CN1849392A - 改善了底物特异性的依赖吡咯并喹啉苯醌(pqq)的葡萄糖脱氢酶变体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种改善了底物特异性和比活性的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)，该酶的检测采用以铁氰化物离子为介体的检测系统。通过在依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶分子中特定区域引入氨基酸突变而改善了它的底物特异性，以及在野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶分子的氨基酸序列中，通过缺失，置换或添加1个或多个氨基酸，使该酶在采用以铁氰化物离子为介体的检测系统中比野生型酶更高的比活性。
Description
技术领域
本发明涉及改善了底物特异性的葡萄糖脱氢酶(本专利中葡萄糖脱氢酶写作GDH)的变体，具体涉及以吡咯并喹啉苯醌(本专利中吡咯并喹啉苯醌写作PQQ)为辅酶的修饰的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶(本专利中依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶写作PQQGDH)，它的制造方法和葡萄糖传感器。
本发明也涉及以铁氰化物离子为介体的检测系统中提高野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶比活性的方法。
本发明还涉及以铁氰化物离子为介体的检测系统中提高了比活性的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，它的制造方法，以及使用它的葡萄糖检测试剂盒和葡萄糖传感器。
本发明之修饰的PQQGDH可以在临床实验室检验或食品分析中用于葡萄糖定量。
背景技术
PQQGDH是以吡咯并喹啉苯醌为辅酶的葡萄糖脱氢酶。由于它催化葡萄糖氧化生成葡糖酸内酯，可以用于测定血糖。血中葡萄糖浓度是糖尿病的重要标志，因而在临床诊断上是极为重要的指标。目前血中葡萄糖浓度的测定，主流方法是利用葡萄糖氧化酶的生物传感器法，但该反应受到溶解氧浓度的干扰，测定值有可能产生误差。因而代替葡萄糖氧化酶的的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶受到重视。
本小组发现鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)NCIMB11517菌株产生依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶，构建了基因克隆和高表达系统(参见专利文献1)。依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶比起葡萄糖氧化酶来在底物特异性方面存在问题。
专利文献1：公开特许平11-243949号公报
同时，在将依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶用于生物传感器时，一般采用以铁氰化物离子为介体的血糖的检测系统。在其试纸片上，由于酶溶解在待检测的血液标本中，而血液比水或作为溶剂的其它通用试剂的粘度更高，溶解性较差，所以希望添加到试纸片上的酶量，即蛋白质量尽量少些。为此，我们试图获得提高每单位蛋白质中酶活性，即依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的比活性。
在以铁氰化物离子为介体的检测系统中，提高了比活性的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶变体尚无报道。
附图简述
图1：表示Q76N，Q76E，Q168I，Q168V，Q76T，Q76M，Q168A，野生型，Q76G，Q76K的最适pH测定结果。横坐标为pH，纵坐标为比活性。图中黑圆点(乙酸)是在含有0.22％Triton-X100的50mM乙酸缓冲液(pH3.0～6.0)中测定酶活性的结果。同样，黑方块(PIPES)是在含有0.22％Triton-X100的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.0～7.0)，黑三角(K-PB)是在含有0.22％Triton-X100的50mM磷酸缓冲液(pH5.0～8.0)，黑菱形(Tris-HCl)是在含有0.22％Triton-X100的Tris盐酸缓冲液(pH7.0～9.0)中分别测定酶活性的结果。测定值是以最高活性为100％表示的相对值。
图2：表示确认Q76K定量葡萄糖性能的结果。横坐标为同一水平的系列稀释值，纵坐标为葡萄糖浓度的测定值(mg/dl)。
图3：表示确认Q76K对麦芽糖作用性能的结果。横坐标为添加的麦芽糖浓度(mg/dl)，纵坐标为以麦芽糖加入浓度为0时作为100％表示的相对％。图中黑三角表示以100mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况，黑菱形表示以300mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况。
图4：表示确认Q76E对麦芽糖作用性能的结果。横坐标为添加的麦芽糖浓度(mg/dl)，纵坐标为以麦芽糖加入浓度为0时作为100％表示的相对值。图中黑三角表示以100mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况，黑菱形表示以300mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况。
图5：表示确认Q168V对麦芽糖作用性能的结果。横坐标为添加的麦芽糖浓度(mg/dl)，纵坐标为以麦芽糖加入浓度为0时作为100％表示的相对值。图中黑三角表示以100mg/dl葡萄糖为本底倍增的麦芽糖浓度，黑菱形表示以300mg/dl葡萄糖为本底倍增的麦芽糖浓度时分别测定的结果。
图6：表示确认Q168A对麦芽糖作用性能的结果。横坐标为添加的麦芽糖浓度(mg/dl)，纵坐标为以麦芽糖加入浓度为0时作为100％表示的相对值。图中黑三角表示以100mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况，黑菱形表示以300mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况。
