CN1904604A - 一种用于毛细管电泳的微体积试样引入装置及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种应用于毛细管电泳的微体积试样引入方法及其使用装置,该装置由毛细管和可移动的试样管-缓冲液管阵列组成,通过调节试样管移出毛细管进口端的速度和角度,以及调节毛细管进口端插入试样溶液的深度,可方便地控制进样量,实现微体积试样引入。本发明的优点是可实现毛细管电泳分析的微体积试样引入,试样区带宽度小于100微米,系统可在较短的分离时间内获得较高的分离效率,该装置结构简单,易实现分析过程的自动化操作。
Description
技术领域
本发明涉及的领域为毛细管电泳分析,特别是涉及一种用于毛细管电泳的微体积试样引入装置及其使用方法。
背景技术
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)是目前分析科学中发展最迅速的分离分析技术之一,具有分析效率高、速度快、试样和溶剂消耗少等优点,因而被广泛应用于化学、环境、生命科学等领域,特别是在DNA测序、蛋白质分离和单细胞分析等研究中具用非常重要的作用。
CE的传统进样方法有电动进样、压力进样和扩散进样。电动进样是依据电泳和电渗原理而被普遍应用于CE进样的一种方法。该方法仅需要高压电源提供进样的动力,即可实现完全的自动化操作。但电动进样对试样中的不同组分存在“歧视效应”,即电迁移速度大的组分进样量多,电迁移速度小的组分进样量少甚至不进样。压力进样,是利用毛细管两端的压力差作为进样动力,驱动管中液体流动,从而将试样带入管内。压力进样没有试样歧视效应,设备简单。扩散进样是根据分子扩散原理,当毛细管进口端插入试样溶液时,试样分子因管口界面的浓度差向管内扩散,从而实现进样。扩散进样可得到较窄的试样区带,但是进样时间长,而且扩散系数不同的试样组分进样量也有差别。
自发进样(Spontaneous Injection或Ubiquitous Injection)是指当进样电压为零或压力差为零时,仍会有少量试样进入毛细管的反常现象。1994年Zare等研究了自发进样的成因(Fishman,H.A.;Amudl,N.M.;Lee,T.T.et.al.Anal.Chem.1994,66:2318-2329),发现当毛细管进口端从试样溶液中垂直的拔出时,会有试样液滴残留在管口,并在表面张力的作用下迅速进入毛细管内。他们将自发进样初步应用于CE进样,但认为该进样方法不能灵活的改变进样量,应用范围有限。
上世纪90年代兴起的高速毛细管电泳技术(High-Speed Capillary Electrophoresis或FastCapillary Electrophoresis,HSCE或Fast-CE),通过缩短毛细管长度和增大分离场强,将分析时间进一步缩短至秒级甚至毫秒级。CE的常规进样方法已不能满足HSCE对快速和皮升级进样的要求。1991年Jorgenson等提出了光门进样法(Monning,C.A.;Jorgenson,J.W.Anal.Chem.1991,63:802-807),在高压状态下让试样不断流过毛细管,利用控制一束功率较强的激光开闭使得大部分荧光标记的试样被漂白,仅允许宽度很窄的试样区带通过;电泳分离后用激光诱导荧光技术(Laser Induced Fluorescence,LIF)检测。该方法得到的试样区带宽度很窄,但它本质上也属于电动进样,因此仍存在进样歧视效应,而且荧光漂白需要大功率激光器,由于漂白不完全也会造成背景基线升高和漂移。1993年Jorgenson等又提出流动门进样法(Lemmo,A.V.;Jorgenson,J.W. Anal.Chem.1993,65:1576-1581),引入试样的毛细管与电泳分离毛细管相距一小段距离,当泵开启时,试样毛细管流出的试样被流动的缓冲液冲走,不能进入分离毛细管;当泵关闭时,试样由电动进样进入分离毛细管。