CN1878570A - 包含粒细胞集落形成刺激因子的稳定的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了粒细胞集落形成刺激因子(G－CSF)的新的稳定的药物组合物。

Description

包含粒细胞集落形成刺激因子的稳定的药物组合物
发明领域
本发明涉及包含粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的稳定的药物组合物。
发明背景
人G-CSF属于造血生长因子，它在嗜中性粒细胞的形成过程中起着决定性的作用。G-CSF用于医学的血液学和肿瘤学领域。现在市场上有两种形式的G-CSF可供临床使用：糖基化的并在哺乳动物细胞尤其是在CHO细胞系中产生的利诺司啶(lenograstim)(Holloway CJ(1994)Eur J Cancer30A Suppl 3：S2-S6；EP 169566)和非糖基化的并在大肠杆菌中产生的非格司亭(filgrastim)(EP 237545)。
从文献中得知，与获自CHO细胞的糖基化形式的G-CSF相比，非糖基化形式的G-CSF在体外特别不稳定(Oh-eda等人(1990)J Biol Chem265(20)：11432-35)。由于糖基化和非糖基化的G-CSF有着不同的稳定性，根据存在/缺乏糖基化，用于制备稳定的可药用G-CSF的现有方法是不同的。尤其是在非糖基化G-CSF的情况下，非糖基化G-CSF是疏水蛋白质，制备在较长的储存期中支持药物蛋白质稳定的可药用组合物并在医疗上使用是一项艰巨的任务，这代表着特殊的挑战，并需要特定的经选择的方法。
非糖基化G-CSF的稳定化组合物在EP 373679中有描述，其特征基本上在于在低的电导率和从2.75至4.0的酸性pH值范围条件下有利地提供了G-CSF的稳定性。但是，可加入多种糖或糖醇、氨基酸、聚合物和洗涤剂，以获得更好的G-CSF稳定性。尤其是强调组合物的pH应低于4以减少聚集体的形成并增加G-CSF的稳定性。在EP 373639中描述的包含G-CSF的药物组合物在pH高于4.0的条件下有聚集体形成和稳定性降低与现有技术文献中获得的结果是一致的(Kuzniar等人(2001)Pharm DevTechnol 6(3)：441-7；Bartkowski等人(2002)J Protein Chem 21(3)：137-43；Narhi等人(1991)J Protein Chem 10(4)：359-367；Wang W(1999)Int JPharmaceut 185：129-188。
在其它专利和科学文献中描述了稳定G-CSF的不同方法。EP 1129720公开了非糖基化的牛G-CSF的稳定含水组合物，其具有的pH范围为5至8并包含含有浓度从约0.01M至约1.0M的硫酸根离子的盐。
在EP 607156中公开了用于输注和注射目的的含有G-CSF的药物组合物。通过设定有利于G-CSF的酸性pH值并加入多种防腐剂、不同的氨基酸和表面活性剂的混合物作为稳定剂以达到G-CSF稳定化的目的。从该说明书中不清楚使用的G-CSF是糖基化还是非糖基化的G-CSF。EP674525公开了在缓冲液中稳定的含水药物组合物，所述缓冲液选自柠檬酸盐、马来酸盐、磷酸盐和柠檬酸盐的组合物和精氨酸。除此之外，加入至少一种表面活性剂以达到G-CSF的稳定。在该说明书中没有具体说明使用的G-CSF是糖基化还是非糖基化形式。
GB 2193621公开了pH范围在7至7.5之间的糖基化G-CSF组合物，其包含至少一种选自可药用表面活性剂、糖类、蛋白质和高分子量化合物的物质。适宜的高分子量化合物包括羟丙基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。尤其指出组合物含有表面活性剂是有利的。
在EP 1060746中描述了存在至少一种可药用表面活性剂的pH约为6.5的包含糖基化G-CSF的药物组合物。说明书公开了依赖于pH的脱唾液酸化(desialylated)G-CSF稳定性的测定。结果表明pH从约5.0至约7.0时脱唾液酸化G-CSF的稳定性很低。
EP 0988861公开了G-CSF特别是牛G-CSF的药物组合物，其中通过加入浓度约为1M的稳定缓冲液如HEPES、TRIS或TRICINE而达到G-CSF的稳定性。
EP 0674524描述了通过加入麦芽糖、纤维二糖、龙胆二糖、异麦芽糖、棉子糖、海藻糖或氨基糖而使G-CSF稳定的冻干药物组合物。
EP 1197221、EP 1260230、EP 1329224中描述了含有pH约6.5的一种或多种氨基酸的糖基化G-CSF组合物，而用氨基酸稳定的冻干组合物则描述在EP 0975335中。在JP2002371009中描述了延长G-CSF药理作用持续时间的方法，其特征在于G-CSF水溶性溶液中存在表面活性剂。
在EP 0459795中描述的口服剂型G-CSF是基于以表面活性剂、脂肪酸和肠道物质稳定化。WO51629描述了加入蛋氨酸而长时间稳定的组合物。
虽然在G-CSF的药物组合物中优选低的离子强度，几乎在每一项专利和科学文献中都加入多种的非离子型、阴离子型或天然的表面活性剂，以防止在包装材料表面的G-CSF聚集和变性。但是，从医学的观点来看，G-CSF组合物中的表面活性剂应优选避免使用，因为它们可引起局部刺激，它们可能含有需要非常仔细地进行控制的毒性杂质，并且它们如何被代谢或被排泄也并不总是清楚的。除此之外，容易自氧化的某些表面活性剂能损伤蛋白质。
本发明的目的是提供非糖基化G-CSF的稳定的液体药物组合物，其使得在不加入来自人和/或动物源的表面活性剂和添加剂的条件下G-CSF可作为药物制剂而正常地使用。特别地，本发明的组合物具有长的贮存期限，生理耐受性良好，易于使用，并可准确地施用。
发明概述
本发明的目的是提供非糖基化G-CSF的药物组合物，其能有利地稳定G-CSF。
本发明提供了根据权利要求1的新的稳定的G-CSF药物组合物。优选的实施方案在从属权利要求书中给出。本发明也提供了根据权利要求17的方法，以及根据权利要求18和19的用途。
