CN1883530B - 具抗病毒、抗炎和/或抗菌作用的六棱菊属提取物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可期待具有作为治疗炎症、病菌或病毒感染引起的各种病症药物用途的六棱菊属植物提取物及其制备方法和医药用途。本发明的六棱菊属植物提取物由六棱菊属植物鲜品或干品经醇水提取、柱层析、醇溶剂洗脱精制而成，提取物中咖啡酰奎尼酸类化合物含量在30％以上。本发明得到的六棱菊属植物提取物具有明显地抗病毒、提高免疫力、抗炎、和/或抗菌功效，可以用于治疗各种急慢性炎症、病毒或病菌感染引起的各种病症。

Description

具抗病毒、抗炎和/或抗菌作用的六棱菊属提取物及其用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体而言，本发明涉及可期待具有作为治疗炎症、病菌或病毒感染引起的各种病症药物用途的六棱菊属植物提取物吸其制备方法和医药用途。

背景技术

六棱菊属(Laggera genus)是菊科中的一个属，全球约有20种，主要分布在非洲中部及亚洲东南部。可作为药用的在我国仅发现六棱菊(Laggera pterodonta)和四棱锋(Laggera alata)两种，主要分布在长江以南及西南地区。因具有显著的抗菌消炎之功效，故云南民间把它们称为臭灵丹，其“臭”字是因为搓揉它们的新鲜枝叶时，会散发出难闻的臭味。

六棱菊属植物作为云南民族用药对风热邪毒、痈疽、疮疖、疥癣、血风癣疮等病症有疗效，《云南思茅中草药选》记载了六棱菊具有清热解毒、消肿拔脓的功效，对咽喉炎、口腔炎、支气管炎、疟疾、跌打损伤、烫烧伤、疮疖肿毒、蛇咬伤等症有独特疗效。近些年针对六棱菊属植物的研究多集中于六棱菊属植物中的低极性和中极性部位，并且得出结论认为该属植物富含黄酮类化合物和倍半萜类化合物(文献：1.李顺林等。云南植物研究，1994，16(4)434-436。2.李顺林等。云南植物研究，1996，18(3)349-352。3.赵昱等。(美国)天然产物杂志(Journal of Natural Products)，1997，60，545-549。4.赵昱等。(英国)植物化学(Phytochemistry)，1997，44，459-464。5.赵昱等。云南植物研究，1997，19(2)207-210。6.赵昱等。中国化学快报，2003，14(4)，393-396。7.赵昱等。(美国)天然产物杂志(Journal of Natural Products)，2003，66(8)，1078-1081。8.赵昱等。(英国)植物化学(Phytochemistry)，2003，63(7)835-839。9.赵昱等。(意大利)植物治疗杂志(Fitoterapia)，2003，74(5)459-463。10.赵昱等。浙江大学学报(医学版)，2002，31(6)406-409。)。

本发明人近几年针对多种炎症模型对六棱菊属植物六棱菊和四棱锋的提取物进行了药理活性研究。以阳性药物地塞米松为对照的药效学试验表明，这些植物提取物的有效部位针对上呼吸道感染病症在体内外抗病毒、抗菌试验和动物实验性治疗试验中显示出良好的活性，对二甲苯引起的小鼠耳肿胀以及角叉菜胶诱发的大鼠足趾肿胀均有明显的抑制作用，且具有较为明显的量效相关性；对由无菌棉球诱导大鼠肉芽肿有较强的抑制作用且有明显的量效相关性；且动物急性毒性试验表明毒副作用很低。本发明人出人意料地发观六棱菊属植物的抗炎活性成分集中在植物提取物的大极性部位，特别是富含咖啡酰奎尼酸类化合物的提取部位是抗炎活性的有效部位，有望开发成为新型的抗炎解毒的新药，并以其无毒副作用、价格低廉等优势替代现有甾体类抗炎药物和同类抗炎解毒中成药，由此完成本发明。其中，咖啡酰奎尼酸类化合物是一类由奎尼酸(quinic acid)与数目不等的咖啡酸(caffeic acid)通过酯化反缩合而成的酚酸类天然成分，广泛存在于植物界如金银花、旋覆花、苍耳等中药及茶叶、山楂等果树中。(文献：李祖晟、朱志安，医学综述，2004，10(4)，249-250)

发明内容

因此，本发明的目的是提供了一种六棱菊属植物中含咖啡酰奎尼酸类化合物的提取物；

本发明的另一目的是提供了一种制备六棱菊属植物中含咖啡酰奎尼酸类化合物提取物的方法；

本发明的另一目的是提供了将六棱菊属植物提取物用于制备抗病毒、抗菌和/或抑制炎症以及增强机机体免疫力的药物的用途；

本发明的另一目的是提供了一种含有六棱菊属植物中的咖啡酰奎尼酸类化合物提取物的药物组合物。

本发明中的六棱菊属植物中咖啡酰奎尼酸类化合物提取物按比色法测定含酚性化合物含量在30％以上

根据本发明人深入的研究，发现六棱菊属植物的抗炎活性成分集中在植物提取物的大极性部位，通过工艺优化，本发明人采用水或水醇溶剂提取辅以多种正、反相层析手段得到该有效部位。经一维和二维核磁共振波谱、质谱、红外、紫外等光谱数据，我们得知此大极性有效部位主要有效成分为不同取代数量和不同取代位置的咖啡酰基奎尼酸类化合物。近代药理学试验研究表明：此类咖啡酰基奎尼酸类化合物具有多种重要生理活性，主要是针对免疫系统的作用：表现在抑制白三烯合成和释放，抑制乙肝病毒和艾滋病毒，抑制组胺释放，从而可用于抗炎、抗病毒和治疗过敏性疾病。此外还发现其具有强效抗氧化作用、抑制脂氧酶抗动脉粥样硬化作用、抗血小板聚集活性以及降血脂作用等活性。值得关注的是：咖啡酰基奎尼酸类化合物还发现具有抗肝纤维化和通过对抑制豚鼠平滑肌收缩而用于急慢性支气管炎、支气管哮喘等症(文献：李祖晟、朱志安，医学综述，2004，10(4)，249-250)。同时，本发明中的咖啡酰基奎尼酸类化合物在有效部位中含量较高，可以作为指标性成分进行六棱菊提取物药物的质量控制标准。

