CN1896274B - 牛胚胎性别简易鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种牛胚胎性别简易鉴定方法，其血液基因组鉴定率达100％，胚胎性别鉴定率为99.0％以上，操作简便、灵敏度高、鉴定快速、实用性强、使用设备简单，并可以在1h内鉴定出胚胎性别，形成的胚胎性别鉴定试剂盒完全可以应用于生产，且成本仅为同类产品的1/10。本发明根据牛特异性序列和雄性特异性序列，设计出6条特异性引物，能够识别6个特异位点，反应目的序列形成一个哑铃型结构单元，并以此为核心，短时间内扩增出大量大小不等的DNA片断。反应过程中，仅需要60～65℃恒温水浴即可；结果鉴定采用dNTPs沉淀法(反应管中部出现白色条带为阴性)。
Description
一、技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域中胚胎性别鉴定方法，尤其是涉及一种牛胚胎性别简易鉴定方法。
二、背景技术：
随着动物繁殖技术的不断进步，奶牛胚胎移植工业得到了快速发展，如同期发情，超数排卵，胚胎移植等技术都趋于成熟，为良种奶牛的迅速繁育提供了技术支持。而在奶牛的繁育过程中，产犊的性别对经济效益有着巨大的影响，生产母牛成为该领域急需要克服的技术难点。目前，性控胚胎的生产主要有胚胎性别鉴定和使用性控精液两种，这两种方法各有优缺点，传统的胚胎性别鉴定主要用PCR方法，设计两对特异引物，用几个卵裂球就可以扩增目的片断。但是操作繁琐耗时，且需要PCR仪、电泳仪及凝胶成像系统等昂贵设备。
目前，国内外还没有用dNTP沉淀法来鉴定反应结果的报道。
三、发明内容：
本发明为了解决上述背景技术中的不足之处，提供一种牛胚胎性别简易鉴定方法，其操作简便、鉴定快速、准确率高、实用性强，并可利用此项方法生产出胚胎性别诊断试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种牛胚胎性别简易鉴定方法，其特殊之处在于包括以下步骤：
1)首先根据牛特异序列和牛雄性特异序列设计下列引物，每条引物分别有6条，能够识别6个位点，其序列是：
雄性特异引物：
S1P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
S1P2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCC
S1P3 ATCCCATGGATGGAGGAGC
S1P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCC
S1P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTAT
S1P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S2P1 CCATGGACTGTCGCCTAT
S2P2 AGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S2P3 ATCCCATGGATGGAGGAGC
S2P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCC
S2P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTAT
S2P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S3P1 GAAAGTGAAAGAAATTAAGTTGC
S3P2 CTGATTTACATTTTGCTAAGGGC
S3P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S3P4 GAATCAAACCCAGGTCTCC
S3P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCG
S3P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
S4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
S4P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCC
S4P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
牛特异性引物：
B1P1 AGGGCCAATAGACCTCATCT
B1P2 TCGCGACCTCTCTCCAAAC
B1P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B1P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B1P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B1P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
B2P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B2P2 AGGAGGCTTGACTCCCTT
B2P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B2P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B2P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B2P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B3P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
