル、ジビニルベンゼンと随意に架橋結合したポリスチレンビーズ、グラフト化共重合体ビーズ（copoly bead）、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、N-N'-ビス-アクリロイルエチレンジアミンと随意に架橋結合したジメチルアクリルアミドビーズ、及び疎水性ポリマーでコートされたガラス粒子が含まれる。
所望であれば、固体支持体に付加されるべき分子はスチレン又はアクリレート部分を作製するために容易に官能化することができ、それによってポリスチレン、ポリアクリレート、又は他のポリマー（ポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、ポリサッカライド、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエーテル、エポキシ、シリカガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリホスフェート、ヒドロゲル、アガロース、セルロース等）への該分子の組込みを可能にする。
本発明の別の態様は、preS1(94-117)ペプチドを含むイムノアッセイ固体支持体を提供する。
好適なイムノアッセイ固体支持体は上述されるものであり、マイクロタイタープレートが含まれる。
イムノアッセイ固体支持体は、
(a)固体支持体を準備すること；及び
(b)preS1(94-117)ペプチドを前記支持体と結合させること
を含む方法によって作製し得る。
固体支持体へペプチドを結合させるための技術は当技術分野で周知であり、上でより詳細に記載されている。
イムノアッセイ固体支持体は本発明の方法を実施する際に有用であり得る。B型肝炎ウイルス（HBV）感染症に罹患した個体がインターフェロン（IFN）治療に応答するか否かを予測する方法は、
(a)preS1(94-117)ペプチドを含むイムノアッセイ固体支持体を準備すること、
(b)前記ペプチドと反応性の抗体が生物学的サンプル中に存在する際に該ペプチドとの結合を可能にする条件下で、生物学的サンプルと前記固体支持体とを混合すること、及び
(c)前記抗体と前記ペプチドとの間で形成された複合体を検出及び/又は測定すること
を含み得る。
複合体は、複合体形成条件下で工程(b)の固体支持体に二次抗体（該二次抗体は前記サンプル由来の抗体と結合する）を添加することによって上述されるように検出し得る。例えば、二次抗体は抗IgG抗体であり得る。二次抗体は検出可能に標識し得る。
例えば、本明細書に記載される方法はELISA方式で実施し得る。マイクロタイタープレートのウェルは前記ペプチドでコートすることができ、その後、抗体分子を含む生物学的サンプル又は抗体分子を含むと推測される生物学的サンプルがコートされたウェルに添加される。抗体を固定した固相ペプチドと結合させるのに十分なインキュベーション期間後に、非結合部分を除去するためにプレートを洗浄することができ、検出可能に標識された結合性二次分子（例えば標識化した抗IgG抗体）が添加される。これらの分子は、ペプチドと結合した任意の捕獲抗体と反応することが可能であり、プレートが洗浄され、標識化抗体の存在が当技術分野で周知の方法を用いて検出される。
本発明の別の態様は、B型肝炎に罹患した個体がインターフェロン（IFN）治療に応答するか否かを予測する際に使用するためのキットであって、preS1(94-117)ペプチドを含む、上記キットを提供する。
このペプチドは、固体支持体（例えばマイクロタイタープレート）上に固定化し得る。
このキットは、試験サンプル中の目的の抗体の存在を判定する方法に使用するための使用説明書を含んでもよい。キットはこの方法に必要な1以上の別の試薬（二次抗体、検出試薬、緩衝液等）を含んでもよい。二次抗体は標識し得る。目的の抗体の存在又は不在を判定する際に使用するためのキットは、この方法の実施のための1以上の物品及び/又は試薬（試験サンプル自体を準備する手段等、例えばサンプルを取り出すための注射器及びサンプル処理容器（かかる成分は一般的には滅菌されている））を含んでもよい。
本発明の別の態様では、B型肝炎に罹患している個体を治療する方法であって、本明細書に記載される方法を用いてインターフェロン（IFN）に応答するものとして個体を同定すること、及びIFNを該個体に投与することを含む、上記方法を提供する。
IFNはIFN-α、例えばIFN-α 2a/2b又はpegIFN-α 2a/2b、好ましくはIFN-α2a又はpegIFN-α 2a(Cooksleyら(2003) J Viral Hepatitis 10: 298-305, Mannsら(2001) Lancet 358: 958-965)であり得る。