图7：表示确认野生型酶对麦芽糖作用性能的结果。横坐标为添加的麦芽糖浓度(mg/dl)，纵坐标为以麦芽糖加入浓度为0时作为100％表示的相对值。图中黑三角表示以100mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况，黑菱形表示以300mg/dl葡萄糖为本底添加麦芽糖的情况。
发明的公开
本发明要解决的问题
本发明涉及在已有技术基础上，以改良PQQGDH底物特异性为要解决的问题。
同时，是在采用铁氰化物离子为介体的检测系统中，以获得相对于野生型酶有更高的比活性的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶为要解决的问题。
解决问题的方法
为了解决上述问题，本发明进行了广泛的研究，使在PQQGDH特定区域引入氨基酸突变而提高底物特异性成为可能。
本发明的发明人通过在野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列中引起一个或多个氨基酸缺失，置换或添加而在采用铁氰化物离子为介体的检测系统中，得以使依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的比活性比野生型酶更高，从而完成了本发明。本发明涉及：
【第1项】
对双糖的作用比野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)更低的修饰的PQQGDH。
【第2项】
比野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)稳定性更好的上述第1项所述修饰的PQQGDH。
【第3项】
通过在野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的氨基酸序列中引入一个或多个氨基酸缺失，置换或添加而使该酶在采用铁氰化物离子为介体的检测系统中比野生型有更高比活性的方法。
【第4项】
通过上述第3项所述方法制备的修饰依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)，在采用以铁氰化物离子为介体的检测系统中较之野生型有更高比活性。
【第5项】
编码上述第1项或第3项所述修饰的PQQGDH的基因。
【第6项】
含有第5项所述的基因的载体
【第7项】
用第6项所述载体转化的转化子
【第8项】
制备修饰的PQQGDH的方法，其特征是培养第7项所述的转化子。
【第9项】
含有第1项或第3项所述的修饰PQQGDH的葡萄糖检测试剂盒
【第10项】
含有第1项或第3项所述的修饰PQQGDH的葡萄糖传感器
【第11项】
含有第1项或第3项所述的修饰PQQGDH的葡萄糖测定方法
本发明的效果
采用本发明获得的修饰PQQGDH是对双糖的活性比野生型PQQGDH更低的酶。采用本发明获得的修饰PQQGDH应用于葡萄糖检测试剂盒和葡萄糖传感器上，有可能具有比应用野生型PQQGDH更高精确度，并能够提供稳定性更好的葡萄糖检测试剂盒和葡萄糖传感器。
另外，采用本发明获得的修饰依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶比活性更高，因而应用于葡萄糖检测试剂盒和葡萄糖传感器时可以减少酶的添加量而廉价制造。
本发明的最佳实施方式
下面，对本发明进行更详细的说明。
本发明中的修饰PQQGDH是对双糖的活性比野生型PQQGDH更低的酶。
对双糖的活性是指对双糖的脱氢作用。双糖有诸如麦芽糖，蔗糖，乳糖，纤维二糖等，特别以麦芽糖为例。在本发明中，对双糖活性的降低也同时说明底物特异性增强。
按下述方法判别其对双糖的活性是否被降低。
在下述试验例1中所述的活性测定法中，用野生型PQQGDH，以D-葡萄糖为底物溶液测定PQQGDH活性值(a)，并用双糖代替D-葡萄糖为底物溶液测定PQQGDH活性值(b)，以D-葡萄糖为底物时的测定值为100，求出相对值((b)/(a)×100)。然后用修饰PQQGDH进行相同操作，由比较二者的测定值来进行判断。
如果本发明修饰的PQQGDH对二糖的活性比野生型PQQGDH的低，则其被包括在本发明的修饰的PQQGDH中，而不管对葡萄糖的作用是否增加，不变或降低。
本发明的修饰PQQGDH，含有在测定葡萄糖浓度时对双糖的活性比用野生型PQQGDH时更低的物质。对麦芽糖的活性更低的那些PQQGDH是优选的。对麦芽糖的活性优选是野生型PQQGDH活性的90％或以下，更优选在75％或以下，更优选在70％或以下，更优选60％或以下，特别是40％或以下，更特别是20％或以下。
本发明的修饰PQQGDH，含有对麦芽糖的活性为对葡萄糖活性90％以下的物质。
本发明的修饰PQQGDH，含有对双糖的Km值比野生型PQQGDH更大的物质。优选对麦芽糖的Km值大。对麦芽糖的Km值，优选为8mM或以上，更优选为12mM或以上，更优选为20mM或以上。
本发明的修饰PQQGDH，含有对双糖的Km值大于对葡萄糖的Km值的物质。优选对麦芽糖的Km值比对葡萄糖的Km值更大。或者优选对麦芽糖的Km值是对葡萄糖的Km值的1.5倍或以上，更优选3倍或以上。
本发明的修饰PQQGDH，是对双糖的活性比野生型PQQGDH更低的酶，因而进一步要求它比野生型PQQGDH的稳定性更好。
本发明中所谓稳定性(本发明中利用热稳定性表述)，根据58℃，30分钟热处理后活性残留率来进行评价。本发明的修饰PQQGDH，含有58℃，30分钟热处理后活性残留率比野生型PQQGDH更高的物质。活性残留率在优选为48％或以上，更优选为55％或以上，特别优选为70％或以上。
对双糖活性比野生型PQQGDH更低的本发明的修饰PQQGDH，可以来自不动杆菌属细菌的修饰PQQGDH为例，在该PQQGDH的氨基酸序列中，在第170位，第245位，第249位，第349位和第429位氨基酸中至少一个氨基酸被置换的修饰PQQGDH。
上述来自不动杆菌属细菌的PQQGDH的氨基酸序列，优选是来自醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)或鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)的氨基酸序列。其中优选序列编号1的序列。序列编号1所表示的野生型PQQGDH蛋白质和序列编号2所表示的其碱基序列，是来自鲍氏不动杆菌NCIMB11517菌株的酶，已在公开特许平11-243949号公报中发表。上述序列编号1的序列中，除信号序列外，第一个氨基酸是天冬氨酸。