2)将上述引物置入反应液A中，其中各成份终浓度为：引物P1、P2各为40～60pMol/L；P3、P4各为20～40pmol/L；P5、P6各为8～25pmol/L；配制dNTPs反应底物为1.5～3.0mM，贝它定为0.6～1.0M，Mg2+为2～8mM；
3)将含有所要鉴定胚胎卵裂球蒸馏水，与20μLA溶液混合，反应总体积为25μL；95～100℃加热5min，冰浴，再加B液，B液各成份浓度为：8000u/mlBstDNA聚合酶，50mM KCL，10mM Tris-HCL(pH 7.5)，0.1mM EDTA，1mMDTT，0.1％TritonX-100和50％甘油，聚合酶58～67℃恒温扩增30～60min；
4)根据以上引物合成产物序列呈大小不同的片断，电泳结果见阳性泳道有多条大小不同的序列条带，而且不同引物之间所生成的条带纹不同，根据条带分布特征，即可判定是哪组引物反应的结果；
5)反应结束后，鉴定结果时，在反应体系中加入C液，即0.5～5μLdNTP沉积液，如果反应管中15s内呈现白色沉淀聚集，特别在沉积液与反应液界面出现环状白色沉淀，而上下液面清澈，随后沉淀层颜色变暗，最后沉淀于反应管底部。此结果证明反应体系中还有大量的dNTP存在，表明反应没有进行，据此可判定结果为阴性。相反，当加入沉淀液后，反应管内无显著变化，表明反应体系中，反应底物dNTP消耗殆尽，结果判定为阳性。
包括胚胎性鉴定试剂盒，盒中包括3部分，A管为反应体系液，包括引物；B管为恒温扩增酶；C管为反应鉴定所用的dNTPs沉积液。
上述的每条引物其中的4条短引物长度18～25bp，两条长引物长度在38～43bp。
反应结束后，在反应体系中加入无毒无副作用的重金属阳离子供体试剂，通过观察有无沉淀反应来判定结果，若反应液中部出现典型的白色条带为阴性，反之则为阳性，添加后15s得出结论，所述的重金属阳离子供体试剂为0.01～1.0mMCuSO4溶液。
将所取胚胎细胞直接加于反应体系，进行反应，无需分步处理。
扩增时使用PCR仪恒温扩增或水浴锅，恒温扩增温度为63℃，扩增时间为45min，反应结束后，80℃下2min终止反应。
与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下：
1、本发明针对牛特异序列和牛雄性特异序列设计引物，采用恒温扩增技术(Notomi T.，et al.，Nucleic Acids Res 2000；28：e63)完成反应。该反应体系仪需要水浴锅，且反应迅速(1 h内反应完全)，鉴定效率提高，而且灵敏度比PCR高，为胚胎性别的鉴定提供了新的方法和途径。结果判定上采用了独立发明的dNTP沉淀法，替代浊度仪，使胚胎性别鉴定程序更加简化。该项发明成本仅为同类产品的1/10，而且操作简便，完全可应用于临床生产。
2、本发明血液基因组鉴定率达100％，胚胎性别鉴定率为99.0％以上，由于要求技术简单，易操作，形成的胚胎性别鉴定试剂盒完全可以应用于生产，且成本仅为同类产品的1/10。该方法在加样，反应过程和鉴定结果都简化，为此也称ABC法。
3、本发明反应过程无需使用价值昂贵的PCR仪，仅需要58～67℃水浴锅等简单设备。
4、本发明在反应结束后，结果鉴定无需采用电泳法，直接采用独特设计的dNTPs沉淀法，即反应体系中引入无毒无副作用的重金属阳离子供体试剂，通过观察有无沉淀反应来判定结果。若反应液中部出现典型的白色条带为阴性，反之则为阳性，15s得出结论。
四、附图说明：
图1是恒温扩增引物设计位置示意图；
图2是扩增反应体系中，形成DNA产物的基本单元结构示意图，形成哑铃型。
图3为胚胎鉴定后，即使用雄性引物反应后，体系中添加dNTP沉积液，中间出现的沉淀效果图，1、2、4和6号有沉淀出现。3、5和7号没有。
图4为胚胎性别鉴定后，电泳验证结果，即1、2、4和6号有条带出现，3、5和7号没有。
图5为用牛特异性引物电泳结果图，全部为阳性，说明基因全部来源于牛胚胎细胞。
五、具体实施方式：
本发明的目的是鉴定牛胚胎性别。发明设计了一组引物，并且建立了一套快速、经济、灵敏、简单且实用的牛早期胚胎性别鉴定方法。
本发明因整个鉴定程序简化，所以命名为ABC法：A在英文为Adding，义为加样简化；B为Bathing，取水浴之意，反应条件即为恒温水浴即可；C为Checking，结果判定简单化。
本发明将此试剂盒分为3部分，分别为A管，B管和C管。A管内包含缓冲液、Mg2+、引物、贝它定(Sigma)、dNTP和纯水；B管为BstDNA恒温聚合酶(NewEngland Biolabs，USA)；C管为dNTP沉淀液。
引物设计：
引物设计中，采用识别6个位点，提高了反应灵敏性，准确性。针对每一特异序列设计6条引物，设计原则为(见图1)：
引物1 A1
引物2 B1
引物3 C1
引物4 C2
引物5 A2+A3
引物6 B3+B2
其中A1与B1间距不超过350bp，A3与B3间距为0～60bp，A2与A3间距为20～100bp，而且A1(B1)可以与A2(B2)重叠。
根据引物设计原则，反应获得哑铃型序列结构单元(见图2)，以该单元为核心，进行裂变式增值或延长，基本无反应抑制，使反应得以迅速进行。
在引物设计中，A1与B1的Tm值设定在58℃～66℃，其它引物则为50℃～66℃。
P1、P4引物序列长17～25bp；P5、P6为36～43bp。
本试验依据Genbank中公布的牛特异性序列(gn：V00125)和雄性特异性序列(gn：D16357)设计下列几组引物。
雄性特异引物：
S1P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
S1P2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCC
S1P3 ATCCCATGGATGGAGGAGC
S1P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCC
S1P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTAT
S1P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S2P1 CCATGGACTGTCGCCTAT
S2P2 AGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S2P3 ATCCCATGGATGGAGGAGC
S2P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCC
S2P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTAT
S2P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S3P1 GAAAGTGAAAGAAATTAAGTTGC
S3P2 CTGATTTACATTTTGCTAAGGGC
S3P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S3P4 GAATCAAACCCAGGTCTCC
S3P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCG
S3P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
S4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
S4P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCC
S4P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
牛特异性引物：
B1P1 AGGGCCAATAGACCTCATCT
B1P2 TCGCGACCTCTCTCCAAAC
B1P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B1P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B1P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B1P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
B2P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B2P2 AGGAGGCTTGACTCCCTT
B2P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B2P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B2P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B2P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B3P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
根据以上引物合成产物序列呈大小不同的片断，电泳结果见阳性泳道有多条大小不同的序列条带。而且不同引物之间所生成的条带纹不同，据条带分布特征，即可判定是哪组引物反应的结果。
反应液A：含有P1～P6六条引物，引物终浓度为：P1、P2各为40～60pMol/L；P3、P4各为20～40pmol/L；P5、P6各为8～25pmol/L。dNTPs为1.5～3.0mM，Betaine(sigma)为0.6～1.0M，Mg2+为2～8mM。
胚胎细胞的采集方法：本发明采用了切割法和抽吸法，胚胎切割液和抽吸液为磷酸缓冲液，含1mg/mL聚乙烯吡络烷酮。
胚胎DNA提取方法：本发明采用加热变性法，将含有所要鉴定胚胎卵裂球5μL的提取液(磷酸缓冲液，含1mg/mL聚乙烯吡络烷酮)与20μLA溶液混合，反应总体积为25μL。95～100℃加热5min，冰浴，再加B液聚合酶58～67℃恒温扩增30～60min。
在水浴反应中，由变性水浴和恒温水浴组成，也可用其他设备替代水浴锅，如PCR仪，加热板等。
反应结束后，加C液即沉淀液，观察结果。
本发明的胚胎性别结果鉴定，不是使用传统的电泳法来鉴定反应产物，而是根据反应体系特有的反应迅速彻底，反应底物dNTPs含量在反应前后的显著变化，设计出底物沉淀法来鉴定反应结果。试验中通过凝胶电泳法验证，结果一致。
鉴定结果时，在反应体系中加入0.5～5μLdNTP沉积液，如果反应管中15s内呈现白色沉淀聚集，特别在沉积液与反应液界面出现环状白色沉淀，而上下液面清澈，随后沉淀层颜色变暗，最后沉淀于反应管底部。此结果证明反应体系中还有大量的dNTP存在，表明反应没有进行，据此可判定结果为阴性。相反，当加入沉淀液后，反应管内无显著变化，表明反应体系中，反应底物dNTP消耗殆尽，结果判定为阳性。
本发明经过多次试验表明，金属离子可以使dNTP产生凝集现象，特别是重金属离子。在配制沉积液时，将一定浓度的金属离子加入超纯水或反应液的缓冲液中(以缓冲液为佳)，充分混溶，室温保存。
本发明选用一定浓度的硝酸银，硫酸铜等作为离子供体，说明沉淀液与dNTP的共沉淀现象。
本发明在反应管选择上，应用了管壁薄，无色透明的反应管，利于肉眼判定结果。