IFN-αは標準的技法に従って、医師の監督下で投与し得る。例えば、体表面積１平方メートル当たり（/MSq）2.5〜5百万ユニットのインターフェロン-αの、1週間に3回の投与が一般的に使用される。より高い用量（最大で10MU/MSq）のインターフェロンも使用することができ、いくつかの研究は、より高い用量が応答割合を改善することを示している。あるいは、5百万ユニットを毎日投与し得る。IFN-α治療は当技術分野で周知であり、典型的には4〜6ヶ月続く。
個体はプレドニゾロン等のコルチコステロイドによっても治療し得る。
本発明の様々な更なる態様及び実施形態は、この開示を参酌して当業者に明らかであろう。本明細書で引用された全ての文書は参照により本明細書に組み入れる。
当業者は、本発明が上述される特徴の様々な組合せ又は部分的組み合わせを用いて実施可能であること、及び具体的に記載又は例示されているか否かを問わず、これらの全ての組合せ及び部分的組合せが本発明に包含されることを理解するであろう。
本発明の特定の態様及び実施形態を、具体例によって、及び下記に記載される図面及び表を参照しながら以下に説明する。
図1aは1人の応答者由来の血清サンプルを用いたELISAをペプチド濃度の範囲で示す。
図1bは1人の非応答者由来の血清サンプルを用いたELISAをペプチド濃度の範囲で示す。
図2は試験系の再現性を示すELISAデータを示す。
図3は、IgG抗-preS1(94-117)反応性について試験し、かつ健康な対照個体のプール（n=20）（点線）と比較した、3人のHBeAg＋のポーランド人の小児由来の前処理血清の分析結果（1人の応答者、及び2人の非応答者、実線）を示す。
図4は、1人の応答者（λ）及び1人の非応答者（ν）であるHBeAg＋のスウェーデン人の成人患者由来の前処理血清の反応性を示す。
図5aは、後に自発的に抗HBe反応性に血清変換した、慢性HBV感染症に罹患した1人のHBeAg＋患者由来の血清の分析結果を示す。preS1(94-117)をコートしたELISAプレートへの添加前に、血清をインキュベーションバッファー（阻害剤の代用、ｓ点線）、preS1(94-117、I点線)又はpreS1(21-32、n点線)と共にインキュベートした。データは405nmでのOD値として与えられる。
図5b、6a及び6bは、急性消退性（resolving）HB感染症に罹患した3人のHBeAg＋患者の分析結果を示す。preS1(94-117)でコートしたELISAプレートへの添加前に、サンプルをインキュベーションバッファー（阻害剤の代用、s点線）、preS1(94-117、I点線)又はpreSI（21-32、n点線）と共にインキュベートした。データは405nmでのOD値として与えられる。
図7は、preS1(94-117、λ)、完全なpreS1(11-117、σ)又はいわゆる肝細胞レセプターに対応するpreS1配列（21-47）（n）と共にプレインキュベートしたHBeAg＋慢性患者由来の血清の分析結果を示す。
図8は、24人の中国人HBeAg＋患者（図8a）、17人のスウェーデン人HBeAg＋患者（図8b）及び68人の健康なスウェーデン人の供血者（図8c）、の群（cohort）のスクリーニング結果を示す。健康な対照血清のバックグラウンドレベルを図の左に表し（白丸）、平均値を表した。OD405nmレベルは各個体についてプロットされた。
図9は、37人のHBeAg＋のスウェーデン人の成人、36人のHBeAg＋のポーランド人の小児及び43人のHBeAg＋の中国人の成人、の群（cohort）のスクリーニングの結果を示す。IgG抗preS1(94-117)反応性は、対照血清のもの(図の右)と比較される。
図10は、急性感染前及び急性感染中に逐次的に試験した、急性消退性HBV感染症に罹患した1人の患者由来の血清サンプルの分析結果を示す。X軸にタイム・スケジュール（臨床症状の発症前後の日）を表す。実線はIgG抗preS1(94-117)反応性を表す。
図11は、慢性HBV感染症に罹患した患者がHBeAgから抗HBe反応性へ自発的に血清変換する間の10年間（追跡の5年後）に、及びHBsAgから抗HBs反応性への10年間の追跡後に、連続的に収集した血清サンプル中のIgG抗preS1(94-117)反応性を示す。
図12aは、α-IFN（Wellferm）によって20週間治療した1人の応答患者に関する、IgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答（kinetic responses）を示す。血清サンプルを治療前、治療中及び治療後に収集し、抗preS1反応性（Ｉ実線）及びHBV-DNA(Ｉ点線)について分析した（図12b）。健康な対照血清のプール（n=20）を用いたELISAプレートのバックグラウンドレベルは点線で表される（対照1〜4）。