本发明的药物组合物优选在pH大于4.0的条件下配制。在存在酸的条件下G-CSF的稳定化得到实现，与此同时本发明的组合物优选不含有G-CSF以外的来自人和/或动物源的表面活性剂和添加剂(如血清蛋白质)。药物组合物任选地还含有多元醇和/或pH缓冲体系和/或一种或多种可药用赋形剂。本发明的药物组合物适宜于作为人用药或兽用药使用，在适宜的施用方式下可药用，特别是肠胃外施用如肌内、皮下和/或静脉内施用。在特别优选的实施方案中，本发明的药物组合物以液体形式，更优选以含水的形式存在。
附图描述
图1显示了含有G-CSF的本发明样品在4℃下储存3个月后的SE-HPLC分析。
图2显示了含有G-CSF的本发明样品和参比样品在40℃下储存1个月后的SE-HPLC分析。
图3显示了含有G-CSF的本发明样品和参比样品在40℃下储存1个月后的SE-HPLC分析。
图4显示了含有G-CSF的本发明样品和参比样品在40℃下储存1个月后的SDS-PAGE分析。
图5显示了含有G-CSF的本发明样品和参比样品在40℃下储存1个月后的SE-HPLC分析。
发明描述和优选的实施方案
令人惊奇地发现非糖基化G-CSF可在pH优选大于4.0的不含表面活性剂的药物组合物中有利地稳定存在。
本发明提供了G-CSF的药物组合物，其包含：
(a)治疗有效量的G-CSF和
(b)酸
并且优选地不含表面活性剂。
本发明的组合物优选在pH大于4.0的条件下制备。
本发明也提供了G-CSF的药物组合物，其除了组分(a)-(b)之外还任选地含有
(c)多元醇和/或
(d)pH缓冲体系和/或
(e)一种或多种可药用赋形剂。
本文所用的术语“粒细胞集落形成刺激因子”(G-CSF)意指可促进造血前体细胞的分化和增殖并促进造血系统成熟细胞活化的G-CSF，其选自如下所定义的包含人G-CSF和衍生物和类似物的G-CSF。G-CSF优选涉及重组的人G-CSF，它通过在大肠杆菌(E.Coli)中表达而得到。
本文所用的术语“治疗有效量的G-CSF”，意指G-CSF的量可产生G-CSF的治疗效果。
本文所用的术语“多元醇”，意指任一多羟基醇，即化合物的每个分子含有两个或多个羟基。
本文所用的术语“表面活性剂”，意指两亲型(表面活性剂)分子的胶体聚集体，它在称之为临界胶团浓度的某一浓度处出现。胶团中聚集体分子的典型数量(聚集体数量)为50至100个。
本文所用的术语“不含表面活性剂”，意指表面活性剂在组合物中不存在，或存在的量低于检测限。
本文所用的术语“G-CSF稳定剂”，意指对G-CSF有稳定作用的可药用赋形剂。
本文所用的术语“G-CSF稳定性”，意指维持G-CSF的含量和维持G-CSF的生物学活性。G-CSF的稳定性尤其受到下列过程的影响：容器壁对G-CSF的吸附、G-CSF的变性或降解、聚集体的形成如G-CSF二聚体和/或G-CSF多聚体和/或具有较高分子量的类似分子。这些过程的出现是由于样品暴露在不同的条件下，如较高的温度、不适当的容器、使用了错误的G-CSF稳定剂、阳光、不适当的储存方式、融解/冷冻和/或不适当的分离方法。
本文所用的术语“不含人和/或动物源的添加剂”，意指源于人和/或动物的不同于G-CSF的添加剂，如明胶或血清蛋白质如人血清白蛋白或牛血清白蛋白，不特意地加入到组合物中。
现已令人惊奇地发现，在本发明的药物组合物中配制的G-CSF可改善其在高于冰箱温度(如2-8℃)的温度，在室温(即低于25℃)，甚至更高的温度(如约40℃)的稳定性。这意味着本组合物可在高于冰箱温度的温度储存一段较长时间，和/或在较高的温度下储存一段时间而不会显著地降低活性，不会产生显著的降解。
在现有技术文献中描述的药物组合物中，非糖基化的G-CSF优选地在pH低于4.0且在低电导率和在低的酸值下或存在不同的稳定剂的条件下被稳定。在另一方面，所有现有技术在pH值大于4.0的条件下稳定的G-CSF组合物都包含不同的稳定剂，它们之中最优选表面活性剂。除此之外，在现有技术的文献中，通常不清楚在G-CSF稳定性研究中使用的是糖基化G-CSF还是非糖基化G-CSF。在pH值大于4.0、低电导率、不加表面活性剂的条件下，用现有技术进行的G-CSF稳定性研究导致了聚集体的形成。在现有技术的文献中，在pH值大于4.0的条件下稳定G-CSF的其他方法包括加入表面活性剂或多种其他的赋形剂。
尽管在现有技术的文献中已有方法和结果的描述，但在本发明中令人惊奇地显示G-CSF的稳定性甚至可在pH值大于4.0并且不加入表面活性剂的条件下达到。除此之外，本发明G-CSF的稳定性可用酸作为唯一的赋形剂来达到，该酸提供了适宜于G-CSF稳定存在的环境。虽然没有局限于这种方式，本发明不需要加入其它的G-CSF稳定剂如可药用的赋形剂以稳定本发明的G-CSF。这是有好处的，因为药物组合物中可药用赋形剂必须严格控制以避免有毒杂质的出现。需除去杂质以避免几乎不可控的物质在人体或动物体中的施用。另一方面，尚不清楚可药用赋形剂在人体中是如何代谢和排泄的，我们需要将它们考虑在内以避免副作用。
在已知的现有技术的一些药物组合物中使用了象非离子型洗涤剂这样的表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯。在G-CSF组合物中使用有自氧化倾向的表面活性剂可被认为是有问题的，优选避免使用，因为它们能形成损伤蛋白质的OH自由基。加入表面活性剂也可造成对施用部位的局部刺激。表面活性剂也可干扰杂质的测定，如通过SEC(分析)法对聚集体的测定。所以，使G-CSF的药物组合物不含表面活性剂，尽可能地简单，避免使用其他的赋形剂，并保持组合物的pH值适宜于患者的施用是有好处的。
从经济的观点来看，优选地不含表面活性剂的本发明的G-CSF组合物也是较好的。组合物越容易制备，费用也就越低，组合物制备的时间越短，患者机体接受的添加剂也就越少。pH值高于4.0比pH值低于4要好，pH值过低在患者中皮下施用可导致局部的不耐受。
虽然并不局限于这种方式，本发明的组合物可因此优选地仅由上述的组分a-b、或任选地a-c、a-c加e、a-d、a-d加e、a-b加e、或a-b加d-e组成。