本发明的反应体系中采用了恒温扩增法，将反应结果与普通PCR法的反应结果进行对比，发现反应灵敏性比PCR高。该PCR反应体系使用的引物为：
CAAGTGCTGCAGAGGATGTGGAG
GAGTGAGATTTCTGGATCATATGGCTACT
引物浓度为30pmoL，Taq聚合酶(Takara)为1μL。反应条件为95℃，30s；52℃，45s；72℃，45s；扩增45个循环，反应总时间为3h。反应结果鉴定采用3.0％琼脂糖凝胶电泳。出现两条带为雄性，一条带为雌性，总时间在4h左右。
实施例1：
采集公母牛血液，其中添加20％ACD血液抗凝剂，使用全血基因组提取试剂盒(Takara)提取基因组DNA，并且稀释到5ng/μL备用。
本试验采用牛特异性引物和牛雄性特异性引物，引物序列如下：
B3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B3P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
S4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
S4P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCC
S4P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
反应容积为25μL，包括1×缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.8；10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100)，dNTP各3.0mM，1.6mM贝它定，2mM MgSO4，1μL Bst DNA聚合酶，1μLDNA模板，引物浓度P1、P2分别为50pmol/L；P3、P4为30pmol/L；P5、P6为15pmol/L。
反应条件：使用PCR仪恒温扩增，恒温扩增温度为63℃，扩增时间为45min，反应结束后，80℃下2min终止反应。
实验设置：分别使用牛特异性引物和雄性特异性引物反应，每一反应设置3管，模板分别为雄性基因组DNA，雌性基因组DNA和空白对照，试验重复10次。反应结束后，进行2％得琼脂糖凝胶电泳与dNTPs沉淀法鉴定结果。
使用牛雄性引物组，电泳结果为有公牛基因组反应呈现阳性，而其他两个反应体系为阴性。用dNTPs沉淀法，阴性管出现典型的白色沉淀聚集，与电泳鉴定结果一致。使用牛特异性引物，试验结果发现空白对照为阴性，公母组全部出现条带，沉淀法与其电泳结果一致，而且准确率100％。
实施例2：
此试验在生产基地(杨凌示范区科元公司)进行，将牛鲜胚胎包括囊胚与桑椹胚胎(A级)，使用显微操作仪进行切割，切割约为10％，然后用此次方法做胚胎的性别鉴定并且移植受体牛。
使用引物为：
P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
P2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCC
P3 ATCCCATGGATGGAGGAGC
P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCC
P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTAT
P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
P1 AGGGCCAATAGACCTCATCT
P2 TCGCGACCTCTCTCCAAAC
P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
将含有胚胎细胞的操作液(5μL)加入透明的PCR管，然后加入19μL试剂盒中的A液，包括1×缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.8，10mM KCl，10mM(NH1)2SO1，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100)，dNTP各3.0mM，1.6mM贝它定，2mM MgSO1，引物浓度P1、P2各为50pmol/L；P3、P4为30pmol/L；P5、P6为15pmol/L。然后100℃水浴5min，提取胚胎细胞基因组DNA，然后快速冷却至冰点，再将1μL B液加入反应管中(BstDNA聚合酶)，65℃水浴扩增50min。判定结果用沉淀法，即在反应结束后，将C液加入反应管，观察沉淀出现结果(见图3)。再用电泳法进行结果验证(见图4，图5)。并将判定结果为雌性的胚胎移植受体牛。
应用该技术先后鉴定胚胎3368枚，获得雌性胚胎1609枚，可疑胚胎69枚，雄性胚胎1690枚。将1609枚雌性胚胎移植于1609头受体母牛，668头受体妊娠，妊娠率为42％；其中12头受体流产，其余受体产犊656头，其中雌性牛犊653头，雄性牛犊3头性别准确率达99％。
Claims (3)
1.一种牛胚胎性别简易鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：
1)首先根据牛特异序列和牛雄性特异序列设计下列引物，每条引物分别有6条，能够识别6个位点，其序列是：
雄性特异引物：
S1P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
S1P2 ACATTTTGCTAAGGGCTTCC
S1P3 ATCCCATGGATGGAGGAGC
S1P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCC
S1P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTAT
S1P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S2P1 CCATGGACTGTCGCCTAT
S2P2 AGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S2P3 ATCCCATGGATGGAGGAGC
S2P4 CAGGAATCAAACCCAGGTCTCC
S2P5 CCAGCACTCTTGCCTGGAAACCATGGACTGTCGCCTAT
S2P6 TTCCTTCTCCAGGGGATCTTCCAGAAGGTAAAGTGTCTGCCT
S3P1 GAAAGTGAAAGAAATTAAGTTGC
S3P2 CTGATTTACATTTTGCTAAGGGC
S3P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S3P4 GAATCAAACCCAGGTCTCC
S3P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCG
S3P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
S4P1 CCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P2 GTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
S4P3 ATGGATGGAGGAGCCTGATAG
S4P4 GAATCAAACCCAGGTCTCC
S4P5 TGACAATCCACCCCAGCACTCCCTGTCCGACTCTTTGCG
S4P6 CTCCAGGGGATCTTCCTGACCGTGGCTCAGAAGGTAAAGTGTC
牛特异性引物：
B1P1 AGGGCCAATAGACCTCATCT
B1P2 TCGCGACCTCTCTCCAAAC
B1P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B1P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B1P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B1P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
B2P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B2P2 AGGAGGCTTGACTCCCTT
B2P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B2P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B2P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B2P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P1 TTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P2 AGGAGGCTTGACTCCCTT
B3P3 AGATCCCTGTCGCCCCT
B3P4 GGGTATCTCTTGGAGCTCACTG
B3P5 TGCGTCTGGAATGCAACCCCTTGTGTCCAGAAGCCAATGT
B3P6 CAAAGAACCCCGCTCTGCTCTAGGAGGCTTGACTCCCTT
2)将上述引物置入反应液A中，其中各成份终浓度为：引物P1、P2各为40～60pMol/L；P3、P4各为20～40pmol/L；P5、P6各为8～25pmol/L；配制dNTPs反应底物为1.5～3.0mM，贝它定为0.6～1.0M，Mg2+为2～8mM；
3)将含有所要鉴定胚胎卵裂球蒸馏水，与20μL A溶液混合，反应总体积为25μL；95～100℃加热5min，冰浴，再加B液，B液各成份浓度为：8000u/mlBstDNA聚合酶，50mM KCL，pH 7.5的10mM Tris-HCL，0.1mM EDTA，1mMDTT，0.1％TritonX-100和50％甘油，聚合酶58～67℃恒温扩增30～60min；
4)根据以上引物合成产物序列呈大小不同的片断，电泳结果见阳性泳道有多条大小不同的序列条带，而且不同引物之间所生成的条带纹不同，据条带分布特征，即可判定是哪组引物反应的结果；
5)反应结束后，鉴定结果时，在反应体系中加入0.5～5μLdNTP沉积液，如果反应管中15s内呈现白色沉淀聚集，在沉积液与反应液界面出现环状白色沉淀，而上下液面清澈，随后沉淀层颜色变暗，最后沉淀于反应管底部；此结果证明反应体系中还有大量的dNTP存在，表明反应没有进行，据此可判定结果为阴性；相反，当加入沉积液后，反应管内无显著变化，表明反应体系中，反应底物dNTP消耗殆尽，结果判定为阳性。
2.根据权利要求1所述的牛胚胎性别简易鉴定方法，其特征在于，反应结束后，在反应体系中加入无毒无副作用的重金属阳离子供体试剂，通过观察有无沉淀反应来判定结果，若反应液中部出现典型的白色条带为阴性，反之则为阳性，添加后15s得出结论，所述的重金属阳离子供体试剂为0.01～1.0mMCuSO4溶液。
3.根据权利要求2所述的牛胚胎性别鉴定方法，其特征在于：扩增时使用PCR仪恒温扩增，恒温扩增温度为63℃，扩增时间为45min，反应结束后，80℃下2min终止反应。
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