鲍氏不动杆菌NCIMB11517以前被分类到醋酸钙不动杆菌。
同时，本发明的修饰PQQGDH，只要具有葡萄糖脱氢酶活性，而且对双糖的活性和/或稳定性不产生实质性的负面影响，就可以进一步使其一部分氨基酸残基发生缺失或置换，也可以添加其它氨基酸。
对双糖活性比野生型PQQGDH更低的本发明的修饰PQQGDH，例如来自来自不动杆菌属细菌的PQQGDH，其氨基酸序列中的第67位，68位，69位，76位，89位，167位，168位，169位，170位，341位，342位，343位，351位，49位，174位，188位，189位，207位，215位，245位，249位，300位，349位，129位，130位，131位及第429位上，至少一个位点发生了氨基酸置换，和/或在428位和429位之间插入了氨基酸而形成的修饰PQQGDH。
改善了底物特异性的本发明的PQQGDH，例如来自不动杆菌属细菌的PQQGDH，其氨基酸序列中发生了氨基酸置换的GDH，以及第428位和第429位之间插入了氨基酸的GDH。
优选在下列位点中选择至少一处发生置换的，和/或在第428位和第429位之间插入了L，A或K而形成的PQQGDH。这些位点选自：
Q76N，Q76E，Q76T，Q76M，Q76G，Q76K，N167E，N167L，N167G，N167T，N167S，N167A，N167M，Q168I，Q168V，Q168A，Q168C，Q168D，Q168E，Q168F，Q168G，Q168H，Q168K，Q168L，Q168M，Q168N，Q168R，Q168S，Q168W，L169D，L169S，L169W，L169Y，L169A，L169N，L169M，L169V，L169C，L169Q，L169H，L169F，L169R，L169K，L169I，L169T，L169P，L169G，L169E，A170L，A170I，A170K，A170F，A170W，A170P，A170M，K89E，K300R，S207C，N188I，T349S，K300T，L174F，K49N，S189G，F215Y，S189G，E245D，E245F，E245H，E245M，E245N，E245Q，E245V，E245C，N249G，N249A，N249E，N249Q，A351T，P67K，E68K，P67D，E68T，I69C，P67R，E68R，E129R，K130G，P131G，E129N，P131T，E129Q，K130T，P131R，E129A，K130R，P131K，E341L，M342P，A343R，A343I，E341P，M342V，E341S，M342I，A343C，M342R，A343N，T349S，T349P，T349Y，N429F，N429P，N429L，N429Y，A343N，L169P，L169G。
在67位，68位，69位，76位，89位，167位，168位，169位，341位，342位，343位，351位，49位，174位，188位，189位，207位，215位，245，300位，349位，129位，130位，131位及429位发生的置换一处亦可，多处亦可。
此处[Q76N]指在第76位处用N(Asn)置换了Q(Gln)。
下段中所示的各种置换，和/或在428位与429位之间插入了L，A或K，都可以使PQQGDH的底物特异性增强。
Q76N，Q76E，Q76T，Q76M，Q76G，Q76K，Q168I，Q168V，Q168A，Q168C，Q168D，Q168E，Q168F，Q168G，Q168H，Q168K，Q168L，Q168M，Q168N，Q168R，Q168S，Q168W，L169A，L169V，L169H，L169K，L169D，L169S，
L169N，L169G，L169C，A170L，A170I，A170K，A170F，A170W，A170P，E245F，E245H，E245M，E245N，E245Q，E245V，E245C，N249G，N249A，N249E，N249Q，
(Q168A+L169G+E245D)，(Q168A+L169P+E245D)，(K89E+K300R)，
(Q168A+L169D)，(Q168S+L169S)，(N167E+Q168G+L169T)，(N167S+Q168N+L169R)，(Q168G+L169T)，(N167G+Q168S+L169Y)，(N167L+Q168S+L169G)，(N167G+Q168S+L169S+L174F+K49N)，(Q168N+L168N+S189R)，(N167E+Q168G+L169A+S189G)，(N167G+Q168R+L169A)，(N167S+Q168G+L169A)，(N167G+Q168V+L169S)，(N167S+Q168V+L169S)，(N167T+Q168I+L169G)，(N167G+Q168W+L169N)，(N167G+Q168S+L169N)，(N167G+Q168S+L169V)，(Q168R+L169C)，
(N167S+Q168L+L168G)，(Q168C+L169S)，(N167T+Q168N+L169K)，
(N167G+Q168T+L169A+S207C)，(N167A+Q168A+L169P)，
(N167G+Q168S+L169G)，(N167G+Q168G)，(N167G+Q168D+L169K)，
(Q168P+L169G)，(N167G+Q168N+L169S)，(Q168S+L169G)，(N188I+T349S)，
(N167G+Q168G+L169A+F215Y)，(N167G+Q168T+L169G)，(Q168G+L169V)，(N167G+Q168V+L169T)，(N167E+Q168N+L169A)，(Q168R+L169A)，
(N167G+Q168R)，(N167G+Q168T)，(N167G+Q168T+L169Q)，
(Q168I+L169G+K300T)，(N167G+Q168A)，(N167T+Q168L+L169K)，
(N167M+Q168Y+L169G)，(N167E+Q168S)，(N167G+Q168T+L169V+S189G)，(N167G+Q168G+L169C)，(N167G+Q168K+L169D)，(Q168A+L169D)，
