CN1871348A

CN1871348A - 用于分离和纯化核酸的核酸吸附性多孔膜以及用于分离纯化核酸的装置

Info

Publication number: CN1871348A
Application number: CN 200480031002
Authority: CN
Inventors: 境野佳树; 牧野快彦; 森寿弘
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2003-10-20
Filing date: 2004-10-20
Publication date: 2006-11-29

Abstract

本发明提供一种核酸吸附性多孔膜以及一种使用该膜的装置，该膜具有优异的分离能力、良好的洗涤效率，可以使操作过程方便快捷，并具有自动操作适应性和尺寸减小适应性，可以批量生产分离能力基本上相同的这种膜，并且该膜适用于分离和纯化核酸的方法；用于分离和纯化核酸的核酸吸附性多孔膜具有核酸吸附性固相，该核酸吸附性固相用在分离和纯化核酸的方法中，该固相吸附核酸，该方法包括以下步骤：(1)通过使含有核酸的样品溶液与核酸吸附性固相接触，使得所述核酸吸附到所述固相上；(2)通过使洗涤液与所述固相接触来洗涤该固相，在此期间所述核酸仍吸附在所述固相上；以及(3)通过使回收液与所述固相接触，使得所述核酸从所述固相解吸附。

Description

用于分离和纯化核酸的核酸吸附性多孔膜以及用于分离纯化核酸的装置

技术领域

本发明涉及一种用于分离和纯化核酸的核酸吸附性多孔膜以及一种使用该多孔膜的核酸分离纯化装置。更具体地说，本发明涉及这样这样一种核酸吸附性膜，其用于通过使用含有核酸的样品溶液并使用核酸分离纯化柱，而从含有核酸的样品中分离和纯化核酸，所述核酸分离纯化柱具有设在容器中的核酸吸附性多孔膜，所述容器具有至少两个开口并具有压力产生装置，本发明还涉及一种使用该多孔膜的核酸分离纯化装置。

背景技术

各种形式的核酸应用于各个领域。例如，在重组核酸技术领域中，核酸以探针、基因组核酸和质粒核酸的形式使用。

在诊断领域中，核酸以各种方法使用。例如，在检测和诊断人类病原体时，常常使用核酸探针。同样，核酸也用于检测遗传性病症。核酸还用于检测食品污染物。此外，基于从绘制基因图谱到克隆和重组表达的各种原因，也常常用核酸对所关心的核酸进行定位、识别和分离。

在许多情况下，只有极微量的核酸可以利用，因此分离和纯化过程费时费力。这些经常费时费力的操作可能会导致核酸损失。在从来自于血清、尿和细菌培养物的样品中纯化核酸时，会碰到污染和假阳性结果的问题。

一种广为人知的纯化方法是把核酸吸附到固相(例如二氧化硅、二氧化硅聚合物或硅酸镁)的表面，随后进行例如洗涤和解吸附操作，以进行纯化(例如，参见专利文献1：JP-B-7-51065)。该方法表现出良好的分离能力。但是，该方法在操作简单性、快速性、自动操作适应性和尺寸缩小适应性方面存在不足之处，并且在工业上很难批量生产出性能相同的吸附剂。此外，该方法还有其它缺点，例如操作不方便并且难以加工成各种形状。

此外，作为简单高效的分离和纯化核酸的方法，已描述有这样一种方法：使用一种用来在固相上吸附核酸的溶液和一种用来使核酸从固相解吸附的溶液，使核酸吸附到固相上，然后再使核酸从固相解吸附，所述固相在其表面上含有带羟基的有机聚合物(参见专利文献2：JP-A-2003-128691)。

另一方面，还有离心法、使用磁珠的方法和使用滤膜的方法作为分离和纯化核酸的常规方法。例如，作为使用滤膜的核酸分离纯化装置，人们提出了一种机构，其中把若干带有滤膜的滤管固定在台架上，把含有核酸的样品溶液注入滤管中，在该装置内，使用气囊通过密封件形成减压环境，所述密封件位于台架底部周围，由此从排出侧抽吸所有滤管，使样品溶液从滤管中通过，从而使核酸吸附到滤膜上，然后依次注入洗涤液和回收液，随后以相同方式生成减压环境以进行抽吸、洗涤和解吸附(例如，参见专利文献3：日本专利No.2,832,586)。

但是，常规的分离和纯化方法在收率和纯度方面仍然存在不足之处，还需要进一步改善。此外，常规的自动装置尺寸很大，适用于分析多种样品，但具有如下问题：这种装置价格昂贵，并且不适用于样品数少且分析频率低的情况，这样会使处理效率降低。特别是，在样品溶液彼此具有不同性能(例如收集的是全血样品)的情况下，如专利文献3(日本专利No.2,832,586)所述的装置(其中同时抽吸所有的管子)，具有如下问题：当部分滤管结束抽吸并因此使抽吸阻力减小时，其它滤管受到的减压力会变小，从而可能使得对高粘度样品溶液的处理不够完全。增大减压容积会造成在减小装置尺寸方面的问题，并且大的减压容积需要一定的时间来实施减压。此外，难以检测溶液是否完全排放，并会使预定的分析时间延长，从而使操作效率受损。此外，对于低粘度样品溶液来说，溶液被过于有力而迅速地从滤管排出，使得泡沫喷溅而落到相邻的滤管和台架上，从而导致污染，因而使分析准确性降低。

发明内容

因此，本发明的目的是要提供一种核酸吸附性固相，其适用于高收率和高纯度地分离和纯化样品中所含的核酸。

本发明的另一目的是要提供一种核酸吸附性固相，该固相具有优异的分离能力和良好的洗涤效率，可进行高速简单操作，具有优异的自动操作适应性和尺寸减小适应性，并且可以批量生产出分离能力基本上相同的这样的固相。

本发明的另一目的是要提供一种核酸分离纯化装置，该装置可以在短时间内高效操作，而不会产生污染且其尺寸可以减小。

作为为解决上述问题而进行的深入研究的结果，本发明人已发现：在分离和纯化核酸的方法中，采用使核酸吸附到多孔膜并从多孔膜解吸附的步骤是有效的。因此，本发明提供了一种适用于该方法的核酸吸附性多孔膜。特别是，已经发现：在分离和纯化核酸的方法中，通过使用使核酸吸附于其上的多孔膜(核酸通过相互作用吸附于其上，其中离子键不参与作用)来作为所述的多孔膜，可以使核酸从含有核酸的样品溶液中高收率、高纯度地分离出来。本发明基于上述发现而完成。

也就是说，本发明具有以下内容。

1.一种用于分离和纯化核酸的核酸吸附性多孔膜，该膜具有在

分离和纯化核酸的方法中所使用的核酸吸附性固相，该固相吸附所述的核酸，

所述方法包括以下步骤：

(1)通过使含有核酸的样品溶液与所述的核酸吸附性固相接触，使得所述核酸吸附到所述固相上；

(2)通过使洗涤液与所述固相接触来洗涤该固相，在此期间所述核酸仍吸附在该固相上；以及

(3)通过使回收液与所述固相接触，使得所述核酸从该固相解吸附。

2.如第1项所述的核酸吸附性多孔膜，其厚度为10μm到500μm。

3.如第1至2项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其平均孔径为0.9μm到5.0μm。

4.如第1至3项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其具有彼此不对称的前表面和后表面。

5.如第4项所述的核酸吸附性多孔膜，其中最大孔径和最小孔径之比为2或2以上。

6.如第1至5项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其空隙容积为50％到95％。

7.如第1至6项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其泡点为0.1kgf/cm²到10kgf/cm²。

8.如第1至7项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其压力损失为0.1kPa到100kPa。

9.如第1至8项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，在25℃的温度和1kg/cm²的压力下，水可以1mL/分钟到5000mL/分钟的量通过所述的膜。

10.如第1至9项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其中每毫克的所述多孔膜吸附0.1μg或更多量的所述核酸。

11.如第1至10项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，所述多孔膜通过该多孔膜和所述核酸之间的基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸。

12.如第11项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜包含具有多糖结构的有机聚合物。

13.如第12项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的吸附所述核酸并包含具有多糖结构的有机聚合物的多孔膜是乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物。

14.如第13项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。

15.如第14项所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量计，所述混合物中三醋酸纤维素/二醋酸纤维素的混合比为99∶1到1∶99。

16.如第13项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。

17.如第13项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。

18.如第13项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。

19.如第12项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含具有多糖结构的聚合物的多孔膜是这样的多孔膜，其包含通过皂化一种或多种醋酸纤维素而得到的有机材料。

20.如第19项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的一种或多种醋酸纤维素的皂化率为5％或更高。

21.如第20项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含通过皂化所述的一种或多种醋酸纤维素而得到的有机材料的多孔膜是这样的多孔膜，其包含通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料。

22.如第21项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的皂化率为5％或更高。

23.如第21或22项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素混合物的皂化产物。

24.如第23项所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量计，所述三醋酸纤维素/所述二醋酸纤维素的混合比为99∶1到1∶99。

25.如第21或22项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是三醋酸纤维素和单醋酸纤维素混合物的皂化产物。

26.如第21或22项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素混合物的皂化产物。

27.如第21或22项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是二醋酸纤维素和单醋酸纤维素混合物的皂化产物。

28.如第19至27项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其中皂化后的所述平均孔径小于皂化前的所述平均孔径。

29.如第28项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的皂化后的平均孔径与所述的皂化前的平均孔径之比为0.8或更低。

30.如第12项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有多糖结构的有机聚合物是再生纤维素。

31.如第11项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过对不具有亲水性基团的有机材料多孔膜进行处理、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

32.如第31项所述的核酸吸附性多孔膜，其中对所述的不具有亲水性基团的有机材料多孔膜所进行的处理包括：把接枝聚合物链连接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物链在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团。

33.如第11项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过用具有亲水性基团的材料来涂覆不具有亲水性基团的有机材料多孔膜、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

34.如第33项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有亲水性基团的材料是有机聚合物，该有机聚合物在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团。

35.如第11项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是无机材料，其中用于形成多孔膜的材料本身具有亲水性基团。

36.如第11项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过对不具有亲水性基团的无机材料多孔膜进行处理、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

37.如第36项所述的核酸吸附性多孔膜，其中把所述亲水性基团引入所述的不具有亲水性基团的无机材料中的处理包括：把接枝聚合物链连接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物链在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团。

38.如第11项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过用具有亲水性基团的材料来涂覆不具有亲水性基团的无机材料多孔膜、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

39.如第38项所述的核酸吸附性多孔膜，其中具有亲水性基团的材料是在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团的有机聚合物。

40.如第31至39项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述亲水性基团是羟基。

41.如第1至40项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的含有核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述回收液分别在所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中，在压力下通过所述核酸吸附性多孔膜。

42.如第41项所述的核酸吸附性多孔膜，其用于所述的分离和纯化核酸的方法中，

其中所述的含有核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述回收液分别在所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中，通过核酸分离纯化柱的第一开口注入，其中所述柱具有至少两个开口，该至少两个开口包括所述第一开口和第二开口；以及

用连接到所述第一开口的压力差产生装置在所述柱的内部形成加压状态，从而使所述的含有核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述回收液分别通过所述多孔膜并使所述的含有核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述回收液分别从所述第二开口排出。

43.一种核酸分离纯化柱，该柱包括：具有至少两个开口的容器，所述的至少两个开口包括第一开口和第二开口；以及第1至42项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜，该多孔膜被容纳(或被设置)在所述容器中。

44.如第43项所述的核酸分离纯化柱，其中作为压力差产生装置的泵以可拆装的方式连接到所述核酸分离纯化柱的所述第一开口。

45.一种成套用，具包括：核酸分离纯化柱，该柱容纳了第1至42项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜；以及试剂。

46.一种核酸分离纯化装置，该装置使用第1至42项中任意一项所述的核酸吸附性多孔膜。

47.如第46项所述的核酸分离纯化装置，该装置是自动实施核酸分离和纯化步骤的自动装置，所述步骤包括：通过在压力下，把含有核酸的样品溶液注入到具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱中，使所述样品溶液中的所述核酸吸附到该核酸吸附性多孔膜上；在压力下，把洗涤液注入到所述的核酸分离纯化柱中，以除去除所述核酸以外的其它成分，在此期间所述核酸仍吸附在所述核酸吸附性多孔膜上；以及在压力下，把回收液注入到所述的核酸分离纯化柱中，使吸附到所述核酸吸附性多孔膜上的所述核酸解吸附，并连同所述回收液回收所述核酸；

其中所述装置包括：

支承机构，其用于支承：所述的核酸分离纯化柱、用于容纳所述样品溶液的排放液和所述洗涤液的排放液的废液容器、用于容纳含有所述核酸的所述回收液的回收容器；

压缩空气供给机构，其用于把压缩空气供给到所述的核酸分离纯化柱；以及

分注机构，其用于分别把所述洗涤液和所述回收液注入到所述的核酸分离纯化柱中。

48.如第47项所述的核酸分离纯化装置，其中所述支承机构包括：立架，其安装在所述装置的主体上；柱支架，其可垂直移动地承载于所述立架上，并支承所述的核酸分离纯化柱；以及用于支承所述废液容器和所述回收容器的支架，该支架位于所述柱支架下面的某一位置上，该支架与所述核酸分离纯化柱的相对位置可以改变。

49.如第47或48项所述的核酸分离纯化装置，其中所述的压缩空气供给机构包括：气嘴，用于从其下缘部喷射压缩空气；压头，用于承载所述气嘴，并用于使所述气嘴相对于被支承在所述柱支架中的所述核酸分离纯化柱垂直移动；以及定位装置，其设置在所述压头上，并用于定位在所述支承机构的台架中的所述核酸分离纯化柱。

50.如第47至49项中任意一项所述的核酸分离纯化装置，其中所述的分注机构包括：洗涤液注入嘴，其用于注入所述洗涤液；回收液注入嘴，其用于注入回收液；注入嘴移动架，其用于支承所述的洗涤液注入嘴和所述的回收液注入嘴，并能够在所述的核酸分离纯化柱上依次移动，所述的核酸分离纯化柱由所述支承机构支承；洗涤液供给泵，其用于从含有所述洗涤液的瓶子中抽吸所述洗涤液，并把该洗涤液供给到所述的洗涤液注入嘴；以及回收液供给泵，其用于从含有所述回收液的瓶子中抽吸所述回收液，并把该回收液供给到所述的回收液注入嘴。