図12bは、応答患者由来の前処理血清中のHBV-DNAのレベルを示す。
図13aは、α-IFN(Wellferm)によって20週間治療した1人の非応答(図13a)患者に関する、IgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答を示す。血清サンプルを治療前、治療中及び治療後に収集し、抗preS1反応性（I実線、OD 405nm）及びHBV-DNA（Ｉ点線、pg/ml）について分析した（図12b）。健康な対照血清のプール(n=20)を用いたELISAプレート中のバックグラウンドレベルは点線で表される（対照1〜4）。
図13bは非応答患者由来の前処理血清中のHBV-DNAのレベルを示す。
図14aは、プレドニゾン及びα-IFNによる治療前、治療中及び治療後に描いた、1人の患者に関するIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答を示す。実線は抗preS1反応性に関する405nmでのOD値を表す。
図14bは、応答患者の血清HBVレベルを示す。点線は血清HBV-DNAの定量的測定の結果を表す(pg/ml)。
図15aは、プレドニゾンとα-IFNによる治療前、治療中及び治療後に描いた、1人の非応答患者のIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答を示す。実線は抗preS1反応性の405nmでのOD値を表す。
図15bは、血清HBV-DNAレベルの動力学的応答を示す。点線は血清HBV-DNAの定量的測定の結果を表す（pg/ml）。
表1は、以前に報告された方法と比較した、IFN-α療法に対する応答を予測する本発明の方法の比較を示す。
表2は、IFN治療前に本発明の方法を用いてHBV患者をスクリーニングした結果を示す。
表3は、IFN治療前に本発明の方法を用いてHBV患者をスクリーニングした更なる結果を示す。
実施例
IgG抗preS1 ♯ 94-117 ELISA
ペプチド：
HBVサブタイプadw、adw2、及び記載した3つのadrサブタイプの内の2つの、preS1 ♯94-117配列(すなわちPASTNRQSGRQPTPISPPLRDSHP)からなるペプチドをSigma Genosys（London Road, Cambridge, UK）から取得した。このペプチドを凍結乾燥して供給し、滅菌蒸留水中に再懸濁して−20℃で維持した。純度はHPLCによって＞95％であった。
ELISAプレート：
マイクロタイタープレート；平底プレートであるImmunolon 2(カタログ番号011−010-3455)を、スウェーデンの代理店であるIn vitro Sweden AB（Stockholm）を介してDynatech Laboratories Inc.（Chantilly Virginia, USA）から取得した。
コーティングバッファー：
0.05M 炭酸ナトリウムバッファー、pH9.6[1.59g Na2CO3(カタログ番号S-2127, min99%, Sigma-Aldrich)及び2.93g NaHCO3 (カタログ番号S-8875 min 99.5%, Sigma-Aldrich）を滅菌水で1000mlとした]をコーティングバッファーとして用いた。ペプチドは500、1000及び2000ng/mlの終濃度まで希釈した。別の試験系では、終濃度は800、1600及び3200ng/mlであった。スクリーニング手順に関して、この研究を通じて2000ng/mlの終濃度を用いた。ウェル当たり50μlを加えた。
コーティング手順：
最適なコーティングのために、プレートを40℃で4時間のインキュベーションによって充填し、その後、使用前に4℃で一晩、冷蔵庫中に保存した。
本明細書に記載されるスクリーニング手順を通じて、プレートはアッセイに使用する前、4℃で一晩保存した（図1A）。
ELISAプレートの洗浄：
1)プレートのコーティング、2）患者又は対照の血清とのインキュベーション、3）コンジュゲートとのインキュベーションの各工程後に、プレートを0.05％ Tweenを含む0.05M NaCl（カタログ番号S-7653, SigmaUltra min 99.5%, Sigma-Aldrich）で洗浄した。
プレートを手で（例えば、自動化洗浄なく）3回洗浄した（毎回5〜10分インキュベートしながら）。
患者の血清とのインキュベーション：