(Q168S+E245D)，(Q168S+L169S)，(A351T)，(N167S+Q1688+L169S)，(Q168I+L169Q)，(N167A+Q168S+L169S)，(Q168S+L169E)，(Q168A+L169G)，(Q168S+L169P)，(P67K+E68K)，(P67R+E68R+I69C)，(P67D+E68T+I69C)，(E129R+K130G+P131G)，(E129Q+K130T+P131R)，(E129N+P131T)，
(E129A+K130R+P131K)，(E341L+M342P+A343R)，(E341S+M342I)，A343I，
(E341P+M342V+A343C)，(E341P+M342V+A343R)，(E341L+M342R+A343N)，
(Q168A+L169A)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169E)，(Q168A+L169F)，(Q168A+L169H)，(Q168A+L169I)，(Q168A+L169K)，(Q168A+L169M)，(Q168A+L169N)，(Q168A+L169P)，(Q168A+L169Q)，(Q168A+L169R)，(Q168A+L169S)，(Q168A+L169T)，(Q168A+L169V)，(Q168A+L169W)，Q168A+L169Y)
相对于野生型酶，改善了热稳定性的本发明的PQQGDH，例如来自不动杆菌属细菌的PQQGDH，其氨基酸序列中20位，76位，89位，168位，169位，245位，246位和300位上至少有一个位点发生了氨基酸置换，而形成的修饰PQQGDH。
可以是选自下列位点进行的置换：K20E，Q76M，Q76G，K89E，Q168A，Q168D，Q168E，Q168F，Q168G，Q168H，Q168M，Q168P，Q168W，Q168Y，Q168S，L169D，L169E，L169P，L169S，Q246H，K300R，Q76N，Q76T，Q76K，L169A，L169C，L169E，L169F，L169H，L169K，L169N，L169Q，L169R，L169T，L169Y及L169G。可以在20位，76位，89位，168位，169位，246位及300位的一个位点发生置换，也可以在多个位点置换。
此处[K20E]，指在第20位的K(Lys)置换成E(Glu)。
以下所示的任何一种氨基酸置换都将使PQQGDH的热稳定性增加：K20E，Q76M，Q76G，(K89E+K300R)，Q168A，(Q168A+L169D)，(Q168S+L169S)，Q246H，Q168D，Q168E，Q168F，Q168G，Q168H，Q168M，Q168P，Q168W，Q168Y，Q168S，(Q168S+L169E)，(Q168S+L169P)，(Q168A+L169A)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169E)，(Q168A+L169F)，(Q168A+L169H)，(Q168A+L169K)，(Q168A+L169N)，(Q168A+L169P)，(Q168A+L169Q)，
(Q168A+L169R)，(Q168A+L169T)，(Q168A+L169Y)，(Q168A+L169G)，(Q168A+L169P+E245D)，(Q168A+L169G+E245D)。
对双糖的活性比野生型PQQGDH更低的本发明的修饰PQQGDH，例如来自不动杆菌属的PQQGDH的氨基酸序列中，在第74位，146位，168位，169位，170位，245位及342位这些位点上，至少有一个位点发生氨基酸置换而形成的修饰PQQGDH。
上述位点中，优选在第74位，146位上至少一个位点发生氨基酸置换。通过在这些位点上引入突变，有可能在降低对双糖的活性的同时，在对葡萄糖的活性方面也比野生型酶有更高的比活性。而且可以增强在含有介体的检测系统中的反应性能。
优选的是从选自D74V，S146A，Q168A，L169P，A170L，A170M，A170I，A170F，E245D，M342I，M342V，M342P，M342A等位点中至少一个进行氨基酸置换的修饰PQQGDH。
更优选是在上述位点D74V，S146A中的至少一个位点发生了氨基酸置换的修饰PQQGDH。
此处[M342A]，指在第342位的M(Met)置换成了A(Ala)。
以下所示的各组中任何一组氨基酸置换都将使PQQGDH的底物特异性增加：
D74V，M342I，M342V，M342P，M342A，S146A，Q168A，L169P，A170L，A170M，A170I，A170F，(S146A+A170L)，(Q168A+L169P+A170L)，
(S146A+A170M)，(Q168A+L169P+A170M)，(S146A+Q168A+L169P+A170L)，(S146A+Q168A+L169P+A170M)，(Q168A+L169P+A170L+E245D)，(Q168A+L169P+A170M+E245D)，(S146A+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+M342I)，(Q168A+L169P+A170M+M342I)，(S146A+M342V)，(Q168A+L169P+A170L+M342V)，(Q168A+L169P+A170M+M342V)，(S146A+M342P)，(Q168A+L169P+A170L+M342P)，(Q168A+L169P+A170M+M342P)，(S146A+M342A)，(Q168A+L169P+A170L+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+M342A)，(D74V+S146A)，(D74V+Q168A+L169P+A170L)，(D74V+Q168A+L169P+A170M)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342V)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+
M342V)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A)。
更优选可以是上述位点D74V，S 146A中的至少一个位点发生了氨基酸置换的修饰PQQGDH。