本发明的药物组合物优选地是液体，特别是在长期储存中维持G-CSF活性的含水药物组合物。这样的液体药物组合物可肠胃外直接使用，如皮下、静脉内或肌内注射，而不再经过可导致G-CSF生物学活性降低或甚至丧失的重建、稀释或其他的制备步骤，并也有利于避免在使用过程中出现其他的技术问题。液体药物组合物因此比冻干的组合物更实用。G-CSF的液体特别是含水药物组合物在制备临床G-CSF组合物中通常比冻干的组合物更优选，因为冻干组合物的重建花费时间，存在着蛋白质组合物不当处理的风险，或重建不当，并且某些添加剂如稳定剂常常要求保留药物的足够活性。
本发明的药物组合物优选地基本上不含源于人和/或动物源的添加剂如血清白蛋白或纯化的明胶作为G-CSF稳定剂。
本发明药物组合物中使用的G-CSF可以是任一非糖基化的高纯度人G-CSF。具体地说，它可来自于天然或用基因工程方法制备，只要它含有与哺乳动物特别是人G-CSF基本上相同的生物学活性。基因工程的G-CSF可与天然的G-CSF具有相同的氨基酸序列，或可为含有一个或多个氨基酸的缺失、替代或添加的其类似物；用PEG或类似方法进行化学修饰后生物学活性相同或得到提高的G-CSF也包括在内。本发明的药物组合物中使用的G-CSF可用任何方法制备，它可通过多种技术从细菌细胞如大肠杆菌的培养物、遗传修饰的酵母或其他适宜的有机体细胞内提取、分离和纯化。
本发明药物组合物中使用的G-CSF最优选通过大肠杆菌的表达而生产，且优选地非糖基化。
本发明的药物组合物可包含治疗有效量的G-CSF。虽然在市场上目前的治疗有效量为从0.3至0.96mg/ml，但这并不对本发明的G-CSF组合物构成限制。
本发明G-CSF组合物的pH值高于4.0，优选从约4.0至约5.0，更优选从约4.2至约4.8，最优选的pH值约为4.4。
优选的pH值范围优选使用醋酸来达到。其他获得并维持期望的pH大于4.0的适宜酸包括但并不局限于盐酸、甲磺酸、马来酸、柠檬酸、谷氨酸、丙二酸、乳酸、硫酸、磷酸和其他可药用酸或它们的混合物。组合物中酸的浓度取决于组合物期望的pH值。
在另一个实施方案中，通过使用选自包括醋酸、柠檬酸、磷酸和其他适宜酸的不同的酸而达到期望的pH值，最终的pH值通过加入选自包括NaOH、TRIS或任何其他适宜的碱的pH调节剂精细调节而达到。通过加入上述的酸和碱，建立了适宜的pH缓冲系统，如醋酸/醋酸盐、柠檬酸/柠檬酸盐、谷氨酸/谷氨酸盐、磷酸/磷酸盐或任何其他适宜的pH缓冲体系。在它们当中，最优选的pH缓冲系统为醋酸/醋酸盐，适宜使用的醋酸浓度为约0.15mM至约15mM，最优选的浓度范围为从1.5mM至10mM。
本发明的药物组合物可任选地还包含多元醇，该多元醇选自山梨醇、甘露糖醇、环己六醇和甘油。在它们之中，特别优选山梨醇，适宜使用的浓度为约1％至约10％(m/v)，最优选的浓度为从3％至8％(m/v)。
本发明的药物组合物可任选地还包含一种或多种的可药用赋形剂。适宜的可药用赋形剂可选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、羟丙基纤维素-β-环糊精、泊洛沙姆(poloxamer)、糖如蔗糖和海藻糖、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙二醇酯和醚、乙二醇和甘油酯和/或多种氨基酸。
本发明的药物组合物可填充于安瓿、注射器、预填充的注射器、多剂量注射用药筒和小玻璃瓶内。这些措施使得使用的体积在适宜的范围之内，每个剂量可为从0.2ml至2ml，但并不局限于此。
本发明的药物组合物中稳定的生物学活性G-CSF可用于治疗疾病，疾病包括：中性粒细胞减少症和中性粒细胞减少症有关的临床后遗症、化疗后发热性粒细胞减少症减少住院的时间、动员造血祖细胞、作为供体白细胞输注的备选、慢性中性粒细胞减少症、中性粒细胞减少和非中性粒细胞减少的感染、移植物接受者、慢性炎症病症、败血症和败血症休克、危险的减少、发病率的降低、死亡率的降低以及中性粒细胞减少和非中性粒细胞减少的感染中住院天数的减少、预防中性粒细胞减少和非中性粒细胞减少的感染患者中的感染和与感染有关的并发症、预防医院内感染并降低医院内感染的死亡率和发病率、减少新生儿的肠内施用、加强新生儿的免疫系统、改善重症监护病房患者和重危患者的临床效果、改善创伤/皮肤溃疡/烧伤的治愈和治疗、增强化疗和/或放疗、全血细胞减少症的治疗效果、增加抗炎症细胞因子、通过预防性使用非格司亭缩短大剂量化疗的间隔、增强光动力疗法的抗癌效果、预防和治疗由不同的大脑功能异常引起的疾病、治疗血栓疾病以及它们的综合症、以及放疗后红细胞生成的恢复。
它也可用于治疗为G-CSF适应症的所有其他疾病。
下列的实施例说明本发明，但对本发明不构成限制。
实施例
分析方法
下列的分析方法用于分析本发明的药物组合物：大小排阻HPLC(SE-HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、用紫外检测确定熔点温度(Tm)、等电聚焦法(IEF)和体外生物学活性测定法。
SE-HPLC
SE-HPLC用于确定G-CSF聚集体的浓度、特别是二聚体和更大的聚集体。二聚体和更大的聚集体的检测限为0.01％。
高效液相色谱(HPLC)系统如下：紫外检测器、在线脱气机、二元泵模块和恒温自动进样器(如Waters Alliance HPLC systems)。在下列的条件下进行分析：
色谱条件：
色谱柱：TSK G3000 SW，10μm，300×7.5mm ID
柱温：30℃
流动相：磷酸盐缓冲液pH值7.0(5mM磷酸钠，50mM NaCl)
流速：0.8ml/分钟，等度模式
检测：紫外检测器，波长215nm
注射体积：20μl(蛋白质的注射量为6-12μg)
自动进样器温度：+2至+8℃
运行时间：20分钟
RP-HPLC
RP-HPLC用于确定G-CSF含量，并根据它们的疏水性对分离的杂质进行定量。
使用的HPLC系统如下：紫外检测器、在线脱气机、二元泵模块、恒温自动进样器和恒温的柱箱(如Waters Alliance HPLC systems)。分析在下列的条件下进行：
色谱条件：
柱：YMC-Pack ODS-AQ，200，球形，3μm，150×4.6mm i.d.
柱温：65℃
流动相：A相：在水中0.1％的三氟醋酸(TFA)和50％的乙睛(ACN)
        B相：0.1％TFA和95％ACN在HPLC用水中的溶液
