CN1876806A - 促进农作物生长的芽孢杆菌kr083及含有该菌株的微生物制剂 - Google Patents

促进农作物生长的芽孢杆菌kr083及含有该菌株的微生物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及1号序列所代表的芽孢杆菌KR083，该菌株可代替化肥来促进植物生长。更具体地，本发明涉及芽孢杆菌KR083以及含有该菌株的微生物制剂，该菌株通过定殖于植物根系内外来固定大气中的氮、促进植物生长并抑制植物病原体的生长。

Description

促进农作物生长的芽孢杆菌KR083 及含有该菌株的微生物制剂
技术领域
本发明涉及由1号序列所代表的芽孢杆菌KR083(Bacillus sp.KR083)(该菌株于2003年6月11日被保藏在韩国农业微生物保藏中心(KACC)，保藏编号为KACC 91050；并于2005年5月27日被重新保藏到韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC 10811BP)，该菌株可代替化肥来促进植物生长。更具体地，本发明涉及芽孢杆菌KR083以及含有该菌株的微生物制剂，该菌株通过定殖于植物根系内外来固定大气中的氮、促进植物生长并抑制植物病原体的生长。
背景技术
肥料是决定农作物产量的一种重要的农业物资，但如果使用过量，它作为一种农作物生长的劣质因子会导致农作物品质退化、河流超营养化、地下水污染、土壤营养失衡以及产量降低。然而，由于工业发展，农田面积逐步减少，为提高农作物产量不可避免地要使用肥料。因此，急需开发更多的环境友好型肥料(pro-environmental fertilizers)来替代化肥。
同时，使用土壤微生物来培育农作物已经在豆科植物中得到广泛应用，主要使用的微生物是与豆科植物形成共生关系的根瘤菌(Rhizobium)。1980年由Kloepper等人命名的促进植物生长的根细菌(Plant growth-promotingrhizobacteria(PGPR))不与寄主植物形成共生关系并能促进植物生长，它包括固氮螺菌(Azospirrilum sp.)(Okon，1985)、假单孢菌(Pseudomonas sp.)(Kloepper等人，1980)、芽孢杆菌(Backman等人，1994)等。被称为PGPR的植物生长促进微生物通过多种功能帮助植物生长，例如固定大气中的氮(Boddy和Dobereiner，1995)、产生植物生长促进激素、促进养分吸收(Hallmann等人，1997)以及避免植物受病害攻击(Pleban等人，1995)。已经证实接种不同的植物生长促进微生物可将水稻产量提高19-60％(Baldani，2000)，并可提高西红柿(Kloepper和Schroth，1981)、菜豆(Polonenko等人，1987；和Dashti等人，1998)、小麦(Freitas和Germida，1990)和甜菜(Suslow和Schrith，1982)的产量。植物生长促进微生物的应用已有研究。
另外，Ward等人(1992)报道指出，已经分类并鉴定的微生物种类占生活在土壤中全部微生物种类的5％以下；Young(1992)报道指出，能固定大气中的氮的微生物超过100种；而Torisvik等人(1990)报道说在土壤中存在许多未被人工培育的微生物。因此，在土壤中还存在许多具有优秀功能的微生物，其数量远大于之前已经发现的，由此引起了关于它们的后续研究。
然而，在归类于促进植物生长的根细菌的土壤微生物中，还没有关于能固定大气中的氮、分泌植物生长促进激素并抑制植物病害的单菌株的报道。
发明内容
因此，本发明的发明人在研究土壤微生物时分离并鉴定了可定殖于水稻植物根系内外的芽孢杆菌KR083，并且还发现该菌株能固定大气中的氮、分泌植物生长促进激素并抑制植物病害。
本发明的目的是提供具有固定大气中的氮、分泌植物生长促进激素并抑制植物病害功能的芽孢杆菌KR083。
本发明的另一个目的是提供上述芽孢杆菌KR083的次级代谢物。
本发明的再一个目的是提供含有芽孢杆菌KR083作为有效成分的微生物制剂。
本发明涉及1号序列所代表的芽孢杆菌KR083以及含有该菌株的微生物制剂，所述菌株能通过定殖于植物根系内外来固定大气中的氮、分泌植物生长促进激素并抑制植物病害。
附图说明
图1示出了芽孢杆菌KR083的分离；
图2a和图2b是芽孢杆菌KR083的电镜照片；
图3是定殖于植物根内部的芽孢杆菌KR083的照片。
生物保藏
本发明的KR083菌株被命名为“芽孢杆菌KR083”，于2003年6月11日被保藏在附属于韩国农村振兴厅/韩国国家农业生物技术研究所的韩国农业微生物保藏中心(KACC)，保藏编号为KACC 91050。
2005年5月27日，KR083被重新保藏到韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏编号为KCTC 10811BP。
具体实施方式
下面将详细说明本发明。
如图2所示，KR083呈杆状，两端为圆形，具有鞭毛，大小为1.5-2.0×0.8-1.0微米。当该菌株在PDB培养基中培养24小时后，会产生聚-β-羟丁酸(poly-β-oxybutyrate)。所述KR083菌株是革兰氏阳性菌，可产生芽孢，进行有氧代谢并有触酶活性。另外，KR083菌株能固定氮分子(N2)，并能在7％的NaCl溶液中生长，在石蕊牛奶(Litmus milk)试验中不显色。当加入培养基的碳源为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖或甘露醇时，KR083菌株会形成酸；而当加入培养基的碳源为柠檬酸盐、糊精、鼠李糖(rhamnose)、山梨糖醇或淀粉时，该菌株会形成碱。另外，该菌株不能在含有半乳糖醇或甘油的培养基中生长。此外，如图3所示，本发明的KR083菌株的特征是存在于植物根系外部并定殖于根内部。