上述本发明的修饰PQQGDH的另一种更优选的实施方式，则可以是从以下各组中选择进行氨基酸置换而形成的修饰PQQGDH：A170V，A170L，A170I，A170T，A170K，A170C，A170M，A170F，A170Y，A170W，A170P，E245D，E245F，E245H，E245M，E245N，E245Q，E245S，E245T，E245V，E245W，E245R，E245G，E245C，N249G，N249A，N249L，N249E，N249Q，T349S，T349P，T349Y，N429F，N429P，N429L，N429Y。
或者上述本发明的修饰PQQGDH，还可以是另一种优选的实施方式，例如从以下位点组中选择进行氨基酸置换形式而形成修饰PQQGDH：
(Q168A+L169G+E245D)，(Q168A+L169P+E245D)，(S146A+A170L)，(Q168A+L169P+A170L)，(S146A+A170M)，(Q168A+L169P+A170M)，(S146A+Q168A+L169P+A170L)，(S146A+Q168A+L169P+A170M)，(Q168A+L169P+A170L+E245D)，(Q168A+L169P+A170M+E245D)，(S146A+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+M342I)，(Q168A+L169P+A170M+M342I)，(S146A+M342V)，(Q168A+L169P+A170L+M342V)，(Q168A+L169P+A170M+M342V)，(S146A+M342P)，(Q168A+L169P+A170L+M342P)，(Q168A+L169P+A170M+M342P)，(S146A+M342A)，(Q168A+L169P+A170L+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+M342A)，(D74V+S146A)，(D74V+Q168A+L169P+A170L)，(D74V+Q168A+L169P+A170M)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342V)，
(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342V)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A)。
更优选，可以列举(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+E245D)。这些是优选的，因为在这些位点发生氨基酸置换的修饰PQQGDH不仅对双糖的活性低，而且对热稳定性良好。
本发明使用的提高在以铁氰化物离子为介体为检测系统中酶的比活性的方法，是在野生型的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(本专利说明书中简称PQQGDH)，的氨基酸序列中是一个到多个氨基酸发生缺失，置换或添加来实现。用于修饰的野生型PQQGDH，是以吡咯并喹啉苯醌为配位，催化氧化D-葡萄糖生成D-葡糖酸基-1，5-内酯的反应的酶，但其来源和结构并没有特别限定。
用于修饰的野生型PQQGDH的代表性的来源，可以列举诸如醋酸钙不动杆菌，鲍氏不动杆菌，铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)，荧光假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)等氧化性细菌，以及放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，大肠杆菌(Eschrichiacoli)，产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)等肠道细菌为代表。但要将大肠杆菌等细菌中的膜型酶改变为可溶性酶是困难的，因而优选来源于属于不动杆菌属微生物的酶。更优选，选择来自乙酸钙不动杆菌或鲍氏不动杆菌等细菌的可溶性PQQGDH。
上述来自不动杆菌属细菌的PQQGDH，其氨基酸序列，优选来自乙酸钙不动杆菌或鲍氏不动杆菌的PQQGDH的氨基酸序列。其中优选序列是序列编号1的序列。序列编号1所表示的野生型PQQGDH蛋白质的氨基酸序列和序列编号2所表示的其碱基序列，来源于鲍氏不动杆菌NCIMB11517菌株，已在公开特许平11-243949号公报中发表。此外，在上述序列编号1中，氨基酸标记除去信号序列后，以天门冬氨酸为第一个氨基酸。
鲍氏不动杆菌NCIMB11517菌株过去被分类到乙酸钙不动杆菌。
本发明中的比活性，是指在以铁氰化物离子为介体的活性检测系统中每单位重量氧分子的活性，更准确地说，是每mg纯化酶的酶活性单位。
本发明中所谓活性中心，是指在依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶中，结合底物D-葡萄糖而发生催化作用的部位，包括与D-葡萄糖相结合的底物结合部位和进行氧化催化反应的与吡咯并喹啉苯醌结合的部位。
本发明所指野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，一般指存在于自然界的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶。而修饰依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，是相对于野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，其氨基酸序列中出现了一个或数个氨基酸发生了缺失，置换或插入的酶。
本发明所谓提高了比活性，一般包括比活性比野生型酶增加了10％或以上的酶，较好的则是比野生型酶增加了50％或以上。
在以铁氰化物离子为介体的活性检测系统中，比活性高于野生型PQQGDH的本发明的PQQGDH，是指通过诸如在活性中心附近置换了至少1个其它氨基酸，而在以铁氰化物离子为介体的活性检测系统中提高了比活性的修饰依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶。
