CN1868457A

CN1868457A - 一种苦参碱磁性微球的制备方法

Info

Publication number: CN1868457A
Application number: CN 200610019300
Authority: CN
Inventors: 刘小平; 王莹; 耿丹清; 陈芬芬
Original assignee: Wuhan University of Technology WUT
Current assignee: Wuhan University of Technology WUT
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2006-06-08
Publication date: 2006-11-29
Anticipated expiration: 2026-06-08
Also published as: CN100362984C

Abstract

本发明涉及一种含有治疗肝癌药物的磁性微球的制备方法。一种苦参碱磁性微球的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：1)、磁流体的制备：将FeCl₃、FeCl₂按摩尔比1－3∶1混合，加入蒸馏水，加入NaOH溶液或氨水至溶液体系pH≥8，加入油酸，加入HCl或HAC溶液至pH为7，得磁流体；2)、苦参碱磁性微球的制备：用质量浓度为0.5％－5％的醋酸溶液配制1－10mg/mL的壳聚糖溶液，用蒸馏水配制0.5－10mg/mL的多聚磷酸盐，取壳聚糖溶液，分别加入壳聚糖溶液体积0.02－0.15倍的磁流体和壳聚糖质量0.2－2倍的苦参碱，将壳聚糖溶液体积0.2－1倍的多聚磷酸盐注入到壳聚糖溶液，搅拌、分离、干燥即得苦参碱磁性微球。该方法可以获得磁定位与药物缓释功能的苦参碱磁性微球。

Description

一种苦参碱磁性微球的制备方法

技术领域

本发明涉及一种含有治疗肝癌药物的磁性微球的制备方法。

背景技术

我国的传统医学几千年来形成了自己独特的较为系统的肿瘤病因、病机理论，并积累了中草药抗癌、治癌的丰富经验，中草药在人类与肿瘤的斗争中发挥着巨大的作用。苦参碱(matrine)是从豆科槐属植物苦豆子苦参根中分离得到的生物碱，在众多的苦参类生物碱中以苦参碱的抗肿瘤活性最强。研究表明，苦参碱能抑制肿瘤细胞增殖、转移，诱导其凋亡、及向正常细胞分化，具有抗肿瘤的活性，对实验性肿瘤有抑制作用。

苦参碱的主要药理作用如下：

1)、保肝、护肝作用：苦参碱可减少肝细胞损伤，并促进其再生，改善肝脏微循环，以利胆红素的摄取、结合与排泄，从而达到抗炎、保肝扩肝以及退黄降酶的功效，最终使肝病理组织学得到明显改善；

2)、抗病毒：苦参碱对HBV-DNA的复制有明显的抑制作用，使肝炎患HBeAg转阴率达51％，抗HBc--lgM转阴率达50％；

3)、抗肿纤维化：主要通过保护肝细胞膜，抑制纤维化因子的释放，调控贮脂细胞(HSC)的功能等多个环节发挥抗肝纤维化的作用；

4)、双向调控免疫，有效改善病理性组织；

5)、抗肿瘤作用：主要通过抑制细胞膜上Na，k-ATP酶并激活腺苷酸环化酶，进而抑制肿瘤细胞生长作用；同时，苦参碱还可抑制肿瘤细胞与内皮细胞的粘附，从而减少肿瘤的转移等；

6)、毒理试验证实苦参碱对动物呼吸系统及心血管系统无明显影响，急性毒性LD50为64.4mg/kg。长期毒性试验未发现有毒理意义的病理损伤，致突变试验均为阴性，表明本品没有明显毒性。

临床应用：主要用来治疗癌症，病毒性肝炎，白细胞减少症等。

磁性靶向制剂是将药物与微粒铁磁性物质共同包裹于高分子聚合物载体中，采用体外磁场引导药物在体内定向移动和定位集中到靶部位的给药系统。主要用作抗癌药物的载体。它是近年来国内外大力研究的一种新型的靶向制剂，主要有磁性微球、磁性微囊、磁性乳剂、磁性纳米粒、磁性脂质体、磁性脂质微球、磁性片剂或胶囊剂等。