具体而言，本发明的含有咖啡酰奎尼酸类化合物的六棱菊属植物提取物是按照包括下列步骤的方法制备得到的：

a)用水或者水-强极性有机溶剂的混和液提取经粉碎或切成小段的六棱菊属植物，浓缩提取液，回收溶剂；

b)将步骤a)得到的浓缩液经柱层析，水洗，然后用丙酮、醇或者是它们与水的混合溶剂洗脱；

c)将步骤b)得到的洗脱液减压浓缩至无醇味，干燥，粉碎得产品。

上述制备方法进一步包括下列步骤：

a)用水或者水-强极性有机溶剂的混和液提取经粉碎或切成小段的六棱菊属植物，浓缩提取液回收有机溶剂，并经离心去除杂质后得到澄清的浓缩液；

b)将步骤a得到的浓缩液经柱层析，先以水洗至近无色，继以丙酮、醇或者是它们与水的混合物洗脱；

c)将洗脱液减压浓缩至无醇味，采用喷雾干燥法进行干燥，得到粉末较细色泽均匀的有效部位，该有效部位为主要含有咖啡酰奎尼酸类化合物的混合物。

在本发明的六棱菊属植物提取物的制备方法中，步骤a)中的水-强极性有机溶剂的混和液优选醇水混合溶剂，其中醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇或它们的混合物，优选甲醇或乙醇。醇水混合溶剂可以是醇和水以任意比例混合的溶剂，优选乙醇和水的混合溶剂，尤其优选30-75％的乙醇水溶液。提取溶剂的用量为药材的1-20倍量(重量倍数)，优选5-10倍量，提取时间和提取次数根据药材和提取溶剂的种类和用量而定，一般提取时间为1-5小时，提取次数为1-5。步骤b)中柱层析所用介质可以是硅胶、反相硅胶、大孔树脂、聚酰胺、离子交换树脂、氧化铝、葡聚糖凝胶(Sephadex)类，优选大孔树脂和聚酰按。洗脱溶剂优选30-95％的乙醇和水的混合溶剂洗脱，或者30-95％的乙醇和水的混合溶剂进行梯度洗脱。步骤c)中浓缩后待喷雾干燥溶液的密度在1.0～1.4内，优选1.05～1.10。

在本发明的六棱菊属植物提取物的制备方法中，六棱菊属植物可以是六棱菊属任一植物的任一部位，既可以是六棱菊属(Laggera spp)任一植物的根、茎、叶、种子、皮、果实，也可以是它们的混合物，优选全草和地上部分。更优选六棱菊(Laggera pterodonta)和/或四棱锋(Laggera alata)的全草或地上部分。

本发明的六棱菊属植物提取物的进一步优选制备方法是，其中步骤a)中的溶剂为水，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小时；步骤b)中的柱层析所用介质是硅胶、反相硅胶、大孔树脂、聚酰胺、离子交换树脂、氧化铝或葡聚糖凝胶(Sephadex)类，优选大孔树脂或聚酰胺，洗脱溶剂是乙醇的水溶液，优选50-80％的乙醇。

本发明的六棱菊属植物提取物的另一种优选制备方法是，其中步骤a)中的溶剂是醇水混合溶剂，其中醇是甲醇、乙醇、乙二醇或者它们的混合物，优选30-75％的乙醇水溶液，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小时；步骤b)中的柱层析所用介质是硅胶、反相硅胶、大孔树脂、聚酰胺、离子交换树脂、氧化铝或葡聚糖凝胶(Sephadex)类，优选大孔树脂或聚酰胺，洗脱溶剂是乙醇的水溶液，优选50-80％的乙醇。

本发明的六棱菊属植物提取物中含有30％-90％的咖啡酰奎尼酸类化合物，优选含有50％-90％的咖啡酰奎尼酸类化合物。

本发明人发现，本发明得到的六棱菊属植物提取物具有抗病毒、抑制炎症、和/或抗菌，以及增强机体免疫力的功能；可以用于治疗细菌或者病毒引起的炎症及其它诱因诱发的炎症等。所述炎症可以包括咽喉炎症，肺炎，腮腺炎，以及由上呼吸道感染引起的其他炎症。病毒可以是指流感病毒或其他主要引起上呼吸道感染或者肺部感染的病毒。从而可能开发出抗病毒、抗菌、抗炎和/或增强人体免疫功能类药物组合物。这种药物组合物可以用制药领域中的常规技术制成，可以制成各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸、注射剂、透皮贴剂、气雾剂等。这些药物组合物可以用于治疗病毒或细菌感染疾病和各种炎症，增强人体免疫力等用途。

下面通过实施例进一步说明本发明。必须说明下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

具体实施方式

实施例1：六棱菊属植物不同提取物对二甲苯致炎小鼠耳肿胀抑制试验

1.不同提取物的制备

1.1.六棱菊水提物的制备 六棱菊药材300克，加水3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得。

1.2.六棱菊醇提物的制备 六棱菊药材300克，加50％乙醇3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得。

1.3.六棱菊挥发油的制备 六棱菊药材450克，加水3,600毫升，接挥发油提取装置，提取挥发油，冷却，即得1.9917克。用前以吐温80溶解并稀释。

1.4.四棱锋水提物的制备 四棱锋药材300克，加水3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得。