更精确地说，以铁氰化物离子为介体的活性检测系统中比活性高于野生型PQQGDH的本发明的PQQGDH，是指以活性中心为圆心的半径为10的范围内存在的氨基酸至少有一个被其它氨基酸置换了的酶。该氨基酸在来自不动杆菌属细菌的PPQGDH的氨基酸序列中，则是从第76位，143位，144位，163位，168位，169位，228位，229位，247位，248位，343位，346位，348位，377位，406位，408位，424位中选择的。
本发明的PQQGDH，可以例举在来自不动杆菌属细菌的PPQGDH的氨基酸序列中，第168位，169位上至少有一个位点发生了氨基酸置换的修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶。
更精确的例子，则是来自不动杆菌属细菌的PPQGDH的氨基酸序列中，选自Q168A，(Q168A+L169G)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169P)，(Q168S+L169E)，(Q168S+L169P)等位点的氨基酸进行了置换的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶。
此处Q168A指第168位的Q(Gln)置换成A(Ala)。
本发明修饰的PQQGDH，只要有葡萄糖脱氢酶活性，而且对利用铁氰化物离子作为介体的检测系统中的比活性不产生实质性的负面影响，就可以使一部分其它氨基酸残基发生缺失或置换，也可以添加其它氨基酸。
同时，本发明的PQQGDH是一种修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，即使上述氨基酸置换不发生在靠近活性中心的部位，也使其在以铁氰化物离子为介体的活性检测系统中保持比野生型酶更高的比活性。
具体而言，是组合了在第245位的氨基酸发生了置换的修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，精确地说，是在选自(Q168A+L169G+E245D)，(Q168A+L169P+E245D)两组中的位置上发生了氨基酸置换的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，
本发明中，使依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶在铁氰化物离子为介体的活性检测系统中有比野生型酶更高的比活性的方法，是在该酶的氨基酸序列中实现一个或多个氨基酸发生缺失，置换或添加。
本发明所采用的方法，对去除，置换或添加的氨基酸并无特别限定，但优选是在活性中性附近的氨基酸。或者说，缺失，置换或添加的氨基酸，最好是以活性中心为圆心的半径为10的范围内的氨基酸。
本发明的方法中的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，最好是在来自不动杆菌属细菌的PQQGDH的氨基酸序列中，在选自第76位，143位，144位，163位，168位，169位，228位，229位，247位，248位，343位，346位，348位，377位，406位，408位，424位氨基酸中的至少一个氨基酸被其它氨基酸置换。
并且来自不动杆菌属细菌的PQQGDH之氨基酸序列中，最好将选自168位和169位的至少一个氨基酸置换成其它氨基酸。
进一步说，优选在不动杆菌属细菌的PQQGDH之氨基酸序列中，氨基酸的置换最好选自Q168A，(Q168A+L169G)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169P)，(Q168S+L169E)和(Q168S+L169P)。
上述氨基酸置换，不在活性中心附近也无大影响，此时在来自不动杆菌属细菌的PQQGDH之氨基酸序列中，合需的是第245位氨基酸的置换。并且，合需的是置换选自(Q168A+L169G+E245D)和(Q168A+L169P++E245D)两组。
可是，在申请本专利过程中，报道了由乙酸钙不动杆菌LMD79.41菌株而来的该酶结晶的X射线衍射结构解析结果，明确了包含活性中心的酶高级结构(参见非专利文献1，2，3，4)。
非专利文献1：J.Mol.Biol.，289，319-333(1999)
非专利文献2：PNAS，96(21)，11787-11791(1999)
非专利文献3：The EMBO Journal，18(19)，5187-5194(1999)
非专利文献4：Protein Science，9，1265-1273(2000)
根据有关该构像结构的知识，正在进行该酶的结构与功能的相关性的研究，但还不能说已经完全清楚了。例如讨论到在编码水溶性葡萄糖脱氢酶的第六个W基序(motif)的B链和C链连接而成的环状结构域(W6BC)中氨基酸残基的结构基因的特定部位通过引入突突变改善其对葡萄糖的选择性(可参见专利文献2)，其效果的证实只在公开的实施例中显示。
专利文献2：公开特许2001-197888
根据本发明专利的结果，验证这些关于高级结构的发现，可以认为，要改变对双糖的活性，以下3个结构部分至少有一个或多个氨基酸可能与其有关。这3个结构部分是：参与和PQQ结合的氨基酸和/或其周围的氨基酸；参与和葡萄糖结合的氨基酸和/或其周围的氨基酸；参与和钙离子结合的氨基酸和/或其周围的氨基酸。
本发明的修饰PQQGDH，例如来自不动杆菌属细菌的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶，其序列编号1的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶中，即包含参与和PQQ结合的氨基酸和/或其周围的氨基酸，以及/或者参与和葡萄糖结合的氨基酸和/或其周围的氨基酸已经被置换。在非专利文献3和4中，报道了参与和PQQ结合的氨基酸是Y344，W346，R228，N229，K377，R406，R408和D424，参与和葡萄糖结合的氨基酸是Q76，D143，H144，D163，Q168和L169等。
本发明的修饰的PQQGDH包括来自不动杆菌属细菌的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶，例如序列编号1的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶中，其涉及结合钙离子的氨基酸和/或其周围的氨基酸已经被置换。在非专利文献1中，描述了涉及结合钙离子的氨基酸包括P248，G247，Q246，D252和T348。