通过使用本发明的核酸吸附性多孔膜、把样品中含有的核酸吸附到多孔膜上、洗涤多孔膜、再使核酸解吸附，可以高效、高纯度地分离和纯化核酸。此外，使用本发明的核酸吸附性多孔膜以分离和纯化核酸的方法在实施时，分离能力优异、相当方便并且快速高效，该方法具有优异的自动操作适应性和尺寸缩小适应性，并且可以批量生产出分离能力基本上相同的多孔膜。

此外，本发明可以提供一种核酸分离纯化装置，该装置使人可以在短时间内高效实施所述分离纯化过程，而不会造成污染，并且该装置可以被制成较小的尺寸。

附图说明

图1是其盖子已被移去的本发明的核酸分离纯化装置的一个实施方案的立体图。

图2是自动装置的示意图。

图3是支承机构中的台架的立体图。

图4是操作时的台架的立体图。

图5是分离和纯化核酸的各阶段的流程图。

图6是核酸分离纯化柱的立体图。

图7是根据本发明的实施方案从含有核酸的样品溶液中分离和纯化出的核酸的电泳结果照片。

图8是根据本发明的实施方案从含有核酸的样品溶液中分离和纯化出的核酸的电泳结果照片。

图9是根据本发明的实施方案从含有核酸的样品溶液中分离和纯化出的核酸的电泳结果照片。

在图中，1表示自动装置，2表示装置主体，3表示支承机构，4表示压缩空气供给机构，5表示溶液注入机构或分注机构，6表示台架，11表示核酸分离纯化柱，11b表示核酸吸附性多孔膜，12表示废液容器，13表示回收容器，40表示压头，41表示气嘴，43表示气泵，45表示开关阀，46表示压力传感器，49表示压销(定位装置)，50表示注入嘴移动架，51w或51r表示注入嘴，52w或52r表示供给泵，56w或56r表示瓶子，61表示立架，62表示柱支架，63表示容器支架，S表示样品溶液，W表示洗涤液，R表示回收液。

本发明的最佳实施方式

使用本发明的核酸吸附性多孔膜以分离和纯化核酸的方法至少包括以下步骤：

(1)使含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，把核酸吸附到该核酸吸附性多孔膜上；

(2)洗涤其上吸附有核酸的所述的核酸吸附性多孔膜；以及

(3)使回收液通过所述的核酸吸附性多孔膜，使得核酸从该核酸吸附性多孔膜解吸附。

优选的是，在步骤(1)、(2)和(3)中，所述的含有核酸的样品溶液、洗涤液和回收液在压力下通过所述的核酸吸附性多孔膜。

更优选的是，在步骤(1)、(2)和(3)中，将所述的含有核酸的样品溶液、洗涤液和回收液分别注入核酸分离纯化柱的第一个开口中，该柱包含具有至少两个开口的容器并包含核酸吸附性多孔膜，并且用压力差产生装置在核酸分离纯化柱中形成加压环境，压力差产生装置与核酸分离纯化柱的所述第一个开口相连，从而使各注入溶液通过并从另一个开口排出。通过使含有核酸的样品溶液、洗涤液和回收液在压力下通过多孔膜，可以使装置以紧凑的形式自动操作，因此这种技术是优选的。要施加的压力优选为约10到约200kPa，更优选为约40到约100kPa。

在上述分离和纯化步骤中，从注入含有核酸的样品溶液的第一步到在核酸分离纯化柱外得到核酸的步骤为止，过程可以在10分钟之内完成，或者在优选条件下，可以在2分钟之内完成。此外，上述分离和纯化核酸的步骤可以使得到的核酸的收率为占样品中含有的全部核酸的50重量％或以上，或者在优选条件下，收率为90重量％或更高。

此外，上述分离和纯化核酸的步骤可以回收分子量在1kbp到200kbp、特别是20kbp到140kbp的宽范围内的核酸。即，与常规采用的使用玻璃滤膜的离心柱方法相比，本方法可以回收分子链更长的核酸。

此外，根据UV一可见光分光光度计所测得的值(260nm/280nm)来看，上述分离和纯化核酸的步骤可使回收的核酸在为DNA时纯度为1.6到2.0，在为RNA时纯度为1.8到2.2。因此，可以稳定地得到具有较少污染物的高纯度核酸。此外，根据UV一可见光分光光度计所测得的值(260nm/280nm)，可回收得到约为1.8的高纯度DNA和约为2.0的高纯度RNA。

在上述步骤中使用的压力差产生装置的实例包括注射器、移液管、产生加压的泵(例如Perista泵)，以及减压生成装置(例如蒸发器)。其中，注射器适用于手动操作，而泵适用于自动化操作。此外，移液管具有可以单手操作的优点。优选的是，压力差产生装置可拆装地与核酸分离纯化柱的一个开口相连。

虽然对本发明可使用的样品没有任何限制，但是其在诊断领域中的实例包括：作为样品收集的体液，例如全血、血浆、血清、尿、大便、精液和唾液，或者植物(或其一部分)、动物(或其一部分)、细菌、病毒、培养的细胞以及由生物材料(例如上述样品的裂解产物和匀浆)制成的溶液。

首先，将这些样品用含有试剂的水溶液处理，所述试剂使细胞膜裂解并使核酸溶解(核酸溶解试剂)。这样就使细胞膜和核膜分解，并使核酸分散到水溶液中，由此得到含有核酸的样品溶液。

为了裂解细胞膜并使核酸溶解，例如，当样品为全血时，必需进行以下步骤：(1)除去红血球，(2)除去各种蛋白质，以及(3)裂解白血球和核膜。所必需进行的步骤(1)除去红血球以及(2)除去各种蛋白质是为防止它们非特定地吸附到多孔膜上并堵塞多孔膜，以及所必需进行的步骤(3)裂解白血球和核膜是为使要提取的核酸溶解。特别是，步骤(3)裂解白血球和核膜是一个重要的步骤，并且在本发明方法中，要求核酸在此步骤中溶解。

含有核酸的样品可以是含有单独一种核酸的样品，或者可以是含有多种不同核酸的样品。要回收的核酸不受种类的限制，可以是DNA或RNA，可以是单链的或双链的以及直链的或环状的。样品数可以为一个或多个(使用多个容器平行处理多个样品)。也没有特别限定要回收的核酸的长度，例如，可以使用长度在几个bp到几个Mbp之间的任何核酸。为了使操作方便，预被回收的核酸的长度通常为约几个bp到约几百个kbp。与常规用于分离和纯化核酸的简单方法所得到的核酸相比，本发明用于分离和纯化核酸的方法可以迅速回收较长的核酸，并且可以用来回收长度优选为50kbp或更长、更优选为70kbp或更长、进一步优选为100kbp或更长的核酸。为了回收较长的DNA，优选进行温和的搅拌和吸液。

通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤将在下文描述。在本发明中，核酸溶解试剂通过使细胞膜和核膜裂解，而用来使核酸溶解，核酸溶解试剂的实例包括含有离液盐(chaotropic salt)、表面活性剂或蛋白酶的溶液。

在此例举了一种方法，用来作为通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的方法，该方法包括以下步骤：

(I)把含有细胞或病毒的样品注入容器中；

(II)把含有离液盐或表面活性剂的核酸溶解试剂溶液加入容器中，并混合样品和该核酸溶解试剂溶液；

(III)温育混合而成的溶液；以及

(IV)把水溶性有机溶剂加入经温育的混合溶液中。

在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，通过均质处理样品可提高其对自动化处理的适应性。例如，这种均质处理可通过超声波处理、使用尖锐突出物处理、高速搅拌处理、通过细孔挤出处理或使用玻璃珠处理来实施。

此外，在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，通过使用含有蛋白酶的核酸溶解试剂，可提高核酸的回收量和回收率，从而可使含有核酸的样品的用量减少并使分析加速成为可能。

可优选使用至少一种选自丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等中的蛋白酶作为这种蛋白酶。此外，可优选使用多种蛋白酶的混合物。

没有特别限定丝氨酸蛋白酶，例如，可优选使用蛋白酶K。没有特别限定半胱氨酸蛋白酶，例如，可优选使用木瓜蛋白酶和组织蛋白酶。

没有特别限定金属蛋白酶，例如，可优选使用羧肽酶。

蛋白酶的使用量可以优选为在添加后达到每毫升全部反应体系有0.001IU到10IU、更优选为0.01IU到1IU的蛋白酶。

此外，可优选使用不含核酸酶的蛋白酶作为这种蛋白酶。此外，可优选使用含有稳定剂的蛋白酶。可优选使用金属离子作为稳定剂。具体地说，优选镁离子，例如，可以以氯化镁的形式添加。在蛋白酶中加入稳定剂可以使回收核酸所需的蛋白酶的量降至微量，从而减少核酸回收所需的费用。基于反应体系的总量，蛋白酶所用稳定剂的量优选为1到1000mM、更优选为10到100mM。

蛋白酶通过预先与其它试剂(例如离液盐和表面活性剂)混合，可以作为一种试剂使用，而用于回收核酸。

或者，蛋白酶可以与其它试剂(例如离液盐和表面活性剂)分开使用。

在后一情况下，样品首先与含有蛋白酶的试剂混合，然后把混合物与含有离液盐和表面活性剂的试剂混合。或者，在首先把样品与含有离液酸(chaotropic acid)和表面活性剂的试剂混合后，再混入蛋白酶。

此外，可以从容纳蛋白酶的容器逐滴直接加入到样品或样品与含有离液盐和表面活性剂的试剂形成的混合物中，就像滴眼药水一样。在此情况下，可简化操作。

核酸溶解试剂还可以优选为以干燥态供给。此外，例如，可以使用预先通过冷冻-干燥而得到含有干燥态蛋白酶的容器。还可以通过同时使用以干燥态供给的核酸溶解试剂和预先含有干燥蛋白酶的容器，得到一种含有核酸的样品溶液。

在通过上述方法得到含有核酸的样品溶液的情况下，核酸溶解试剂和蛋白酶具有良好的储存稳定性，并且可以简化操作，而不会改变核酸的收率。

对混合样品和核酸溶解试剂溶液的方法没有特别限定。

混合时，优选使用搅拌器在30到3000rpm下混合3分钟，由此可以提高所分离和纯化的核酸的收率。此外，还优选用上下翻转(end-over-end)的混合操作方式混合5到30分钟。此外，还可以通过反复吸液操作10到50次来实施混合。在此情况下，通过简单操作可以提高经分离和纯化的核酸的收率。

通过在蛋白酶的最佳温度下以最佳反应时间来温育样品和核酸溶解试剂溶液的混合物，可以提高经分离和纯化的核酸的收率。温育温度通常为20℃到70℃，这优选为蛋白酶的最佳温度，温育时间通常为1到90分钟，这优选为蛋白酶的最佳温育时间。对温育方法没有特别限定，并且可以用浸入热浴或放入加热室的方式来实施。

在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，核酸溶解试剂溶液的pH值优选为5到10，更优选为6到9，进一步优选为7到8。

此外，在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，离液盐在核酸溶解试剂溶液中的浓度优选为0.5M或更高，更优选为0.5M到4M，进一步优选为1M到3M。关于离液盐，优选为盐酸胍，但是也可以使用其它离液盐(例如，异硫氰酸胍和硫氰酸胍)。除了离液盐，还可以使用脲作为离液性物质。可以单独使用上述盐或者结合使用两种或多种上述盐。

核酸溶解试剂溶液可以含有水溶性有机溶剂。优选以醇作为水溶性有机溶剂。醇可以是任何伯醇、仲醇和叔醇。可优选使用甲醇、乙醇、丙醇及其异构体、以及丁醇及其异构体作为醇。可以单独使用上述水溶性有机溶剂或者结合使用两种或多种上述水溶性有机溶剂。水溶性有机溶剂在核酸溶解试剂溶液中的浓度优选为1重量％到20重量％。

此外，在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，与样品混合的表面活性剂的实例包括非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂。

在本发明中，可优选使用非离子表面活性剂。可以使用聚氧亚乙基烷基苯基醚类表面活性剂、聚氧亚乙基烃基醚类表面活性剂和脂肪酸烷基酰胺作为非离子表面活性剂，其中优选使用聚氧亚乙基烃基醚类表面活性剂。更优选的是选自POE癸醚、POE月桂基醚、POE十三烷基醚、POE亚烷基癸醚、POE失水山梨醇单月桂酸酯、POE脱水山梨糖醇单油酸酯、POE脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、四油酸聚氧乙烯山梨糖醇、POE烷基胺和POE炔二醇的聚氧亚乙基烃基醚类表面活性剂。

此外，也可以优选使用阳离子表面活性剂。更优选的阳离子表面活性剂是选自溴化十六烷基三甲基铵、氯化十二烷基三甲基铵、氯化十四烷基三甲基铵和氯化十六烷基吡啶中的阳离子表面活性剂。可以单独使用上述表面活性剂或者结合使用两种或多种上述表面活性剂。

表面活性剂在核酸溶解试剂溶液中的浓度优选为0.1重量％到20重量％。

在回收除RNA以外的其它核酸(例如DNA)的情况下，在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，优选把RNA-分解酶加入核酸溶解试剂溶液中。这样，可以减少RNA的干扰，否则RNA会共同出现在回收核酸中。还优选添加DNA-分解酶抑制剂。

另一方面，在回收除DNA以外的其它核酸(例如RNA)的情况下，优选把DNA-分解酶加入核酸溶解试剂溶液中。这样，可以减少DNA的干扰，否则DNA会共同出现在回收核酸中。还优选添加RNA-分解酶抑制剂。优选以那些专门抑制RNA-分解酶的抑制剂作为所述的RNA-分解酶抑制剂。

对RNA分解酶没有特别限定，可以优选使用能够专门分解RNA(例如核糖核酸酶H(RNase H))的酶。

对DNA分解酶没有特别限定，可以优选使用能够专门分解DNA的酶(例如DNase I)。

对核酸酶以及核酸酶抑制剂可以以通常所用的浓度来使用。此外，可实施热处理。优选在用蛋白酶处理的同时，实施这种热处理。

在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，含有核酸的样品溶液可优选含有消泡剂。消泡剂的优选实例包括两类，分别为含硅消泡剂和醇类消泡剂。优选以炔二醇类表面活性剂作为醇类消泡剂。

