CN1869689A - 一种微悬臂梁阵列生物芯片 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微悬臂梁阵列生物芯片。该微悬臂梁阵列生物芯片，它包括由微悬臂梁组成的阵列，所述微悬臂梁单侧表面修饰有生物探针分子。本发明生物芯片中的微悬臂梁上的生物探针分子与待检测样品中的靶分子的相互作用可通过光学装置进行监测。检测时无需对待检测样品标记，消除了可能由标记产生的附加影响；可实现实时、并行的监测整个生化反应的发生过程，从而可以得到更丰富的生物信息；特别适用于难于标记示踪物，如荧光素或示踪同位素的被检测靶分子。

Description

一种微悬臂梁阵列生物芯片

技术领域

本发明涉及一种生物芯片，特别涉及一种微悬臂梁阵列生物芯片。

背景技术

生物芯片技术肇始上世纪90年代初，近年来更是得到了迅猛的发展。它通过在厘米见方的芯片上集成成千上万个与生命相关的探针分子，对生命科学与医学中的各种生物化学反应过程进行检测，从而实现对基因、配体、抗原等生物活性物质进行高效快捷的测试和分析。

目前已有的生物芯片虽然已有多种，但其工作过程基本是相同的：首先是制作生物芯片，主要是采用表面化学的方法处理固相基质表面，如玻璃片或硅片，然后使生物探针分子，如DNA，RNA按特定的顺序修饰到基片上(目前商业上已达到将40万种不同的DNA分子有序的排列在1cm²上)。其次是待检测样品的处理，因为待检测的生物样品常常是一些生物分子的混合物，不能直接与芯片发生反应，所以一般来说需要将样品进行特定的生物处理，获取其中的DNA，蛋白质等靶分子。对于配对反应后的信号提取，现有如下几种方法：如同位素标记、荧光标记、表面等离子体共振(SPR)和X射线衍射等。特别是，由于受到现有芯片技术中所采用的检测方法的原理限制，还必须需对靶分子进行标记，其中以荧光素标记法或同位素标记法最为普遍。接着就是把准备好的待检测样品与生物芯片接触以触发探针分子与靶分子的反应，比如某个探针分子是一个单链DNA序列，靶分子恰好是与其配对DNA单链序列，那么二者就会发生配对杂交反应。反应完成后将生物芯片进行冲洗，与探针分子发生了特定生化反应的靶分子在探针分子的位置被留了下来，根据之前对靶分子的不同标记方式通过用激光扫描荧光显微镜，或同位素底片曝光的方法采集芯片上各个不同反应点的信号并经过相关软件分析图像便可得到有关的生物信息。

如上所述，现有的生物芯片技术在工作过程中必须对样品进行标记，这使得使用起来较为麻烦，而且标记本身可能对样品造成附加的影响，使得检测的结果难于分析。另外，现有的芯片技术得到的只是整个生化反应过程进行得的结果信息，没有对反应过程进行之信息的反映。

基于微悬臂梁的生化传感器是在原子力显微镜(AFM)出现后，迅速发展起来的一种新的传感技术。它的原理在于：一根经过表面化学处理后修饰了探针分子的微悬臂梁，当有生化反应在其表面发生时，比如待检测样品中的靶分子与微梁上的探针分子可发生生化反应时，微梁的表面应力(也就是表面能)会发生变化从而导致微梁产生弯曲变形，通过监测这种变形就可以知道整个生化反应进行过程的信息。

发明内容

本发明的目的是提供一种微悬臂梁阵列生物芯片。

本发明所提供的微悬臂梁阵列生物芯片，它包括由微悬臂梁组成的阵列，所述微悬臂梁单侧表面修饰有生物探针分子。

为了提高光学测量装置的探测灵敏度，所述微悬臂梁的游离端还连接有反光板。

该微悬臂梁阵列生物芯片可按常规方法在硅片或玻璃片基板(厚度可为200-1000μm)上用SiNx、SiO₂、Si等薄膜材料刻蚀制作而成，如用MEMS工艺制作。

所述微悬臂梁优选由变形梁、反光板和芯片框架构成。所述微悬臂梁的变形梁厚度可为0.1-2μm，长度可为40-1000μm，宽度大于等于20μm。芯片框架的厚度为基板厚度(200-1000μm)。

可按常规方法在微悬臂梁的单侧表面上修饰生物分子，如：首先，在蒸镀有20～50纳米厚Au的SiN_x微悬臂梁一侧表面上，利用巯基与Au的结合，将一端吸附有巯基(-HS)的生物分子吸附到微悬臂梁的镀金侧面，并通过self-assemble(自组装)过程最终形成分子刷(Milner，S.T.Science 1991，251，905)(图4中A)。