本发明的修饰PQQGDH，在具有活性的野生型酶的立体结构中，包含有通过诱导以活性中心为圆心的半径为15范围内，优选10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
本发明的修饰PQQGDH，在具有活性的野生型酶的立体结构中，包含有通过诱导以底物为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。具体的，优选在以葡萄糖为底物时，通过诱导以野生型酶活性立体结构中的底物为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
本发明的修饰PQQGDH，在具有活性的野生型酶的立体结构中，包含有通过诱导以结合在底物的1位碳原子上的OH基为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。具体的，优选是在以葡萄糖为底物时，通过诱导以野生型酶活性立体结构中的底物为圆心的半径为10内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
本发明的修饰PQQGDH，在具有活性的野生型酶的立体结构中，包含有通过诱导以结合在底物的2位碳原子上的OH基为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。具体的，优选在以葡萄糖为底物时，通过诱导以野生型酶活性立体结构中的底物为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
根据以上教导，本领域技术人员，参照来源于鲍氏不动杆菌NCIMB11517菌株的具有序列编号1所示序列的野生型PQQGDH蛋白质和序列编号2所示的碱基序列，通过在合适区域内置换氨基酸残基，可以无需多次试验下，即可使与上述酶有较高相似性(优选80％或以上即可，更优选在90％或以上)的其它来源(不管天然的，修饰的或人工合成的)的修饰PQQGDH，获得对双糖的活性比野生型PQQGDH更低的修饰PQQGDH。
如果以其它角度来验证根据本发明专利的成果所获得的有关高级结构的发现，可以认为，置换活性中心附近一个以上氨基酸残基，将关系到以铁氰化物离子为介体的检测系统中酶比活性的提高。
在本专利发明中，所谓活性中心附近的氨基酸，指参与和PQQ，葡萄糖以及/或与PQQ配位的钙离子结合的氨基酸，其它区域都称为非活性中心附近。
本发明的修饰PQQGDH，还包含有在具有活性的野生型酶的立体结构上以活性中心为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
本发明的修饰PQQGDH，实质上还包含有在具有活性的野生型酶的立体结构上以底物为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。具体的，优选以葡萄糖为底物时，通过诱导以野生型酶的活性三级结构中的底物为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
本发明的修饰PQQGDH，实质上还包括有在具有活性的野生型酶的立体结构中，通过诱导以结合在底物的1位碳原子上的OH基为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。具体的，优选以葡萄糖为底物时，通过诱导以野生型酶的活性三级结构中的底物为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
本发明的修饰PQQGDH，实质上还包含有在具有活性的野生型酶的立体结构中，通过诱导以结合在底物的2位碳原子上的OH基为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。特别是在以葡萄糖为底物时，通过诱导以野生型酶的活性三级结构中的底物为圆心的半径为10范围内存在的氨基酸发生突变而得到的结构。
此外，在有多个位点发生突变时，将修饰酶和野生型酶在总体上进行比较，铁氰化物离子为介体的检测系统中的比活性提高时，并不一定所有修饰的位点都在活性中心附近。
根据以上教导，本领域技术人员，对于其它来源修饰PQQGDH，可以通过在合适区域内置换氨基酸残基，即可在以在以铁氰化物离子为介体的检测系统中获得比活性高于野生型PQQGDH的PQQGDH。
例如，将来自乙酸钙不动杆菌LMD79.41菌株的酶的氨基酸序列与序列编号1的序列相比较，不同的氨基酸残基很少，同源性为92.3％(包括信号序列)。由于它们非常类似，所以能够很容易识别序列编号1中的某个残基与其它来源的酶的哪个氨基酸残基相对应。因此，根据本发明，通过使它的一个或多个位置上的氨基酸残基发生缺失，置换或添加等，即可获得对双糖活性比野生型PQQGDH更低的修饰PQQGDH。这种修饰的PQQGDH也包括在本发明范围内。
本发明是编码上述修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的基因。
本发明是编码对双糖活性比野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)更低的修饰PQQGDH的基因。还有包含该基因的载体。还有用该载体转化的转化子。还有修饰的PQQGDH的制造方法，其特征是培养该转化子。
编码本发明的修饰PQQGDH的基因，有可能通过改造含有编码来自微生物等各种来源的野生型PQQGDH的基因的DNA片段来获得。具体可举出诸如鲍氏不动杆菌，铜绿假单胞杆菌，恶臭假单胞杆菌，荧光假单胞杆菌，氧化葡糖杆菌等氧化性细菌，或放射状形土壤杆菌，大肠杆菌，产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)等肠道细菌等。但要将大肠杆菌等细菌中的膜型酶改变为可溶性酶是困难的，因而优选来源于属于不动杆菌属细菌的可溶性酶。更优选与来自乙酸钙不动杆菌或鲍氏不动杆菌等细菌的该酶具有高同源性的可溶性PQQGDH。
改造编码野生型PQQGDH的基因的方法，通常采用改造遗传信息的方法。即通过在带有蛋白质的遗传信息的DNA中变换特定碱基，或通过在具有蛋白的遗传信息的DNA中插入或缺失某特定碱基，从而制备出带有修饰的蛋白质的遗传信息的DNA。改造DNA中碱基的具体方法，有诸如使用市售试剂盒(Transformer Mutagenesis Kit；Clonetech制，EXOIII/Mung Bean/deletion Kit；Stratagene制，Quick Change SiteDirected Mutagenesis Kit；Stratagene制，等等)，或利用多聚酶链式反应(PCR)。
