CN1851522A - 激光扫描共聚焦显微镜扫描畸变现象的全场校正方法 - Google Patents

Abstract

激光扫描共聚焦显微镜扫描畸变现象的全场校正方法，采用标准光栅试件，用LSCM扫描云纹方法得到扫描云纹图像，再通过云纹相移技术对原始图像进行四步相移处理得到相移云纹图像，根据云纹相移理论由相移得到的云纹图得出相位图，解包裹后得到原始相位图，根据相位和位移场的关系得到扫描畸变场，从而达到校正的目的。本发明同现有方法作比较，有如下显而易见的突出特点和显著优点：本发明通过扫描云纹和云纹相移技术，将扫描控制单元的畸变现象引起的扫描线的畸变场直接测量出来。具有精度高、操作简单、实时测量且可进行全场测试等特点。

Description

激光扫描共聚焦显微镜扫描畸变现象的全场校正方法

技术领域

本发明涉及一种激光扫描共聚焦显微镜的全场校正技术。

背景技术

随着科学技术的飞速发展，高图像分辨率的显微镜成为科学工作者进行科研的有效工具。20世纪80年代发展起来的激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscopy-LSCM)是当今生物学的研究领域中的一种先进的图像采集和分析仪器，被广泛应用于生物学的各个领域，如：细胞骨架研究、生理生化研究、基因定位及染色体三维作图、胚胎学研究、植物学研究等等。传统的光学显微镜由于衍射极限的限制其空间分辨率受到了限制，而激光扫描共聚焦显微镜利用激光作为照明光源，在传统的光学显微镜的基础上采用了共轭聚焦的原理和扫描成像装置，大大提高了其空间分辨率，同时由于系统是在光学显微镜基础上设计完成的因此其对工作环境无特殊要求，相比其他高分辨率显微镜其测量过程的相对简单。

激光共聚焦扫描显微镜是由光学系统、电子控制系统及软件系统三个子系统构成，其工作原理如附图1所示，激光器3发出的照明激光束经过分光镜4和扫描镜5后由显微镜6会聚在位于物镜焦点的试样7上，试样表面的被激光照射的点会反射出沿各个方向的光线，其中一部分光线经显微镜、分光镜后再通过检测针孔光栏2，由检测器1接收，形成试样表面被激光照射点的图像。在激光束扫描过程中，只有显微物镜的焦平面上被激光扫描的点反射出的光线能够到达检测器，其它位置发出的光线均被检测针孔光栏阻挡，这种阻挡非焦面光线干扰的共焦成像方式能得到更高的成像质量。通过旋转安装在电机上的扫描镜可将激光点在试样表面沿X、Y方向逐点扫描，从而得到一幅待测试样表面的扫描图像。

LSCM的扫描过程主要是通过电子控制系统来控制两块扫描镜来完成扫描，形成平面扫描图像系统。作为激光共聚焦显微镜的核心部件，要求扫描速度快且无扫描畸变。实际的系统中扫描镜是采用步进电机驱动，步进电机在使用中其可控角是以步为单位的，即其角度是跳跃式变化的，且每一个步长也并非完全相等，因此在这种高精度的控制条件下会产生转角误差。这种误差就会引起扫描控制单元的畸变，最终导致扫描图像出现畸变。

因此我们必须对这种畸变进行校正，由于这种畸变的产生主要是由于步进电机驱动过程中的误差引起的，所以目前传统的方法都是从步进电机角度入手，对步进电机的误差进行修正或者消除。传统的步进电机的误差的校正方法有：采用高精度的步进电机，根据要求精度可以尽量选用精度高误差小的步进电机，来降低系统的畸变现象，但是这种方法并没有根除步进电机的误差只是通过采用高精度的步进电机来降低误差出现的几率；设计高精度的控制电路来控制步进电机的误差，常见的如细分驱动方式，通过减小步进电机的步长来减小步长不均匀所引起的误差，但是这种方法也有其局限性，即在高速转动中电机的步距的不均匀性会引起很高的振动，导致系统的不稳定性，因此采用这种方法会降低扫描的速度；现在最有效最常用的办法就是对电机进行闭环控制，通过电路控制来得到一个补偿电流，通过在原始电流基础上增加这个补偿电流来实现对电机误差的控制，此方法在实现起来相对复杂，需要复杂的电路设计，同时对误差的修正只能是一种离线状态的修正，其电路一旦设计完成，就不可再改变，因此不能处理在工作状态下复杂的误差现象，而且这种校正更多的是一种平均化的结果，无法实现逐点全场的校正。