所述生物分子包括抗体、抗原、凝集素、糖、亲和素、生物素、受体、配体和DNA等生物探针分子。

本发明生物芯片中的微悬臂梁上的生物探针分子与待检测样品中的靶分子的相互作用可通过光学装置进行监测。还可以将样品注入前(微梁上的探针分子还未与样品中的靶分子发生生化反应)光学接收器10上采集到的微梁(微梁阵列)图像作为本底图像，与反应后的图象进行相减比较，凸显出发生了生化反应的微梁阵列位置和亮度，指示所对应的探针分子的生化反应。探针分子和靶分子的生化反应完成后不需要对生物芯片进行冲洗。检测时无需对待检测样品标记，消除了可能由标记产生的附加影响；可实现实时、并行的监测整个生化反应的发生过程，从而可以得到更丰富的生物信息；特别适用于难于标记示踪物，如萤光素或示踪同位素的被检测靶分子。

附图说明

图1是微悬臂梁阵列芯片和平行光照明方案的光学监测装置示意图。

图2是光学滤波单元(刀口形式)及其滤波原理。

图3是一个单元格中只有一根微悬臂梁的微悬臂梁阵列示意图。

图4是DNA双链杂交反应示意图。

图5是抗原——抗体特异性杂交反应示意图

图6是双变形梁的微悬臂梁阵列示意图。

图7是一个单元格中有复数根微悬臂梁的微悬臂梁阵列示意图。

图8是微悬臂梁阵列芯片及其放大图。

图9是图1的光学监测装置监测微悬臂梁阵列生物芯片上羊抗人IgM和人血清免疫球蛋白M(IgM)相互作用的结果。

具体实施方式

下述实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

图3显示的是微悬臂梁阵列的示意图。一个单元格中只有一根微悬臂梁。其微悬臂梁由变形梁14、反光板15和芯片框架16构成。矩形的反光板连接于微悬臂梁的游离端，用来增大有效的检测用反光面积。

图4显示的是修饰单链DNA探针的微悬臂梁单元与样品中的配对单链DNA靶分子发生杂交反应，引起微悬臂梁变形的示意图。

图5显示的是修饰有生物抗体分子的微悬臂梁单元与样品中的配对生物抗原分子发生特异性杂交反应，引起微悬臂梁变形的示意图。

待检测样品中的靶分子与微悬臂梁上的生物分子发生生化反应时，会导致微悬臂梁游离端的转角变化，在实际应用中，可将微悬臂梁转角变形信号，通过衍射谱滤波技术，转换为光学接收器上对应的微悬臂梁像的光强信号，根据光强信号的变化即可确定微悬臂梁上探针分子和靶分子的相互作用情况。

图6是微悬臂梁的变形梁为两根时的稳定支撑情况，这样的结构可以将与微悬臂梁连接的反光板的侧向偏转抑制，获取更好的效果。

图7是在一个支撑框架格中制作复数根的微梁，同一个框架格中的复数根微梁上修饰同一种生物探针分子，以概率的方式检测样品试剂中的生物靶分子。

微悬臂梁游离端的转角的变化可用如图1所示的光学装置检测。

图1给出了微悬臂梁阵列芯片和平行光照明方案的光学监测装置示意图。其中，微悬臂梁阵列芯片7安放于顶部透光的反应容器6中，通过与容器底部接触的恒温系统控制反应容器的温度，其温度稳定度为±0.01K。待检测样品通过蠕动泵经过流动控制系统12进出反应器。

光学监测装置由光学照明子系统、光学滤波子系统和光学成像子系统组成。光学照明子系统由光源1、光源滤波孔2、挡光板3、半透半反镜4和光源透镜5组成。光学滤波子系统由光学滤波单元8和傅立叶变换透镜13组成。光学成像子系统由成像透镜9和光学接收器10组成。

光源滤波孔2放置在光源1的后方(图中的右方)。光源滤波孔2正好位于光源透镜5的前焦点，光线被光源透镜5准直为平行光束，此平行光束被半透半反镜4反射的光线照射在微悬臂梁阵列7上，并被微悬臂梁阵列7反射。从微悬臂梁阵列7返回的衍射光线透过半透半反镜4，被傅立叶变换透镜13汇聚在其后焦平面上，形成微悬臂梁阵列7的光学衍射谱。光学滤波单元8放置在傅立叶变换透镜13的后焦平面上，并预先设置有通光区域以及不通光区域。衍射谱只有落在光学滤波单元8通光区域的部分才能经成像透镜9到达光学接收器10，并在光学接收器10上形成微悬臂梁阵列的可见光图像，落在光学滤波单元8不通光区域的部分被挡住，不能到达光学接收器10。微悬臂梁阵列在初始状态，其每一根微梁的反光板都取一个相同的初始角度。故在光学谱平面上相同的位置汇聚叠加成(微悬臂梁)微悬臂梁阵列的光学衍射谱，经光学滤波后成像形成(微悬臂梁)微悬臂梁阵列的可见光图像。