消泡剂的具体实例包括含硅消泡剂(例如，硅油、二甲基聚硅氧烷、有机硅乳液、改性聚硅氧烷和有机硅复合物)、醇类消泡剂(例如，炔二醇、庚醇、乙基己醇、高碳醇和聚氧化亚烷基二醇)、醚类消泡剂(例如，庚基溶纤剂和壬基溶纤剂-3-庚基山梨糖醇)、脂肪和油类消泡剂(例如，动物油和植物油)、脂肪酸类消泡剂(例如，硬脂酸、油酸和棕榈酸)、金属皂类消泡剂(例如，硬脂酸铝和硬脂酸钙)、脂肪酸酯类消泡剂(例如，天然蜡和磷酸三丁酯)、磷酸盐类消泡剂(例如，辛基磷酸钠)、胺类消泡剂(例如，二戊基胺)、酰胺类消泡剂(例如，硬脂酸酰胺)和其它消泡剂(例如，硫酸铁和矾土)。特别优选的是，可以使用含硅消泡剂和醇类消泡剂的组合物作为消泡剂。此外，可优选使用炔二醇类消泡剂作为醇类消泡剂。

此外，在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，所得到的含有核酸的样品溶液的表面张力优选为0.050J/m²或更低，其粘度优选为1到10000mPa，其比重优选为0.8到1.2。

在通过裂解细胞膜和核膜而使核酸溶解、从而由样品得到含有核酸的样品溶液的步骤中，优选使用醇作为水溶性有机溶剂，将其加入所温育的混合溶液中。可优选使用任何伯醇、仲醇和叔醇作为醇。可优选使用甲醇、乙醇、丙醇、丁醇及其异构体。水溶性有机溶剂在含有核酸的样品溶液中的最终浓度优选为5重量％到90重量％。

下文要描述本发明所用的核酸吸附性多孔膜以及吸附步骤。

本发明的核酸吸附性多孔膜使溶液可以通过其内部。在此，术语“使溶液可以通过其内部”是指：当在与膜的一面相接触的空间和与膜的另一面相接触的空间之间产生压力差时，溶液可以从高压空间通过膜的内部到达低压空间，或者是指：当对膜施加离心力时，溶液可以以离心方向通过膜的内部。

本发明的核酸吸附性多孔膜优选为以基本上不涉及离子键的相互作用而吸附核酸的多孔膜。这意味着在使用多孔膜的条件下，没有发生离子化，并且可以推测：由于周围极性改变，核酸和多孔膜相互吸引。因此，可以以优异的分离性能和优良的洗涤效率来分离和纯化核酸。优选的是，核酸吸附性多孔膜是具有亲水性基团的多孔膜，并且可以推测：当周围极性改变时，核酸的亲水性基团和多孔膜的亲水性基团相互吸引。在此，术语“具有亲水性基团的多孔膜”是指这样的多孔膜，其中构成多孔膜本身的材料具有亲水性基团，或者是这样的多孔膜，为了在多孔膜中引入亲水性基团，通过对多孔膜构成材料进行处理或涂覆而得到该多孔膜。多孔膜构成材料可以是有机或无机材料。例如，可以使用这样的多孔膜，其中多孔膜构成材料本身是具有亲水性基团的有机材料；可以使用这样的多孔膜，为了将亲水性基团引入其中，通过处理由不含亲水性基团的有机材料所制成的多孔膜而得到该多孔膜；可以使用这样的多孔膜，其中通过用具有亲水性基团的材料涂覆由不含亲水性基团的有机材料所制成的多孔膜，由此引入亲水性基团而得到该多孔膜；可以使用这样的多孔膜，其中多孔膜构成材料本身是具有亲水性基团的无机材料；可以使用这样的多孔膜，其中为了将亲水性基团引入其中，通过处理由不含亲水性基团的无机材料所制成的多孔膜而得到该多孔膜；并且可以使用这样的多孔膜，其中通过用具有亲水性基团的材料涂覆由不含亲水性基团的无机材料所制成的多孔膜，由此引入亲水性基团而得到该多孔膜。为了处理方便，优选使用有机材料(例如有机聚合物)作为构成多孔膜的材料。

亲水性基团是指能与水发生相互作用的极性基团(原子)，包括所有参与吸附核酸的基团(原子)。作为亲水性基团，优选那些与水表现出约为中等水平的相互作用的亲水性基团(参见由共立出版株式会社出版的《化学大词典》中所述的关于“亲水性基团”中的“亲水性不太强的基团”)，其实例包括羟基、羧基、氰基和羟乙基，优选羟基。

具有羟基的有机材料多孔膜的实例包括由下列物质形成的多孔膜：聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚氧乙烯、醋酸纤维素、或者乙酰值不同的醋酸纤维素的混合物。特别是，可优选使用具有多糖结构的有机材料多孔膜。

可优选使用纤维素、半纤维素、葡聚糖、淀粉酶、淀粉精、淀粉、糖原、支链淀粉、甘露聚糖、葡甘露聚糖、地衣淀粉、异地衣淀粉、昆布糖、角叉菜胶、木聚糖、果聚糖、褐藻酸、透明质酸、软骨素、甲壳素和壳聚糖作为具有多糖结构的有机材料。但是，对此没有限制，并可以使用任何具有多糖结构或其衍生物的有机材料。此外，可优选使用任何上述多糖的酯衍生物。此外，可优选使用任何上述多糖的酯衍生物的皂化产物。

优选使用选自羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯中的一种或多种作为任何上述多糖的酯衍生物的酯。此外，更优选使用羧酸酯、硝酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磷酸酯、膦酸酯和焦磷酸酯的各自的皂化产物。

优选使用选自烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯的一种或多种作为任何上述多糖的羧酸酯。此外，更优选使用任何上述多糖的烷基羰基酯、烯基羰基酯、芳香基羰基酯和芳烷基羰基酯的各自的皂化产物。

优选使用选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基中的一种或多种作为任何上述多糖的烷基羰基酯的酯基。此外，更优选使用具有一个或多个选自乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、庚酰基、辛酰基、癸酰基、十二烷酰基、十三烷酰基、十六烷酰基和十八烷酰基中的酯基的任何上述多糖的皂化产物。

优选使用一种或多种丙烯酰基和甲基丙烯酰基作为任何上述多糖的烯基羰基酯的酯基。此外，更优选使用具有一个或多个选自丙烯酰基和甲基丙烯酰基中的酯基的任何上述多糖的皂化产物。

优选使用一种或多种苯酰基和萘酰基(naphthaloyl)作为任何上述多糖的芳香基羰基酯的酯基。此外，更优选使用具有一个或多个含苯酰基和萘酰基的酯基的任何上述多糖的皂化产物。

优选使用硝酸纤维素、硝酸半纤维素、硝酸葡聚糖、硝酸琼脂糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支链淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸异地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜胶、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明质酸、硝酸软骨素、硝酸甲壳素和硝酸壳聚糖作为任何多糖的硝酸酯。

此外，更优选使用硝酸纤维素、硝酸半纤维素、硝酸葡聚糖、硝酸琼脂糖、硝酸糊精、硝酸淀粉酶、硝酸淀粉精、硝酸糖原、硝酸支链淀粉、硝酸甘露聚糖、硝酸葡甘露聚糖、硝酸地衣淀粉、硝酸异地衣淀粉、硝酸昆布糖、硝酸角叉菜胶、硝酸木聚糖、硝酸果聚糖、硝酸褐藻酸、硝酸透明质酸、硝酸软骨素、硝酸甲壳素和硝酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选使用硫酸纤维素、硫酸半纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸琼脂糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支链淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸异地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜胶、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明质酸、硫酸软骨素、硫酸甲壳素和硫酸壳聚糖作为任何多糖的硫酸酯。

此外，更优选使用硫酸纤维素、硫酸半纤维素、硫酸葡聚糖、硫酸琼脂糖、硫酸糊精、硫酸淀粉酶、硫酸淀粉精、硫酸糖原、硫酸支链淀粉、硫酸甘露聚糖、硫酸葡甘露聚糖、硫酸地衣淀粉、硫酸异地衣淀粉、硫酸昆布糖、硫酸角叉菜胶、硫酸木聚糖、硫酸果聚糖、硫酸褐藻酸、硫酸透明质酸、硫酸软骨素、硫酸甲壳素和硫酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选选自烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯中的一种或多种作为任何上述多糖的磺酸酯。此外，更优选使用任何上述多糖的烷基磺酸酯、烯基磺酸酯、芳香基磺酸酯和芳烷基磺酸酯的各自的皂化产物。

优选使用磷酸纤维素、磷酸半纤维素、磷酸葡聚糖、磷酸琼脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支链淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸异地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜胶、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明质酸、磷酸软骨素、磷酸甲壳素和磷酸壳聚糖作为任何上述多糖的磷酸酯。

此外，更优选使用磷酸纤维素、磷酸半纤维素、磷酸葡聚糖、磷酸琼脂糖、磷酸糊精、磷酸淀粉酶、磷酸淀粉精、磷酸糖原、磷酸支链淀粉、磷酸甘露聚糖、磷酸葡甘露聚糖、磷酸地衣淀粉、磷酸异地衣淀粉、磷酸昆布糖、磷酸角叉菜胶、磷酸木聚糖、磷酸果聚糖、磷酸褐藻酸、磷酸透明质酸、磷酸软骨素、磷酸甲壳素和磷酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选使用膦酸纤维素、膦酸半纤维素、膦酸葡聚糖、膦酸琼脂糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支链淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸异地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜胶、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明质酸、膦酸软骨素、膦酸甲壳素和膦酸壳聚糖作为任何上述多糖的膦酸酯。

此外，更优选使用膦酸纤维素、膦酸半纤维素、膦酸葡聚糖、膦酸琼脂糖、膦酸糊精、膦酸淀粉酶、膦酸淀粉精、膦酸糖原、膦酸支链淀粉、膦酸甘露聚糖、膦酸葡甘露聚糖、膦酸地衣淀粉、膦酸异地衣淀粉、膦酸昆布糖、膦酸角叉菜胶、膦酸木聚糖、膦酸果聚糖、膦酸褐藻酸、膦酸透明质酸、膦酸软骨素、膦酸甲壳素和膦酸壳聚糖的各自的皂化产物。

优选使用焦磷酸纤维素、焦磷酸半纤维素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸琼脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支链淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸异地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜胶、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明质酸、焦磷酸软骨素、焦磷酸甲壳素和焦磷酸壳聚糖作为任何上述多糖的焦磷酸酯。

此外，更优选使用焦磷酸纤维素、焦磷酸半纤维素、焦磷酸葡聚糖、焦磷酸琼脂糖、焦磷酸糊精、焦磷酸淀粉酶、焦磷酸淀粉精、焦磷酸糖原、焦磷酸支链淀粉、焦磷酸甘露聚糖、焦磷酸葡甘露聚糖、焦磷酸地衣淀粉、焦磷酸异地衣淀粉、焦磷酸昆布糖、焦磷酸角叉菜胶、焦磷酸木聚糖、焦磷酸果聚糖、焦磷酸褐藻酸、焦磷酸透明质酸、焦磷酸软骨素、焦磷酸甲壳素和焦磷酸壳聚糖的各自的皂化产物。

可以使用甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素、羧乙基-氨基甲酰乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟乙基甲基纤维素、氰乙基纤维素和氨基甲酰乙基纤维素作为任何上述多糖的醚类衍生物，但是其醚类衍生物并不限定于此。优选使用羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

还可以优选使用其中的羟基被以任意程度卤化取代的任何多糖。

作为包含具有多糖结构的有机聚合物的多孔膜，其优选实例为醋酸纤维素。还可以使用这样的有机聚合物的多孔膜，其中所述有机聚合物包含乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物。可优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物、三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物、三醋酸纤维素和二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物作为乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物。特别是，可优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比(以重量计)优选为99∶1到1∶99，更优选为90∶10到50∶50。

在专利文献JP-A-2003-128691中例举了一种包含表面皂化的醋酸纤维素的多孔膜来作为特别优选的包含醋酸纤维素的多孔膜。表面皂化的醋酸纤维素是对乙酰值不同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理而得到的产物，还可以优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物、三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物、三醋酸纤维素和二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物以及二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物的皂化产物。更优选使用三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物。三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合比(以重量计)优选为99∶1到1∶99，更优选为90∶10到50∶50。在此情况下，可通过调节皂化处理的程度(皂化率)来控制固相表面上羟基的量(密度)。为了提高分离核酸的效率，优选使羟基的量(密度)更高。由皂化处理得到的多孔膜的皂化率(表面皂化率)优选为5％到100％，更优选为10％到100％。

多孔膜优选为皂化处理后平均孔径小于皂化处理前平均孔径的多孔膜。优选这样的多孔膜，其皂化处理后的平均孔径与皂化处理前的平均孔径之比为0.8或更低，更优选该比值为0.5或更低的多孔膜。

皂化处理是指使醋酸纤维素与皂化处理液(例如，氢氧化钠水溶液)接触。与皂化处理液接触的部分醋酸纤维素转化成再生纤维素，由此引入羟基。如此制备的再生纤维素在结晶形态等方面与初始纤维素不同。在本发明中，优选使用再生纤维素的多孔膜作为多孔膜。

此外，为了改变皂化率，通过改变氢氧化钠浓度来实施皂化处理是足够的。通过NMR、IR或XPS，很容易测得皂化率(例如，通过羰基峰减弱的程度来测定)。

作为把羟基引入不含羟基的多孔膜中的方法，可以把在其聚合物主链或侧链上具有羟基的接枝聚合物连接到多孔膜上。

有两种方法可作为把接枝聚合物链连接到有机材料多孔膜的方法：一种方法是把多孔膜和接枝聚合物链化学连接；另一种方法是使具有可聚合的双键的化合物从多孔膜开始聚合，以形成接枝聚合物链。

首先，在把多孔膜和聚合物链化学连接的方法中，聚合物在其末端或侧链上具有能与多孔膜反应的官能团，该官能团与多孔膜的官能团发生化学反应，由此形成接枝。对于可与多孔膜反应的官能团没有特别限定，只要其可以与多孔膜的官能团发生反应即可，其实例包括硅烷偶联基(例如烷氧基硅烷)、异氰酸基、氨基、羟基、羧基、磺酸基、磷酸基、环氧基、烯丙基、甲基丙烯酰基和丙烯酰基。

特别有用的在聚合物末端或侧链上具有反应性官能团的化合物的实例包括：在其末端具有三烷氧基甲硅烷基的聚合物、在其末端具有氨基的聚合物、在其末端具有羧基的聚合物、在其末端具有环氧基的聚合物以及在其末端具有异氰酸基的聚合物。对在此使用的聚合物没有特别限定，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可，具体实例包括聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯及其盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐以及聚氧乙烯。