上述方法只能在一定限度内消除误差，但是对这种误差的量化就束手无策，同时采用的方法也多为离线的修正，不能在实际工作状态下校正，因此在实际扫描过程中尤其是高速扫描的过程中这种图像畸变现象无法得到修正。

发明内容

本发明的目的在于提供一种激光扫描共聚焦显微镜中扫描畸变的全场的校正方法，即通过扫描云纹和云纹相移技术，将激光扫描共聚焦显微镜中的扫描畸变场直接测量出来，实现激光扫描共聚焦显微镜中扫描畸变的校正，消除LSCM图像的特征扭曲。

本发明所采用的技术方案如下：一种激光扫描共聚焦显微镜扫描畸变现象校正方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

a.根据标准一维光栅样品栅距p_s和激光扫描共聚焦显微镜扫描所使用的扫描线数N，按照公式 (l是云纹条数)计算形成扫描云纹时所需要的扫描区域L的大小；

b.在待标定激光扫描共聚焦显微镜中按步骤a计算出的扫描区域对标准一维光栅样品进行扫描，并形成扫描云纹，记录云纹图像；

c.利用激光扫描共聚焦显微镜中的载物台对光栅样品做平移使样品发生p_s/4，p_s/2，3ps/4的位移量，使得记录下来的云纹条纹的光强函数的相移量为π/2，π，3π/2，记录下各个相位下的云纹图像；

d.根据云纹相移方法的理论，用各幅图像中的光强函数计算出第一幅云纹图的相位函数；

e.由步骤d得到的相位函数画出相位图；

f.对步骤e得到的相位图作解包裹处理得到原始的相位图和相位函数；

g.根据上边得到相位函数(x)，由云纹方法的原理，按照公式 求出

样品的位移场v(x，y)，该位移场v(x，y)就是所需要求的激光扫描共聚焦显微镜中扫描控制单元的畸变场

本发明同现有方法相比，具有以下优点及突出性效果：本发明通过扫描云纹和云纹相移技术，将激光扫描共聚焦显微镜中的扫描畸变场直接测量出来。具有精度高、操作简单、实时测量且可进行全场测试等特点。

附图说明

图1为激光扫描共聚焦显微镜的工作原理图。

图2为理想情况下的扫描云纹示意图。

图3为扫描畸变现象示意图。

图4为一维标准光栅样品在LSCM中形成的扫描云纹图。

图5为通过云纹相移方法求得的相位图。

图6为对图5解包裹后的相位图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的原理和具体实施方法作进一步的说明。

为达到上述发明目的。本发明需采用一维标准光栅试件，用LSCM扫描云纹方法得到扫描云纹，再通过云纹相移方法得出全场区域的位移场信息，从中提取出扫描控制单元的畸变信息，从而达到校正的目的。扫描云纹方法是基于传统云纹方法原理的一种在高倍显微镜中实现的几何云纹方法，主要原理是在样品表面通过刻蚀或者转移光栅的方法形成一块试件栅，同时由于显微镜的扫描线是按照一定的规律逐行扫描，因此在快速的扫描过程中会在试件表面形成一块参考栅，两块栅叠加就会形成几何云纹，通过传统的云纹公式就可以得到样品的变形情况。云纹相移技术是通过移动试件栅或者参考栅来使得云纹条纹的光强中的相位发生变化，通过多步相移得到的云纹条纹来一次求解出光强函数中的相位，由于样品的变形与相位有关，就可以得到样品的变形信息。