磁流体是借助于表面活性剂将强磁性超微粒子分散到液相中所得到的非常稳定且带有磁性的胶态溶液，它将固体的强磁性和液体的流变性巧妙地结合起来。目前较为成熟的磁流体制备方法包括：化学共沉淀法、机械研磨法、热分解法、火花电蚀法、还原法、电沉淀法、真空蒸镀法等。化学共沉淀法因具有操作简便、成本低、对设备要求不高等优点，是目前制备磁流体最常使用的方法。

60年代初国外首次提出将抗癌药物与磁性物质共包于或分散于载体(骨架)材料中，通过加热固化或交联固化形成磁性载药微球。磁性微球在足够的外加磁场作用下，可以引导负载药物在体内定向移动、定位、浓集。而微球作为靶向给药的载体，采用生物可降解的高分子物如白蛋白、聚乳酸、壳聚糖、聚乳酸聚乙醇酸共聚物等，将药物包裹或嵌入，制备出载药的微球或微囊。根据微粒的直径大小不同，可以被肺、肝、肾、脾等截留，从而实现生物物理靶向作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种苦参碱磁性微球的制备方法，该方法可以获得磁定位与药物缓释功能的苦参碱磁性微球。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种苦参碱磁性微球的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

1)、磁流体的制备：将FeCl₃、FeCl₂按摩尔比1-3∶1混合，加入FeCl₃和FeCl₂总质量30-100倍的蒸馏水，在40-80℃搅拌下加入NaOH溶液或氨水至溶液体系pH≥8，保温反应0.5-2h后加入FeCl₃和FeCl₂总质量1-2倍的油酸，反应1-3h后，加入HCl或HAC溶液至pH为7，反应0.5-2h后用蒸馏水洗涤即得磁流体；

2)、苦参碱磁性微球的制备：采用离子凝聚法制备苦参碱磁性微球，用质量浓度为0.5％-5％的醋酸溶液配制1-10mg/mL的壳聚糖溶液，用蒸馏水配制0.5-10mg/mL的多聚磷酸盐，取壳聚糖溶液，分别加入壳聚糖溶液体积0.02-0.15倍的磁流体和壳聚糖质量0.2-2倍的苦参碱，在高速搅拌下(500-1500r/min)，将壳聚糖溶液体积0.2-1倍的多聚磷酸盐注入到壳聚糖溶液，搅拌5-30min，离心分离微球，干燥即得粒径小(500-1500nm)、分布均匀的苦参碱磁性微球。

所述的NaOH溶液的浓度为0.5-3mol/L，氨水的浓度为1％-25％。

本发明采用壳聚糖作为靶向给药的载体，壳聚糖为阳离子聚合物，可与带负电荷的聚合物(多聚磷酸盐)相互作用形成聚电解质复合物，将药物包埋于复合膜内，制备成缓释微球，此过程简单。本发明采用离子凝聚法，采用静电引发物理交联避免在化学交联过程中引入有毒的试剂和不必要的影响。多聚磷酸盐(TPP)是多聚阴离子，能于阳离子的壳聚糖在静电作用下发生发应，在离子凝聚方法中，将多聚磷酸盐溶液逐滴滴入不断搅拌中的壳聚糖醋酸溶液，具有相反电荷的壳聚糖和多聚磷酸盐发生反应，壳聚糖即凝聚从溶液中沉淀出来形成微球。

苦参碱磁性微球兼具磁定位与药物缓释功能，其磁靶向定位作用确定了药物主要在病灶部位聚集，在体内循环时可使药物微球到达靶部位，实现靶向作用，减少了药物对正常细胞的毒副作用；并具有明显的缓释功能，可延长药物在体内的作用时间；苦参碱磁性微球也本身具有良好的生物体内相容性，对于细胞的毒性很小，细胞的生长受磁性微球的影响不大。

