CN108181488A - 一种基于核酸适配体的有机磷农药的微悬臂梁阵列检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于检测样品溶液中的有机磷农药的方法，所述方法包括以下步骤：将能够特异性结合有机磷农药的核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上；使固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列与样品溶液接触；检测固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列在与所述样品溶液接触后产生的弯曲变形。本发明还提供用于检测样品溶液中的有机磷农药的微悬臂梁阵列和系统。所述有机磷农药优选包括丙溴磷和甲拌磷。

Description

一种基于核酸适配体的有机磷农药的微悬臂梁阵列检测方法

技术领域

本发明涉及农药残留检测领域，特别是涉及一种基于表面应力效应微悬臂梁阵列传感器，使用适配体作为探针分子检测有机磷农药丙溴磷和甲拌磷。

背景技术

农药广泛应用于农业生产中，对农产品的各种病虫害的防治有非常重要的作用。在所有的农药中，有机磷农药作为一种高毒性的广谱杀虫剂，具有杀虫效率高、防治范围广和价格便宜等特点，在我国被广泛的应用于各种农作物和水果蔬菜等的生产中。但有机磷农药对人畜也有着很强的毒性，其农药残留对食品安全和环境的危害日益严重。目前有很多种检测农药残留的方法，常用的方法有气相色谱法、高效液相色谱法、酶抑制法和酶联免疫法等方法。气相色谱法和高效液相色谱法检测灵敏度高，但是所用仪器昂贵，样品需要复杂的预处理过程。酶抑制法简单，但灵敏度很低。酶联免疫法特异性强，灵敏度高，但是需要对分子进行标记，而标记过程繁杂并且可能影响分子活性。因此发展无标记、快速、灵敏度高、经济高效的农药残留检测方法是很有必要的，对食品安全领域具有重要意义。

基于表面应力效应的微悬臂梁传感技术是在原子力显微镜(AFM)的基础上发展起来的一种技术。在实验中，探针分子被修饰在微悬臂梁的表面。当目标分子与探针分子在微悬臂梁表面发生生物或者化学反应时，其表面应力会发生变化，从而导致微悬臂梁发生弯曲变形。通过光学或者电学方法检测这种弯曲变形，可以得到反应的信息。相比于传统的传感技术，微悬臂梁传感技术不需要分子标记，灵敏度高，响应快速，可以实时监测实验的全过程。

核酸适配体是一段DNA或者RNA的序列，通常可以通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从核酸分子文库中筛选得到。相比于常见的抗原-抗体的免疫反应，适配体也能够结合特定的分子，并且具有很高的亲和性和特异性。另外，适配体的化学稳定性远优于蛋白质，受环境因素影响小，易存储，合成方便，在合成过程中可以修饰需要的其他化学基团，价格便宜，同时灵敏度也极高，是检测小分子的理想探针分子。

在有机磷农药检测领域，微悬臂梁传感技术使用农药对应的抗体已有很多的研究，但是尚未有使用适配体作为探针分子在微悬臂梁传感平台进行检测的报道。

发明内容

在本发明中，发明人提出使用修饰有DNA适配体的微悬臂梁阵列对有机磷农药丙溴磷和甲拌磷进行检测，取得了很高的灵敏度和特异性，并且可以在蔬菜样品溶液环境中进行有效检测。

本发明提供了一种基于核酸适配体的微悬臂梁阵列传感器，可以对有机磷农药丙溴磷和甲拌磷进行实时定量检测，有很高的灵敏度和特异性，并且能够对实际样品进行检测，满足国家农药残留检测的标准。

为了解决有机磷农药的检测方法中的现有问题，本发明提出了基于DNA适配体的微悬臂梁阵列，利用微悬臂梁的高灵敏度和DNA适配体与丙溴磷或甲拌磷的特异性结合，进行实时快速检测，并且将此技术应用于蔬菜样品中有机磷农药丙溴磷和甲拌磷的检测。

为了实现该技术目标，主要的技术方案为：

1)微悬臂梁阵列的修饰

当DNA适配体和有机磷农药在微悬臂梁表面发生反应时，产生的应力变化会导致微悬臂梁的弯曲，原理如图1所示。为了达到检测的目的，我们需要将适配体固定在微悬臂梁的表面。