患者の血清を、0.05％ Tween 20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート, カタログ番号P-1379, Sigma-Aldrich Sweden AB)及び1％ウシ胎児血清（FBS, 熱不活化 56oC 90 分）(カタログ番号10106-151 Gibco BRL, Life Technologies)を含む0.05M リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で、スクリーニング手順については1/125に、又は滴定実験については1/125〜1/16000の二段階で希釈した。希釈した血清（50μl/ウェル）をプレート上4℃で一晩インキュベートした（この実験セットを通じて、これより短いインキュベーション時間は分析しなかった）。希釈試薬中のタンパク質含量は重要であり、1％ FBSが、このタイプの「部位特異的」ELISA系を通じて、最適にすることが早くから判っている。
コンジュゲートとのインキュベーション：
抗ヒトIgGコンジュゲート：アルカリホスファターゼで標識した、ヤギ由来のヒトIgG(γ鎖特異的)に対する単離したアフィニティー抗体を用いた（カタログ番号A-3187, Sigma Aldrich）。
コンジュゲートを0.05％ Tween及び1％FBSを含むPBSで1/1000に希釈し、プレート上4℃で一晩インキュベートした。
基質：
ジエタノールアミンHCl中のp-ニトロフェニルリン酸を基質として用いた：Sigma 104ホスファターゼ基質（p-ニトロフェニルリン酸ジナトリウム6水和物）の5mgの錠剤を5mlのジエタノールアミンHCl（pH9.8）[97mlジエタノールアミン(カタログ番号D-8885 min 98%), 101mg MgCl26H2O (カタログ番号M-0250, 塩化マグネシウム6水和物, Sigma-Aldrich) 及び約160mlの1M HCl(塩酸, 1mol/l, Riedel-de Haen, 35328, Sigma-Aldrich 01780)を1000mlの蒸留水中でpH9.8とした]に溶解した。
プレートの読み取り：
405nmでの光学密度（OD）値を、異なる時間（5〜60分間で変化する）のインキュベーション後に、TITERTEK Multiskan Plus Photometer(Flow Laboratories, Edinburgh, Scotland)で測定した。最適条件でプレートをインキュベーションの20〜30分後に読み取った。
正常（N）値：
20人の健康な供血者由来の血清をプールして、対照血清として使用した（n=20）。
未知の患者の血清のスクリーニング目的のために、異なる対照血清がIgG、IgM及びIgA抗肝炎（A、B、C、D及びE）マーカーの検査で陰性と出たことが重要である。対照血清はAbbott Laboratoriesから市販されている試験系で試験した。グレーゾーン10〜20％±カットオフ値範囲内の反応性を有する血清を避けた。
これらのアッセイ条件を通じて、対照（n=20）血清の平均OD405値±5SDは、正常（N）値（S/N）≧2.5を超えるサンプル（S）と同等であった。
陽性の反応性を有する患者血清：
スクリーニング手順に関して、患者及び対照の血清を1/125希釈し、反応性についてアッセイした。2.5以上のS/N値を陽性とみなした。
血清の力価：患者及び対照の血清を1/125〜1/16000に希釈し、反応性についてアッセイした。陽性反応性の終点は後に見出すことができた。
阻害実験：
等容量の希釈した（PBS-Tween-1％ FBS）患者血清と阻害剤（PBS-Tween-1％ FBS）とを4℃で4時間インキュベートし、その後、コートしたELISAプレートへ移し、上述の手順に供した。
使用した阻害試薬：preS1 ♯94-117、preS1 ♯21-32、preS1 ♯11-117、preS1 ♯21-47。
統計：
ノンパラメトリックなマンホイットニーU検定を用いて患者のグループ間のデータを比較した。
カイ二乗検定を用いて異なる患者群中の応答個体数を比較した（群中の個体が5以上の場合）。
患者群が5より小さい場合にはフィッシャーの正確検定を用いた。
固相（例えばELISAプレート）を充填するペプチドタンパク質の最適濃度
固相（すなわち、ELISAプレート）を1ml当たり500、1000又は2000ngのペプチドで充填した。1人の応答者（図1a）及び1人の非応答者（図1b）のHBeAg反応性患者由来の血清サンプル（実線）を「健康な」対照血清（点線）のプール（n=20）と比較した。血清を1/125希釈して、IgG抗preS1(94-117)反応性について分析した。405nmでのOD値を表す。
応答患者（スウェーデン人の成人）については、血清サンプルを20週間のα-IFN（Wellferm）による治療前（-1週）、治療中（4、6及び18週）及び治療後（4、9及び18ヶ月）に収集した（図1a）。
非応答患者（スウェーデン人の成人）については、血清サンプルを治療前（時間0）、治療中（4、10及び14週）及び治療後（18ヶ月）に収集した（図1b）。