通过使具有可聚合双键的化合物从多孔膜开始聚合以形成接枝聚合物链的方法通常被称为表面接枝聚合法。表面接枝聚合法是这样一种方法：其中通过用等离子体或光辐射或通过加热，在基材的表面上形成活性部位，将具有可聚合双键的化合物与多孔膜接触放置，该化合物从活性部位开始聚合，由此连接到多孔膜上。

用于形成与基材相连的接枝聚合物链的化合物必须具有可聚合的双键和参与吸附核酸的亲水性基团。可以使用任何具有亲水性基团的聚合物、具有亲水性基团的低聚物和具有亲水性基团的单体作为这种化合物，只要在其分子内具有双键即可。特别有用的化合物是具有亲水性基团的单体。

可以使用下列单体作为具有亲水性基团的单体的特别有用的具体实例。例如，可以特别优选使用具有羟基的单体，例如丙烯酸2-羟乙酯、甲基丙烯酸2-羟乙酯和单甲基丙烯酸甘油酯。此外，可优选使用具有羧基的单体，例如丙烯酸和甲基丙烯酸，或者其碱金属盐和胺盐。

作为另一种把亲水性基团引入到包含不具有亲水性基团的有机材料的多孔膜中的方法，可以用具有亲水性基团的材料进行涂覆。对用于涂覆的材料没有特别限定，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可。为了使操作简单，优选为有机材料聚合物。聚合物的实例包括聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯及其盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐、聚氧化亚乙基、醋酸纤维素以及乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物，其中优选具有多糖结构的聚合物。

此外，在把醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物涂覆到不具有亲水性基团的有机材料多孔膜上之后，可对所涂覆的醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在此情况下，皂化率优选为约5％或更高，更优选为约10％或更高。

可以例举一种含有二氧化硅化合物的多孔膜作为包含具有亲水性基团的无机材料的多孔膜。含有二氧化硅化合物的多孔膜的实例包括如日本专利3,058,342所述的玻璃滤膜和二氧化硅多孔薄膜。这种二氧化硅多孔薄膜可以如此形成：把能够形成双分子膜的阳离子两性物质的溶液分散到基材上，除去基材上液体膜的溶剂以形成两性物质的多层双分子薄膜，使该多层双分子薄膜与含有二氧化硅化合物的溶液接触，然后取下多层双分子薄膜。

有两种方法可作为把亲水性基团引入不具有亲水性基团的无机材料中的方法：一种方法是把多孔膜和接枝聚合物链化学连接；另一种方法是使用单体从多孔膜开始形成接枝聚合物链，所述单体的分子内具有可聚合的双键。

在把多孔膜和聚合物链化学连接的方法中，把可以和接枝聚合物的末端官能团反应的官能团引入无机材料中，并且使接枝聚合物与引入无机材料中的官能团化学连接。此外，在使用分子内具有双键并具有亲水性基团的单体、并且使该单体从多孔膜开始聚合从而形成接枝聚合物链的情况下，把官能团引入无机材料中，该官能团在具有双键的化合物发生聚合时发挥起点的作用。可优选使用在谈到使多孔膜和接枝聚合物链化学结合的时候所例举的那些具有亲水性基团的接枝聚合物和那些分子内具有双键并具有亲水性基团的单体，来作为具有亲水性基团的接枝聚合物和分子内具有双键并具有亲水性基团的单体。

作为另一种把亲水性基团引入到包含不具有亲水性基团的无机材料的多孔膜中的方法，可以用具有亲水性基团的材料进行涂覆。对用于涂覆的材料没有特别限定，只要其具有参与吸附核酸的亲水性基团即可。为了使操作简单，优选为有机材料聚合物。聚合物的实例包括聚丙烯酸羟乙酯、聚甲基丙烯酸羟乙酯及其盐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸及其盐、聚氧化亚乙基、醋酸纤维素以及乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物。

此外，在把醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物涂覆到不具有亲水性基团的无机材料多孔膜上之后，可对所涂覆的醋酸纤维素或乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物进行皂化处理。在此情况下，皂化率优选为约5％或更高，更优选为约10％或更高。

包含不具有亲水性基团的无机材料的多孔膜的实例包括：由金属(例如铝)、玻璃、水泥、陶瓷(例如陶)、新型陶瓷、硅或活性炭加工而成的多孔膜。

可以使用厚度为10μm到500μm的多孔膜作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜。更优选的是，可以使用厚度为50μm到250μm的多孔膜。为了使洗涤方便，多孔膜最好具有较薄的厚度。

此外，优选使用平均孔径为0.9μm到5.0μm的多孔膜作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜。更优选的是，使用平均孔径为1.5到3.5μm的多孔膜。这种孔径大小提供了充足的吸附核酸的表面积并减少了堵塞，因此是优选的。可根据泡点法(以ASTMF316-86和JISK3832为基础)确定溶液可从中通过的多孔膜的平均孔径大小。

溶液可从中通过的固相可以是其前表面和后表面彼此对称的多孔膜，但优选为前表面和后表面彼此不对称的多孔膜。在本文中使用的术语“前表面和后表面彼此不对称”是指从多孔膜的一面到其另一面，膜的物理及/或化学性能发生变化。物理性能的实例是平均孔径大小。此外，化学性能的实例是皂化度。在使用其前表面和后表面在平均孔径大小方面彼此不对称的多孔膜的情况下，优选进行调节，使平均孔径沿着溶液通过膜的方向，从较大尺寸变为较小尺寸。优选使用最大孔径/最小孔径之比为2或2以上的多孔膜。最大孔径/最小孔径之比更优选为5或5以上。由此可以得到充足的吸附核酸的表面积，并且很难发生堵塞。

此外，可以使用空隙容积为50％到95％的多孔膜作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜。更优选的是，可以使用空隙容积为65到80％的多孔膜。此外，可以使用泡点为0.1kgf/cm²到10kgf/cm²的多孔膜作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜。更优选的是，可以使用泡点为0.2到4kgf/cm²的多孔膜。

此外，优选使用压力损失为0.1kPa到100kPa的多孔膜作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜。通过施加压力，这种膜可达到均匀的压力，因此是优选的。更优选的是，可以使用压力损失为0.5到50kPa的多孔膜。在本文所用的术语“压力损失”是指水每通过100μm的膜厚所需要的最小压力。

此外，可以使用当在25℃下施加1kg/cm²的压力时水以每分钟1到5000mL/cm²的量通过的多孔膜作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜。更优选的是，可以使用当在25℃下施加1kg/cm²的压力时水以每分钟5到1000mL/cm²的量通过的多孔膜。

此外，优选使用每毫克膜的核酸吸附量为0.1μg或更高的多孔膜作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜。更优选的是，可以使用每毫克膜的核酸吸附量为0.9μg或更高的多孔膜。

此外，作为溶液可从中通过的上述核酸吸附性多孔膜，优选使用的多孔膜为，当将5×5mm的正方形的该膜样品浸入5mL三氟醋酸中时，在1小时内不溶解，但在48小时内溶解。此外，可优选使用包含纤维素衍生物的多孔膜，当将5×5mm的正方形的该膜样品浸入5mL三氟醋酸中时，在1小时内溶解，但是当浸入5mL二氯甲烷中时，在48小时内不溶解。

在使含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜的情况下，为了使溶液与多孔膜均匀接触，优选使样品溶液从膜的一面通过而到达另一面。在使含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜的情况下，为了减少堵塞，优选使样品溶液从孔径较大的一侧通过而到达孔径较小的一侧。

在使含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜的情况下，为了使溶液和多孔膜达到适当的接触时间，流速优选为2到1500μL/秒/cm²膜面积。如果溶液和多孔膜的接触时间太短，则不能达到充分分离和纯化的效果，而从操作方面来说，接触时间太长是不利的。此外，流速更优选为5到700μL/秒/cm²膜面积。

此外，所用溶液可从中通过的核酸吸附性多孔膜的数目可以是一个，但是也可以使用多个膜。多个核酸吸附性多孔膜可以彼此相同或彼此不同。

可以使用这样的核酸分离纯化柱，其中上述的溶液可从中通过的核酸吸附性多孔膜由具有至少两个开口的容器所容纳。此外，可优选使用这样的核酸分离纯化柱，其中上述的溶液可从中通过的多个核酸吸附性多孔膜由具有至少两个开口的容器所容纳。在此情况下，由具有至少两个开口的容器所容纳的多个核酸吸附性多孔膜可以彼此相同或彼此不同。

多个核酸吸附性多孔膜可以是包含无机材料的核酸吸附性多孔膜和包含有机材料的核酸吸附性多孔膜的组合。例如，在此例举一种玻璃滤膜和再生纤维素多孔膜的组合。此外，多个核酸吸附性多孔膜可以是包含无机材料的核酸吸附性多孔膜和包含有机材料的核酸吸附性多孔膜的组合。例如，在此例举一种玻璃滤膜和尼龙或聚砜多孔膜的组合。

核酸分离纯化柱优选为装在具有至少两个开口的容器中，除了容纳上述的溶液可从中通过的核酸吸附性多孔膜以外，不容纳其它膜。可以使用塑料(例如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯)作为容器材料。此外，还可以使用可生物降解的材料。容器可以是透明的或有颜色的。

可以使用配有识别各柱的装置的核酸分离纯化柱作为上述的核酸分离纯化柱。识别各个核酸分离纯化柱的装置的实例包括条形码和磁带。

此外，可以使用这样的核酸分离纯化柱，该柱所具有的结构可以使核酸吸附性多孔膜很容易从具有至少两个开口的容器中取出。

可以使用上述的核酸分离纯化柱通过以下步骤分离和纯化核酸，其中该柱具有核酸吸附性多孔膜，各溶液可通过该膜。

上述步骤为：

(a)把含有核酸的样品溶液注入到核酸分离纯化柱的第一个开口中，该柱包含具有至少两个开口的容器，并且具有核酸吸附性多孔膜，所述样品溶液可通过该膜；

(b)使用压力差产生装置在核酸分离纯化柱中形成加压环境，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的上述第一个开口相连，从而使注入的含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此使核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；

(c)把洗涤液注入到核酸分离纯化柱的上述第一个开口中；

(d)使用压力差产生装置在核酸分离纯化柱中形成加压环境，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的上述第一个开口相连，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此洗涤核酸吸附性多孔膜，而保持核酸仍被吸附；

(e)把回收液注入到核酸分离纯化柱的上述第一个开口中；以及

(f)使用压力差产生装置在核酸分离纯化柱中形成加压环境，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的上述第一个开口相连，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，从而使核酸从核酸吸附性多孔膜解吸附并从核酸分离纯化柱的容器中排出。

在另一实施方案中，可以进行以下步骤：

(b)使用压力差产生装置在核酸分离纯化柱中形成减压环境，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的另一个开口相连，从而使注入的含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此使核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；

(c)把洗涤液注入到核酸分离纯化柱的上述第一个开口中；

(d)使用压力差产生装置在核酸分离纯化柱中形成减压环境，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的另一个开口相连，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此洗涤核酸吸附性多孔膜，而保持核酸仍被吸附；

(f)使用压力差产生装置在核酸分离纯化柱中形成减压环境，该压力差产生装置与核酸分离纯化柱的另一个开口相连，或者把离心力施加到核酸分离纯化柱上，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，从而使核酸从核酸吸附性多孔膜解吸附并从核酸分离纯化柱的容器中排出。

在另一种实施方案中，可以进行以下步骤：

(b)把离心力施加到核酸分离纯化柱上，从而使注入的含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此使核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上；

(c)把洗涤液注入到核酸分离纯化柱的上述第一个开口中；

(d)把离心力施加到核酸分离纯化柱上，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，由此洗涤核酸吸附性多孔膜，而保持核酸仍被吸附；

(f)把离心力施加到核酸分离纯化柱上，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出，从而使核酸从核酸吸附性多孔膜解吸附并从核酸分离纯化柱的容器中排出。

洗涤步骤如下所述。洗涤操作用于提高核酸的回收量和回收纯度并使含有核酸的样品必需量减少。此外，通过自动进行洗涤和回收操作，可以使该操作更加方便快捷。为快速完成操作可以只进行一次洗涤步骤，而在纯度更加重要的情况下，优选重复进行几次洗涤操作。

在洗涤步骤中，使用管子、移液管或自动注入装置或功能与上述各装置相同的设备，把洗涤液送入核酸分离纯化柱中，该柱中有核酸吸附性多孔膜。由此送入的洗涤液通过核酸分离纯化柱的一个开口(含有核酸的样品溶液已通过该开口注入)，并使用压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵或电动移液管)在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使洗涤液通过核酸吸附性多孔膜并从核酸分离纯化柱的另一个开口排出。此外，还可以使洗涤液由一个开口送入并由同一开口排出。此外，还可以使洗涤液由核酸分离纯化柱的一个开口送入，该开口与送入含有核酸的样品溶液所用的开口不同。但是，一种方法是由核酸分离纯化柱的一个开口送入洗涤液，使洗涤液通过核酸吸附性多孔膜并由一个与送入洗涤液的开口不同的开口排出，这种方法的洗涤效率很好，因此是优选的。

在洗涤步骤中，洗涤液的用量优选为2μl/mm²或更多。如果洗涤液用量大，则会提高洗涤效率。为了保持良好的可操作性并防止样品经洗涤损失，其用量优选为200μl/mm²或更少。

在洗涤步骤中，洗涤液通过核酸吸附性多孔膜的流速对于每平方厘米(cm²)的柱中膜面积优选为2到1500μL/秒，更优选为5到700μL/秒。当降低流速以延长洗涤时，洗涤效率会大大提高。但是，加速进行分离和纯化核酸的操作也很重要，因此选择上述范围。

在洗涤步骤中，洗涤液的温度优选为4到70℃。更优选的是，洗涤液的温度为室温。

此外，在洗涤步骤中，还可以在进行洗涤的同时，通过对核酸分离纯化柱进行机械振动或施加超声波而搅拌，或者可以通过离心进行洗涤。

在洗涤步骤中，一般不把酶(例如核酸酶)加入洗涤液中，但是可以加入能分解杂质(例如蛋白质)的酶。此外，在某些情况下，可以加入DNA-分解酶或RNA-分解酶。通过使用含有DNA-分解酶的洗涤液，样品中仅RNA被选择性回收。相反，通过使用含有RNA-分解酶的洗涤液，样品中仅DNA被选择性回收。

在洗涤步骤中，洗涤液优选为含有水溶性有机溶剂及/或水溶性盐的溶液。要求洗涤液发挥以下功能：要洗去与核酸一起吸附到核酸吸附性多孔膜上的样品溶液中所含的杂质。因此，洗涤液必须具有这样的组成物，其仅使杂质从核酸吸附性多孔膜解吸附，而不会使核酸解吸附。为此，水溶性有机溶剂(例如醇)适用于使核酸以外的其它成分解吸附，因为核酸在这种溶剂中是微溶的，所以核酸仍留在多孔膜上。此外，添加水溶性盐可增强核酸的吸附效果，因此会使选择性除去不必要成分的能力增强。