本发明的有益效果是：制备方法简单，通过纳米技术制备纳米磁流体(四氧化三铁纳米粒子)作为磁核，用壳聚糖包载苦参碱和磁流体制备成微球，从而制备出苦参碱靶向药物新剂型，具有较好的靶向(磁定位)及缓控释作用，能很好的发挥苦参碱的抗肿瘤作用，提高其抗肿瘤活性，同时最大限度的降低其毒副作用，使其成为真正的极具前途的抗肿瘤靶向给药系统新剂型。苦参碱磁性微球具有磁响应性强(原子吸收结果)、粒径小(500-1500nm)的特点。

本发明采用静脉滴注的形式，剂量与用法用量为每次以100mg(以苦参碱含量计)加入10％葡萄糖注射液500ml中滴注，一日1次，疗程为2周。滴注速度以每分钟约60滴为宜。

本发明制备的苦参碱磁性微球用于治疗肝癌。

附图说明

图1是离子凝聚法示意图

图2是苦参碱磁性微球的释放曲线图

图3是磁流体的粒径图

图4是实施例1的苦参碱磁性微球的粒径图

图5是磁流体显微镜照片

图6是苦参碱磁性微球显微镜照片

图7是磁流体的X-射线衍射图谱

图8是实施例2的苦参碱磁性微球的粒径图

图9是实施例3的苦参碱磁性微球的粒径图

图中：1-多聚磷酸盐溶液，2-搅拌器，3-壳聚糖溶液(含磁流体)，4-苦参碱磁性微球。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

实施例1：

一种苦参碱磁性微球的制备方法，它包括如下步骤：

1、磁流体的制备

用化学共沉淀法制备磁流体。称取2.703g FeCl₃·6H₂O与0.994g FeCl₂·4H₂O按照1∶2mol充分溶解在200mL二次蒸馏水里，超声脱气10min后，在搅拌和保温40℃的条件下，滴加2mol/L的NaOH溶液。当溶液pH值升高到6-7时，铁盐水解产生大量的黑色Fe₃O₄粒子，继续滴加NaOH至pH约11，在40℃下陈化30min，用注射器在5min内滴入5mL油酸，再继续2h后，用质量浓度为5％乙酸中和至pH＝7，用蒸馏水反复洗涤，并以1000r/min的速度离心10min除去较大颗粒，即得到稳定的磁流体。

2、苦参碱磁性微球的制备：

如图1所示，离子凝聚法。用质量浓度为1.5％的醋酸溶液配制4mg/mL的壳聚糖溶液，用蒸馏水配制1mg/mL的多聚磷酸钠，取10mL的壳聚糖溶液，分别加入0.5mL磁流体和40mg苦参碱，在高速搅拌下(1000r/min)，将5mL的多聚磷酸盐注入到壳聚糖溶液，搅拌10min，离心分离微球(将制备的磁性微球分离出来)，-80℃冷冻干燥即得粒径小(平均粒径为682.4nm)、分布均匀的苦参碱磁性微球。

苦参碱磁性微球的释放曲线：

参照中国药典2005年版附录XI X D体外药物释放度试验项下测定，取苦参碱磁性微球0.1g，置药物溶出度仪(RCZ-6C型，上海)中，分别于0.5、1、2、4、6、8、18小时取5mL溶液，并及时补充溶剂；用紫外分光光度计(760CRT，上海)在波长215nm处测定苦参碱含量，结果见表1；并根据测定结果绘制释放曲线，见图2；结果显示，苦参碱磁性微球呈缓慢释放。

表1

时间(h)

0.5

1

2

4

6

8

18

累计释放量(mg)

0.929

1.402

2.419

3.395

4.105

4.954

6.114

磁流体和苦参碱磁性微球粒径分布：

将磁流体和苦参碱磁性微球稀释到50倍，用Zetasizer3000HSA激光粒度测试仪(英国Malvern)测试其粒径分布，如图3、图4所示，磁流体的平均粒径为152.2nm，分布均匀，苦参碱磁性微球的平均粒径为682.4nm，分布均匀。