1.5.四棱锋醇提物的制备 四棱锋药材300克，加50％乙醇3000毫升，回流提取，提取2次，每次2小时。合并提取液，减压浓缩至干，真空干燥，即得。

2.小鼠耳肿胀模型的筛选实验

2.1.方法与步骤：

2.1.1、动物分组、编号及称重，每组10只，共5组。

2.1.2、按实验设计浓度用灭菌生理盐水配制各组药物。阳性药物用醋酸地塞米松片剂，DEX，5.0毫克/公斤；NS组：灭菌生理盐水，各试药组的低剂量组为100毫克/公斤，中剂量组为200毫克/公斤，高剂量组为400毫克/公斤，挥发油按照其在药材中的含量分别加入。

2.1.3、各组小鼠按相应剂量灌胃给药3天，1次/天，末次给药后60分钟，用20微升二甲苯在小鼠右耳廓复制局部炎症，左耳做对照。致炎后60分钟，小鼠颈椎脱臼处死，剪下左右耳廓，用直径9毫米的打孔器冲下左右耳片，称重。

以同一小鼠左右耳片的重量差表示“肿胀度”，统计比较阳性组和试药组与生理盐水组小鼠耳廓肿胀度的差异是否显著。

注：

2.2.结果：

表1-1小鼠耳肿胀试验结果(抑制率％)

结果表明，药材水提物和醇提物对该炎症模型在高剂量均具有较强的抑制活性。挥发油基本上不具抑制活性。

实施例2：六棱菊属植物不同提取部位对二甲苯致炎小鼠耳肿胀抑制试验

1.不同提取物的制备

1.1.六棱菊水提物的制备 取10公斤六棱菊药材风干的样品，切成小段，以80L水提取三次，每次两小时，合并提取液，浓缩，离心去除杂质，浓缩液上样于已处理好的树脂，以水洗至色较浅，继以70％乙醇冼脱至色浅，洗脱液减压回收溶剂，真空干燥，即得。

1.2.六棱菊石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位提取物的制备 取10公斤六棱菊药材风干的样品，粉碎，以100L 95％乙醇热提两次，每次两小时，合并提取液，用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分配萃取，真空干燥，即得。

1.3.六棱菊乙醇提取物的制备 取10公斤六棱菊药材风干的样品，粉碎，以50L70％乙醇提取三次，每次两小时，合并提取液，浓缩，离心去除杂质，浓缩液上样于已处理好的树脂，以水洗至色较浅，继以50％乙醇冼脱至色浅，洗脱液减压回收溶剂，真空干燥，即得。

1.4.四棱锋石油醚及乙酸乙酯部位提取物的制备 取10公斤四棱锋药材风干的样品，粉碎，以80L 95％乙醇热提两次，每次两小时，合并提取液，用蒸馏水制成悬浮液后依次用石油醚和乙酸乙酯分配萃取，真空干燥，即得。

1.5.四棱锋乙醇提取物的制备 取10公斤四棱锋药材风干的样品，粉碎，以100L70％乙醇提取三次，每次两小时，合并提取液，浓缩，离心去除杂质，浓缩液上样于已处理好的树脂，以水洗至色较浅，继以50％乙醇洗脱至色浅，洗脱液减压回收溶剂，真空干燥，即得。

2.小鼠耳肿胀模型的筛选实验

2.1.方法与步骤：

2.1.1、动物分组、编号及称重，每组10只，共5组。

2.1.2、按实验设计浓度用灭菌生理盐水配制各组药物。阳性药物用醋酸地塞米松片剂，DEX，5.0毫克/公斤；NS组：灭菌生理盐水，各试药组的低剂量组为100毫克/公斤，中剂量组为200毫克/公斤，高剂量组为400毫克/公斤，挥发油按照其在药材中的含量分别加入。

2.1.3、各组小鼠按相应剂量灌胃给药3天，1次/天，末次给药后60分钟，用20微升二甲苯在小鼠右耳廓复制局部炎症，左耳做对照。

致炎后60分钟，小鼠颈椎脱臼处死，剪下左右耳廓，用直径9毫米的打孔器冲下左右耳片，称重。

以同一小鼠左右耳片的重量差表示“肿胀度”，统计比较阳性组和试药组与生理盐水组小鼠耳廓肿胀度的差异是否显著。

注：

2.2.结果：

                    表2-1小鼠耳肿胀试验结果(抑制率％)

结果表明，六棱菊水提部位、六棱菊醇提部位、四棱锋醇提部位，以及它们的组合物对该炎症模型在高剂量均具有较强的抑制活性。

实施例3：六棱菊植物中酚酸类化合物及药物组合物的制备

取10公斤六棱菊药材风干的样品，切成小段，以水提取三次，第一次用8倍量，第二次用6倍量，第三次用6倍量。加水第1次提取1.5小时，第2、3次提取1小时，浓缩，离心去除杂质，浓缩液上样于已处理好的树脂，以水洗至色较浅，继以70％乙醇冼脱至色浅，洗脱液减压回收溶剂，喷雾干燥得原料细粉，批号为031225。此即为本发明中六棱菊植物提取物的有效部位，以下简称为A^III ₅。以原料：(淀粉+微晶纤维素)按一定比例(1∶0.5～1∶3，其中淀粉：微晶纤维素的范围为1∶0～0∶1)制粒后套入胶囊中(根据需要可以是0～4号胶囊)，即得。

按比色法测定A^III ₅中含酚性化合物含量在30％以上，具体方法为：

1.仪器与试药

紫外可见分光光度仪；十万分之一天平；甲醇，铁氰化钾，三氯化铁，盐酸为分析纯；十二烷基磺酸钠为化学纯。化合物1对照品由浙江大学药学院中药与天然药物研究室提供，六棱菊属植物的提取物A^III ₅为喷干粉末。

2.方法与结果

2.1显色反应试剂的制备 精密称取十二烷基磺酸钠3.0克，加水1000毫升使溶解，得十二烷基磺酸钠试液；取铁氰化钾0.6克，加水溶解成100毫升，得铁氰化钾试剂；取三氯化铁六水合物0.9克，加水溶解成100毫升，得三氯化铁试液。