可优选使用甲醇、乙醇、异丙醇、正-异丙醇、丁醇和丙酮作为加入洗涤液中的水溶性有机溶剂。其中，优选使用乙醇。洗涤液中水溶性有机溶剂的添加量优选为20重量％到100重量％，更优选为40重量％到80重量％。

另一方面，加入洗涤液中的水溶性盐优选为卤盐，其中优选氯化物。此外，水溶性盐优选为一价阳离子或二价阳离子的盐，特别优选碱性金属盐或碱土金属盐。其中，优选钠盐和钾盐，最优选钠盐。

在洗涤液中加入水溶性盐的情况下，其浓度优选为10mM/L或更高。没有特别限定该浓度的上限，该浓度上限可以在不损害杂质溶解性的范围内变化。但是，该浓度优选为1M/L或更低，更优选为0.1M/L或更低。

水溶性盐特别优选氯化钠，其浓度特别优选为20mM/L或更高。

优选不含任何离液性物质的洗涤液，这样可以减小把离液性物质带入在洗涤步骤之后的回收步骤的可能性。如果把离液性物质带入回收步骤，则通常会抑制酶反应(例如PCR)。因此，考虑到随后的酶反应，最好是洗涤液中不含离液性物质。此外，因为离液性物质具有腐蚀性和危害性，所以为了测试操作的安全性，不需要离液性物质对实验人员极为有利。

如前所述，离液性物质是脲、胍盐、异氰酸钠、碘化钠、碘化钾等。

此前，在分离和纯化核酸过程的洗涤步骤中，因为溶液对容器的润湿性能，所以洗涤液通常残留在容器(例如柱)中。因为洗涤液被带入在洗涤步骤之后的回收步骤，所以这是所得核酸纯度降低的原因或者是随后步骤的反应性降低的原因。因此，在使用容器(例如柱)来实施核酸吸附和解吸附的情况下，最重要的是：吸附或洗涤所用的溶液(特别是洗涤液)不应残留在核酸分离纯化柱内，以避免对随后的步骤造成有害影响。

因此，为了防止把洗涤步骤所用的洗涤液带入随后的回收液中并使核酸分离纯化柱内洗涤液的残留量达到最小，洗涤液的表面张力优选为0.035J/m²或更低。通过降低洗涤液的表面张力，可改善洗涤液和核酸分离纯化柱之间的润湿性能，因此溶液残留量会降低。

反之，为了降低核酸分离纯化柱内洗涤液的残留量，洗涤液的表面张力可调节到0.035J/m²或更高，从而使抗水性增强，以形成向下流动的液滴。根据多孔膜(其具有吸附于其上的核酸)、回收液和洗涤液的组合情况来选择合适的表面张力。

使用本发明的核酸吸附性多孔膜可以简化洗涤步骤。即，(1)洗涤液通过核酸吸附性多孔膜的次数可以为一次，(2)洗涤步骤可在室温下进行，(3)洗涤后，可立即把回收液注入核酸分离纯化柱中，以及(4)可以进行一次或多次的步骤(1)、(2)和(3)。在常规方法中，为了快速除去洗涤液中所含的有机溶剂，通常需要干燥步骤。但是，因为本发明的核酸吸附性多孔膜厚度很薄，所以不需要干燥步骤。

在分离和纯化核酸的过程中，洗涤步骤存在以下问题：洗涤液经常四散并落到其它部位上，因此会造成样品污染。通过合理设计核酸分离纯化柱的形状和废液容器的形状，可以避免这种在洗涤步骤中受到的污染，所述柱包含具有两个开口的容器并且具有核酸吸附性膜。

下文描述核酸从核酸吸附性膜解吸附以回收核酸的步骤。

在回收步骤中，使用管子、移液管或自动注入装置或功能与上述各装置相同的设备，把回收液送入核酸分离纯化柱中，该柱中配有核酸吸附性多孔膜。回收液通过核酸分离纯化柱的一个开口送入(含有核酸的样品溶液已通过该开口注入)，并使用压力差产生装置(例如，滴液管、注射器、泵或电动移液管)在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使回收液通过核酸吸附性多孔膜并从不同于上述开口的另一个开口排出。此外，还可以使回收液由一个开口送入并由同一开口排出。此外，还可以使回收液由核酸分离纯化柱的一个开口送入，该开口与送入含有核酸的样品溶液的开口不同。但是，一种方法是由核酸分离纯化柱的一个开口送入回收液，使回收液通过核酸吸附性多孔膜并由一个与送入该回收液的开口不同的开口排出，这种方法的回收效率很好，因此是优选的。

可以基于含有核酸并由样品制成的样品溶液的体积来调节回收液的体积，实施核酸解吸附。含有经分离和纯化的核酸的回收液的量根据所用样品的量而变化。回收液的通常用量一般为数十微升到数百微升。但是，当样品量极小，或与此相反，当需要分离和纯化大量核酸时，回收液的量可以在1μl到数十毫升的范围内变化。

可以使用纯化的蒸馏水或缓冲水溶液(例如Tris/EDTA缓冲溶液)作为回收液。此外，在用回收的核酸进行PCR(聚合酶链反应)的情况下，可以使用PCR反应所用的缓冲溶液(例如，含有最终浓度为50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-Cl以及1.5mmol/L的MgCl₂的水溶液)。

回收液的pH值优选为2到11，更优选为5到9。回收液中的离子浓度和盐的浓度对所吸附的核酸的洗脱有影响。回收液的离子浓度优选为290mmol/L或更低，盐的浓度优选为90mmol/L或更低。用这种回收液可提高核酸的回收率，从而回收更多核酸。要回收的核酸可以是任何DNA、RNA、单链核酸、双链核酸、直链核酸和环状核酸。

通过使用体积小于含有核酸的初始样品溶液的体积的回收液，可以得到含有浓缩核酸的回收液。回收液体积与样品溶液体积之比可优选为1∶100到99∶100，更优选为1∶10到9∶10，由此很容易使核酸浓缩，而不用在分离和纯化核酸的步骤之后，实施任何浓缩操作。因此，可以提供这样的方法，通过该方法可得到其核酸浓度大于样品中的核酸浓度的核酸溶液。

作为另一种方法，通过在下述条件下使核酸解吸附，可以得到含有所需浓度核酸的回收液，该条件是：回收液的体积大于含有核酸的初始样品溶液的体积。因此，可以得到含有核酸的回收液，其浓度适合于随后的步骤(例如，PCR)。回收液体积与样品溶液体积之比可优选为1∶1到50∶1，更优选为1∶1到5∶1，从而提供如下优点：在分离和纯化核酸之后，可取消麻烦的浓度调节操作。此外，使用足够体积的回收液可提高从多孔膜回收的核酸的回收率。

此外，通过改变回收液的温度，很容易回收核酸。例如，使用温度为0到10℃的回收液使核酸从多孔膜解吸附，可降低核酸酶的作用，而不用任何试剂或任何特别操作来避免由核酸酶造成的分解，因此可避免核酸分解并且简单高效地得到核酸溶液。

此外，当回收液的温度调节到10到35℃时，可在室温回收核酸，因此不用采取复杂步骤使核酸解吸附、分离和纯化。

在另一种方法中，通过把回收液的温度调节到更高温度(例如35到70℃)，可容易地以高回收率使核酸从多孔膜解吸附，而不用任何复杂操作。

回收液注入的次数不受限制，注入次数可以为一次或多次。通常，在需要方便快捷地分离和纯化核酸的情况下，进行一次注入。但是，例如在需要回收大量核酸的情况下，在某些情况下回收液要注入多次。

在回收步骤中，可以调整用于回收核酸的回收液的组成，从而使之在后续步骤中可以照样使用。如此分离和纯化的核酸通常用PCR(聚合酶链反应)方法扩增。在此情况下，经分离和纯化的含有核酸的溶液必须用适合于PCR方法的缓冲溶液稀释。在本发明的回收步骤中，使用适合于PCR方法的缓冲溶液作为回收液，可以使溶液方便快捷地用于随后的PCR步骤。

此外，在回收步骤中，可以把稳定剂加入核酸回收液中。要添加的稳定剂的实例包括抗微生物剂、抗真菌剂和核酸分解抑制剂。在此例举EDTA作为核酸酶抑制剂。作为另一个实施方案，稳定剂可以预先加入回收容器中。

对回收步骤中所用的回收容器没有特别限定，可以使用由不吸收260nm的光的材料制成的回收容器。用该容器可以测定核酸溶液的浓度，而不用把溶液转移到其它容器中。不吸收260nm的光的材料实例包括石英玻璃等，但是材料并不限定于此。

使用核酸分离纯化柱和压力差产生装置从含有核酸的样品中分离和纯化核酸的步骤优选使用自动装置来实施，其中各步骤是自动实施的，该柱包含具有两个开口的容器并且具有核酸吸附性多孔膜。该装置使操作方便快捷，并且不管操作人员能力如何，都可以提供具有特定质量水平的核酸。

一个自动装置的实施方案是：其中从含有核酸的样品中分离和纯化核酸的步骤是使用核酸分离纯化柱和压力产生器自动实施的，所述柱包含具有至少两个开口的容器，并且具有核酸吸附性多孔膜。但是，自动装置并不仅限于此。

本发明的自动装置是用于自动地分离纯化核酸的装置，其中把含有核酸的样品溶液注入具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱中，形成加压环境使样品溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，把洗涤液注入核酸分离纯化柱中，形成加压环境以除去杂质，把回收液注入核酸分离纯化柱中，使吸附到核酸吸附性多孔膜上的核酸解吸附，并把核酸和回收液一起回收。该自动装置包括：支承机构，其用于支承核酸分离纯化柱；被排放样品溶液和被排放洗涤液所用的废液容器，以及容纳含有核酸的回收液的回收容器；压缩空气供给机构，其用于把压缩空气引入核酸分离纯化柱中；以及分注机构，其用于分别把洗涤液和回收液注入核酸分离纯化柱中。

所述支承机构优选为这样的机构，其具有：在装置主体上安装的立架；承载于立架上可垂直移动的柱支架，该柱支架支承着核酸分离纯化柱；以及用于支承废液容器和回收容器的支架，该支架位于柱支架的下面的某一位置上，从而使其与核酸分离纯化柱的相对位置可以改变。

所述的压缩空气供给机构优选为这样的机构，其具有：从下缘部喷射压缩空气的气嘴；压头，用于承载气嘴并用于使气嘴可以相对于由柱支架支承的核酸分离纯化柱垂直移动；以及位于压头上的定位装置，该定位装置用于定位在支承机构的台架中的核酸分离纯化柱。

此外，所述的分注机构优选为这样的机构，其具有：用于注入洗涤液的洗涤液注入嘴；用于注入回收液的回收液注入嘴；支承洗涤液注入嘴和回收液注入嘴的注入嘴移动架，该移动架能够在由支承机构支承的核酸分离纯化柱上依次移动；用于从含有洗涤液的瓶子中抽吸洗涤液并把洗涤液供给洗涤液注入嘴的洗涤液供给泵；以及用于从含有回收液的瓶子中抽吸回收液并把回收液供给回收液注入嘴的回收液供给泵。

根据如上所述的自动装置，可以紧凑构造一种机构，其装有：支承着核酸分离纯化柱、废液容器和回收容器的支承机构；把压缩空气引入核酸分离纯化柱中的压缩空气供给机构；以及分别把洗涤液和回收液注入核酸分离纯化柱中的机构，其中分离和纯化核酸的步骤在短时间内高效、自动地实施，实施方式为：把含有核酸的样品溶液注入具有核酸吸附性膜的核酸分离纯化柱中，形成加压环境使样品溶液中的核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，把洗涤液注入核酸分离纯化柱中，形成加压环境以洗掉杂质，把回收液注入核酸分离纯化柱中，使吸附到核酸吸附性多孔膜上的核酸解吸附，并将其回收。

当把支承机构构造成具有立架、柱支架(该柱支架可垂直移动地承载于立架上，并支承着核酸分离纯化柱)以及可交换地支承废液容器和回收容器的支架时，就可使核酸分离纯化柱和两个容器很容易地固定，并可使废液容器和回收容器很容易地互换。

此外，当把压缩空气供给机构构造成具有气嘴、用于垂直移动气嘴的压头以及用于定位核酸分离纯化柱的定位装置时，通过简单的机构就保证了压缩空气的供给。

此外，当把分注机构构造成具有用于注入洗涤液的洗涤液注入嘴、用于注入回收液的回收液注入嘴、能够在核酸分离纯化柱上依次移动的注入嘴移动架、用于从含有洗涤液的瓶子中抽吸洗涤液并把洗涤液供给洗涤液注入嘴的洗涤液供给泵，以及用于从含有回收液的瓶子中抽吸回收液并把回收液供给回收液注入嘴的回收液供给泵时，就可以通过简单机构依次注入洗涤液和回收液。

自动装置的实施方案参照附图说明如下。图1是其盖子已被移走的本发明核酸提取装置的一个实施方案的立体图。图2是自动装置的略图。图3是支承机构中的台架的立体图。图4是使用条件下的台架状态的立体图。图5是显示操作过程的图。图6是核酸分离纯化柱的立体图。

本发明一个实施方案的自动装置1是一种使用核酸分离纯化柱11(如图6(具有核酸吸附性多孔膜的柱)所示)从含有核酸的样品溶液中提取核酸的装置。在核酸分离纯化柱11中，核酸吸附性多孔膜11b装在柱体11a的底部，柱体11a的上端有开口，柱体11a低于核酸吸附性多孔膜11b的部分形成漏斗状的形式，排放部分11c是在下端中心以预定长度突出形成的细管口的形状，而纵向突出体11d在柱体11a的两侧上形成。下文要描述的样品溶液、洗涤液和回收液通过上端开口相继注入，压缩空气通过上端开口引入，各种溶液向下流动通过核酸吸附性多孔膜11b，并从排放部分11c排放到废液容器12或回收容器13中。此外，在该图中，柱体11a具有上部和下部互相接合的结构。

在自动装置1中，核酸的分离和纯化按照如图5(a)到(g)所示的核酸分离和纯化过程来实施。首先，在图5的步骤(a)中，把经过溶解处理的样品溶液S注入位于废液容器12之上的核酸分离纯化柱11中。然后，在图5的步骤(b)中，把压缩空气引入核酸分离纯化柱11中，以施加压力并使样品溶液S通过核酸吸附性多孔膜11b，从而把核酸吸附到核酸吸附性多孔膜上，而通过的液体成分被排放到废液容器12中。