応答患者はIgG抗preS1(94-117)反応性の治療前血清を有したが、非応答患者由来の治療前血清は検出可能なレベルの抗preS1抗体を欠いた。
プレートの200ng/mlコートは最も低いバックグラウンドレベルを与えた。2000ng/mlのpreS1(94-117)ペプチドによる固相の充填を、その後、スクリーニング手順のための研究を通して使用した。
再現性
試験系の再現性は図2に示される。反応性は、同一の血清サンプルを1ヶ月間隔で試験した際に、上述されるように応答患者について提供される。
アッセイ系におけるIgG抗preS1(94-117)応答患者の血清の曲線プロファイル
3人のHBeAg＋ポーランド人の小児（1人が応答者で、2人が非応答者、実線）由来の治療前血清をIgG抗preS1(94-117)反応性について試験し、健康な対照個体のプール（n=20）(点線)と比較した（図3）。血清を1/125から1/16000に二段階希釈し、データを405nmでのOD値として示した。
治療前の応答患者の血清（黒丸）は、陰性であった非応答患者（黒三角及び黒四角）由来の2つの治療前血清と比較して、高いIgG抗preS1(94-117)力価（終点4000）を含んでいた。
図4は1人の応答者（黒丸）及び1人の非応答者（黒四角）のHBeAg＋スウェーデン人の成人患者由来の治療前血清の反応性を示す。
応答患者由来の治療前血清は、高力価(2000)のIgG抗preS1(94-117)抗体によって陽性であったが、非応答者由来の治療前血清は検出可能なレベルの抗体を欠いた。
IgG抗preS1(94-117)ELISAの特異性
IgG抗preS1(94-117)反応性の阻害
慢性HBV感染症に罹患した1人のHBeAg＋患者（後に抗HBe反応性へ自発的に血清変換した）（図5a）及び急性消退性HB感染症に罹患した3人のHBeAg＋患者（図5b、6a及び6b）由来の血清を、preS1(94-117)をコートしたELISAプレートへの添加前に、インキュベーションバッファー（阻害剤の代用、黒三角、点線）、preS1(94-117)（黒丸、実線）又はpreS1(21-32)（黒四角、点線）と共にインキュベートした。データは405nmでのOD値として表される。
可溶性preS1(94-117)ペプチドはIgG抗preS1(94-117)反応性を100％まで阻害したが、preS1のN末端部分由来のpreS1ペプチド（21-32）は阻害しなかった。
HBeAg＋慢性患者由来の血清をpreS1(94-117、黒丸)、完全なpreS1(11-117、黒三角)又はいわゆる肝細胞レセプター（n）に対応するpreS1配列（21-47、黒四角）と共にプレインキュベートした（図7）。
可溶性preS1(94-117)ペプチドはIgG抗preS1(94-117)反応性を100％まで阻害した。一方、無関係のpreS1ペプチドは阻害しなかった。
異なる追跡時間でのIgG抗preS1(94-117)ELISAの感受性
13人のHBeAg＋患者の内の12人（92％）が、治療の終了後12（Fu12）〜18（Fu18）ヶ月まで追跡した際に、α-IFN単独での治療又はプレドニゾロンと併用した治療に応答した（表２）。応答は、血清HBV-DNAの定量的測定及び/又はHBeAgから抗HBe反応性への血清変換によって評価されるウイルス複製の排除によって判断した。
表2で陰性として分類される応答患者はボーダーラインの反応性を有し、幾つかの実験では陽性であったが、他の実験では陰性であった。この患者の反応性パターンは更なる血清サンプルで再試験してもよい。
対照的に全ての非応答患者（0/9、0％）は検出可能なレベルのIgG抗preS1(94-117)（表3）を欠いた。応答患者と非応答患者との間のIgG抗preS1(94-117)反応性における差異は有意であった（p<0.0005）。
別セットのHBeAg＋患者（治療後1、2、3又は6ヵ月追跡）については（表2及び3）、0/13(0％)の非応答患者と比較して6/7（86％）の応答患者（p＜0.0005）が、検出可能なレベルのIgG抗preS1(94-117)を含む治療前サンプルを有した。
治療前のIgM抗preS1(94-117)反応性は、応答患者と非応答患者との間で有意に異ならなかった（表2及び3）。
他の予測マーカーとの比較
非応答患者と比較した応答患者由来の治療前サンプルは、IgM抗HBc(サンプル/カットオフ、S/CO)、トランスアミナーゼ（ALT、μkat/L）、血清HBV-DNA（pg/ml）及び組織学（CPH又はCAH）の内容についても分析した。これらのパラメーターは、予測マーカーの探索の観点で早くから議論されてきた。この研究で試験した患者については、2群の患者間で有意な差異は認められなかった。