当样品注入放置有微悬臂梁阵列7的反应容器6内，样品中的靶分子与微悬臂梁上的探针分子发生生化反应并导致微悬臂梁产生转角变形时，相应地，从微悬臂梁阵列7上的反射返回的衍射光也产生一个偏转，表现在傅立叶变换透镜13后焦平面上就是一个衍射谱的平移。衍射谱的平移使它原来落在光学滤波单元8通光区域的一部分光线移入了光学滤波单元8的不通光区域(或者相反)，而被光学滤波单元8的不通光部分挡住(或者能够通过光学滤波单元8)。因此能够通过光学滤波单元8的光线将减少(或增多)，到达光学接收器10的光能减少(或增多)。反映在光学接收器10上就是可见光图像光强的减弱(或增强)。即接收到的可见光光强的变化就反映了生化反应发生的信息。在图1的示例中，虽然光学滤波单元8用刀口实现，但光学滤波单元8也可以通过狭缝或者矩形孔来实现。只是当光学滤波单元8用刀口实现时，接收到的可见光图像空间分辨率最高。至于物理上如何实现光学滤波单元8，可以用机械的方法制作刀口、狭缝和矩形孔。各部件的典型参数为：光源1用普通白光、激光等；光源滤波孔2的孔径为0.02-1mm；光源透镜5的焦距为50-100mm(或更小)；透镜13的焦距50-100mm(透镜数值孔径NA＝1，或更小)；刀口8可以采用不透光材料制作的刀片，刀刃处应尽量薄，达到微米量级(如5um)；成像透镜9的焦距5-100mm(透镜数值孔径NA＝1，或更小)。

图2给出了图1中傅立叶变换透镜13后焦平面上光学滤波单元8和衍射谱的相对位置关系。图2中A表示的是微悬臂梁未发生转角变形时，光学滤波单元8和衍射谱的相对位置关系；图2中B表示的是微悬臂梁发生转角变形后，光学滤波单元8和衍射谱的相对位置关系。在图2中，光学滤波单元的不通光区域由光学滤波单元8表示，定义的滤波边界由701表示。1801，1802和1803分别表示衍射谱18的0级、1级和2级。图2中没有画出更高级次的衍射光，是因为光能在更高的衍射级次上已经相当弱，对光学滤波已经没有太大的影响。微悬臂梁发生转角变形时，光学滤波单元8的初始位置位于衍射谱的零级，即衍射谱光强梯度最大的位置(见图2中A所示)。微悬臂梁发生转角变形后，其衍射谱的移动见图2中B所示。由于衍射谱的平移，其部分衍射光已经移出了通光区域进入不通光区域，相应地，光学接收器10上接收到的光强将变弱。由于各微悬臂梁的变形不同，所以转角也不同，其衍射谱的平移量也不相同，每个微悬臂梁单元的衍射谱通过光学滤波单元8通光区域光量变化也就不同，反映在光学接收器10上就是光强随转角变化，此时接收器上接收到的强度图像就是由于微梁上发生生化反应而导致的微梁变形的反映。也就是说，实时的“看到”了微悬臂梁阵列上所进行的生化反应。事实上，光学滤波单元不仅可以用图示中的刀口实现，也可以用狭缝或者矩形孔来实现。

实施例1、用图1的光学监测装置监测微悬臂梁阵列芯片上的抗体分子和抗原分子相互作用

1、微悬臂梁阵列芯片的制备

用MEMS工艺刻蚀制作如图3、图6或图7所示的微悬臂梁阵列芯片，其微悬臂梁由变形梁14、反光板15和芯片框架16构成。矩形的反光板连接于微悬臂梁的游离端，用来增大有效的检测用反光面积。

以SiNx材料制作微悬臂梁阵列芯片为例，制作工序例如下：首先在硅片衬底上直接生长出制作器件结构所需的SiNx薄膜，利用图形刻蚀法在SiNx薄膜上制作微悬臂梁阵列结构。然后从结构的上表面对微悬臂梁阵列中的变形梁和反光板蒸镀金膜，金膜厚20～50纳米。最后去除器件结构中框架以外部分的硅衬底，形成微悬臂梁阵列生物芯片。微悬臂梁的变形梁长200um，宽20um，厚1um。