流速：1.0mL/分钟，根据下表用梯度方式进行：
  时间[分钟]   流动相B[％]
  0.0   8
  4.0   8
  19.0   28
  19.1   100
  21.0   100
  21.1   8
  25.0   8
检测：紫外检测器，波长215nm
注射体积：10μl(蛋白质的注射量为3-6μg)
自动进样器温度：+2至+8℃
运行时间：25分钟
用紫外检测确定Tm
Tm用于估计蛋白构象稳定性。高的Tm表示在某一组合物中有较高的蛋白质稳定性。G-CSF的稳定性通常可通过加入某些赋形剂而得到改善。
带有Peltier冷却加热系统(DBS，PTP-1)的紫外分光光度计：使用Perkin Elmer Lambda BIO 40分光光度计，在下列的条件下进行分析：
温度范围：50-70℃
升温速率：1℃/分钟
检测：波长280nm
进样体积：1.0ml(蛋白质的浓度：0.3-0.6mg/ml)
自动进样器温度：+2至+8℃
SDS-PAGE
SDS-PAGE用于视觉上检测蛋白质二聚体和其他聚集形式(三聚体和更大的分子形式)的存在。
上样样品在不含还原剂的上样缓冲液中制备。使用垂直SDS-PAGE：凝胶NuPAGE Bis-TRIS 12％，8×8cm，厚度1.0mm，15泳道(Invitrogen)，在MOPS SDS电泳缓冲液(Invitrogen)中。在200V的恒定电压下电泳。样品通过考马斯蓝染色而分析(0.1％ Phast Gel Blue R350在30％的甲醇中)。
体外G-CSF的生物学活性测定
G-CSF生物学活性通过基于刺激细胞增殖(NFS-60细胞)的方法测定，使用已知的方法(Hammerling U等人(1995)J Pharm Biomed Anal 13：9-20)并使用人重组G-CSF国际标准品(88/502，来自酵母细胞；NIBSCPotters Bar，Hertfordshire，UK)；(Mire-Sluis AR 等人(1995)J ImmunolMethods 179，117-126)。
pH值的测定
用MA 5741(Iskra)pH计和Biotrode(Hamilton)电极测定pH值。用适宜的新配制校准缓冲液将pH计在pH值从3.0至5.0的范围内校准。pH值在25℃测量。pH测量值的标准差为0.003个pH值(0.3％)。
测定在药物组合物中的G-CSF稳定性的条件
4℃：在冰箱温度下(范围为+4℃至+6℃)储存在冰箱中
40℃：储存在40℃±2℃
25℃：在25℃至30℃的室温下储存于1ml的预填充的注射器中，在Vibromix 314EVT振荡器中以75转/分钟的速度振摇。
实施例1：稳定性试验
制备下列的G-CSF药物组合物：
S18：1.5mg/ml的G-CSF，用醋酸将pH值调节至4.4
B1a(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液将pH调节至4.2
B1b(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液将pH调节至4.4
B1c(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液将pH调节至4.6
B1d(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液将pH调节至4.8
B1e(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，0.13mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，pH4.4
B-1e-3(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，0.13mM柠檬酸，5％(w/v)山梨醇，pH 4.4
B-1e-4(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，0.13mM马来酸，5％(w/v)山梨醇，pH 4.4
B1f(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，用TRIS将pH调节至4.4
B-1b(0.6)：0.6mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液将pH调节至4.4
B-1e(0.6)：0.6mg/ml G-CSF，0.13mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，pH4.4
B-1e-2(0.6)：0.6mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，0.004％吐温80，用稀NaOH溶液将pH调节至4.4
B-1e-3(0.6)：0.6mg/ml G-CSF，0.13mM柠檬酸，8％(w/v)山梨醇，pH 4.4
B-1e-4(0.6)：0.6mg/ml G-CSF，0.13mM马来酸，8％(w/v)山梨醇，pH 4.4
B-1g(0.6)：0.6mg/ml G-CSF，0.04mM HCl，8％(w/v)山梨醇，pH 4.4
B2a(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，3％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液将pH调节至4.2
B2b(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，3％(w/v)山梨醇，用稀NaOH溶液将pH调节至4.4
B-3b(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，0.04mM甲磺酸，5％(w/v)山梨醇，pH 4.4
B-4a(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)甘油，pH 4.4