肝細胞レセプターの第1又は第2部分（preS1(12-32)又はpreS1(32-47)）に対する特異性を有するIgM及びIgG抗体は、応答患者と非応答患者間で有意に異ならなかった（表2及び3）。
慢性HBV感染症に罹患した患者（スウェーデン人、ポーランド人及び中国人）由来のHBeAg反応性の血清の群（cohort）からの、血清中のIgG抗preS1(94-117)反応性
スクリーニングのために、患者及び対照血清を1/125希釈した。3つの異なる実験からの結果を図8a〜cに示す。健康な対照血清のバックグラウンドレベルを図の左に表し（白丸）、平均値を表す。
OD405nmレベルを、24人の中国人HBeAg＋患者（図8a）、17人のスウェーデン人HBeAg＋患者（図8b）及び68人の健康なスウェーデン人の供血者（図8c）の群中の各個体についてプロットした。
別セットの実験において（図9）、405nmでのOD値を、37人のHBeAg＋スウェーデン人の成人、36人のHBeAg＋ポーランド人の小児及び43人のHBeAg＋中国人の成人の群中の各個体についてプロットした。IgG抗preS1(94-117)反応性を、図の右の対照血清のものと比較した。
正常（N）値を超える（＞2.5）サンプルが、陽性反応性のカットオフ値として判断される。これは平均対照値±5−6SDに等しい。
HBeAg＋患者の群（22〜25％）は、血清中に検出可能なレベルのIgG抗preS1(94-117)を有する。HBeAg＋患者由来のIgG抗preS1(94-117)反応性血清の頻度は、人種起源（例えば中国人又はスウェーデン人）とは無関係に同じであった。
急性HBV感染の間の、血清中のIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答（kinetic response）
急性消退性HBV感染症に罹患した1人の患者由来の血清サンプルを、急性感染前及び感染中に逐次的に試験した（図10）。X軸にタイムスケジュールを表す（臨床症状の発生前後日）。実線はIgG抗preS1(94-117)反応性を表す。血清サンプルは、臨床症状の発生前にはIgG抗preS1(94-117)について陰性であったが、発生後は反応性であった。IgG抗preS1(94-117)反応性はHBeAg/抗HBe血清変換時（36日）にピークであったが、HBsAg/抗HBs血清変換時（162日）には低下した。
点線は健康な対照血清のプール（n=20）による、プレートのバックグラウンド値を表す。
抗HBeへ自発的に血清変換した後に抗HBsへ自発的に血清変換するHBeAg慢性患者におけるIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答
図11は、慢性HBV感染症に罹患した患者がHBeAgから抗HBe反応性へ自発的に血清変換した間の10年間（追跡の5年後；月/年 4/83）に、及びHBsAgから抗HBs反応性への10年間の追跡後（月/年 1/88）に、連続的に収集した血清サンプル中のIgG抗preS1(94-117)反応性を立証する。血清IgG抗preS1(94-117)反応性はHBe-antigenimiaの間に変動し、抗HBeへの血清変換後にピークレベルに達し、抗HBs反応性への血清変換の間に減少する。
非応答患者と比較した、応答者におけるα-IFNによる治療の間のIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答
20週間の間α-IFN（Wellferm）で治療した1人の応答患者（図12a）と1人の非応答患者（図13a）に関するIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答。血清サンプルを治療前、治療中及び治療後に収集し、抗preS1反応性（実線）（図12a及び13a）及びHBV-DNA（点線、pg/ml）（図12b及び13b）について分析した。健康な対照血清のプール（n=20）を有するELISAプレートのバックグラウンドレベルは点線によって表される（対照1〜4）。
応答患者由来の治療前血清は抗preS1抗体及びHBV-DNAを含み（図12a及び12b）、一方、非応答患者由来の前処理血清は高レベルのHBV-DNAを含んだが検出可能なレベルのIgG抗preS1(94-117)を欠いた（図13a及び13b）。
preS1のN末端部分に対する特異性を有する血清抗体の存在は、治療計画の間、動的でありかつ変動している。応答患者については、反応性はHBeAgから抗HBe反応性への血清変換時にピークに達した。
プレドニゾンと併用したα-IFN治療中のIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答