2.2对照品溶液的制备 精密称取化合物1对照品2.73毫克，以甲醇溶解并定容至25毫升。

2.3供试品溶液的制备 取六棱菊属植物的提取物A^III ₅(批号为031225)25毫克，以50％甲醇溶解并定容至25毫升。

2.4标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液1毫升，2毫升，3毫升，4毫升，5毫升，6毫升于25毫升量瓶中，加甲醇至6毫升，再分别精密加入0.3％十二烷基磺酸钠2.0毫升，0.6％铁氰化钾-0.9％三氯化铁(1∶1)2.0毫升，摇匀，暗处放置5分钟，加0.1莫尔/升盐酸溶液至25毫升，摇匀，暗处放置20分钟，以甲醇为空白，在700纳米处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，对照品质量为横坐标，计算标准曲线。结果见表3-1，标准曲线为y＝3.7964x+0.0847，相关系数r＝0.9983，线性范围为0.1092毫克～0.6552毫克。

表3-1不同质量标准品吸光度结果

2.5样品含量测定 精密吸取供试品溶液1毫升于25毫升量瓶中，加甲醇至6毫升，余同1.24项下，以甲醇为空白，在700纳米处测定吸光度。并通过标准曲线计算样品总酚含量。结果提取物总酚含量为54.4％。

实施例4.由实施例3制备得到的原料A^III ₅对角叉菜胶导致的大鼠足趾肿胀抑制试验

1.材料和方法

1.1动物：SD大鼠150+20g，由安徽医科大学动物实验中心提供，合格证号，皖实动准字01号。

1.2试验药：A^III ₅批号20031015；阳性对照药雷公藤多苷(TWM)批号030402，上海复旦复华药业有限公司生产。

1.3主要仪器：MK-500型足爪容积测定仪：日本Mukomachi Kiai CD公司产品。

1.4方法：

SD大鼠随机分为5组，每组10只，即模型对照组、AIII5(35，70，140毫克/公斤)三个剂量组和阳性对照药雷公藤多苷(40毫克/公斤)组。灌胃给药5天，第5天给药1小时后于每个鼠右后足跖腱膜下注射10克·L-1角叉菜胶(用生理盐水配制)0.1毫升致炎，用足爪容积测量仪分别测定右后足爪致炎前与致炎后1、3、5、7小时致炎侧足容积。

采用SPSS统计软件分析给药组和对照组足爪肿胀度的差异。

2结果：SD大鼠在致炎后1小时，足爪开始肿胀，3小时后肿胀明显，5～7小时到峰值。A^III ₅(35，70，140毫克/公斤)和阳性对照药雷公藤多苷(40毫克/公斤)能明显抑制足爪肿胀。各药组的足爪肿胀也在5～7小时达峰值，但峰值比模型组明显低。说明A^III ₅具有显著的消肿作用。见表4-1。

表4-1  A^III ₅对角叉菜胶诱导的大鼠足爪肿胀度的影响(            x±s，n＝10)

^*P＜0.05，^**P＜0.01皆与模型组比较

实施例5：由实施例3制备得到的原料A^III ₅对无菌棉球诱导大鼠肉芽肿炎症模型的影响

1.原理：

由于植入大鼠皮下棉球的刺激作用，引起结缔组织增生，产生异体肉芽肿，这种肉芽增生与某些炎症的后期病理改变相似。故可通过定量分析试验药物对肉芽增生的抑制程度来恒量该药物的抗炎活性强弱。

2.试验药物：

试验药物A^III ₅：用DMSO分别配制成浓度为20毫克/毫升、10毫克/毫升、5毫克/毫升。

阳性药物吲哚美辛(Indolmethacin)：用NS配制成1毫克/毫升。

3.分组：

NS组；DMSO组；Indolmethacin组：10毫克/公斤；A^III ₅(H)组：200毫克/公斤；A^III ₅(M)组：100毫克/公斤；A^III ₅(L)组：50毫克/公斤。(注：分为6组，每组8只大鼠，均为ig给药，0.1毫升/10g体重。)

4.方法与步骤：

各组动物按相应剂量灌胃给药。给药后1小时用乙醚麻醉。先用固定板固定大鼠，再用灭菌NS湿润大鼠左右腋窝下皮肤，并剪去相应被毛。碘酊、酒精棉球消毒术部，用手术刀作一长约8～10mm的横切口，再用止血钳在腋窝下皮下靠近背部扩充皮下组织。在每侧腋窝皮下相同部位各埋入一个灭菌棉球，结节缝合2～3针。伤口处撒上一定的青、链霉素抗感染，每天1次，连续4次。每天给药1次，连续7天，第8天处死，手术取出棉球，称湿重。60℃烘干棉球至恒重，减去棉球原重，即为肉芽组织重量。统计分析药物组与模型组肉芽肿重量差异是否显著，并计算其抑制率。

5结论：通过采用“无菌棉球诱导大鼠肉芽肿炎症模型”检测A^III ₅三个剂量(200毫克/公斤、100毫克/公斤、50毫克/公斤)的抗炎活性，结果表明：

(1)若采用肉芽肿重量(毫克)统计：A^III ₅(M)组与DMSO组比较差异非常显著(P＜0.01)；A^III ₅(H)、A^III ₅(M)和A^III ₅(L)组的抑制率分别为17.38％、42.5％和24.68％。

(2)若采用肉芽肿重量(毫克/100g体重)统计：A^III ₅(M)组与DMSO组比较差异非常显著(P＜0.01)；而A^III ₅(L)组与DMSO组比较差异显著(P＜0.05)。A^III ₅(H)、A^III ₅(M)和A^III ₅(L)组的抑制率分别为23.07％、43.47％、28.93％。

(3)NS和DMSO组肉芽肿重量(毫克)分别为25.84±8.23；24.34±10.58。而NS和DMSO组肉芽肿重量(毫克/100克体重)分别为7.10±2.33；7.01±3.12。显然二者差异很小，说明DMSO作溶剂没有大的干扰。