该微悬臂梁阵列芯片及其放大图如图8所示，A为微悬臂梁阵列芯片，B和C为该微悬臂梁阵列芯片的放大图。该微悬臂梁阵列芯片中有两种不同结构的微梁单元。B中的放大图为不同梁长的双变形梁结构微悬臂梁单元，C中的放大图为不同梁长的单根变形梁结构微悬臂梁单元。阵列芯片上微梁数为(5×2)×(11×4)＝440。

2、人血清免疫球蛋白M(IgM)微悬臂梁阵列传感芯片的制备：

试剂：冻干羊抗人IgM诊断血清(单扩散效价1：140)，冻干人血清免疫球蛋白参考血清(含IgM：1.43g/L)。3-巯基丙酸(MPA)；盐酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

制备方法：将洁净的镀金微悬臂梁阵列芯片放人MPA溶液(99g/100mL)浸泡1h，取出用水冲洗，氮气干燥。再置于100g/L EDC和100g/L NHS的混合溶液(1∶1)活化1h，取出用蒸馏水洗去过量的EDC和NHS，氮气干燥。取IgM抗体(冻干羊抗人IgM诊断血清)10uL，用pH 6.1PBS缓冲溶液稀释至500uL，实验中每次取稀释后的抗体20uL，滴加于微悬臂梁阵列芯片镀金面上，在37℃恒温下温育45min。取出用PBS冲洗，之后将BSA 20uL滴加于微悬臂梁阵列芯片镀金面上，再在37℃恒温下温育1h，以封闭包被了抗体的微悬臂梁阵列芯片镀金面上非特异性吸附位点，取出后用蒸馏水洗净，制得用来检测人血清免疫球蛋白M(IgM)的微悬臂梁阵列生物芯片传感器。

3、用图1的光学监测装置监测微悬臂梁阵列生物芯片上羊抗人IgM和人血清免疫球蛋白M(IgM)的相互作用

图1的光学监测装置中，光源1为普通白光，光源滤波孔2的孔径为0.02mm；光源透镜5的焦距为50mm；傅立叶变换透镜13的焦距50mm(透镜数值孔径NA＝1)；刀口8采用不透光材料制作的刀片，刀刃处为5微米；成像透镜9的焦距50mm(透镜数值孔径NA＝1)。

具体的检测方法如下：

1)将该微悬臂梁阵列生物芯片安放于顶部透光的反应容器6中(37℃)，通过与容器底部接触的恒温系统控制反应容器的温度，其温度稳定度为±0.01K。

2)通过蠕动泵恒速控制PBS缓冲溶液(pH 6.1)流过容器，在光学监测装置中，通过观察微悬臂梁阵列反光板亮度，实时监测芯片微悬臂梁阵列变形。

3)待微悬臂梁阵列稳定后通过蠕动泵加入用PBS稀释的IgM溶液(20μg/ml)，实时监测微悬臂梁阵列变形。

4)待微悬臂梁阵列达到稳定后停止流动，结束实验。

5)提取出微梁阵列的变形信息，分析实验数据。

检测结果如图9所示，图9中，A为抗原抗体反应前，在光学监测装置中观察到的微悬臂梁阵列图像；B为抗原抗体反应后，在光学监测装置中观察到的微悬臂梁阵列图像。椭圆标记区域为微悬臂梁阵列位置，上一行为不同梁长的双变形梁结构微悬臂梁阵列，下一行为不同梁长的单根梁结构微悬臂梁阵列。

实施例1给出的是用微悬臂梁阵列检测一种抗原抗体。对于同时检测多种不同的抗原抗体，只需将不同的抗体，利用逐点喷涂的方法修饰到芯片上的不同微悬臂梁上，用上面的方法，检测不同的抗原。

实施例1给出的是利用本发明的芯片检测抗体和抗原的相互作用结果。利用本发明的芯片检测其他生物分子间的相互作用，如凝集素和糖、亲和素和生物素、受体和配体以及DNA分子之间的相互作用的方法与实施例1相同，检测效果也与

实施例1相同。

Claims (5)

1、微悬臂梁阵列生物芯片，它包括由微悬臂梁组成的阵列，所述微悬臂梁单侧表面修饰有生物探针分子。

2、根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于：所述微悬臂梁的游离端还连接有反光板。

3、根据权利要求2所述的生物芯片，其特征在于：所述微悬臂梁由变形梁、反光板和芯片框架构成。

4、根据权利要求3所述的生物芯片，其特征在于：所述微悬臂梁的变形梁厚度为0.1-2μm，长度为40-1000μm，宽度大于等于20μm；所述微悬臂梁的芯片框架的厚度为200-1000μm。

5、根据权利要求1至4中任一所述的生物芯片，其特征在于：所述生物探针分子包括抗体、抗原、凝集素、糖、亲和素、生物素、受体、配体和DNA。

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