然后，在图5的步骤(c)中，将洗涤液W自动注入核酸分离纯化柱11中，在步骤(d)中，把压缩空气引入核酸分离纯化柱中，以洗掉其它杂质，而使核酸保持在吸附于核酸吸附性多孔膜11b上的状态，把通过多孔膜的洗涤液W排放到废液容器12中。步骤(c)和步骤(d)可以重复多次。

此后，在步骤(e)中，把位于核酸分离纯化柱11之下的废液容器12换成回收容器13，在步骤(f)中，将回收液R自动注入核酸分离纯化柱11中，在步骤(g)中，把压缩空气引入核酸分离纯化柱11中，使得核酸吸附性多孔膜11b和核酸之间的结合力减小，并使核酸解吸附，把含有核酸的回收液R排放到回收容器13中以进行回收。

如图1和2所示，自动装置1包括：装有支承机构3的主体2，该支承机构3支承多个核酸分离纯化柱11、废液容器12和回收容器13；压缩空气供给机构4，该压缩空气供给机构4把压缩空气引入核酸分离纯化柱11中；以及分注机构5，该分注机构5用于相继注入洗涤液W和回收液R。机构3到5分别详细描述如下。

<支承机构>

在装置主体的前面且较低的部位，支承机构3具有安装台21，安装台上装有台架6，台架6支承多个核酸分离纯化柱11、废液容器12和回收容器13。图3还示出，台架6具有立架61、柱支架62和容器支架63。立架61使柱支架62可垂直移动地支承在两侧的支柱61a中，并且在底板61b上，立架61使容器支架63可前后移动地支承在支柱61a之间的较低部分。

柱支架62由两块互相连接的板件构成，并且具有在纵向延伸的支撑腿62b，支撑腿62b位于横向延伸的支承部62a的两端。支撑腿62b以可垂直移动的方式插入滑槽61c中，滑槽61c分别在立架61的各支柱61a中形成。支撑腿62b通过推动元件(未示出)向上推，该推动元件包含在立架61中。在支承部62a中，并列设置多个支承孔62c，核酸分离纯化柱11从上面插入，突出体11d(参见图6)在各个核酸分离纯化柱11的柱体11a的两侧上形成，突出体11d的下端与柱支架62内的配合件(未示出)配合，以支承核酸分离纯化柱。配合件可以移动，并且在移动后，会解除与突出体11d的配合，从而使所有核酸分离纯化柱11同时落下，以将其扔掉。

该柱支架62在上表面的两侧具有销孔62d，操作时，如下文所述，压销49(参见图1)的端部49a发挥定位装置的作用，端部49a与各个销孔62d配合，把柱支架62向下压。该机构如此设计，使得当柱支架62在如图3所示的上提位置时，核酸分离纯化柱11的排放部分11c的下端位于废液容器12和回收容器13之上，其中废液容器12和回收容器13固定在容器支架63中，但是当柱支架62向下移动到如图4所示的低位时，核酸分离纯化柱11的排放部分11c以预定程度插入废液容器12或回收容器13的内部。

容器支架63具有废液容器支承孔63a和回收容器支承孔63b，63a和63b在横向平行排列成两排，多个废液容器12被支承在后侧的废液容器支承孔63a的那一排中，而多个回收容器13被支承在前侧的回收容器支承孔63b的那一排中。废液容器支承孔63a的孔距和回收容器支承孔63b的孔距与柱支架62的核酸分离纯化柱支承孔62c的孔距相同，并把废液容器12和回收容器13如此定位，使得它们分别位于各个被支承孔62c在柱支架62中的核酸分离纯化柱11之下。为了避免把废液容器12和回收容器13混淆，例如，优选使它们的尺寸或形状互不相同。

通过施压部件(未示出)把容器支架63向前压，施压部件包含在立架61中。通过使安装台21内的动作部件31(参见图2)透过立架61的底板61b中形成的开口，与容器支架63的底部中的配合孔(未示出)配合，使得容器支架63移动以交换容器(前后移动)。随着容器交换马达32(直流马达)的驱动，容器支架63随着动作部件31的移动操作而成比例地向后移动，从而使回收容器13到达柱支架62之下。当不动作时，通过图中未示出的施压部件，把废液容器12压到柱支架62之下。基于定位传感器33a和33b发出的检测到的信号，来控制容器交换马达32的操作。

<压缩空气供给机构>

如图1和2所示，压缩空气供给机构4具有：相对于支承机构3的台架6可垂直移动的压头40、在压头40中排列成行的多个气嘴41(在图1或2中为8个气嘴)、产生压缩空气的气泵43、安全阀44、为各个气嘴41装设的可单独操作的开关阀45和为各个气嘴41装设的压力传感器46，压缩空气供给机构4连续为核酸分离纯化柱11提供压缩空气。

导杆24所支承的压头40可垂直移动，导杆24垂直设置在装置主体2的中间框架22和上框架23之间。同样，滚珠螺母组件40a设置在压头40中，把滚珠螺母组件40a旋到设置在垂直方向的滚珠丝杠副25上，根据压力传感器48a到48c检测的信号，由垂直移动的马达47(脉冲马达)驱动，通过同步皮带和皮带轮使滚珠丝杠副25旋转，从而使压头40垂直移动。压头40的两侧都有压销49，通过弹簧49b向下推动，可使压销49垂直移动，其端部49a与柱支架62上表面上的销孔62d配合，从而压紧定位。

设置压销49，使得在加压操作下，柱支架62前侧受压，而不会干扰下文所述的洗涤液注入嘴51w和回收液注入嘴51r的横向移动。

压头40中的气嘴41受到向下压力时，可以垂直移动，片状密封件42具有与气嘴41相对应的通孔42a(参见图2)，片状密封件42位于气嘴41之下，压头40向下移动时，各个气嘴41的端部通过密封件42挤压固定在柱支架中的核酸分离纯化柱11的上端开口，从而密封核酸分离纯化柱11，由此可以使压力通过通孔42a施加于核酸分离纯化柱11中。

把安全阀44打开通向大气，由此排放位于气泵43和开关阀45之间的通道中的空气。构造空气环路，使得开关阀45选择性开启，从而把压缩空气从气泵43通过各气嘴41而引入对应的核酸分离纯化柱中。为了分别检测核酸分离纯化柱11的内压，为每个气嘴41都设置了压力传感器46。该机构如此控制，使得当检测到的压力达到预定水平(例如，100kPa)时，关闭相应的开关阀45以停止供应压缩空气，或者当检测到的压力已降到预定水平或低于该水平时，可判断出溶液已完全排放了。

<分注机构>

分注机构5具有：可以在台架6上横向移动的设置于注入嘴移动架50中的洗涤液注入嘴51w和回收液注入嘴51r、用于把洗涤液瓶56w中含有的洗涤液W送入洗涤液注入嘴51w的洗涤液供给泵52w、用于把回收液瓶56r中含有的回收液R送入回收液注入嘴51r的回收液供给泵52r以及装在支承台21上的废液瓶57。

注入嘴移动架50由导轨27支承，可以横向移动，导轨27设置于该装置主体2的垂直壁的水平方向上，注入嘴移动架50的移动由图中未示出的注入嘴移动马达(脉冲马达)控制，从而使各注入嘴依次停在各核酸分离纯化柱11上，而在复位状态下，注入嘴移动架50停在废液瓶57之上。洗涤液注入嘴51w和回收液注入嘴51r的末端向下弯曲，洗涤液注入嘴51w通过活页阀55w连接到洗涤液供给泵52w，洗涤液供给泵52w通过活页阀55w连接到洗涤液瓶56w，而回收液注入嘴51r通过活页阀55r连接到回收液供给泵52r，回收液供给泵52r通过活页阀55r连接到回收液瓶56r。洗涤液供给泵52w和回收液供给泵52r由注射泵构成，并且各泵的活塞部件由泵马达53w或53r(脉冲马达)可控地驱动，从而根据传感器54w或54r检测的位置，注入预定量的洗涤液W或回收液R。

也就是说，在注入洗涤液W或回收液R的情况下，把活页阀55w或55r转到洗涤液瓶56w那一侧或回收液瓶56r那一侧，驱动泵马达53w或53r以使洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r的活塞部件向后移动，从而把洗涤液W或回收液R抽到洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r的内部，随后，把活页阀55w或55r转到洗涤液注入嘴51w那一侧或回收液注入嘴51r那一侧，驱动泵马达53w或53r，以使洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r的活塞部件向前推进，从而通过洗涤液注入嘴51w或回收液注入嘴51r，把洗涤液或回收液放出，直到通向废液瓶57的通道内的空气被排出，然后停止驱动洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r。之后，把洗涤液注入嘴51w或回收液注入嘴51r移到核酸分离纯化柱11之上，控制洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r的驱动量，以把预定量的洗涤液W或回收液R注入核酸分离纯化柱11中。

洗涤液瓶56w和回收液瓶56r分别具有其自身的容器56wb或56rb以及瓶盖56wu或56ru。对瓶盖56wu和56ru分别设置有细管状的吸管58w和58r，各吸管58w和58r的下端开口接近容器56wb或56rb的底部，从而随着洗涤液供给泵52w或回收液供给泵52r的操作，分别抽吸洗涤液W或回收液R。此外，为了随着抽吸操作而引入空气，瓶盖56wu和56ru具有管(或开口)，这在图中未示出。此外，因为洗涤液的用量大于回收液的用量，所以洗涤液瓶56w的容器56wb的高度大于回收液瓶56r的容器56rb的高度，因此，吸管58w比吸管58r长。与瓶盖56wu对应的瓶子顶端的螺纹和与瓶盖56ru对应的瓶子顶端的螺纹具有相同直径。

通过分别使用限制器28和28，分别把瓶盖56wu和56ru固定到主体2的中间框架22上，分别把吸管58w和58r安装到瓶盖上，从而把瓶子56w和56r安装到装置主体2上。容器56wb或56rb分别从安装好的瓶盖56wu和56ru下面旋进瓶盖中，而吸管58w和58r分别插入瓶盖的顶部。采用这种结构是为了避免这样的结果：当将分别具有吸管58w和58r的瓶盖56wu和56ru从容器56wb或56rb移走，以补充洗涤液W或回收液R，并且把瓶盖56wu和56ru放在桌子等物的上面时，会有物质粘到吸管58w和58r的顶部，而污染洗涤液W或回收液R。

特别是，对于高度很高的洗涤瓶56w来说，把容器56wb移走后，吸管58w的下端和用于放置装置主体2的台面之间的距离H被设计成大于容器56wb的高度h。即，瓶盖56wu必须由限制器28安装在离开台面的高度至少是容器56wb的高度h的两倍的位置上。这种结构使得容器56wb容易换位并补充溶液，而不用考虑装有吸管58w的固定瓶盖56wu。上述内容同样适用于回收液瓶56r。

接着，基于图中未示出的协调控制单元所包含的程序，使上述机构3到5响应控制板7的输入操作而运转，该控制板7位于装置主体2的上部。

下文具体描述使用上述核酸分离纯化装置1来分离和纯化核酸的操作。首先，把核酸分离纯化柱11固定在柱支架62中，该支架在支承机构3的台架6中，把废液容器12和回收容器13固定在容器支架63中，把台架6安装在装置主体2的支承台21上。然后，把经过溶解处理的样品溶液S依次注入各核酸分离纯化柱11中。此外，可以在把核酸分离纯化柱11插入未安装到装置1上的台架6中之后或之前，把样品溶液预先注入核酸分离纯化柱11中。

然后，使用控制板7操纵该装置。驱动压缩空气供给机构4的垂直移动的马达47使压头40向下移动，压销49的前端49a与柱支架62的销孔62d配合而限定位置，同时，如图4所示，位于核酸分离纯化柱11的下端的排放部分11c以预定程度插入废液容器12中，以免排放液四散而造成污染。然后，使压头40进一步向下移动，以使得各个气嘴41的下端通过密封件42挤压核酸分离纯化柱11的上端开口。因为压销49限定了柱支架62的位置，各个气嘴41准确地挤压核酸分离纯化柱11，所以可保证充分密封。

随后，充入压缩空气。关闭所有的开关阀45，驱动气泵43，然后打开第一开关阀45。压缩空气由气泵43通过第一气嘴41充入第一个核酸分离纯化柱11中，当经过压力传感器46检测到压力已提高到预定水平时，关闭第一开关阀。随后，打开第二开关阀45，压缩空气通过第二气嘴41充入第二个核酸分离纯化柱11中。依次重复上述操作，直到把压力施加到所有核酸分离纯化柱11上。受压样品溶液S通过核酸吸附性多孔膜11b，从而使核酸吸附到膜11上，并通过位于下部的排放部分11c，把其它成分排放到废液容器12中。当所有样品溶液S都通过了核酸吸附性多孔膜11b时，压力减小到溶液排放结束时的压力水平，或低于该水平，当经过各个压力传感器46检测到核酸已完全附着在所有核酸分离纯化柱11中时，压头向上移动。

然后，转换到洗涤处理阶段。当气嘴41与核酸分离纯化柱11分开，并移动到注入嘴移动架允许移动的高度时，压头在充入空气后的向上移动停止。压销49挤压柱支架62，并如图4所示，核酸分离纯化柱11的下端插入废液容器12中。保持这种状态来进行洗涤处理。移动注入嘴移动架50，然后停止，以使得洗涤液注入嘴51w抵达第一个核酸分离纯化柱11之上的位置，然后注入预定量的洗涤液W。然后把注入嘴移动架移动到下一个核酸分离纯化柱11上，并且依次注入洗涤液W。当洗涤液W已注入到所有核酸分离纯化柱11中时，使压头40向下移动，使各个气嘴41的下端通过密封件42挤压各个核酸分离纯化柱11的上端开口。然后，和前述步骤一样，开关阀45相继打开，把压缩空气充入各个核酸分离纯化柱11中。受压洗涤液W通过核酸吸附性多孔膜11b，以洗掉除核酸以外的杂质，并通过位于下部的排放部分11c，排放到废液容器12中。当所有洗涤液W都通过位于各个核酸分离纯化柱11中的核酸吸附性多孔膜11b而排出时，压头40向上移动到初始位置。在进行多次洗涤处理时，重复上述过程。