磁流体和苦参碱磁性微球的表面形貌：

用E200型Nikon ECLIPSE生物显微镜分别观察磁流体和苦参碱磁性微球的表面形貌。图5为磁流体的显微镜照片，如图5所示，磁流体分布均匀，未发生团聚；图6为苦参碱磁性微球显微镜照片，如图6所示，苦参碱磁性壳聚糖呈球形，形状规整，分布均匀，未产生团聚和絮凝。

磁流体X-射线衍射试验：

取100mL磁流体，冷冻干燥后，取粉末进行X-射线衍射试验，测试条件为：岛津XRD-6000型X-射线衍射仪；扫描方式：定性，步进扫描；电压/电流：40kV/30mA；扫描速度：4.0000deg/min；步长：0.02°(2θ)；预置时间：0.3s；靶：Cu靶；扫描范围：(2θ)10-60°。结果如图7所示，其特征峰与Fe₃O₄标注卡特征峰吻合。

苦参碱磁性微球中铁含量的定量测定：

采用WFX-110原子吸收分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)测定苦参碱磁性微球中铁的含量。分析条件：用空气乙炔加热方式对待测元素进行原子化。仪器工作参数：波长：248.3nm；光谱通带宽：0.2nm；灯电流12mA；空气流量10L/min；乙炔流量3L/min。

从表2可以看出磁性微球中的含量为26.38％。

表2苦参碱磁性微球的原子吸收检测结果

样品名称	色泽	含量/mg.Kg^-1	百分率％	铁的含量％
样品名称	色泽	含量/mg.Kg^-1	百分率％	铁的含量％	苦参碱磁性微球	褐色	191290.42	19.1％	26.38％

苦参碱磁性微球增强抗肿瘤效应实验研究

1实验材料

1.1实验动物

昆明种小鼠，体重20～25g，雌雄兼有。由湖北省医学科学院动物中心提供。符合三级实验动物质量标准。

1.2药物

苦参碱磁性微球(MCSM)，自制；环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，上海华联制药有限公司。

1.3动物移殖性肿瘤

小鼠S180，武汉大学中国典型培养物保藏中心。

2方法与结果

取生长好的昆明种小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水稀释，调整浓度为1×107/ml，经胎盼蓝染色，证实获细胞率95％，每只小鼠腋皮下注射0.2ml，随机分组，设生理盐水(NS)对照组、环磷酰胺(CTX)阳性对照、苦参碱磁性微球(MCSM)设高、中、低三个剂量组，分别为100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，次日起腹腔注射给药，隔日1次，连续16天，解剖取瘤体、胸腺、脾脏，称重，计算抑瘤率，根据以下公式判定结果：

肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％

试验结果表明，苦参碱磁性微球中剂量组对小鼠S180的抑瘤作用有明显的增效，抑瘤率达56.12％，结果见表3

表3苦参碱磁性微球对小鼠S180的作用(X±S)

组别	剂量	动物数	瘤重(g)	胸腺重(mg)	脾重(mg)	抑瘤率(％)
组别	剂量	动物数	瘤重(g)	胸腺重(mg)	脾重(mg)	抑瘤率(％)	NS	-	10	2.14±0.59	28.43±6.49	39.57±6.34
CTX	0.10	10	1.42±0.48	35.68±6.81	45.26±10.16	33.64	NS	-	10	2.14±0.59	28.43±6.49	39.57±6.34
CTX	0.10	10	1.42±0.48	35.68±6.81	45.26±10.16	33.64	MCSM	0.10	10	1.18±0.52	39.34±5.76	48.51±9.28	44.86
0.05	10	1.40±0.43	36.58±6.23	46.72±10.41	34.58			0.10	10	1.18±0.52	39.34±5.76	48.51±9.28	44.86
0.05	10	1.40±0.43	36.58±6.23	46.72±10.41	34.58	0.025		10	1.70±0.54	32.29±8.62	43.24±8.59	20.56