实验中使用的DNA适配体序列为5’-HS-(CH2)6-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’，在合成过程中修饰有巯基，可以与微悬臂梁的金层发生化学反应从而结合。我们将新的微悬臂梁阵列进行清洗，然后用适配体修饰微悬臂梁阵列，使适配体固定在微悬臂梁表面。在下一步中，我们使用MCH对微悬臂梁阵列再次修饰，MCH带有巯基，也可以与金表面发生反应。我们使用MCH与金表面的结合对微悬臂梁阵列金表面进行封闭。

2)使用微悬臂梁阵列对有机磷农药的检测

修饰好的微悬臂梁阵列固定在反应池中，缓冲液流入，以固定流速流动。激光照射在微悬臂梁的尖端，微悬臂梁尖端的弯曲会导致反射光的偏转，反射光由光电位置敏感器(PSD)接收，如图2所示。微悬臂梁阵列检测仪器示意图见图3。当微悬臂梁阵列在缓冲液中达到平稳状态后，有机磷农药溶液被加入反应池中。当加入的有机磷农药溶液流完后，缓冲液被加入反应池中。在整个实验过程中，微悬臂梁阵列的偏转情况被实时监测并记录。

本发明使用基于表面应力效应的微悬臂梁阵列，使用适配体作为探针分子来检测有机磷农药丙溴磷和甲拌磷，优点有

1)微悬臂梁阵列技术不需要荧光或者分子标记，操作简便。

2)微悬臂梁光学读出技术能检测很小的位移，并且适配体和有机磷农药的结合很高效，实验灵敏度高。

3)适配体与有机磷农药的结合具有很高的特异性，可以排除很多非特异性干扰。

4)在适配体的合成过程中，可以将巯基连接在适配体一端。相比已有的抗体修饰方法，微悬臂梁表面修饰适配体的过程只需一步，简便易行。

5)相比于抗体，适配体的合成简单，价格便宜，并且稳定性好，易于存储。

6)微悬臂梁阵列传感器可以对同一阵列中的不同微悬臂梁进行区别修饰，可以在实验中同时检测实验梁和对比梁的偏转，消除实验环境造成的不利影响。

更具体地，本发明提供以下各项：

1.一种用于检测样品溶液中的有机磷农药的方法，所述方法包括以下步骤：

将能够特异性结合有机磷农药的核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上；

使固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列与样品溶液接触；以及

检测固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列在与所述样品溶液接触后产生的弯曲变形。

2.根据1所述的方法，其中所述有机磷农药包括丙溴磷和甲拌磷。

3.根据1所述的方法，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5’-HS-(CH2)6-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGA AAAGGCTGAGAGCTACGC-3’。

4.根据1所述的方法，其中通过微悬臂梁传感系统检测所述弯曲变形，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。

5.根据1所述的方法，所述方法还包括在将所述核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上后用封闭剂对微悬臂梁阵列表面进行封闭的步骤。

6.根据5所述的方法，其中所述封闭剂是6-巯基1-己醇。

7.一种用于检测样品溶液中的有机磷农药的系统，所述系统包括表面固定有能够特异性结合有机磷农药的核酸适配体的微悬臂梁阵列、反应池和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器，优选地所述有机磷农药包括丙溴磷和甲拌磷。

8.根据7所述的系统，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5’-HS-(CH2)6-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’。

9.一种用于检测样品溶液中的有机磷农药的微悬臂梁阵列，所述微悬臂梁阵列表面固定有能够特异性结合有机磷农药的核酸适配体，优选地所述有机磷农药包括丙溴磷和甲拌磷。

10.根据9所述的微悬臂梁阵列，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5’-HS-(CH2)6-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’。

附图说明

图1是微悬臂梁表面DNA适配体和丙溴磷反应导致弯曲原理示意图。

图2显示微悬臂梁弯曲的光学读出原理。

图3是微悬臂梁阵列修饰过程和微悬臂梁阵列传感系统示意图。

图4显示不同浓度丙溴磷溶液中微悬臂梁阵列的平均偏转值。

图5显示不同浓度甲拌磷溶液中微悬臂梁阵列的平均偏转值。

图6显示不同浓度的丙溴磷蔬菜样品溶液中微悬臂梁阵列的平均偏转值

具体实施方式

实施例1、微悬臂梁阵列的修饰过程

实验1DNA适配体在微悬臂梁阵列上的修饰过程

1)清洗：将未使用的微悬臂梁阵列(购自德国Micromotive公司)置入酶标孔板中，加入Piranha Dip溶液(V(H₂O₂):V(H₂SO₄)＝1:3)中浸泡数分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干；