KR083菌株的生理生化特征如下表1所示。
表1KR083菌株的生理生化特征
  分类   特征   分类   特征
  菌株形态   杆状   菌株大小(微米)   1.5-2.0×0.8-1.0
  鞭毛   有   产生聚-β-羟丁酸   在PDP培养基中培养后产生5
  芽孢   有   革兰氏染色   +
  有氧代谢   +   厌氧代谢   -
  大气固氮作用   +   触酶活性   +
  石蕊牛奶反应   无色   脱氮作用   +
  淀粉水解活性   -   酪蛋白水解活性   -10
  脂酶活性   -   在4℃的生长   +
  在7％的NaCl溶液中的生长   +   -
  使用碳源的反应   葡萄糖   形成酸   使用碳源的反应   麦芽糖   形成酸
  阿拉伯糖   形成酸   甘露醇   形成酸
  木糖   形成酸   山梨糖醇   形成碱15
  乳糖   形成酸   半乳糖醇   不形成
  半乳糖   形成酸   甘油   不形成
  果糖   形成酸   糊精   形成碱
  鼠李糖   形成碱   淀粉   形成碱
  蔗糖   形成酸   柠檬酸盐   形成碱20
参考实施例1KR083的序列分析
采用16S rDNA序列分析方法分析KR083DNA序列。首先，用聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA部分，将产物插入pGEMT-T载体中，然后用DNA自动测序仪ABI3100(Applied Biosystem，美国)进行DNA序列分析。PCR反应使用2号序列的 fD1(5′-agagtttgatggctcag-3′)和3号序列的rP2(5′-acggctaccttgttacgactt-3′)。另外，使用pUC/M13的正向引物(5′-gttttcccagtcacgac-3′：4号序列)和反向引物(5′-gcggataacaatttcacacagg-3′：5号序列)进行反应来分析上述引物的两端部分，并使用四个引物进行反应来分析内部的DNA序列。根据大肠杆菌16S rDNA序列(Ecsherichia coil 16S rDNA，GenBank第J01695号)，每个DNA序列使用16SP-1的311-330部分(5′-gccacactggaactgagacac-3′)、16SP-2的684-703部分(5′-tgtagcggtgaaatgcgtg-3′)、16SP-3的944-963部分(5′-ggagcatgtgt tattcg-3′)以及16SP-4的1228-1247部分(5′-ctacacacgtg ctacaatgg-3′)。
1号序列代表KR083菌株的16S rDNA序列。对该菌株和GenBank数据库中DNA序列之间的同源性进行研究发现，该菌株与芽孢杆菌的同源性大于99％，而与其它菌种的同源性低于98％，由此将该菌株划分为芽孢杆菌。
根据本发明的芽孢杆菌KR083对植物生长的促进效果如下：当将玉米根部浸入到稀释了50倍的所述菌株培养液中维持1.5小时，根长增加21.3％。另外，当该菌株在室温下培养72小时，其固氮量分别比Herbaspirrilumseropedicae BR11175和固氮醋酸杆菌(Acetobacter diazotrophicus)BR11281高1.02和143倍。此外，芽孢杆菌KR083还对立枯丝核病菌(Rhizoctoniasolani)和胡萝卜欧氏杆菌(Erwinia carotovora)显示出很强的生长抑制活性。
可以使用本领域熟知的方法将本发明的微生物制剂配制成植物生长促进剂或植物病原生长抑制剂，但并不局限于此。为代替化肥，本发明的微生物制剂优选配制成用于促进植物生长的有机肥料。
当本发明的微生物制剂是一种干粉状或液态肥料的植物生长促进剂时，每1克干粉或1毫升液体中芽孢杆菌KR083的含量为105-107。
当本发明的微生物制剂是一种干粉状或液态肥料的病原生长抑制剂时，每1克干粉或1毫升液体中芽孢杆菌KR083的含量应超过107。在这种情况下，其特征是该菌株的含量比植物生长促进剂的含量更高。
下述实施例将详细说明本发明。然而，对于本领域技术人员来说，显然，这些实施例只是用来描述本发明而不是限制本发明的范畴。
<实施例1>KR083的分离
如图1所示，把在无菌培养基中发芽的一粒水稻种子转移到0.6％的琼脂糖培养基中，将0.5克土壤样品(来自俄罗斯St.Petersburg)接种在距水稻根部1-2厘米处，然后将培养基在28℃培养48小时。将上述根碾碎使之形成悬浮液后，将该悬浮液涂敷到LC培养基中以分离菌株。
<实验实施例1>KR083的大气固氮作用
在用于血液收集的真空管中加入5毫升半固体状的LGI培养基并将KR083菌株接种其中，在恒温下培养，然后用气相色谱测定其乙炔还原活性(Hardy，1970)。结果如下表2中所示。
表2KR083的大气固氮作用
菌株   培养期间的菌株活性(微摩尔C2H4/24毫升/0.5小时)
  12小时   24小时   48小时
  Herbaspirilhum seropedicae BR 11175   0.93   7.89   170.93
  HerbaspirillumrubrisubalbicansBR 11192   0.64   0.83   3.70
  固氮醋酸杆菌BR11281   0.45   0.81   1.29
  KR083   0.45   21.48   249.68
如表2所述，根据本发明的芽孢杆菌KR083比Herbaspirillum seropedicaeBR1175、Herbaspirillum rubrisubalbicans BR11192和固氮醋酸杆菌BR11281显示出更高的大气固氮作用。