上述结果表明，A^III ₅(M)组即100毫克/公斤剂量(相当于人用剂量17.64毫克/公斤)对“无菌棉球诱导大鼠肉芽肿炎症模型”具有显著的抗炎活性。

实施例6：由实施例3制备得到的原料A^III ₅对醋酸致小鼠毛细血管通透性增高模型(腹膜炎)的影响

1材料与方法

1.1动物：昆明种小鼠，雄性，体重18～20克，由安徽医科大学实验动物中心提供，合格证号，皖实动准字01号。

1.2试验药：A^III ₅批号20031015；雷公藤多苷(TWM)，批号030402，上海复旦复华药业有限公司生产。

1.3主要仪器：7530可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂产品)。

1.4方法：

小鼠随机分为为5组，每组10只，即溶媒组(0.5％羧甲基纤维素钠)、A^III ₅(50，100，200毫克/公斤)和阳性对照(TWM，40毫克/公斤)组。灌胃给药5天，最后一次给药1h后，尾静脉注射伊文思蓝生理盐水溶液0.1毫升/10克，立即腹腔注射0.6％醋酸0.2毫升/只，20分钟后断头放血处死小鼠，剪开腹腔，用5毫升生理盐水冲洗腹腔数次，收集洗涤液，离心1000转5分钟，在590纳米处测定吸光度(absorbent，A)值。SPSS统计分析给药组和对照组A值的差异。

2结果：A^III ₅各剂量组腹腔洗液A值明显低于溶媒组，表明其对醋酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加有显著的抑制作用，且A^III ₅高剂量(200毫克/公斤)抑制作用明显强于低剂量(50毫克/公斤)，具有一定的量效关系，见表6-1。

表6-1.A^III ₅对醋酸酸所致小鼠腹腔毛细血管通透性增加的抑制作用

^**p＜0.001，与溶媒组比较；#p＜0.05与A^III ₅(50毫克/公斤)组比较

实施例7：由实施例3制备得到的原料A^III ₅对小白鼠碳粒廓清功能的影响

1.材料与方法

1.1实验动物 昆明种小鼠，18～22克，雄性。购于安徽医科大学实验动物中心，合格证号：皖实动准01号。

1.2.药物与试剂

A^III ₅，批号20031015；雷公藤多苷，批号030402，上海复旦复华药业有限公司生产。

印度墨汁：上海长江日用粘合材料厂，批号：881120，以生理盐水按1∶6的倍数进行稀释。

0.1％Na₂CO₃溶液：0.1克的Na₂CO₃加双蒸水至100毫升。

1.3.主要仪器：7530可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂产品)。

1.4实验方法

1)小鼠随机分为5组，每组10只，即阴性对照组、A^III ₅(50，100，200毫克/公斤)和阳性对照组雷公藤多苷(TWM)80毫克/公斤。

2)灌胃给药7天，于末次给药30min后，尾静脉注射印度墨汁0.05～0.1毫升/10克，于注射后2分钟和12分钟分别用吸管(预先用肝素溶液湿润)分别从眶后静脉丛取血20微升，溶于2毫升0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀，在640纳米波长下测A值。

3)计算廓清指数K

$K=\frac{\log O{D}_1-\log O{D}_2}{t_1-t_2}$

OD₁、OD₂为不同时间所取血样的A值；t₁-t₂为取两血样的时间差。一般以均数±标准差表示各组K值，进行统计学检验。

K值增加，说明试药有免疫增强作用；K值降低，说明试药有免疫抑制作用。

2.实验结果

与正常组比较，A^III ₅(100，200毫克/公斤)剂量组的廓清指数K明显增加，而TWM组廓清指数K明显降低，说明A^III ₅有免疫增强作用，而TWM有免疫抑制作用。见表7-1。

表7-1  A^III ₅对小鼠吞噬功能的影响(n＝10，            x±s)

^*p＜0.05，^**p＜0.01，皆与正常组比较

实施例8：由实施例3制备得到的原料A^III ₅的体外抗病毒作用研究

1.材料与方法

1.1药物与试剂

实验药物：A^III ₅，批号20031015，用前以生理盐水溶解，使其终浓度为100毫克/毫升，过滤除菌分装，置4℃冰箱内放置备用；注射用双黄连，哈药集团中药二厂生产，批号0504003；清开灵注射液，广州明兴制药有限公司，批号050421；板兰根颗粒，杭州胡庆余堂药业有限公司生产，批号050201，以生理盐水按1∶6的倍数进行稀释。

病毒株：流感病毒FM-1鼠肺适应株，由南京医科大学引进。-84℃低温保存，复苏后SPF鸡胚传代两次，血凝效价为1∶1280。

细胞株：狗肾传代细胞(MDCK)，购自中国科学院上海细胞研究所细胞库，常规方法传代培养。培养液为含10％FCS的RPMI 1640，维持液为含2％FCS的RPMI1640，均加入1％青霉素和链霉素。

SPF鸡胚：购自浙江省农业科学院。

0.5％鸡红细胞悬液：心脏采集健康SPF公鸡鸡血，抗凝去纤维，Alsever氏液中4℃保存(不超过10天)，临用前以0.85％灭菌生理盐水洗涤3次，制成0.5％鸡红细胞悬液。

试剂：小牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司，批号041117；RPMI 1640培养液，Gibco公司出品，批号2535081；Hanks液，取预先配制好的A、B母液(20倍浓缩)，1∶1混匀后稀释20倍作为使用液，过滤，分装，4℃保存；PBS，称取NaCl 8.0克、KCl 0.2克、NaHPO4·12H2O2.9克、KH2PO40.2克，加双蒸水至1000毫升，充分溶解后，分装、高压灭菌，4℃保存备用；细胞消化液(VTP)，称取2.5克胰酶和0.2克EDTA，加入1000毫升PBS，再加入配好的双抗10毫升，混匀后过滤，分装为4毫升/瓶，-20℃冻存备用；双抗，青霉素2瓶×80万单位，链霉素100万单位，加入100毫升Hanks液中，过滤，分装为5毫升/瓶，-20℃冻存备用。