2)修饰适配体：清洗过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入DNA适配体溶液，培育2小时。然后以Tris-buffer(50mM NaCl,10mM KCl,10mM MgCl₂和50mM Tris-HCl,pH8.0)清洗，氮气吹干；

3)封闭：修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入6-巯基1-己醇(MCH，1mM)的酒精溶液中，培育1小时。然后以Tris-buffer清洗，氮气吹干。得到修饰好的微悬臂梁阵列。

实验2无DNA适配体的微悬臂梁阵列修饰过程

1)清洗：将未使用的微悬臂梁阵列(购自德国Micromotive公司)置入酶标孔板中，加入Piranha Dip溶液(V(H₂O₂):V(H₂SO₄)＝1:3)中浸泡数分钟，用去离子水冲洗，氮气吹干；

2)封闭：修饰过的微悬臂梁阵列置于酶标孔板中，加入6-巯基1-己醇(MCH，1mM)的酒精溶液中，培育1小时。然后以Tris-buffer清洗，氮气吹干。得到修饰好的微悬臂梁阵列。

实施例2、使用微悬臂梁阵列对有机磷农药的检测

实验1、使用微悬臂梁阵列对丙溴磷溶液的检测

1)固定微悬臂梁阵列：将微悬臂梁阵列固定于系统的反应池中，加入Tris-buffer流动液体排除反应池中的气泡。

2)调节系统光路：调节激光器、反应池与PSD(光电位置敏感器)的位置，使八根激光都能照射在微悬臂梁阵列的尖端并且反射在PSD的靶面中。

3)样品和缓冲液的加入：调整注射泵，以30μL/min的速度流动Tris-buffer。实时监测微悬臂梁阵列的偏转情况。当微悬臂梁阵列在Tris-buffer中稳定半小时后，加入2mL的丙溴磷溶液。经过65分钟，加入2mL的Tris-buffer。全程实时监控和采集微悬臂梁阵列的偏转数据。

改变实施例2实验1中丙溴磷溶液的浓度，分别为5、10、50、200和1000ng/mL，得到不同浓度下微悬臂梁阵列平均偏转的曲线(图4)。改变微悬臂梁阵列修饰过程，变为实施例1中实验2，得到数据见图4。

实验2、使用微悬臂梁阵列对甲拌磷溶液的检测

1)固定微悬臂梁阵列：将微悬臂梁阵列固定于系统的反应池中，加入Tris-buffer流动液体排除反应池中的气泡。

2)调节系统光路：调节激光器、反应池与PSD(光电位置敏感器)的位置，使八根激光都能照射在微悬臂梁阵列的尖端并且反射在PSD的靶面中。

3)样品和缓冲液的加入：调整注射泵，以30μL/min的速度流动Tris-buffer。实时监测微悬臂梁阵列的偏转情况。当微悬臂梁阵列在Tris-buffer中稳定半小时后，加入2mL的甲拌磷溶液。经过65分钟，加入2mL的Tris-buffer。全程实时监控和采集微悬臂梁阵列的偏转数据。

改变实施例2实验2中甲拌磷溶液的浓度，分别为10、20和100ng/mL，得到不同浓度下微悬臂梁阵列平均偏转的曲线(图5)。

实验3、使用微悬臂梁阵列对对硫磷溶液的检测

1)固定微悬臂梁阵列：将微悬臂梁阵列固定于系统的反应池中，加入Tris-buffer流动液体排除反应池中的气泡。

2)调节系统光路：调节激光器、反应池与PSD(光电位置敏感器)的位置，使八根激光都能照射在微悬臂梁阵列的尖端并且反射在PSD的靶面中。

3)样品和缓冲液的加入：调整注射泵，以30μL/min的速度流动Tris-buffer。实时监测微悬臂梁阵列的偏转情况。当微悬臂梁阵列在Tris-buffer中稳定半小时后，加入2mL的对硫磷溶液(200ng/ml)。经过65分钟，加入2mL的Tris-buffer。全程实时监控和采集微悬臂梁阵列的偏转数据。本实验结果见图4。