该方法装置简单,易于搭建,可与各种检测器配合使用,但由于泵的开关需要一定时间,所以试样引入量比光门进样法有所增加。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单实用的应用于毛细管电泳的微体积试样引入装置及其使用方法。该装置既可以应用于毛细管电泳分析中试样的微量引入、贮存和更换,也可以用作液相色谱、微流控分析芯片和其他领域的进样系统,以及毛细管电泳与液相色谱、微流控分析芯片联用的接口部分。
本发明用于毛细管电泳的微体积试样引入装置,由毛细管、试样管、缓冲液管、废液池、电泳分离装置组成,其特征是:至少一个试样管和至少一个缓冲液管固定在可移动的试样引入平台上组成试样管-缓冲液管列阵,至少一个插入缓冲液管的导电电极与对应插入废液池的导电电极构成电泳分离装置,缓冲液管和试样管的管壁上有供毛细管出入的缺口,毛细管进口端通过缓冲液管的缺口或试样管的缺口进入或脱离缓冲溶液或试样溶液,毛细管的出口端插入废液池。
根据本发明,所使用的毛细管1的材质为石英,或者玻璃,或者硅,或者高分子材料(如聚乙烯,聚苯乙烯,聚四氟乙烯,聚碳酸酯,聚二甲基硅氧烷,聚甲基丙烯酸甲酯,硅橡胶等),或者无机和有机复合材料;毛细管1的长度范围为1毫米至100厘米,毛细管通道8横截面的形状为圆形,或者椭圆形,或者矩形,或者其它多边形,毛细管通道8横截面的内径范围,或者长度和宽度范围,为10纳米至1毫米。所用毛细管1的进口端12为平整截面结构,要求截面尽可能平整光洁,尽量没有突出的毛刺或缺口,截面与毛细管的轴线的夹角在30°至150°之间。或者将毛细管1的进口端12采用各种方法加工成锥形尖端,有利于减小试样溶液在进口端的残留,降低试样引入量。加工成锥形尖端的方法有,采用机械研磨方法加工成锥形尖端,或者采用化学刻蚀方法加工成锥形尖端,或者采用加热拉制的方法加工成锥形尖端。毛细管1进口端12的截面的表面,经过憎水化或者亲水化处理,或者经过表面抛光处理,目的是减小试样溶液在进口端的残留,降低试样引入量。电泳时毛细管水平放置,有利于控制毛细管进出口端液面高度一致。
根据本发明,所使用的缓冲液管和试样管的管壁上加工有供毛细管出入的缺口9,缺口9的宽度大于毛细管1的外径,最大不超过10毫米,缺口9的长度范围为0.1毫米至20毫米,缺口9的深度范围为0.1毫米至50毫米。
根据本发明,所使用的可移动的试样引入平台为手动控制的平移台,或者由计算机控制的步进电机精密平移台,至少可在一维方向上进行平移运动,移动的方向和速度可控。
根据本发明,将所使用的导电电极固定在缓冲液管内,以防止电极在随毛细管移动时,电极与管壁间有溶液残留。毛细管进口端缓冲液管内的电极接电源正极,毛细管出口端废液池内的电极接电源负极,或者毛细管进口端缓冲液管内的电极接电源负极,毛细管出口端废液池内的电极接电源正极。
根据本发明,所述的用于毛细管电泳的微体积试样引入装置的使用方法是:(1)在常温常压条件下,在毛细管1通道8内充满缓冲液10;(2)在试样管2内加入一定体积的试样溶液11;(3)在缓冲液管3内加入一定体积的缓冲液10;在废液池5内加入一定体积的缓冲液10;(4)移动试样引入平台4,使毛细管1的进口端12通过缺口9进入试样管2中的试样溶液11中;(5)移动试样引入平台4,使试样管2中的试样溶液11脱离毛细管1的进口端12,完成试样引入;(6)移动试样引入平台4,使毛细管1的进口端12通过缺口9进入缓冲液管3中的缓冲溶液10中;(7)在缓冲液管3的导电电极6和废液池5的导电电极7之间施加电压进行电泳分离。
根据本发明,在试样引入过程中的(5)步骤中,当试样管中的试样溶液脱离毛细管进口端的瞬间,有一滴试样溶液附着在进口端的截面上,该试样液滴在表面张力作用下,逐渐进入毛细管内,暴露在毛细管进口端外的液滴体积逐渐减小,直至液滴全部进入管内,完成进样过程。