1.3.主要仪器：二氧化碳培养箱：美国Shellab公司产品；生物安全柜：美国Labcanco产品；倒置显微镜：重庆光电仪器有限公司产品；电热恒温箱：上海森信实验仪器有限公司；Synergy-HT酶标仪：美国Bio-Tek公司产品。立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂产品。

1.4.实验方法

采用微量细胞病变抑制法，以利巴韦林(病毒唑)，清开灵，双黄连，板兰根为阳性对照药，从A^III ₅的最大无毒浓度开始，测定A^III ₅抗流感病毒FM-1株的半数有效浓度(EC₅₀)，治疗指数。

1.4.1.病毒毒力测定：将病毒按常规接种于9-11日龄的鸡胚尿囊腔中，35℃培育72小时，4℃冰箱过夜，收集尿囊液，进行红细胞凝集实验，测得病毒效价为1∶1280。观察细胞病变效应(CPE)，结果记录为：“++++”为100％病变；“+++”为75％病变；“++”为50％病变；“+”为25％病变“-”为阴性结果。观察结束后将96孔板结晶紫染色后保存。

1.4.2.试验药细胞毒性测定：将配好的试验药品原液，分别用无血清1640液作连续10倍的系列稀释，稀释6个浓度，并标记为原液(100毫克/毫升)，10^-1，10-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-67个浓度。然后将原液和6个浓度药液分别加入已长成单层的MDCK细胞板中，每孔100微升，每个浓度重复4个孔，并设正常细胞对照。整个实验重复3次。细胞在37℃，5％二氧化碳，100％相对湿度的培养箱中继续培养72小时，然后每孔加入10微升5毫克/毫升的MTT溶液(用生理盐水配制)，继续培养3小时。吸去上清，每孔加入150微升DMSO，振荡使甲臢溶解，在570纳米波长下测定OD值。计算抑制率和IC₅₀：抑制率＝(OD对照-OD样品)/OD对照×100％；通过回归计算出药品对MDCK细胞的IC₅₀。

1.4.3.药物对流感病毒的抑制作用：选用健康、新鲜受精SPF鸡胚，消毒备用。鸡胚随机分为14组，每组5胚，即A^III ₅六个剂量组(最大无毒浓度用生理盐水连续做10倍稀释)、阳性对照药六个剂量组(最大无毒浓度用生理盐水连续做10倍稀释)、生理盐水对照组和病毒对照组。将不同稀释度的药液注入鸡胚中，0.25毫升/每胚，30分钟后经相同途径注入100 EID₅₀的病毒0.1毫升，对照组以生理盐水代替。35℃温箱孵育5天。收获尿囊液，测其血凝效价。能抑制其血凝效价32倍以上所注射的最小药量，即为其抑制效价(MIC)。

2.结果：

2.1.微量细胞病变抑制法测定A^III ₅体外对FM-1的抑制作用，结果见表8-1

表8-1.A^III ₅体外对FM-1病毒的抑制作用

2.1.按Reed-Muench分别计算A^III ₅和阳性药物的抗流感病毒效果，结果见表8-2。

表8-2.A^III ₅及阳性药物对流感病毒的抑制作用比较(微克/毫升)

3.结论：A^III ₅在体外具有强效抑制流感病毒FM-1的作用，其抑制作用与利巴韦林(病毒唑)相似；对FM-1的抑制作用均强于清开灵，双黄连和板兰根。

实施例9：由实施例3制备得到的原料A^III ₅的体内抗病毒作用研究

1.材料与方法

1.1药物与试剂

实验药物：A^III ₅，批号20031015，用前以生理盐水溶解，使其终浓度为100毫克/毫升，过滤除菌分装置4℃冰箱内放置备用；注射用双黄连，哈药集团中药二厂生产，批号0504003；清开灵注射液，广州明兴制药有限公司，批号050421；板兰根颗粒，杭州胡庆余堂药业有限公司生产，批号050201，以生理盐水按1∶6的倍数进行稀释。

病毒株：流感病毒FM-1鼠肺适应株，由南京医科大学引进。-84℃低温保存，复苏后SPF鸡胚传代两次，血凝效价为1∶1280。

试剂：小牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司，批号041117。融化后56℃灭活30分钟，置4℃保存备用；RPMI 1640培养液，Gibco公司出品，批号2535081，1000毫升RPMI 1640培养液含2克NaHCO3、0.11g丙酮酸钠及1％青霉素和链霉素，置4℃保存备用；Hanks液，取预先配制好的A、B母液(20倍浓缩)，1∶1混匀后稀释20倍作为使用液，过滤，分装，4℃保存；PBS，称取NaCl8.0克、KCl 0.2克、NaHPO4·12H2O 2.9克、KH2PO4 0.2克，加双蒸水至1000毫升，充分溶解后，分装、高压灭菌，4℃保存备用；细胞消化液(VTP)，称取2.5克胰酶和0.2克EDTA，加入1000毫升PBS，再加入配好的双抗10毫升，混匀后过滤，分装为4毫升/瓶，-20℃冻存备用；双抗，青霉素2瓶×80万单位，链霉素100万单位，加入100毫升Hanks液中，过滤，分装为5毫升/瓶，-20℃冻存备用。

1.3.主要仪器：二氧化碳培养箱：美国Shellab公司产品；生物安全柜：美国Labcanco产品；倒置显微镜：重庆光电义器有限公司产品；电热恒温箱：上海森信实验仪器有限公司；Synergy-HT酶标仪：美国Bio-Tek公司产品。立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂产品。

1.4.实验方法

1.4.1.病毒对小鼠感染毒力测定：昆明种小鼠共60只，体重20±2克，乙醚浅麻醉，以5个10倍稀释度病毒液滴鼻感染，每组10只，同时设1组作正常动物对照，每鼻孔0.03毫升。观察2周，记录发病死亡数，计算半数死亡量(LD₅₀)。如不发病或发病不死亡，取标本检测病毒，计算半数感染量(ID₅₀)。