然后，转换到回收处理阶段。首先，通过压头40在洗涤处理结束后的向上移动，使压销49沿着台架6中的柱支架62向上移动，并且使位于核酸分离纯化柱下部的排放部分11c移动到废液容器12以上，在此之后，操纵支承机构3的动作部件31，使容器支架向后移动，从而把回收容器13定位到核酸分离纯化柱11之下，由此使容器交换。

随后，使压头40向下移动，并使压销49的前端与柱支架62的销孔62d配合以挤压支架，从而使核酸分离纯化柱11的下端保持插入回收容器13中的状态。然后，移动注入嘴移动架50，然后停止，以使回收液注入嘴51r抵达第一个核酸分离纯化柱11之上的位置。把预定量的回收液R注入第一个柱中，然后把注入嘴移动架50移动到下一个核酸分离纯化柱11上，并且依次注入回收液R。当回收液R已注入到所有核酸分离纯化柱11中时，与此前所述的一样，使压头40再向下移动，且各个气嘴41的下端通过密封件42挤压各个核酸分离纯化柱11的上端开口。然后，开关阀45相继打开，把压缩空气充入各个核酸分离纯化柱11中。受压回收液R通过核酸吸附性多孔膜11b，以使吸附到膜11b的核酸解吸附，并通过位于下部的排放部分11c排放到回收容13中。当核酸分离纯化柱11中所有的回收液R都排出时，压头40向上移动，由此完成系列操作。

在分离和纯化结束后，把台架6从安装台21上拆下来，并从柱支架62和容器支架63上分别取下核酸分离纯化柱11以及废液容器12，将其扔掉。另一方面，从容器支架63上取下回收容器13，如果需要，就把盖子盖到各个容器上，然后，例如，再接受后续的核酸分析处理。

此外，在本实施方案中，使用多个核酸分离纯化柱11，但本发明并不仅限于此，可仅对一个核酸分离纯化柱11进行处理。

以下由实施例来更详细地描述本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。

实施例1

(1)制备核酸分离纯化柱

核酸分离纯化柱所用的容器由高抗冲聚苯乙烯制成，该容器具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分，且该容器内径为7mm。将混合比为6∶4的三醋酸纤维素和二醋酸纤维素混合物的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔径＝1.2μm)作为乙酰值各不相同的醋酸纤维素混合物的核酸吸附性多孔膜，装在核酸分离纯化柱的容器的适合容纳该核酸吸附性多孔膜的所述部分中，从而制成核酸分离纯化柱。

(2)制备核酸溶解试剂(用于RNA)和洗涤液

制备具有表1所示配方的核酸溶解试剂溶液和洗涤液。

表1

(核酸溶解试剂溶液)

盐酸胍(得自Life Technologies公司)Tris(得自Life Technologies公司)Triton X-100(ICN)蒸馏水

382g12.1g10g1000ml

(洗涤液)

100mM NaCl10mM Tris-HCl65％乙醇

(3)分离和纯化核酸的过程

制备人骨髓瘤细胞(HL60)的培养液。所收集的培养液含有1×10⁶个细胞，经过5分钟的离心处理使细胞沉淀，随后除去上层清液以得到细胞。把200μg的RNA-溶解试剂溶液加入HL60细胞(1×10⁶个)中，然后搅拌。随后，加入200μl乙醇，并搅拌所得混合物，从而制备出含有RNA的样品溶液。把含有RNA的样品溶液由含有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的一个开口注入柱中，所述核酸吸附性多孔膜由乙酰化程度各不相同的醋酸纤维素的混合物制成。然后，把压力产生器连接到该开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的含有RNA的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，并使样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触，接着，所述样品溶液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把洗涤液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入柱中，把压力产生器连接到核酸分离纯化柱的上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，接着，所述洗涤液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把回收液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入，把压力产生器连接到核酸分离纯化柱的上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，接着，所述回收液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出，以回收溶液。

(4)分离和纯化的RNA的确认

对回收液进行琼脂糖凝胶电泳。结果示于图7(图7中的分子量标记为：READY-LOAD(商标)；1kb Plus NA梯带)。从图7所示结果可见，通过使用含有核酸吸附性多孔膜和压力产生器的核酸分离纯化柱，其中所述核酸吸附性多孔膜包含乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物，则可以以高回收效率分离和纯化RNA。

实施例2

(1)制备核酸分离纯化柱

通过对由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)得到的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔径＝50μm)进行皂化处理，得到核酸吸附性多孔膜，用该核酸吸附性多孔膜作为由乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物制得的多孔膜经皂化处理而得到的核酸吸附性多孔膜，并将其装在实施例1所制备的核酸分离纯化柱的容器的部分中，所述容器的内径为7mm并具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分，从而制成核酸分离纯化柱。

把三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜在2N的氢氧化钠水溶液中浸泡20分钟，来实施上述皂化处理。处理后，多孔膜的平均孔径从5.0μm降到2.5μm。

(2)分离和纯化核酸的过程

把200μl实施例1中制备的核酸溶解试剂和20μl蛋白酶(得自SIGMA公司；细菌“蛋白酶”XXIV型)溶液加入200μl人全血样品中，将该混合物在60℃下温育10分钟。温育后，加入200μl乙醇并搅拌混合物，以制备含有核酸的样品溶液。把含有核酸的样品溶液由核酸分离纯化柱的第一个开口注入在上述步骤(1)中制备的核酸分离纯化柱中，该柱中含有核酸吸附性多孔膜，该核酸吸附性多孔膜由乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的皂化产物制成。随后，把压力产生器连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，由此使样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。然后，所述样品溶液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把实施例1中制备的洗涤液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入柱中，把压力产生器连接到核酸分离纯化柱的上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，接着，所述洗涤液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把回收液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入。然后，把压力产生器连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且所述回收液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出，以回收溶液。

(3)分离和纯化的核酸的确认

对回收液进行琼脂糖凝胶电泳。结果示于图8(分子量标记与图7相同)。可见，通过使用含有核酸吸附性多孔膜和压力产生器的核酸分离纯化柱，该核酸吸附性多孔膜包含乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的皂化产物，则可以以高回收效率分离和纯化核酸。

实施例3

(1)制备核酸分离纯化柱

核酸分离纯化柱所用的容器由高抗冲聚苯乙烯制成，该容器具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分，且该容器内径为7mm。

使用由三醋酸纤维素多孔膜经皂化处理而得到的多孔膜作为用于分离和纯化核酸的核酸吸附性多孔膜，并将其装在步骤(1)所制备的核酸分离纯化柱的容器部分中。

通过把三醋酸纤维素多孔膜在2N的氢氧化钠水溶液中浸泡20分钟，来实施上述皂化处理。处理后，多孔膜的平均孔径从5.0μm降到2.5μm。

(2)制备核酸溶解试剂溶液和洗涤液

表2

(核酸溶解试剂溶液)

382g12.1g10g1000ml

(洗涤液)

10mM Tris-HCl65％乙醇

(3)分离和纯化核酸的过程

把200μl核酸溶解试剂和20μl蛋白酶(得自SIGMA公司；细菌“蛋白酶”XXIV型)溶液加入200μl人全血样品中，将该混合物在60℃下温育10分钟。搅拌后，把溶液由在步骤(1)中制备的核酸分离纯化柱的第一个开口注入柱中，该柱中含有70μm厚的核酸吸附性多孔膜。随后，把压力差产生装置连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，由此使样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。然后，所述样品溶液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把洗涤液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入柱中。然后，把压力差产生装置连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，注入的洗涤液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把回收液由上述第一个开口注入核酸分离纯化柱中。然后，把压力差产生装置连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，所述回收液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出，以回收溶液。

对比例1

实施与实施例3相同的过程，但是使用600μm厚的多孔膜代替70μm厚的多孔膜，来作为核酸吸附性多孔膜。

(4)测定核酸纯化操作所需的时间

实施例3和对比例1的实验重复10次。把分离和纯化步骤所需时间加以平均，把各平均时间与使用70μm厚的多孔膜所需的时间进行对比，并把后者的时间取作1。由此得到的结果示于表3。

表3

多孔膜厚度(μm)	所需的相对时间
多孔膜厚度(μm)	所需的相对时间	70	1
600	10	70	1

由表3明显可见，采用本发明方法可以快速回收和纯化核酸。

实施例4

实施与实施例3相同的过程，但是使用70μm厚的、最大孔径与最小孔径之比为2或2以上的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

对比例2

实施与实施例4相同的过程，但是使用粒径为0.2μm的聚合物珠代替70μm厚的、最大孔径与最小孔径之比为2或2以上的多孔膜。

(1)测定核酸纯化操作所需的时间

实施例4和对比例2的实验重复5次。在分离和纯化核酸的方法中，肉眼判断是否使样品溶液通过而回收了核酸，或者是否由于堵塞而不可能纯化。由此得到的结果示于表4。

表4

测定次数	实施例4	对比例2
测定次数	实施例4	对比例2	1	○	×
2	○	×	1	○	×
2	○	×	3	○	×
4	○	×	3	○	×
4	○	×	5	○	×

○：溶液通过，回收了核酸。

×：发生堵塞

由表4结果明显可见，采用本发明方法，可以快速回收和纯化核酸，而不会造成堵塞。

实施例5

实施与实施例3相同的过程，但是使用70μm厚的、空隙容积为70％的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

对比例3

实施与实施例5相同的过程，但是使用70μm厚的、空隙容积为58％或80％的多孔膜代替70μm厚的、空隙容积为70％的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

(1)核酸回收量的测定

实施例5和对比例3的实验重复10次。把作为纯化步骤结果的核酸回收量加以平均，把回收量进行互比，并把使用空隙容积为70％的多孔膜所回收的核酸量取作1。结果示于表5。

此外，多孔膜的空隙容积用多孔膜的空隙容积率表示，以多孔膜的假定重量和实际重量相比作为多孔膜的空隙容积率，所述假定重量为由切开的多孔膜的横截面及其厚度所决定的体积与多孔膜构成物质的密度的乘积。

表5

多孔膜的空隙容积(％)	回收量相对值
多孔膜的空隙容积(％)	回收量相对值	58	0.4
70	1	58	0.4
70	1	80	1.1

由表5结果明显可见，采用本发明方法，可以高效回收和纯化核酸。

实施例6

实施与实施例3相同的过程，但是使用70μm厚的、泡点为4.5kgf/cm²的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

对比例4

实施与实施例6相同的过程，但是使用70μm厚的、泡点为5.5kgf/cm²或2.0kgf/cm²的多孔膜代替70μm厚的、泡点为4.5kgf/cm²的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

(1)测定核酸纯化操作所需的时间

实施例6和对比例4的实验重复10次。把纯化步骤所需时间加以平均，把平均时间进行相对比较，并把泡点为4.5kgf/cm²的多孔膜所需的时间取作1。由此得到的结果示于表6。

表6

多孔膜的泡点(kgf/cm²)	所需的相对时间
多孔膜的泡点(kgf/cm²)	所需的相对时间	5.5	1.6
4.5	1	5.5	1.6
4.5	1	2.0	0.4

由表6结果明显可见，采用本发明方法，可以快速回收和纯化核酸。

实施例7

实施与实施例3相同的过程，但是使用70μm厚的、压力损失为75kPa的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

对比例5

实施与实施例7相同的过程，但是使用70μm厚的、压力损失为90kPa或20kPa的多孔膜代替70μm厚的、压力损失为75kPa的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

(1)测定核酸纯化操作所需的时间

实施例7和对比例5的实验重复10次。把纯化步骤所需时间加以平均，把平均时间进行相对比较，并把压力损失为75kPa的多孔膜所需的时间取作1。由此得到的结果示于表7。

此外，所述压力损失是在把干燥状态的多孔膜通过水一次，用水充分润湿之后测得的。

表7

多孔膜的压力损失(kPa)	所需的相对时间
多孔膜的压力损失(kPa)	所需的相对时间	90	2
75	1	90	2
75	1	20	0.3

由表7结果明显可见，采用本发明方法，可以快速回收和纯化核酸。

实施例8

实施与实施例3相同的过程，但是使用当在1kg/cm²的压力和25℃下使水通过时透水量为60mL/分钟/cm²的70μm厚的多孔膜，来代替所用的70μm厚的多孔膜，以作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

对比例6

实施与实施例8相同的过程，但是使用当在1kg/cm²的压力和25℃下使水通过时透水量为80或30mL/分钟/cm²的70μm厚的多孔膜，来代替同样条件下透水量为60mL/分钟/cm²的70μm厚的多孔膜，以作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

(1)测定核酸纯化操作所需的时间

实施例8和对比例6的实验重复10次。把纯化步骤所需时间加以平均，把平均时间进行相对比较，并把当在1kg/cm²的压力和25℃下使水通过时透水量为60mL/分钟/cm²的多孔膜所需的时间取作1。由此得到的结果示于表8。

此外，所述多孔膜的透水量是在把干燥状态的多孔膜通过水一次，用水充分润湿之后测得的。温度为25℃，压力为1kg/cm²。

表8

多孔膜的透水量[mL/(分钟·cm²)]	所需的相对时间
多孔膜的透水量[mL/(分钟·cm²)]	所需的相对时间	30	2
60	1	30	2
60	1	80	0.8

由表8结果明显可见，采用本发明方法，可以快速回收和纯化核酸。

实施例9

实施与实施例3相同的过程，但是使用70μm厚的、核酸吸附量为0.9μg/毫克膜重的多孔膜代替所用的70μm厚的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

对比例7

实施与实施例9相同的过程，但是使用70μm厚的、核酸吸附量为0.5μg/毫克膜重的多孔膜代替70μm厚的、核酸吸附量为0.9μg/毫克膜重的多孔膜，来作为用于分离和纯化核酸的多孔膜。

(1)比较当使用重量相同的膜时核酸的回收量

根据本发明方法和对比例方法(实施例9和对比例7)，从含有核酸的样品溶液中纯化核酸，核酸的电泳结果示于图9。此外，所用的分子量标记是λDNA/经HindIII酶切。

由图9结果明显可见，采用本发明方法，可以从等量样品溶液中，高收率地回收和纯化核酸。

实施例10

(1)制备用于纯化核酸的柱

核酸分离纯化柱所用的容器由高抗冲聚苯乙烯制成，该容器具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分，且该容器内径为7mm。含有混合比为6∶4的三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔径＝5.0μm)，作为含乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的皂化产物的核酸吸附性多孔膜，并将其装在核酸分离纯化柱的用于容纳核酸吸附性多孔膜的容器的所述部分中，从而制成核酸分离纯化柱。

把三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜在2N的氢氧化钠水溶液中浸泡20分钟，以实施上述皂化处理。处理后，多孔膜的平均孔径从5.0μm降到2.5μm。