1人の応答患者（図14a）及び1人の非応答患者（図15a）に関するIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答を、プレドニゾン及びα-IFNによる治療前、治療中及び治療後に図示した。実線は抗preS1応答性についての405nmでのOD値を表し（図14b及び15b）、点線は血清HBV-DNA（pg/ml）の定量的測定の結果を表す（図14b及び15b）。応答患者に関する抗preS1の陽性治療前レベル（図14a）。
予測マーカーは、プレドニゾンによる併用治療による又はよらないα-IFN治療のいずれについても有効である。
既知の予測マーカーとの比較
治療前データに基づくIFN-α療法に対する応答の予測は、既に様々な統計モデルの使用によって調査されてきた。
Lauら, 1998 Journal of Viral Hepatitis 5: 105-114は、33％の応答者と67％の非応答者となるべき恣意的な予測を提供した（表1参照）。治療前変量（性別、肝繊維症、ALTレベル）を含む二段階ロジスティックモデルの使用によって、これらは応答者の数を33％から61％（例えば感受性）、及び非応答者は67％から76％（例えば特異性）に増加した。
Smilesロジスティック回帰によって、応答者数と非応答者の数は、それぞれ77％及び87％に増加した。
Brookら, 1989 Hepatology 10: 761-763は、治療前変量である急性肝炎のASTレベルと病歴とを使用して、感受性を33から77％まで増加し、特異性を67から79％まで増加した。
Perilloら, 1993 Hepatology 18: 1306-1312は、治療前変量HBeAg及びALTレベルによるステップワイズCox回帰分析を用いた。感受性及び特異性はそれぞれ81％及び46％まで上昇した。
Lindhら及びSoderstromらは治療前変量HBV-DNA（それぞれ1ml当たり＜5億コピー及び1ml当たり1億6千万コピー）を用いた。感受性はそれぞれ51％と67％であり、特異性はそれぞれ74％と89％であった。最初の群（Lindhら）は併用レジメンで成人を治療し、後者の群（Soderstromら）は小児を治療した。
本明細書に記載される無侵襲アッセイから得たデータは、12〜18ヶ月の追跡により、感受性が33％から92％まで上昇し、特異性が67％から100％まで上昇したことを示す（表1及び2；neg, 陰性；pos, 陽性）。
Figure 0004486647
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図1aは1人の応答者由来の血清サンプルを用いたELISAをペプチド濃度の範囲で示す。 図1bは1人の非応答者由来の血清サンプルを用いたELISAをペプチド濃度の範囲で示す。 図2は試験系の再現性を示すELISAデータを示す。 図3は、IgG抗-preS1(94-117)反応性について試験し、かつ健康な対照個体のプール（n=20）（点線）と比較した、3人のHBeAg＋のポーランド人の小児由来の前処理血清の分析結果（1人の応答者及び2人の非応答者、実線）を示す。 図4は、1人の応答者（λ）及び1人の非応答者（ν）であるHBeAg＋のスウェーデン人の成人患者由来の前処理血清の反応性を示す。 図5aは、後に自発的に抗HBe反応性に血清変換した、慢性HBV感染症に罹患した1人のHBeAg＋患者由来の血清の分析結果を示す。 図5bは、急性消退性HB感染症に罹患した3人のHBeAg＋患者の分析結果を示す。 図6aは、急性消退性HB感染症に罹患した3人のHBeAg＋患者の分析結果を示す。 図6bは、急性消退性HB感染症に罹患した3人のHBeAg＋患者の分析結果を示す。 図7は、preS1(94-117、λ)、完全なpreS1(11-117、σ)又はいわゆる肝細胞レセプターに対応するpreS1配列（21-47）（n）と共にプレインキュベートしたHBeAg＋慢性患者由来の血清の分析結果を示す。 図8は、24人の中国人HBeAg＋患者（図8a）、17人のスウェーデン人HBeAg＋患者（図8b）及び68人の健康なスウェーデン人の供血者（図8c）、の群（cohort）のスクリーニング結果を示す。 図9は、37人のHBeAg＋のスウェーデン人の成人、36人のHBeAg＋のポーランド人の小児及び43人のHBeAg＋の中国人の成人、の群(cohort)のスクリーニングの結果を示す。 図10は、急性感染前及び急性感染中に逐次的に試験した、急性消退性HBV感染症に罹患した1人の患者由来の血清サンプルの分析結果を示す。 