<实验性实施例2>KR083的植物生长促进效果
为检测芽孢杆菌KR083的植物生长促进效果，对椭圆小球藻(Chlorellavulgaris)、海藻和玉米幼苗进行实验。当Hata培养基的温度为50℃时，将椭圆小球藻与培养基(液态)混合，然后将混合好的培养基转移到培养皿中固化。在每个平板中开一个半径为4毫米的孔，将100微升芽孢杆菌KR083涂于平板上，重复10次。将处理后的海藻在光照条件下放置5天，然后检测海藻的生长范围。将玉米根末端3毫米浸入该菌株培养物悬浮液中，并保持1.5小时，其它玉米根部浸入无菌培养液中作为对照。将玉米幼苗放置在塑料箱中的湿滤纸上，然后用滤纸将存在于根的起始线上的根末端(the rootend existing on the starting line ofthe root)盖好，于28℃培养24小时。测量新增长的根的长度，重复10次，测得的所述KR083菌株的玉米生长促进效果如下表3中所示。
表3菌株对海藻和玉米的生长促进效果
菌株 椭圆小球藻生长(φ，毫米/5天)   玉米生长(与未处理的相比％)
  1∶1   1∶50
  KR083   3   -20   +26.3
  金黄杆菌KR044(Chryseobacterium SP.KR044) 0 0 +8
  芽孢杆菌KR091   0   0   0
如表3所述，接种5天后芽孢杆菌KR083的生长促进水平使小球藻直径增加3毫米。在玉米根的例子中，在用以1∶2稀释的原液(4.5×109c.f.u/毫升)进行接种时，本发明的芽孢杆菌KR083的生长促进水平降低了20％，而在用以1∶50稀释的原液进行接种时，其生长促进水平却提高了26.3％。
<实验性实施例3>KR083对植物病原体的抑制效果
使用下列方法检测KR083对植物病原体的抑制效果。首先，在PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)中分别接种病原真菌和细菌，然后将培养液转移到培养皿中固化。在每个平板中开一个半径为4毫米的孔，将100微升芽孢杆菌KR083在PDA液体培养基中于28℃下培养5天，然后接种到该孔中。将平板在28℃下放置5天，然后检测PGPR的生长抑制范围。将5毫升(1×106分生孢子/毫升)真菌和5毫升(1×108cfu/毫升)细菌在45℃下分别与250毫升PDA培养基混合并振荡，每个培养皿中各取25毫升溶液铺板，重复3次。结果如表4中所示。
表4芽孢杆菌KR083菌株对植物病原真菌和细菌的生长抑制范围
(生长抑制范围，Φ/毫米)
菌株               植物病原真菌           植物病原细菌
  立枯丝核病菌   黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)   胡萝卜欧氏杆菌3391   丁香假单孢杆菌8300
  KR083   30.7±1.7   34.0±7.0   32.0±3.2   26.0±4.6
结果显示，本发明的KR083菌株对立枯丝核病菌、腐霉菌(Pythium)、胡萝卜欧氏杆菌和丁香假单孢杆菌表现出很强的生长抑制效果。
<实验性实施例4>在农作物中接种芽孢杆菌KR083的效果
将常规培养的本发明芽孢杆菌KR083的培养液接种到大麦、辣椒和番茄上，结果如下表5中所示。
表5KR083的接种
农作物   生长量(千克/10年)   增加(％)
  未接种   接种
  大麦(Kun-al大麦1号)   733.5   762.0   3.9
  辣椒(种植在韩国青阳Cheongyang)   376.8   428.5   13.7
  番茄(产自Sunyoung番茄)(在活的有机体内播种后第40天)   1.66克   4.41克   165.7
如表5所示，证实芽孢杆菌KR083使大麦生长增加了3.9％，辣椒生长增加了13.7％，番茄生长增加了165.7％，并且证实了本发明的芽孢杆菌KR083可增加农作物产量。
工业实用性
如上所述，已证实本发明的芽孢杆菌KR083通过定殖于植物根系内外来固定大气中的氮、促进植物生长并抑制植物病原体的生长。因此，当使用常规方法将芽孢杆菌KR083用作微生物制剂时，它能保护水质和土壤环境、增加农作物产量并保护农作物免受植物病原体侵害。
                                        序列表
<110>韩国农村振兴厅(Republic ofKorea represented by Rural Development Administration)
<120>促进农作物生长的芽孢杆菌KR083及含有该菌株的微生物制剂
<130>I5047YOL
<150>KR10-2004-0043317
<151>2004-06-12
<160>5
<170>PatentIn 3.1
<210>1
<211>1512
<212>DNA
<213>芽孢杆菌KR083(Bacillus sp.KR083)
<400>1
gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg     60
gtggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt    120
aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaatactgg atggttgttt    180
gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg    240
cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag    300
agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta    360
gggatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgaatg aaggttttcg    420
gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga    480
cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt    540
ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga    600
tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga    660
agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag    720
tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa    780
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt    840
tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa    900
gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt     960
cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tggcaatcct agagatagga    1020
cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag    1080
atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg    1140
ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat    1200
catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa    1260
accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc    1320
gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc    1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga    1440
ggtaaccttt taggagccag ccgccgaagg tgggacagat gattggggtg aagtcgtaac    1500
aaggtagccg ta                                                        1512
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增假芽孢杆菌KR083基因的PCR引物fD1
<400>2
agagtttgat ggctcag                                                     17
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增假芽孢杆菌KR083基因的PCR引物rP2
<400>3
acggctacct tgttacgact t                                                21
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增假芽孢杆菌KR083基因的pUC/M13的PCR扩增正向引物
<400>4
gttttcccag tcacgac                                                     17
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增假芽孢杆菌KR083基因的pUC/M13的PCR扩增反向引物
<400>5
gcggataaca atttcacaca gg                                               22

Claims (7)

1、一种芽孢杆菌KR083(Bacillus sp.KR083)，其含有1号序列所代表的rDNA序列，其保藏编号为KCTC 10811BP。
2、一种微生物制剂，该微生物制剂含有如权利要求1所述的芽孢杆菌KR083作为有效成分。
3、根据权利要求2所述的微生物制剂，其中，所述制剂是代替化肥的有机肥料。
4、根据权利要求2所述的微生物制剂，其中，所述制剂用于促进植物生长。
5、根据权利要求2所述的微生物制剂，其中，所述制剂用于抑制病原体生长。
6、根据权利要求2所述的微生物制剂，其中，所述制剂还含有芽孢杆菌KR083的次级代谢物作为有效成分。
7、一种土壤管理或植物培育方法，该方法通过用如权利要求2-6中任意一项所述的微生物制剂处理土壤或植物来进行土壤管理或植物培育。
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