(2)制备核酸溶解试剂和洗涤液

制备具有表9所示配方的核酸溶解试剂溶液和洗涤液。

表9

(核酸溶解试剂溶液)

382g12.1g10g1000ml

(洗涤液)

100mM NaCl10mM Tris-HCl70％乙醇

(3)分离和纯化DNA的过程

把200μl实施例10中制备的核酸溶解试剂和20μl蛋白酶(得自SIGMA公司；细菌“蛋白酶”XXIV型)溶液加入200μl人全血样品中，将该混合物在60℃下温育10分钟。温育后，把200μl乙醇加入溶液中，搅拌该混合物，以制备含有核酸的样品溶液。把最终得到的含有核酸的样品溶液由含有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口注入柱中，所述核酸吸附性多孔膜包含乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的皂化产物。随后，把压力产生器连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的含有核酸的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，由此使样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触。然后，所述样品溶液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。在此情况下，测定样品溶液通过多孔膜所需的时间。随后，把实施例10中制备的洗涤液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入柱中。然后，把压力产生器连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，并使注入的洗涤液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把回收液由上述第一个开口注入核酸分离纯化柱中。然后，把压力产生器连接到上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，并且所述回收液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出，以回收溶液。

(4)DNA回收量的确认

对回收液进行UV检测。基于260nm处的吸收度，测定回收液中DNA的含量。

实施例11

实施与实施例10相同的过程，但是使用由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)得到的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔径＝3.0μm)经过皂化处理而得到的多孔膜，并测定样品溶液通过多孔膜所需的时间以及回收溶液中DNA的量。

把三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜在2N的氢氧化钠水溶液中浸泡20分钟，来实施上述皂化处理。处理后，多孔膜的平均孔径从3.0μm降到1.2μm。

对比例8

实施与实施例10相同的过程，但是使用由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔径＝0.8μm)经过皂化处理而得到的多孔膜，并测定样品溶液通过多孔膜所需的时间以及回收溶液中DNA的量。

对比例9

实施与实施例10相同的过程，但是使用由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔径＝5.6μm)经过皂化处理而得到的多孔膜，并测定样品溶液通过多孔膜所需的时间以及回收溶液中DNA的量。

由实施例10和11以及对比例8和9得到的测定值示于表10中。

表10

	样品溶液通过多孔膜所需的时间(秒)	DNA回收量(μg)
	样品溶液通过多孔膜所需的时间(秒)	DNA回收量(μg)	实施例10	8	5.4
实施例11	15	5.6	实施例10	8	5.4
实施例11	15	5.6	对比例8	因为堵塞，所以不能通过	0.0
对比例9	6	3.4	对比例8	因为堵塞，所以不能通过	0.0

由表10可见，在本发明的实施例10和11中，样品溶液可以在短时间内通过多孔膜，并回收足够量的DNA。

另一方面，在对比例8中，多孔膜被样品溶液所含的成分堵塞，使样品溶液不能通过多孔膜，因此不能回收DNA。此外，在对比例9中，虽然样品溶液可以在短时间内通过多孔膜，但是DNA的回收量不够。

实施例12

(1)制备用于纯化核酸的核酸分离纯化柱

核酸分离纯化柱所用的容器由高抗冲聚苯乙烯制成，该容器具有用于容纳核酸吸附性多孔膜的部分，且该容器内径为7mm。将含有混合比为6∶4的三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物的皂化产物的多孔膜(厚度＝70μm，平均孔径＝5.0μm)作为含乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的皂化产物的核酸吸附性多孔膜，并将其装在核酸分离纯化柱的适合容纳核酸吸附性多孔膜的容器的所述部分中，从而制成核酸分离纯化柱。

(2)制备RNA溶解试剂和洗涤液

制备具有表11所示配方的RNA溶解试剂溶液和洗涤液。

表11

(RNA溶解试剂溶液)

盐酸胍(得自Life Technologies公司)Tris(得自Life Technologies公司)NP-40(得自和光纯药工业株式会社)蒸馏水

382g12.1g10g1000ml

(洗涤液)

100mM NaCl10mM Tris-HCl56％乙醇

(3)分离和纯化RNA的过程

制备人骨髓瘤细胞(HL60)的培养液。所收集的培养液含有1×10⁶个细胞，并经过5分钟的离心处理使细胞沉淀，随后除去上层清液以得到细胞。把200μg的RNA-溶解试剂溶液加入HL60细胞(1×10⁶个)中，然后搅拌。随后，加入200μl乙醇，并搅拌所得混合物，从而制备出含有RNA的样品溶液。把含有RNA的样品溶液由在上述步骤(1)中制备的含有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱的第一个开口注入柱中，所述核酸吸附性多孔膜由乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物制成。然后，把压力产生器连接到该开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的含有RNA的样品溶液通过核酸吸附性多孔膜，并使样品溶液与核酸吸附性多孔膜接触，接着，所述样品溶液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。在此情况下，测定样品溶液通过多孔膜所需的时间。随后，把洗涤液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入柱中，把压力产生器连接到核酸分离纯化柱的上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的洗涤液通过核酸吸附性多孔膜，接着，所述洗涤液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出。随后，把回收液由核酸分离纯化柱的上述第一个开口注入，把压力产生器连接到核酸分离纯化柱的上述第一个开口，并在核酸分离纯化柱中形成加压环境，从而使注入的回收液通过核酸吸附性多孔膜，接着，所述回收液由核酸分离纯化柱的另一个开口排出，以回收溶液。

(4)RNA回收量的确认

对回收液进行UV检测。由260nm处的吸收度(OD)，测定回收液中RNA的含量。

对比例10

实施与实施例12相同的过程，但是使用由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔径＝0.8μm)经过皂化处理而得到的多孔膜，并测定样品溶液通过多孔膜所需的时间以及回收溶液中RNA的量。

对比例11

实施与实施例12相同的过程，但是使用由三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物(混合比＝6∶4)的多孔膜(厚度＝70μm；平均孔径＝5.6μm)经过皂化处理而得到的多孔膜，并测定样品溶液通过多孔膜所需的时间以及回收溶液中RNA的量。

由实施例12及对比例10和11得到的测定值示于表12中。

表12

	样品溶液通过多孔膜所需的时间(秒)	RNA回收量(μg)
	样品溶液通过多孔膜所需的时间(秒)	RNA回收量(μg)	实施例12	16	9.6
对比例10	因为堵塞，所以不能通过	0.0	实施例12	16	9.6
对比例10	因为堵塞，所以不能通过	0.0	对比例11	9	6.5

由表12可见，在本发明的实施例12中，样品溶液可以在短时间内通过多孔膜，并回收足够量的RNA。另一方面，在对比例10中，多孔膜被样品溶液所含的成分堵塞，使样品溶液不能通过多孔膜，因此不能回收RNA。

此外，在对比例11中，虽然样品溶液可以在短时间内通过多孔膜，但是RNA的回收量不够。

Claims

1.一种用于分离和纯化核酸的核酸吸附性多孔膜，该膜具有在分离和纯化核酸的方法中所使用的核酸吸附性固相，该固相吸附所述的核酸，

所述方法包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的核酸吸附性多孔膜，其厚度为10μm到500μm。

3.如权利要求1至2中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其平均孔径为0.9μm到5.0μm。

4.如权利要求1至3中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其具有彼此不对称的前表面和后表面。

5.如权利要求4所述的核酸吸附性多孔膜，其中最大孔径和最小孔径之比为2或2以上。

6.如权利要求1至5中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其空隙容积为50％到95％。

7.如权利要求1至6中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其泡点为0.1kgf/cm²到10kgf/cm²。

8.如权利要求1至7中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其压力损失为0.1kPa到100kPa。

9.如权利要求1至8中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，在25℃的温度和1kg/cm²的压力下，水可以1mL/分钟到5000mL/分钟的量通过所述的膜。

10.如权利要求1至9中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中每毫克的所述多孔膜吸附0.1μg或更多量的所述核酸。

11.如权利要求1至10中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，所述多孔膜通过该多孔膜和所述核酸之间的基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸。

12.如权利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜包含具有多糖结构的有机聚合物。

13.如权利要求12所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的吸附所述核酸并包含具有多糖结构的有机聚合物的多孔膜是乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物。

14.如权利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素的混合物。

15.如权利要求14所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量计，所述混合物中三醋酸纤维素/二醋酸纤维素的混合比为99∶1到1∶99。

16.如权利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是三醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。

17.如权利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。

18.如权利要求13所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物是二醋酸纤维素和单醋酸纤维素的混合物。

19.如权利要求12所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含具有多糖结构的聚合物的多孔膜是这样的多孔膜，其包含通过皂化一种或多种醋酸纤维素而得到的有机材料。

20.如权利要求19所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的一种或多种醋酸纤维素的皂化率为5％或更高。

21.如权利要求20所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的包含通过皂化所述的一种或多种醋酸纤维素而得到的有机材料的多孔膜是这样的多孔膜，其包含通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料。

22.如权利要求21所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物的皂化率为5％或更高。

23.如权利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是三醋酸纤维素和二醋酸纤维素混合物的皂化产物。

24.如权利要求23所述的核酸吸附性多孔膜，其中以重量计，所述三醋酸纤维素/所述二醋酸纤维素的混合比为99∶1到1∶99。

25.如权利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是三醋酸纤维素和单醋酸纤维素混合物的皂化产物。

26.如权利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是三醋酸纤维素、二醋酸纤维素和单醋酸纤维素混合物的皂化产物。

27.如权利要求21或22所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过皂化乙酰值各不相同的醋酸纤维素的混合物而得到的有机材料是二醋酸纤维素和单醋酸纤维素混合物的皂化产物。

28.如权利要求19至27中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中皂化后的所述平均孔径小于皂化前的所述平均孔径。

29.如权利要求28所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的皂化后的平均孔径与所述的皂化前的平均孔径之比为0.8或更低。

30.如权利要求12所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有多糖结构的有机聚合物是再生纤维素。

31.如权利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过对不具有亲水性基团的有机材料多孔膜进行处理、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

32.如权利要求31所述的核酸吸附性多孔膜，其中对所述的不具有亲水性基团的有机材料多孔膜所进行的处理包括：把接枝聚合物链连接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物链在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团。

33.如权利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过用具有亲水性基团的材料来涂覆不具有亲水性基团的有机材料多孔膜、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

34.如权利要求33所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的具有亲水性基团的材料是有机聚合物，该有机聚合物在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团。

35.如权利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是无机材料，其中用于形成多孔膜的材料本身具有亲水性基团。

36.如权利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过对不具有亲水性基团的无机材料多孔膜进行处理、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

37.如权利要求36所述的核酸吸附性多孔膜，其中把所述亲水性基团引入所述的不具有亲水性基团的无机材料中的处理包括：把接枝聚合物链连接到所述多孔膜上，所述接枝聚合物链在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团。

38.如权利要求11所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的通过基本上不涉及离子键的相互作用来吸附所述核酸的多孔膜是通过用具有亲水性基团的材料来涂覆不具有亲水性基团的无机材料多孔膜、从而把亲水性基团引入该多孔膜中而得到的多孔膜。

39.如权利要求38所述的核酸吸附性多孔膜，其中具有亲水性基团的材料是在其聚合物主链或其侧链上具有亲水性基团的有机聚合物。

40.如权利要求31至39中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述亲水性基团是羟基。

41.如权利要求1至40中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，其中所述的含有核酸的样品溶液、所述洗涤液和所述回收液分别在所述的步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中，在压力下通过所述核酸吸附性多孔膜。

42.如权利要求41所述的核酸吸附性多孔膜，其用于所述的分离和纯化核酸的方法中，

43.一种核酸分离纯化柱，该柱包括：具有至少两个开口的容器，所述的至少两个开口包括第一开口和第二开口；以及权利要求1至42中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜，该多孔膜被容纳在所述容器中。

44.如权利要求43所述的核酸分离纯化柱，其中作为压力差产生装置的泵以可拆装的方式连接到所述核酸分离纯化柱的所述第一开口。

45.一种成套用具，其包括：核酸分离纯化柱，该柱具有权利要求1至42中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜；以及试剂。

46.一种核酸分离纯化装置，该装置使用权利要求1至42中任意一项权利要求所述的核酸吸附性多孔膜。

47.如权利要求46所述的核酸分离纯化装置，该装置是自动实施核酸分离和纯化步骤的自动装置，所述步骤包括：通过在压力下，把含有核酸的样品溶液注入到具有核酸吸附性多孔膜的核酸分离纯化柱中，使所述样品溶液中的所述核酸吸附到该核酸吸附性多孔膜上；在压力下，把洗涤液注入到所述的核酸分离纯化柱中以除去除所述核酸以外的其它成分，在此期间所述核酸仍吸附在所述核酸吸附性多孔膜上；以及在压力下，把回收液注入到所述的核酸分离纯化柱中，使吸附到所述核酸吸附性多孔膜上的所述核酸解吸附，并连同所述回收液回收所述核酸；

其中所述装置包括：

48.如权利要求47所述的核酸分离纯化装置，其中所述支承机构包括：立架，其安装在所述装置的主体上；柱支架，其可垂直移动地承载于所述立架上，并支承所述的核酸分离纯化柱；以及用于支承所述废液容器和所述回收容器的支架，该支架位于所述柱支架下面的某一位置上，该支架与所述核酸分离纯化柱的相对位置可以改变。

49.如权利要求47或48所述的核酸分离纯化装置，其中所述的压缩空气供给机构包括：气嘴，用于从其下缘部喷射压缩空气；压头，用于承载所述气嘴，并用于使所述气嘴相对于被支承在所述柱支架中的所述核酸分离纯化柱垂直移动；以及定位装置，其设置在所述压头上，并用于定位在所述支承机构的台架中的所述核酸分离纯化柱。

50.如权利要求47至49中任意一项权利要求所述的核酸分离纯化装置，其中所述的分注机构包括：洗涤液注入嘴，其用于注入所述洗涤液；回收液注入嘴，其用于注入回收液；注入嘴移动架，其用于支承所述的洗涤液注入嘴和所述的回收液注入嘴，并能够在所述的核酸分离纯化柱上依次移动，所述的核酸分离纯化柱由所述支承机构支承；洗涤液供给泵，其用于从含有所述洗涤液的瓶子中抽吸所述洗涤液，并把该洗涤液供给到所述的洗涤液注入嘴；以及回收液供给泵，其用于从含有所述回收液的瓶子中抽吸所述回收液，并把该回收液供给到所述的回收液注入嘴。