B-4c(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)甘油，0.1％泊洛沙姆188，pH 4.4
B-5a(0.6)：0.6mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，0.1％吐温20，用稀NaOH溶液将pH调节至4.4
B-6a(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，0.05％泊洛沙姆188，pH 4.4
B-6b(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，0.1％泊洛沙姆188，pH 4.4
B-6d(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，1.0％泊洛沙姆188，pH 4.4
D2a(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，0.04mM甲磺酸，5％(w/v)山梨醇，0.1％泊洛沙姆188，pH 4.4
D2b(0.3)：0.3mg/ml G-CSF，10mM甲磺酸，5％(w/v)山梨醇，0.1％泊洛沙姆188，用稀NaOH溶液将pH调节至4.4
S12：1.0mg/ml G-CSF，10mM醋酸，5％(m/v)山梨醇，用NaOH将pH调节至4.0
■参比组合物
A(S16-10ACT)：0.3mg/ml G-CSF，10mM醋酸，5％(m/v)山梨醇，0.004％吐温80，用NaOH将pH调节至4.0(象Neupogen一样)
B(S16-10ACT)：0.3mg/ml G-CSF，1.5mM醋酸，5％(m/v)山梨醇，0.004％吐温80，用HCl将pH调节至3.8
N：Neupogen组合物，可在市场上买到(G-CSF的浓度为0.6mg/ml)
样品S18中G-CSF的含量为1.5mg/ml，在4℃储存3个月。样品用SE-HPLC分析；12μg的G-CSF上样于色谱柱中。图1显示了结果(AU＝吸收单位)。
G-CSF的含量分别为0.3mg/ml的样品在40℃储存1个月。样品用SE-HPLC分析；6μg的G-CSF上样于色谱柱中。图2显示了选择的结果(AU＝吸收单位)。
图2的说明
H+                      B-1e(0.3)
Na+                     B-1b(0.3)
TRIS+                   B-1f(0.3)
图3显示了G-CSF含量分别为0.6mg/ml的一些样品在40℃储存1个月的SE-HPLC结果，12μg的G-CSF上样于色谱柱中(AU＝吸收单位)
图3的说明
H+                       B-1e(0.6)较大的聚集体
Na+                      B-1b(0.6)较大的聚集体
吐温80                    B-1e-2(0.6)较大的聚集体
吐温20                    B-5a(0.6)较大的聚集体
A                         较大的聚集体
B                         包含吐温20的安慰剂的反应
C                         二聚体
D                         G-CSF单体
E                         包含吐温20的安慰剂的反应
图4显示了G-CSF含量分别为0.6mg/ml的本发明样品和参比样品在40℃储存1个月的SDS-PAGE分析的结果。用作参比对照的N(0.3mg/ml)在相同的条件下储存。每一条泳道上样1μl。
图4的说明：
泳道1：低分子量蛋白质标准品(0.79μg)
泳道2：N(1μg)
泳道3：B-1e(0.6)
泳道4：B-1b(0.6)
泳道5：B-1e-2(0.6)
泳道6：B-5a(0.6)
图5显示了G-CSF含量分别为0.3mg/ml的一些样品在40℃(±2℃)储存1个月(40)的SE-HPLC结果，12μg的G-CSF上样于色谱柱中。
图5的说明：
H+             B-1e(0.3)的较大聚集体
Na+            B-1b(0.3)的较大聚集体
泊洛沙姆        B-6b(0.3)的较大聚集体
稳定性试验的结果
在4℃储存2个月和3个月的S18样品的SE-HPLC分析结果表明二聚体和更大的聚集体或者没有检测到，或者只检测到少量(表1，图1)。
这些结果相当于G-CSF组合物(AS16-10ACT)中G-CSF的稳定性，其中所述G-CSF组合物(AS16-10ACT)与市售的G-CSF组合物(Neupogen(G-CSF＝0.3mg/ml)，非糖基化的G-CSF)相同(表1)。
样品S18的Tm与AS16-10ACT的Tm相当，表明S18中G-CSF的稳定性可预期与AS16-10ACT中G-CSF稳定性相当。这一点通过在4℃的稳定性研究得到确认(表1)。
此外，G-CSF稳定性也得到了SDS-PAGE分析的确认(没有提供结果)。除此之外，在储存时间之后RP-HPLC分析没有显示杂质或蛋白质含量有显著的改变(没有提供结果)。用于本发明组合物的G-CSF的体外生物学活性与国际标准品(Cat.N0.88/502；NIBSC，UK)处于相同的水平上。在组合物S18中储存数月后，G-CSF的生物学活性没有改变。
                                     表1
pH   储存时间 温度  二聚体(SE-HPLC)   较大的聚集体(SE-HPLC)   Tm(℃)
  AS16-10ACTc＝0.3mg/ml 4.0   1m   40℃  0.00％   0.13％ 66.9
  1m   4℃  0.00％   0.00％
  S18c＝1.5mg/ml 4.4   2m   4℃  0.02％   0.00％ *67.2
  3m   4℃  0.02％   0.00％