在本发明中，我们采用光栅样品作为参考栅，扫描线所形成的虚栅作为试件栅，在没有扫描控制单元的畸变现象引起的扫描畸变的时候，得到的云纹条纹应该为完全水平的等宽度的条纹，如图2所示。而由于扫描畸变现象，在实际扫描中扫描线形成的虚栅会出现扭曲的现象，如图3所示(虚线为正常的扫描线，实线为发生畸变后的扫描线)。我们以这种扭曲的虚栅作为变形后的试件栅，认为无畸变影响的虚栅为变形前的试件栅，所以变形场实际上就是扫描线的畸变场，也就是我们需要校正的扫描控制单元的畸变现象。

采用的光栅样品其栅距为p_s，空间频率为f_s。扫描区域的长度为L，扫描线数为N，则根据云纹方法的原理在观察区域出现两条云纹条纹时有应变 ${\mathrm{\ϵ}}_y=\frac{p_s}{L},$ 由上式就可以得到

进一步可知，当扫描区域内有条纹出现时各参量之间应满足

其中l是云纹条数，由前面的等式根据ps值和扫描线数N，就可以确定扫描区域的大小。

图4所示为根据上边计算结果调整LSCM参数最终得到的云纹条纹图，此云纹条纹的光强函数可以表示为I(x，y)＝I₀(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+δ]}，其中I₀(x，y)是背景光强，b(x，y)是交流光强分布，(x，y)是相位函数，δ为相移量。通过在LSCM中调整样品台的位置使光栅

样品发生p_s/4，p_s/2，3p_s/4的位移量，由云纹的透射函数的关系可以知道，当光栅样品发生上述位移时，云纹条纹场的光强函数的相位发生π/2，π，3π/2得相移量。初始的云纹条纹的相移量为0，则得到的4幅云纹条纹图的条纹光强函数分别为：

I₁(x，y)＝I₀(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)]}

I₂(x，y)＝I₀(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+π/2]}

I₃(x，y)＝I₀(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+π]}

I₄(x，y)＝I₀(x，y){1+b(x，y)cos[(x，y)+3π/2]}

联立上述方程可以解出相位函数

上边求得的相位函数(x)其取值区间在[-π，+π]之间的相位图如图5所示，对求得的该相位图进行解包裹得到实际的通过灰度变化表示的相位图，如图6所示。

由云纹方法的原理知道，相位函数和变形场之间存在着对应关系

其中v(x，y)为位移场。因此通过相位函数就求出变形场，此变形场就是我们所需要校正的扫描控制单元的畸变现象所引起的畸变场。到此就完成了对激光扫描共聚焦显微镜的扫描控制单元的畸变形象的全场校正。

Claims (1)

1.一种激光扫描共聚焦显微镜扫描畸变现象校正方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：

a.根据标准一维光栅样品栅距p_s和激光扫描共聚焦显微镜扫描所使用的扫描线数N，按照公式L＝p_s(N(l-1))计算形成扫描云纹时所需要的扫描区域L的大小，l是云纹条数；

b.在待标定激光扫描共聚焦显微镜中按步骤a计算出的扫描区域对标准一维光栅样品进行扫描，并形成扫描云纹，记录云纹图像；

c.利用激光扫描共聚焦显微镜中的载物台对光栅样品做平移使样品发生p_s/4，p_s/2，3p_s/4的位移量，使得记录下来的云纹条纹的光强函数的相移量为π/2，π，3π/2，记录下各个相位下的云纹图像；

d.根据云纹相移方法的理论，用各幅图像中的光强函数计算出第一幅云纹图的相位函数；

e.由步骤d得到的相位函数画出相位图；

f.对步骤e得到的相位图作解包裹处理得到原始的相位图和相位函数；

g.根据上边得到相位函数(x)，由云纹方法的原理，按照公式

求出样品的位移场v(x，y)，该位移场v(x，y)就是所求的激光扫描共聚焦显微镜中扫描控制单元的畸变场。

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