根据本发明,在试样引入过程中,由于试样管移出毛细管进口端的速度不同,或是移出毛细管进口端的角度不同,或是毛细管进口端插入试样管内试样溶液的深度不同,均会造成残留在毛细管进口端截面的试样溶液液滴体积的变化,使得通过自发进样过程而进入毛细管内的试样量不同。通过控制上述因素,可以控制毛细管内试样的引入量(即试样区带的初始宽度)。
在试样管移出毛细管进口端的角度和毛细管进口端插入试样管内试样溶液的深度保持不变的条件下,试样管移出毛细管进口端的速度越慢,残留在进口端截面上的试样液滴的体积越小,通过自发进样过程进入毛细管内的试样量越少,试样区带的初始宽度越窄。当试样管移出毛细管进口端的速度在1微米/秒至10厘米/秒范围内时,可获得低于100微米初始宽度的试样区带。
当试样管移出毛细管进口端的速度和毛细管进口端插入试样管内试样溶液的深度保持不变时,试样管移出毛细管进口端的角度(指试样管移动方向与毛细管中轴线指向出口端的方向之间的夹角)越大,残留在进口端截面的试样液滴的体积越小,进入毛细管内的试样量越少,试样区带的初始宽度越窄。在实际操作中,试样管的移动方向与毛细管的轴线的夹角范围在0°至180°之间,当两者的夹角范围在60°至150°之间时,引入的试样初始区带较窄,可获得宽度小于100微米的试样区带。
当试样管移出毛细管进口端的速度和角度均保持不变时,毛细管插入试样管内试样溶液的深度越深,残留在进口端管口的试样液滴的体积越小,进入毛细管内的试样量越少,试样区带的初始宽度越窄。在实际操作中,毛细管进口端插入试样管的深度范围控制在0.1毫米至20毫米范围内。
根据本发明,在试样引入过程中,毛细管出口废液池中的液位高度应等于或者稍高于试样管中的液位高度,两者之间的差异范围是0至10厘米。毛细管出口废液池中的液位高度应稍高于试样管中的液位高度的目的是,抑止在试样引入过程中,试样由试样管向毛细管进口端的扩散效应。
本发明的优点是,可实现毛细管电泳分析的微体积试样引入;通过调节试样管移出毛细管进口端的速度和角度,以及毛细管进口端插入试样管的深度,可准确和方便地控制进样量;进样量在皮升至纳升级;试样管-缓冲液管阵列的移动方向和速度可精确控制;进样系统结构简单,容易搭建,操作简便,手动或自动化控制均可,便于推广应用。
以下参照附图详细描述本发明。
附图说明
图1是本发明的试样引入装置侧视结构示意图。
图2是本发明的试样引入原理示意图。
图3是本发明的装置进行毛细管电泳分析的结果记录图。
图4是本发明的实施例2的侧视结构示意图。
图5是本发明的实施例3的侧视结构示意图。
图6是本发明的实施例3的俯视结构示意图。
图中:毛细管1,试样管2,缓冲液管3,平台4,废液池5,导电电极6,导电电极7,毛细管通道8,缺口9,缓冲液10,试样溶液11,进口端12,指示方向13,液膜14,毛细管外壁15,毛细管截面16,箭头所示方向表面张力17,试样区带18,试样液滴19,废液液滴20,不同试样溶液21,22
具体实施方式
参照附图,以下将详细描述根据本发明的优选实施例。
实施例1
参见图1,试样管2、缓冲液管3和废液池5由200微升的离心管加工而成,在离心管的管壁上切割出一条宽1毫米、深2毫米的取样缺口9。导电电极6、7分别固定在缓冲液管3和废液池5内,其中缓冲液管3内的导电电极6接高压电源正极,废液池5内的导电电极7接电源负极。试样管2和缓冲液管3水平并排放置,固定在可移动的试样引入平台4上。在缓冲液管3、废液池5和试样管2中分别加入等量的缓冲液10或试样溶液11,使液面位于取样缺口9的范围内并且缓冲液10浸没导电电极6、7。实验中采用长3厘米、内径50微米、外径375微米的石英毛细管1进行毛细管电泳分离操作,毛细管1水平放置。毛细管1的出口端水平插入废液池5内溶液深度约1.5毫米。废液池5中的液位高度高于试样管2中的液位高度1-2毫米。进样时,沿指示方向13平移固定试样管2-缓冲液管3阵列的平台4,使试样管2缓慢移出毛细管1的进口端12,在自发进样作用下实现试样引入;进样完成后,固定试样管2-缓冲液管3阵列的平台4继续移动,使毛细管1的进口端12移入缓冲液管3内,开始电泳分离。