m：月；％：二聚体/较大的聚集体占G-CSF总量的百分数，c＝G-CSF的浓度，
*Tm为当G-CSF浓度＝0.3mg/ml时测得的值
这些结果表明在适当的条件下(长期稳定性研究的开始部分)，储存数月之后样品S18的全部G-CSF稳定性都达到。S18中G-CSF的稳定性优于或相当于样品AS16-10ACT，虽然S18中没有加入其他的G-CSF稳定剂(如表面活性剂)，G-CSF的浓度高出5倍，储存时间较长且pH值远高于4.0(4.4)。
在一系列具有1.5mM醋酸并用不同的碱(NaOH、TRIS)将pH值调至4.4，以及仅用醋酸将pH值调至4.4的组合物中测试不同的缓冲系统的影响。分析的结果列于表2和图2中。
                                            表2
 相反离子   储存时间   温度   二聚体(SE-HPLC)   较大的聚集体(SE-HPLC)   Tm(℃)
B-1f(0.3) TRIS+   1w   40℃   0.01％   0.02％ 61.3
  1m   40℃   0.00％   0.65％
B-1b(0.3) Na+   1w   40℃   0.00％   0.01％ 60.3
  1m   40℃   0.00％   0.46％
  B-1e(0.3) H+   1w   40℃   0.01％   0.04％ 66.5
  1m   40℃   0.00％   0.31％
m：月；w：周；％：二聚体/较大的聚集体占G-CSF总量的百分数
结果表明当使用不同的阳离子时Tm和较大的聚集体的含量存在着差别。含有纯酸的组合物的Tm高于含有Na+和TRIS+阳离子的组合物。与此相一致，与含有Na+和TRIS+阳离子的组合物相比，含有纯酸的组合物中聚集体的含量最低。除此之外，RP-HPLC分析的结果显示在储存一段时间之后杂质的量和特性没有产生显著的变化(结果没有提供)。这些结果表明在G-CSF的稳定性方面，与TRIS+和Na+相比优选使用纯酸(H+)。
在一系列包含1.5mM醋酸/醋酸盐缓冲系统、pH值为4.2、4.4、4.6和4.8的组合物中试验pH值对G-CSF稳定性的影响。SE-HPLC分析的结果列于表3。
                          表3
  pH   储存时间   温度   二聚体(SE-HPLC)   较大的聚集体(SE-HPLC)
  B-1a(0.3)   4.2   1w   40℃   0.00％   0.00％
  1m   40℃   0.00％   0.20％
  B-1b(0.3)   4.4   1w   40℃   0.00％   0.01％
  1m   40℃   0.00％   0.46％
  B-1c(0.3)   4.6   1w   40℃   0.00％   0.01％
  B-1d(0.3)   4.8   1w   40℃   0.00％   0.02％
m：月；w：周；％：二聚体/较大的聚集体占G-CSF总量的百分数
在pH值范围为4.2至4.8时，在40℃检测，二聚体的出现基本上不存在差别。
用含有0.6mg/ml G-CSF的组合物试验了脱氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(表面活性剂)对G-CSF稳定性的影响。结果列于表4以及图3和4。
                                      表4
  表面活性剂   储存时间   温度   二聚体(SE-HPLC)  较大的聚集体(SE-HPLC)   蛋白质含量(RP-HPLC)   Tm(℃)
  B-1b(0.6)   -   1w   40℃   0.00％   0.00％   63.4
  1m   40℃   0.03％   0.06％   94.8％
  1w振摇   25℃   0.08％   0.04％
  B-1e(0.6)   -   1w   40℃   0.00％   0.00％   64.4
  1m   40℃   0.03％   0.08％   94.1％
  1w振摇   25℃   0.04％   0.08％
  B-1g(0.6)   -   1w   40℃   0.00％   0.00％   64.6
  1m   40℃   0.03％   0.10％   93.8％
  1w振摇   25℃   0.02％   0.03％
  B-1e-2(0.6)   0.004％吐温80   1w   40℃   0.00％   0.00％   63.6
  1m   40℃   0.02％   0.16％   91.8％
  1w振摇   25℃   0.02％   0.05％
  B-5a(0.6)   0.1％吐温20   1w   40℃   0.00％   0.00％   62.5
  1m   40℃   0.12％   0.62％   42.7％
  1w振摇   25℃   0.65   0.32
m：月；w：周；％：二聚体/较大的聚集体占G-CSF总量的百分数
表4的结果显示，通过加入表面活性剂吐温20(Tween 20)或吐温80(Tween 80)，G-CSF的稳定性没有得到改善。结果表明在没有加入表面活性剂的条件下达到了G-CSF的稳定性。除此之外，蛋白质含量的RP-HPLC分析显示含有脱氧乙烯山梨醇脂肪酸酯的聚合物中蛋白质含量较低。
用含有0.3mg/ml G-CSF的组合物试验了泊洛沙姆(嵌段共聚物)对G-CSF稳定性的影响。结果列于表5和6以及图5。
                表5
  嵌段共聚物   Tm(℃)
  B-6a(0.3)   0.05％泊洛沙姆188   61.3
  B-6b(0.3)   0.10％泊洛沙姆188   61.1
  B-6d(0.3)   1.00％泊洛沙姆188   56.7
m：月；w：周；％泊洛沙姆：w/v
表5的结果表明加入泊洛沙姆188后Tm降低了。
                                   表6
  嵌段共聚物   储存时间   温度  二聚体(SE-HPLC)   较大的聚集体(SE-HPLC)