図11は、慢性HBV感染症に罹患した患者がHBeAgから抗HBe反応性へ自発的に血清変換する間の10年間（追跡の5年後）に、及びHBsAgから抗HBs反応性への10年間の追跡後に、連続的に収集した血清サンプル中のIgG抗preS1(94-117)反応性を示す。 図12aは、α-IFN（Wellferm）によって20週間治療したある応答患者に関する、IgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答（kinetic responses）を示す。 図12bは、応答患者由来の前処理血清中のHBV-DNAのレベルを示す。 図13aは、α-IFN(Wellferm)によって20週間治療した1人の非応答患者に関する、IgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答を示す。 図13bは非応答患者由来の前処理血清中のHBV-DNAのレベルを示す。 図14aは、プレドニゾン及びα-IFNによる治療前、治療中及び治療後に描いた、1人の患者に関するIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答を示す。 図14bは、応答患者の血清HBVレベルを示す。点線は血清HBV-DNAの定量的測定の結果を表す(pg/ml)。 図15aは、プレドニゾンとα-IFNによる治療前、治療中及び治療後に描いた、1人の非応答患者のIgG抗preS1(94-117)反応性の動力学的応答を示す。 図15bは、血清HBV-DNAレベルの動力学的応答を示す。点線は血清HBV-DNAの定量的測定の結果を表す（pg/ml）。

Claims (19)

  1. B型肝炎ウイルス（HBV）感染症に罹患した個体がインターフェロン（IFN）治療に応答するか否かを予測する方法であって、前記方法が、
    前記個体から得たサンプルにおいてpreS1(94-117)ペプチドと反応性の抗体の存在又は不在を判定することを含み、
    前記サンプル中の前記抗体の存在が、前記個体が前記治療に応答することを示す、
    上記方法。
  2. 前記サンプル中の前記抗体の存在を検出し、それによって前記個体がIFN治療に応答すると判定することを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記サンプル中の前記抗体の不在を検出し、それによって前記個体がIFN治療に応答しないと判定することを含む、請求項1に記載の方法。
  4. 個体が慢性HBV感染症に罹患している、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 個体がHBeAg陽性である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 個体がHBeAg陰性である請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  7. 抗体がIgG又はIgM抗体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
  8. サンプルが血液、血清又は血漿サンプルである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
  9. サンプルとpreS1(94-117)ペプチドとを接触させること、及び前記ペプチドと前記抗体との結合を測定することを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
  10. ペプチドが検出可能な標識を含む、請求項9に記載の方法。
  11. ペプチドが固定化されている、請求項9に記載の方法。
  12. 前記結合が標識化二次抗体によって検出される、請求項9〜11のいずれか1項に記載の方法。
  13. preS1(94-117)ペプチドを含む、B型肝炎に罹患した個体がインターフェロン（IFN）治療に応答するか否かを予測する際に使用するためのキット。
  14. 前記ペプチドが固体支持体上に固定されている、請求項13に記載のキット。
  15. 前記固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項14に記載のキット。
  16. ヒト抗体に結合する標識化二次抗体をさらに含む、請求項13〜15のいずれか1項に記載のキット。
  17. 標識化二次抗体の結合を検出するための試薬をさらに含む、請求項13〜16のいずれか1項に記載のキット。
  18. 洗浄バッファーをさらに含む請求項13〜17のいずれか1項に記載のキット。
  19. サンプル処理容器をさらに含む請求項13〜18のいずれか1項に記載のキット。
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