参见图2。如图2A所示,将毛细管1进口端12外壁15上的聚酰亚胺涂层去除3毫米长,并进行硅烷化处理。进口端12的截面16与毛细管1轴线方向垂直。在毛细管1内充满缓冲液10,水平放置。进样时,试样管2沿指示方向13进行一维移动,速度为50微米/秒,毛细管1的进口端12穿过管壁上的缺口9进入试样管2,其进口端12浸入试样管2内试样溶液11中深度约1.5毫米;试样管2继续移动,毛细管1的进口端12穿过另一侧管壁上的缺口9,此时试样管2缺口9与进口端12之间形成一液膜14,该液膜14浸润进口端12的外壁15以及截面16;试样管2继续移动,毛细管1的进口端12继续脱离该试样管2,此时试样管2缺口9与进口端12之间的液膜14断裂,残留的一滴试样溶液11附着在进口端12的截面16上。如图2B所示,该试样溶液11液滴在如箭头所示方向17的表面张力作用下,渐渐进入毛细管1内,进口端12残留的液滴体积逐渐减小。如图2C所示,当试样溶液11液滴完全进入毛细管1内时,形成的试样区带18的初始宽度为50微米,自发进样完成。
图3是根据本发明的优选实施例1的装置进行毛细管电泳分析的结果记录图。实验中采用激光诱导荧光检测系统,激发光波长473纳米,荧光检测波长520纳米,检测点距毛细管进口端12约1.5厘米。利用该装置,在21秒内实现了异硫氰酸酯荧光素(FITC)和荧光素(Fluorescence)的基线分离。
实施例2
参见图4,缓冲液管3和废液池5由200微升的离心管加工而成,在离心管的管壁上切割出一条宽1毫米,深2毫米的取样缺口9。导电电极6、7分别固定在缓冲液管3和废液池5内,其中缓冲液管3内的导电电极6接高压电源正极,废液池5内的导电电极7接电源负极。在缓冲液管3和废液池5中分别加入等量的缓冲液10,使液面位于取样缺口9的范围内并且缓冲液10浸没导电电极6、7。采用与流动注射分析仪相连的聚四氟乙烯管作为试样管2,其内径为0.5毫米。该聚四氟乙烯管将试样溶液11引入试样管2顶端,形成一试样液滴19。试样管2和缓冲液管3水平并排放置,固定在可移动的试样引入平台4上。实验中采用长3厘米、内径50微米、外径375微米的石英毛细管1进行毛细管电泳分离操作,毛细管1水平放置。毛细管1出口端水平插入废液池5内溶液深度约1.5毫米。进样时,沿指示方向13平移固定试样管2-缓冲液管3阵列的平台4,使试样液滴19缓慢移出毛细管1的进口端12,在自发进样作用下实现试样引入。进样完成后,固定试样管2-缓冲液管3阵列的平台4继续移动,使毛细管1进口端12移入缓冲液管3内,开始电泳分离;同时,试样管2内后续的试样溶液11将前一次的试样液滴19冲走,落下的废液液滴20流入废液池。
实施例3
参见图5和图6,试样管2、缓冲液管3和废液池5由200微升的离心管加工而成,在离心管的管壁上切割出一条宽0.8毫米、深2毫米的取样缺口9。导电电极6、7分别固定在缓冲液管3和废液池5内,其中缓冲液管3内的导电电极6接高压电源正极,废液池5内的导电电极7接电源负极。多个试样管2和缓冲液管3间隔水平并排放置,固定在可移动的试样引入平台4上。实验中采用长3厘米、内径50微米、外径375微米的石英毛细管1进行毛细管电泳分离操作,毛细管1出口端12利用机械研磨方法加工成锥形尖端结构,毛细管1水平放置。毛细管1出口端水平插入废液池5内溶液深度约1.5毫米。在缓冲液管3和废液池5中分别加入等量的缓冲液10,使液面位于取样缺口9的范围内并且缓冲液10浸没导电电极6、7;在不同的试样管2中分别加入等量的不同试样溶液11,21,22,使液面位于取样缺口9的范围。进行多个试样溶液的引入操作时,沿指示方向13平移固定试样管2-缓冲液管3阵列的平台4,使毛细管1进口端12依次进出各个试样管2内的试样溶液11,21,22,完成多个试样溶液的引入操作。试样引入平台4带动试样管2一维平移的速度为1毫米/秒至10毫米/秒。