  B1b(0.3)   -   1m   40℃  0.00％   0.46％
  B-6b(0.3)   0.10％泊洛沙姆188   1m   40℃  0.00％   1.6％
  B-4a(0.3)   -   1m   40℃  0.00％   0.50％
  B-4c(0.3)   0.10％泊洛沙姆188   1m   40℃  0.00％   1.02％
m：月；w：周；％：二聚体/较大的聚集体占G-CSF总量的百分数，％泊洛沙姆：w/v
表6的结果显示加入嵌段共聚物泊洛沙姆188后G-CSF的稳定性没有得到改善。
表4、5和6的结果表明，在维持G-CSF在G-CSF药物组合物中的稳定性方面、脱氧乙烯山梨醇脂肪酸酯和泊洛沙姆并不是适宜的赋形剂。
用一系列含有醋酸、马来酸、柠檬酸和甲磺酸的组合物试验了不同的酸对G-CSF稳定性的影响。结果列于表7中。
                                         表7
  酸   储存时间   温度   二聚体(SE-HPLC)   较大的聚集体(SE-HPLC)   Tm(℃)
  B-1e(0.6)   醋酸   1w   40℃   0.00％   0.00％   64.4
  1m   40℃   0.03％   0.08％
  B-1e-3(0.6)   柠檬酸   1w   40℃   0.00％   0.00％   64.2
  1m   40℃   0.03％   0.08％
  B-1e-4(0.6)   马来酸   1w   40℃   0.00％   0.00％   64.2
  1m   40℃   0.03％   0.07％
  B-3b(0.3)   甲磺酸   1w   40℃   0.00％   0.09％   64.1
  1m   40℃   0.00％   0.22％
m：月；w：周；％：二聚体/较大的聚集体占G-CSF总量的百分数
使用不同的酸的组合物的结果相当，含醋酸的组合物G-CSF稳定性稍微好一些。
用一系列含有山梨醇和甘油的组合物试验选择的多元醇和其浓度对G-CSF稳定性的影响。结果列于表8。
                                      表8
 多元醇   储存时间   温度  二聚体(SE-HPLC)   较大的聚集体(SE-HPLC)   Tm(℃)
  B-1b(0.3)  5％山梨醇，pH 4.4   1w   40℃  0.00％   0.01％   60.3
  1m   40℃  0.00％   0.46％
  B-2b(0.3)  3％山梨醇，pH 4.4   1w   40℃  0.00％   0.01％   61.9
  1m   40℃  0.00％   0.65％
  B-4a(0.3)   5％甘油，pH 4.4   1w   40℃   0.00％   0.00％   61.4
  1m   40℃   0.00％   0.50％
m：月；w：周；％：二聚体/较大的聚集体占G-CSF总量的百分数，％多醇：w/v
表8的结果显示山梨醇或甘油对G-CSF的稳定性都是有效的。RP-HPLC分析的结果表明表8的组合物之间不存在显著的差别(结果没有提供)。
实施例2
含有G-CSF的本发明药物组合物的组合物
本发明的药物组合物的组合物展示在表9中。
                                          表9
样品   G-CSF含量(mg/ml) 非活性成分 pH
  S18   1.5   醋酸(用于调节pH值)   4.4
  B1e(0.3)：   0.3   0.13mM醋酸，5％(w/v)山梨醇   4.4
  B-1g(0.6)   0.6   0.04mM HCl，8％(w/v)山梨醇，   4.4
  B-1e-4(0.3)   0.3   0.13mM马来酸，5％(w/v)山梨醇   4.4
  B-1e(0.6)   0.6   0.13mM醋酸，8％(w/v)山梨醇   4.4
  B-1g(0.6)   0.6   0.04mM HCl，8％(w/v)山梨醇   4.4
  B-1e-3(0.6)   0.6   0.13mM柠檬酸，8％(w/v)山梨醇   4.4
  B-1e-4(0.6)   0.6   0.13mM马来酸，8％(w/v)山梨醇   4.4
  B-1e-3(0.3)   0.3   0.13mM柠檬酸，5％(w/v)山梨醇   4.4
B2a(0.3) 0.3   1.5mM醋酸，3％(w/v)山梨醇，NaOH(用于调节pH值) 4.2
B2b(0.3) 0.3   1.5mM醋酸，3％(w/v)山梨醇，NaOH(用于调节pH值) 4.4
B1a(0.3) 0.3   1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，NaOH(用于调节pH值) 4.2
B1b(0.3) 0.3   1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，NaOH(用于调节pH值) 4.4
B1c(0.3) 0.3   1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，NaOH(用于调节pH值) 4.6
B1d(0.3) 0.3   1.5mM醋酸，5％(w/v)山梨醇，NaOH(用于调节pH值) 4.8
B-1b(0.6) 0.6   1.5mM醋酸，8％(w/v)山梨醇，NaOH(用于调节pH值) 4.4
  B-3b(0.3)   0.3   0.04mM甲磺酸，5％(w/v)山梨醇   4.4
  B-4a(0.3)   0.3   1.5mM醋酸，5％(w/v)甘油   4.4
体积浓缩物(bulk concentration)的制备：
用于制备G-CSF体积浓缩物的G-CSF起始原料通过在大肠杆菌的表达而生产(非糖基化的G-CSF)。