1.4.2.试验药品对流感病毒致小鼠出血性肺炎的肺指数和肺指数抑制率的测定：将小鼠随机分为9组，每组20只，即：正常对照组；病毒对照组；；A^III ₅(大、中、小剂量)三个剂量组，利巴韦林组，清开灵组，双黄连组和板兰根组。用A^III ₅对小鼠的最大耐受剂量(LD₀＝3克/公斤)的1/2、1/4、1/8三个剂量，按体重灌胃给药，每只鼠＜0.5ml，分别用TCM06的三个浓度，即100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml剂量给药，2次/日，预防性给药3天后，用15倍LD₅₀病毒量滴鼻感染小鼠，每鼻孔0.03毫升。感染后连续给药4天，第4天将每组动物的第1小组称取体重并放血杀死。解剖小鼠，取出全肺，放入盛有蒸馏水平皿中洗涤两次，摘除气管、肺门淋巴结等组织，吸水纸吸干后称重，计算肺指数和肺指数抑制率。肺指数＝小鼠肺重/小鼠体重×100％；肺指数抑制率＝(病毒对照组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100％。每组剩下的第2小组动物继续给药2天(共6天)，观察2周，逐日记录死亡数。

计算死亡保护率(％)＝(病毒对照组死亡率-实验组死亡率)×100％；各组平均死亡日＝14-平均存活日。各组平均存活日采用COX生存分析，平均存活日组间比较采用LogRank检验。

2.结果：

2.1.流感病毒对小鼠毒力测定：采用Reed-Muench法计算，流感病毒FM-1在小鼠体内的LD₅₀为10^-3.82，查反对数得，LD₅₀为原液6607倍稀释，药效学试验中，采用15倍LD₅₀病毒浓度，即病毒原液作440倍稀释。见表9-1。

表9-1.流感病毒在小鼠体内的LD₅₀计算

2.2.A^III ₅对流感病毒致小鼠出血性肺炎的肺指数和肺指数抑制率的影响：分别计算各组小鼠肺指数和肺指数抑制率。从表9-2可以看出，感染模型组体重下降明显低于正常对照组，A^III ₅各剂量组和阳性药物组均能逆转小鼠的体重下降；感染模型组肺指数显著低于正常对照组，A^III ₅各剂量组与阳性药物组的肺指数与正常对照组无显著改变，而明显高于感染模型组。

表9-2.滴鼻感染后小鼠的各项指标

##P＜0.01，与正常组比较；^*P＜0.05，^**P＜0.01，与病毒对照组比较。

2.3.连续观察2周A^III ₅对小鼠死亡数和各项指标的影响：

2.3.1小鼠每天的死亡数：见表9-3

表9-3.观察2周小鼠每天的死亡数

注：组别(1)为正常对照组，(2)为病毒对照组，(3)为A^III ₅大剂量实验组，(4)为A^III ₅中剂量实验组，(5)为A^III ₅小剂量实验组，(6)为利巴韦林组，(7)为清开灵组，(8)为双黄连组，(9)为板兰根组。

2.3.2连续观察2周小鼠的各项指标：见表9-4

表9-4.连续观察2周小鼠的各项指标

注：^*P＜0.05，^**P＜0.01，与病毒对照组比较。组别(1)为正常对照组，(2)为病毒对照组，(3)为A^III ₅大剂量实验组，(4)为A^III ₅中剂量实验组，(5)为A^III ₅小剂量实验组，(6)为利巴韦林组，(7)为清开灵组，(8)为双黄连组，(9)为板兰根组。

3.结论：体内抗FM-1实验等结果表明，A^III ₅对流感病毒感染小鼠有一定的保护作用。A^III ₅FM-1的抑制作用与利巴韦林相似；其抑制作用均强于清开灵，双黄连和板兰根。

实施例10：由实施例3制备得到的原料A^III ₅的体外抗菌作用

1.方法：用液体培养基牛肉汤作A^III ₅的连续10倍稀释(牛肉汤：A^III ₅＝0.9毫升：0.1毫升)，A^III ₅浓度为100毫克/毫升、10毫克/毫升、1毫克/毫升、100μg/毫升、100μg/毫升、1μg/毫升、0.1μg/毫升、0.01μg/毫升，共8个浓度，每个浓度做两个复管，每试管加浓度为5×105个/毫升的细菌悬液0.1毫升，并设立对照。摇匀，置37℃恒温箱中培养24h。观察每组的肉汤透明状况。“-”为浑浊，无抑菌效果。见表6。

2.结果：从表6可以看出：肉汤培养中，浓度为100毫克/毫升、10毫克/毫升的A^III ₅对金黄色葡萄球菌(G+)有抑菌作用。A^III ₅对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)均为10毫克/毫升。

表10-1  A^III ₅体外抗菌实验(试管法)

注：“-”表示为浑浊

实施例11：由实施例3制备得到的原料A^III ₅对绵羊红细胞所致小鼠溶血素抗体生成的影响

1.材料与方法

1.1实验动物：昆明种小鼠，18～22g，雄性。购于安徽医科大学实验动物中心，合格证号：皖实动准01号。

1.2药物与试剂：A^III ₅，批号20031015；环磷酰胺(cyclophosphamide)，上海华联制药有限公司，批号：030506；Alsever溶液(葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，氯化钠0.42g，双蒸水100毫升，无菌过滤)；都氏试剂(碳酸氢钠1.0g，氰化钾0.05g，高铁氰化钾0.2g，双蒸水1000毫升)；豚鼠血清(补体)的制备：豚鼠心脏取血，分离血清并稀释，血清∶SRBC＝1∶0.2(V/V)，于4℃冰箱放置30min，2000rpm离心10min，吸取上清液，用生理盐水稀释成1∶10血清备用。

1.3主要仪器：7530可见紫外分光光度计(上海分析仪器厂产品)；TDL-16c台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂产品。