由图4、5中数据可得，当丙溴磷和甲拌磷的浓度增加时，修饰有适配体的微悬臂梁阵列的平均偏转随之增加，二者呈正相关。由图4可知，当微悬臂梁表面没有修饰适配体时，高浓度的丙溴磷溶液基本上没有引起偏转。当加入的溶液为另一种有机磷农药对硫磷时，修饰有适配体的微悬臂梁阵列也没有产生明显的响应。这些结果表明，微悬臂梁阵列产生的偏转主要是由于适配体和有机磷农药之间的特异性结合导致，并且基于适配体的微悬臂梁阵列传感器对检测丙溴磷等有机磷农药具有良好的特异性。此方法的检测极限很低，具有很高的灵敏度。

实施例3、蔬菜样品溶液的制备

选择韭菜作为蔬菜样品。取20g韭菜，剪碎，浸泡于100mL的Tris-buffer中，摇晃溶液2分钟，静置30分钟。然后使用滤纸(滤孔直径为30、10和5μm)对该溶液进行多次过滤，过滤得到的溶液作为样品液。向样品液中加入不同量的丙溴磷来配置不同浓度的丙溴磷蔬菜样品溶液。

改变实施例2实验1中加入的丙溴磷溶液，改为实施例3得到的丙溴磷蔬菜样品液，可以得到微悬臂梁阵列在实际样品中的检测结果(图5)。

由图中数据可得知，当丙溴磷的蔬菜样品溶液流入反应池时，所有的曲线会有一个迅速的响应。这个响应的原因很可能是蔬菜样品液制备过程中残留的杂质导致的。杂质与微悬臂梁阵列产生非特异性的吸附，并且杂质会影响反应池中溶液的折射率，都会导致这种快速的响应。而在缓冲液再次加入反应池后，随着缓冲液置换反应池中的蔬菜样品液，所有的曲线都有一定程度的恢复，符合对快速响应的推断。相比于实施例2中溶解于缓冲液的丙溴磷溶液，在丙溴磷的蔬菜样品溶液环境中，微悬臂梁阵列的平均偏转与实施例2中对应浓度基本保持一致。这说明基于适配体的微悬臂梁阵列传感器可以在蔬菜样品的环境中正常工作，可以用于实际样品的检测中。

Claims (10)

1.一种用于检测样品溶液中的有机磷农药的方法，所述方法包括以下步骤：

将能够特异性结合有机磷农药的核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上；

使固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列与样品溶液接触；以及

检测固定有所述核酸适配体的微悬臂梁阵列在与所述样品溶液接触后产生的弯曲变形。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机磷农药包括丙溴磷和甲拌磷。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5’-HS-(CH2)6-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’。

4.根据权利要求1所述的方法，其中通过微悬臂梁传感系统检测所述弯曲变形，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器。

5.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在将所述核酸适配体固定在微悬臂梁阵列上后用封闭剂对微悬臂梁阵列表面进行封闭的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述封闭剂是6-巯基1-己醇。

7.一种用于检测样品溶液中的有机磷农药的系统，所述系统包括表面固定有能够特异性结合有机磷农药的核酸适配体的微悬臂梁阵列、反应池和微悬臂梁传感系统，所述微悬臂梁传感系统包括激光器和光电位置敏感器，优选地所述有机磷农药包括丙溴磷和甲拌磷。

8.根据权利要求7所述的系统，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5’-HS-(CH2)6-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’。

9.一种用于检测样品溶液中的有机磷农药的微悬臂梁阵列，所述微悬臂梁阵列表面固定有能够特异性结合有机磷农药的核酸适配体，优选地所述有机磷农药包括丙溴磷和甲拌磷。

10.根据权利要求9所述的微悬臂梁阵列，其中所述核酸适配体是DNA适配体，其序列为5’-HS-(CH2)6-AAGCTTGCTTTATAGCCTGCAGCGATTCTTGATCGGAAAAGGCTGAGAGCTACGC-3’。