结果表明，苦参碱磁性微球高剂量有明显的增强抗瘤效应，与同剂量的CTX相比(p＜0.05)，中剂量与CTX相比(p＞0.05)，低剂量增强抗瘤效应不明显，与生理盐水相比仍有抗瘤效应(p＜0.05)；同时实验发现，瘤重与胸腺、脾重负相关，瘤重越小，胸腺、脾重越大，反之，瘤重越大，胸腺、脾重越小。

实施例2：

一种苦参碱磁性微球的制备方法，它包括如下步骤：

1)、磁流体的制备：将FeCl₃、FeCl₂按摩尔比1∶1混合，加入FeCl₃和FeCl₂总质量30倍的蒸馏水，在40℃搅拌下加入浓度为0.5mol/L NaOH溶液至溶液体系pH＝8，保温反应0.5h后加入FeCl₃和FeCl₂总质量1倍的油酸，反应1h后，加入HCl溶液至pH为7，反应0.5h后用蒸馏水洗涤即得磁流体；

2)、苦参碱磁性微球的制备：采用离子凝聚法制备苦参碱磁性微球，用质量浓度为0.5％的醋酸溶液配制1mg/mL的壳聚糖溶液，用蒸馏水配制0.5mg/mL的多聚磷酸盐，取壳聚糖溶液，分别加入壳聚糖溶液体积0.02倍的磁流体和壳聚糖质量0.2倍的苦参碱，在高速搅拌下(500r/min)，将壳聚糖溶液体积0.2倍的多聚磷酸盐注入到壳聚糖溶液，搅拌5min，离心分离微球，干燥即得粒径小(平均粒径为685.2，如图8所示)、分布均匀的苦参碱磁性微球。

实施例3：

一种苦参碱磁性微球的制备方法，它包括如下步骤：

1)、磁流体的制备：将FeCl₃、FeCl₂按摩尔比3∶1混合，加入FeCl₃和FeCl₂总质量100倍的蒸馏水，在80℃搅拌下加入浓氨水至溶液体系pH＝14，保温反应2h后加入FeCl₃和FeCl₂总质量2倍的油酸，反应3h后，加入HAC溶液至pH为7，反应2h后用蒸馏水洗涤即得磁流体；

2)、苦参碱磁性微球的制备：采用离子凝聚法制备苦参碱磁性微球，用质量浓度为5％的醋酸溶液配制10mg/mL的壳聚糖溶液，用蒸馏水配制10mg/mL的多聚磷酸盐，取壳聚糖溶液，分别加入壳聚糖溶液体积0.15倍的磁流体和壳聚糖质量2倍的苦参碱，在高速搅拌下(1500r/min)，将壳聚糖溶液体积1倍的多聚磷酸盐注入到壳聚糖溶液，搅拌30min，离心分离微球，干燥即得粒径小(平均粒径为1282.9nm，如图9所示)、分布均匀的苦参碱磁性微球。

Claims

1.一种苦参碱磁性微球的制备方法，其特征在于它包括如下步骤：

2)、苦参碱磁性微球的制备：采用离子凝聚法制备苦参碱磁性微球，用质量浓度为0.5％-5％的醋酸溶液配制1-10mg/mL的壳聚糖溶液，用蒸馏水配制0.5-10mg/mL的多聚磷酸盐，取壳聚糖溶液，分别加入壳聚糖溶液体积0.02-0.15倍的磁流体和壳聚糖质量0.2-2倍的苦参碱，在高速搅拌下，将壳聚糖溶液体积0.2-1倍的多聚磷酸盐注入到壳聚糖溶液，搅拌5-30min，离心分离微球，干燥即得粒径为500-1500nm、分布均匀的苦参碱磁性微球。