1.4实验方法

1)小鼠随机分为5组，每组10只，即正常对照组、A^III ₅(50，100，200毫克/公斤)和环磷酰胺阳性对照组。A^III ₅用药组连续灌胃8天，环磷酰胺组皮下注射环磷酰胺40毫克/公斤/日，连续用药3天。

2)绵羊红细胞(SRBC)悬液制备 无菌条件下，从绵羊外颈静脉取血，置于盛有玻璃珠的灭菌锥型瓶中，摇动10min除去纤维蛋白，加入相当于羊血体积2倍的Alsever溶液摇匀，置于4℃冰箱中备用。临用时取上述保存的羊红细胞用生理盐水洗涤3次，每次1000～2000rpm离心5min，弃去上清液，再用生理盐水以3∶5(v/v)稀释，浓度为2×1010个/毫升。

3)免疫及给药 小鼠于第2次用药后腹腔注射SRBC悬液0.2毫升/只，对照组以同样方法免疫，于免疫后7天，眼眶取血进行溶血素测定。

4)溶血素测定 取血1毫升于离心管中放置1h后，用长针将凝固血与管壁剥离，使血清充分渗出，离心取血清，用生理盐水稀释500倍，再取1毫升加入反应管中，再加入10％0.5毫升SRBC，并于每管中加入1毫升以生理盐水1∶10稀释的豚鼠血清，立即置入37℃恒温水浴中，保温10min，即放入冰浴以终止反应，离心取上清1毫升，加3毫升都氏试剂，混匀放置10min后，在540nm下测吸光度A值。

5)羊红细胞半数溶血时A值的测定 取0.25毫升SRBC用都氏液稀释至4毫升，摇匀，放置10min，离心取上清液，于540nm测吸光度A值。

6)半数溶血值HC₅₀的计算

将给药组的平均HC₅₀值与对照组平均HC₅₀进行t检验来判断其差异显著性。给药后溶血素增多，A值高或HC₅₀增高，则说明药物可增强体液免疫。

2.结果

实验结果表明A^III ₅(100，200毫克/公斤)剂量组能明显提高小鼠产生溶血素水平，说明A^III ₅可增强体液免疫。而环磷酰胺组能降低小鼠产生溶血素水平。

表11-1  A^III ₅对绵羊红细胞所致小鼠溶血素抗体生成的影响(n＝10，            x±s)

^*p＜0.05，^**p＜0.01vs normal

实施例12：由实施例3制备得到的原料A^III ₅组合物片剂的制备方法

用原料A^III ₅ 2,000毫克，按照药剂学一般压片法混匀后加辅料8,000毫克，压制成100片。每片重100毫克。

实施例13：由实施例3制备得到的原料A^III ₅组合物胶囊剂的制备方法

用原料A^III ₅ 5,000毫克，以原料∶(淀粉+微晶纤维素)按比例(1∶1)，其中淀粉∶微晶纤维素1∶1制粒后套入0号空心胶囊中。共装100粒，每个胶囊重100毫克。

Claims (13)

1.一种具有抗病毒、抗炎、和/或抗菌功能的六棱菊属植物提取物，其由包含下列步骤的方法制备得到：

a)用水或水-强极性有机溶剂的混和液提取经粉碎或切成小段的六棱菊属植物，浓缩提取液，回收溶剂；

b)将步骤a)得到的浓缩液经柱层析，水洗，然后用用醇与水的混合溶剂冼脱；

c)将步骤b)得到的洗脱液减压浓缩至无醇味，干燥，粉碎得产品；其中，六棱菊属植物是指六棱菊和/或四棱锋，提取部位是茎、根、叶、种子、皮、果实，或它们的混合物；步骤b)中的醇与水的混合溶剂是指50-80％的乙醇。

2.根据权利要求1的六棱菊属植物提取物，其制备方法的步骤a)中的水-强极性有机溶剂的混合液是醇水混合溶剂。

3.根据权利要求1的六棱菊属植物提取物，其制备方法的步骤a)中的提取溶剂的重量为药材重量的1-20倍，提取时间为1-5小时，提取次数为1-5次。

4.根据权利要求1的六棱菊属植物提取物，其制备方法的步骤b)中的柱层析所用介质是反相硅胶、大孔树脂、或聚酰胺。

5.根据权利要求1的六棱菊属植物提取物，其制备方法的步骤a)中的提取溶剂为水，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小时；步骤b)中的柱层析所用介质是反相硅胶、大孔树脂、或聚酰胺。

6.根据权利要求5的六棱菊属植物提取物，其中步骤b)中的柱层析所用介质是大孔树脂或聚酰胺。

7.根据权利要求1的六棱菊属植物提取物，其中步骤a)中的提取溶剂是醇水混合溶剂，其中醇是甲醇、乙醇、乙二醇或者它们的混合物；步骤b)中的柱层析所用介质是反相硅胶、大孔树脂、或聚酰胺。

8.根据权利要求7的六棱菊属植物提取物，其中步骤a)中的提取溶剂是30-75％的乙醇水溶液，提取1-5次，每次用3-10倍量，每次提取0.5-3小时；步骤b)中的柱层析所用介质是大孔树脂或聚酰胺。

9.权利要求1-8之一的六棱菊属植物提取物，其含有30％-90％的咖啡酰奎尼酸类化合物。 

10.权利要求1-8之一的六棱菊属植物提取物，其含有50％-90％的咖啡酰奎尼酸类化合物。

11.权利要求1-10之一的六棱菊属植物提取物用于制备治疗炎症、病毒感染引起的各种病症的药物的用途，其中炎症包括咽喉炎症，肺炎，腮腺炎，以及由上呼吸道感染引起的其他炎症，病毒是流感病毒或其主要引起上呼吸道感染或者肺部感染的病毒。

12.一种具有抗病毒、抗炎和/或抗菌功能的药物组合物，其含有治疗有效量的权利要求1-10之一的提取物和可药用载体。

13.根据权利要求12的药物组合物，其是片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射剂、滴丸、外用搽剂或气雾剂。