Claims (10)
1、一种用于毛细管电泳的微体积试样引入装置,其特征在于,由毛细管、试样管、缓冲液管、废液池、电泳分离装置组成,至少一个试样管和至少一个缓冲液管固定在可移动的试样引入平台上组成试样管-缓冲液管列阵列阵,平台移动的方向和速度可控,至少一个插入缓冲液管的导电电极与对应插入废液池的导电电极构成电泳分离装置,缓冲液管和试样管的管壁上有供毛细管出入的缺口,毛细管进口端通过缓冲液管的缺口或试样管的缺口进入或脱离缓冲溶液或试样溶液,毛细管的出口端插入废液池。
2、根据权利要求1所述的微体积试样引入装置,其特征在于,所述的毛细管(1)的材质为石英,或者玻璃,或者硅,或者高分子材料,或者无机和有机复合材料;毛细管(1)的长度范围为1毫米至100厘米;毛细管通道(8)横截面的形状为圆形,或椭圆形,或矩形,或多边形;毛细管通道横截面的内径范围,或长度和宽度范围为10纳米至1毫米。
3、根据权利要求1所述的微体积试样引入装置,其特征在于,所述的毛细管(1)的进口端(12)为平整截面结构,或锥形尖端结构,进口端(12)的截面,经过憎水化,或亲水化处理,或抛光处理。
4、根据权利要求1所述的微体积试样引入装置,其特征在于,所述的缓冲液管(3)和试样管(2)的缺口(9)的宽度大于毛细管(1)的外径,最大不超过10毫米,缺口(9)的长度范围为0.1毫米至20毫米,深度范围为0.1毫米至50毫米。
5、根据权利要求1所述的用于毛细管电泳的微体积试样引入装置的使用方法是:
●在常温常压条件下,在毛细管(1)通道(8)内充满缓冲液(10);
●在试样管(2)内加入一定体积的试样溶液(11);
●在缓冲液管(3)内加入一定体积的缓冲液(10);在废液池(5)内加入一定体积的缓冲液(10);
●移动试样引入平台(4),使毛细管(1)的进口端(12)通过缺口(9)进入试样管(2)中的试样溶液(11)中;
●移动试样引入平台(4),使试样管(2)中的试样溶液(11)脱离毛细管(1)的进口端(12),完成试样引入;
●移动试样引入平台(4),使毛细管(1)的进口端(12)通过缺口(9)进入缓冲液管(3)中的缓冲溶液(10)中;
●在缓冲液管(3)的导电电极(6)和废液池(5)的导电电极(7)之间施加电压进行电泳分离。
6、根据权利要求5所述的用于毛细管电泳的微体积试样引入装置的使用方法,其特征在于,在试样引入过程中,试样管(2)的移动方向与毛细管(1)的中轴线的夹角在0°至180°之间。
7、根据权利要求6所述的用于毛细管电泳的微体积试样引入装置的使用方法,其特征在于,在试样引入过程中,当试样管(2)的移动方向与毛细管(1)的轴线的夹角在60°至150°之间,在毛细管(1)进口端(12),获得宽度小于100微米的试样引入区带。
8、根据权利要求5所述的用于毛细管电泳的微体积试样引入装置的使用方法,其特征在于,在试样引入过程中,控制试样引入平台(4)带动试样管(2)移出毛细管(1)进口端(12)的移动线速度在1微米/秒至10厘米/秒之间。
9、根据权利要求5所述的用于毛细管电泳的微体积试样引入装置的使用方法,其特征在于,在试样引入过程中,毛细管(1)的进口端(12)插入试样管(2)内试样溶液(11)的深度范围控制在0.1毫米至20毫米之间。
10、根据权利要求5所述的用于毛细管电泳的微体积试样引入装置的使用方法,其特征在于,在试样引入过程中,出口废液池(5)中液位的高度等于或高于试样管(2)中的液位高度,两者之间的液位高度差异范围为0至10厘米。
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