G-CSF体积浓缩物在纯酸(醋酸或盐酸)、pH值为4.4的溶液中制备，G-CSF的浓度为1.5mg/ml。体积浓缩物的SE-HPLC分析表明二聚体和较大的聚集体低于检测限。在RP-HPLC分析中观察到的杂质含量在2-4％之间。(新配制的Neupogen样品的分析表明在RP-HPLC分析中观察到的杂质浓度相当或较高。)
赋形剂的质量：
醋酸：符合《欧洲药典》；HCl：Merck 32％，分析用；马来酸：符合《美国药典》；柠檬酸：Merck，分析用；甲磺酸：Fluka；NaOH：符合《欧洲药典》；山梨醇：符合《欧洲药典》；甘油：Merck，分析用；泊洛沙姆188：BASF，Pluronic F68，NF级；吐温20：Sigma，低过氧化物，低羰基，含有BHT作为抗氧剂；吐温80(Sigma，低过氧化物，含有BHT作为抗氧化剂)；注射用水：符合《欧洲药典》；分析用水(水)：Milli-Q(Millipore)。
参比药物组合物的制备：
A(S16-10ACT)：G-CSF的体积浓缩物(1.5mg/ml)用缓冲液稀释5倍，缓冲液含有用稀NaOH溶液将pH值调节至4.0的12.5mM醋酸、6.25％的山梨醇和0.005％(w/v)的吐温80。最终组合物的pH值为4.0±0.1。
A(S16-1.5ACT)：G-CSF的体积浓缩物(1.5mg/ml)用缓冲液稀释5倍，缓冲液含有用稀NaOH溶液将pH值调节至4.0的1.875mM醋酸、6.25％(w/v)的山梨醇和0.005％(w/v)的吐温80。最终组合物的pH值为4.0±0.1。
本发明药物组合物的制备：
通常：
本发明的药物组合物通过事先用0.2PES/Nalgene滤器过滤过的适宜无菌缓冲液稀释无菌的G-CSF体积浓缩物而制备。G-CSF的最终浓度分别为0.3mg/ml或0.6mg/ml。
过滤的溶液灌装入洗涤和灭菌过的2ml小玻璃瓶(小玻璃瓶用水解类型I无色管状玻璃制造)，用溴丁橡胶的弹性密封盖盖住，用铝帽封口。
S18：在最后的纯化步骤后，蛋白质溶液用醋酸酸化的水(pH4.4)进行超滤。使用带有3个Pellicon XL Ultracell-5PLCCC/Millipore滤器的Labscale TFF System/Millipore。G-CSF溶液的超滤用10倍量体积先前通过0.2PES/Nalgene过滤的酸化水进行。测定电导率和pH值。G-CSF的最终浓度为1.5mg/ml。此后蛋白质溶液通过无菌的0.22μm PVDF滤器的无菌过滤。
B-1e(0.3)：G-CSF的体积浓缩物用含有0.16mM醋酸、6.25％(w/v)山梨醇的溶液稀释5倍。在组合物B-1e-4(0.3)、B-1e-3(0.3)、B-3b(0.3)中使用适宜量的其他酸如柠檬酸、马来酸、甲磺酸，以在类似的组合物中达到pH值4.4，最终组合物的pH值为4.4±0.1。
B-1a(0.3)，B-1b(0.3)，B-1c(0.3)，B-1d(0.3)：G-CSF的体积浓缩物用含有用稀NaOH溶液调节pH值至4.2(4.4、4.6、4.8)的1.875mM醋酸和6.25％(w/v)山梨醇的缓冲液稀释5倍。最终组合物的pH值为4.2±0.1(分别为4.4±0.1；4.6±0.1；4.8±0.1)。
B-1b(0.6)：G-CSF的体积浓缩物(1.5mg/ml)用使用稀NaOH溶液将pH值调节至4.4的2.5mM醋酸和13.3％(w/v)山梨醇稀释2.5倍。最终组合物的pH值为4.4±0.1。
B-1e(0.6)，B-1e-3(0.6)，B-1e-4(0.6)，B-1g(0.6)：G-CSF的体积浓缩物(1.5mg/ml)用含0.22mM醋酸、13.3％(w/v)山梨醇的溶液稀释2.5倍，在其他的情况下使用适宜量的其他酸如柠檬酸、马来酸，以在类似的组合物中达到pH值4.4，最终组合物的pH值为4.4±0.1。
B-2a(0.3)，B-2b(0.3)：G-CSF的体积浓缩物用含有用稀NaOH溶液调节pH值为4.2或4.4的1.875mM醋酸和3.75％(w/v)山梨醇的缓冲液稀释5倍。最终组合物的pH值分别为4.2±0.1或4.4±0.1。
B-4a(0.3)：G-CSF的体积浓缩物用含有用稀NaOH溶液调节pH值为4.4的1.875mM的醋酸和6.25％(w/v)甘油的缓冲液稀释5倍。最终组合物的pH值为4.4±0.1。

Claims (19)

1.粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)的稳定的药物组合物，其中组合物具有大于4.0的pH值且包含治疗有效量的G-CSF和酸且不含表面活性剂。
2.权利要求1的组合物，其中组合物的pH值在从4.2至4.8的范围内。
3.权利要求2的组合物，其中组合物的pH值为约4.4。
4.根据任一上述权利要求的组合物，其任选地还包含：
a.多元醇和/或
b.pH缓冲系统和/或
c.一种或多种可药用赋形剂。
5.根据任一上述权利要求的组合物，其中G-CSF为非糖基化的。
6.根据任一上述权利要求的组合物，其中组合物是含水的。
7.权利要求1的组合物，其中酸选自醋酸、HCl、马来酸、谷氨酸、甲磺酸和柠檬酸。
8.权利要求7的组合物，其中酸选自醋酸和HCl。
9.权利要求4的组合物，其中多元醇选自山梨醇、甘油、环己六醇和甘露糖醇。
10.权利要求9的组合物，其中所选的多元醇是山梨醇。
11.权利要求10的组合物，其中含有的山梨醇为从约1％至约10％。
12.权利要求10的组合物，其中含有的山梨醇为从约3％至约8％。
13.权利要求1至11中任意一项所述的组合物，其中pH缓冲系统选自醋酸/醋酸盐和磷酸/磷酸盐。
14.权利要求13的组合物，其中所选的pH缓冲系统为醋酸/醋酸盐。
15.权利要求14的组合物，其中所含的醋酸浓度从约0.15mM至约15mM。
16.权利要求15的组合物，其中所含的醋酸浓度从约1.5mM至约10mM。
17.制备含有G-CSF的组合物的方法，其中制备了权利要求1-16中任意一项所述的组合物。
18.权利要求1至17中任意一项所述的组合物的用途，用于制备治疗和/或预防需要G-CSF的疾病的药物。
19.权利要求1至17中任意一项所述的组合物的用途，用于治疗和/或预防需要G-CSF的疾病。
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