所制备的带有经改造的蛋白质遗传信息的DNA，以与质粒连接的状态转移到宿主微生物中，即成为生产经改造的蛋白质的转化子。此时所用的质粒，例如在以大肠杆菌为宿主时可以用pBluescript，pUC18等。宿主微生物则可以用诸如大肠杆菌W3110，大肠杆菌C600，大肠杆菌JM109和大肠杆菌DH5α等。重组载体转染宿主的方法，在宿主是大肠杆菌属微生物时，可以采用在有钙离子的情况下转染重组DNA的方法等，也可以采用电穿孔法。还可以利用市售的感受态细胞(例如东洋纺织制Competent High JM109)
这种基因可以从这些菌株中抽提，也可以化学合成。还可以采用PCR法得到含有编码PQQGDH的基因片段。
在本发明中得到编码PQQGDH的基因的方法有以下几种。例如将乙酸钙不动杆菌NCIB11517菌株的染色体分离纯化。经超声波处理，限制性内切酶消化等切断DNA，用DNA连接酶将线形表达载体与DNA的两个平滑末端或粘末端结合使之连接成环而构建成重组载体。将该重组载体转染到能够复制的宿主微生物中，以载体中标记的表达和酶活性为指标进行筛选，得到包含含有编码以PQQ为辅基的GDH的基因的重组载体的微生物。
然后培养包含上述重组载体的微生物，从该培养后的微生物的微生物细胞中分离纯化重组载体，即可从该表达载体中取得编码GDH的基因。例如作为基因供体的乙酸钙不动杆菌NCIB11517菌株的染色体DNA，其具体提取方法如下。
将该基因供体微生物经过1～3天搅拌培养，离心所得到的培养液收集菌体，然后使其裂解，即可制备出包含着编码以PQQ为辅基的GDH的基因的细菌裂解物溶液。裂解的方法例如有用细菌裂解酶如溶菌酶处理等，必要时可以合并使用蛋白酶，其它酶或十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂。还可以结合使用冻融和干燥或弗氏细胞压碎器(French press)等物理破碎方法。
采用常规方法从上述得到的裂解物溶液中分离纯化DNA，例如用苯酚或蛋白酶处理去除蛋白质，核糖核酸酶处理，酒精沉淀等方法加以适当组合即可。
切断从微生物中分离纯化得到的DNA的方法，例如可以采用超声波处理，酶消化等方法。优选采用作用于特定核苷酸序列的II型限制性内切酶。
克隆时的载体，可以用在宿主微生物中自主增殖的噬菌体或用于基因重组的构建自质粒的载体。噬菌体有诸如以大肠杆菌为宿主的Lambda gt10，Lambda gt11等。以大肠杆菌为宿主的质粒则有诸如pBR322，pUC19，pBluescript等。
进行克隆时，载体可以用切断编码作为上述GDH基因供体的微生物DNA的同一限制性内切酶进行切割即可得到，但不是一定要使用与切断该微生物DNA的同一种的限制型内切酶。将微生物DNA片段与载体DNA片段结合的方法可以是通用的使用DNA连接酶的方法。例如将微生物DNA片段的粘末端与载体DNA片段的粘末端退火后，使用合适的DNA连接酶制备出微生物DNA片段与载体DNA片段的重组载体。如有必要，可以在退火后，转染宿主微生物，利用活体内的DNA连接酶制备重组载体。
用于克隆的宿主微生物，只要重组载体稳定，并能通过自主增殖而表达外源基因的特征，并无特别要求。一般可以采用大肠杆菌W3110，大肠杆菌C600，大肠杆菌HB101，大肠杆菌JM109和大肠杆菌DH5α等。
将重组载体转移到宿主微生物中的方法，例如大肠杆菌为宿主微生物时，可以采用钙处理的感受态细胞法或电穿孔法等。
用上述方法得到的微生物转化子，通过在营养培养基中培养可以稳定产生大量GDH。为筛选出转染有目的重组载体的宿主微生物，可以检测包含在目的DNA的载体上同时表达抗药性标记并通过加入PQQ诱导表达GDH活性的微生物。例如挑选出能在根据抗药性标记设计的选择性培养基上生长，并选择产生GDH的微生物。
用上述方法得到的以PQQ为辅基的GDH基因的碱基序列用Science，第214卷，1205(1981)上描述的双脱氧法进行分析。GDH的氨基酸序列则依据上述测定的碱基序列推定。
如上所述，将一次选择得到的包含编码以PQQ为辅基的GDH的基因的重组载体，转移到能在产生PQQ的微生物中复制的重组载体中，该转移通过采用限制性内切酶法和PCR法从包含GDH基因的重组体中回收GDH基因DNA，并与其它载体片段连接而很容易实现。同时，这些载体转化能产生PQQ的微生物可以采用以钙处理的感受态细胞法或电穿孔法进行。
能产生PQQ的微生物，有同化甲醇的细菌例如甲基杆菌属(Methylobacterium)的细菌，醋酸细菌例如乙酸杆菌属(Acetobacter)或葡糖杆菌属(Gluconobacter)中的细菌，其它细菌例如属于黄杆菌属(Flavobacterium)，假单胞菌属和不动杆菌属的细菌。优选采用假单胞菌属和不动杆菌属细菌的细菌，因为其中已经建立可用的宿主-载体系统且容易利用。
假单胞杆菌属细菌中，可以用铜绿假单胞杆菌，荧光假单胞杆菌，恶臭假单胞杆菌。不动杆菌属中，可以用乙酸钙不动杆菌，鲍氏不动杆菌等。
能在上述微生物中复制的重组载体，有来自RSF的载体，或含有与其类似复制子的载体，可以用在假单胞杆菌属细菌中。例如pKT240，pMMB24等(M.M.Bagdasarian等，Gene，26，273(1983))，pCN40，pCN60等(C.C.Nieto等，Gene，87，145(1990))和pTS1137。此外，也可以利用pME290等(Y.Itoh等，Gene，36，27(1985))，pNI111，pNI120C(N.Itoh等，J.Biochem.，110，614(1991))。
在不动杆菌属细菌中可以利用pWM43等(W.Minas等，Appl.Environ.Microbiol.59，2807(1993))，pKT230，pWH1266等(M.Hunger等，Gene，87，45(1990))作为载体。
用上述方法得到的微生物转化子，通过在营养培养基中培养可以稳定产生大量修饰的蛋白质。作为转化子的宿主微生物的培养方式，选择培养条件时要考虑宿主的营养生理特性，多数情况下是进行液体培养。工业化则采用通气搅拌培养更为有利。
培养基中的营养源，可以广泛采用培养微生物通常用的材料。碳源可以是可以同化的含碳化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，糖蜜，丙酮酸等。氮源是可以利用的含氮化合物即可，例如蛋白胨，肉膏，酵母膏，酪素水解物，大豆粕的碱抽提物等。其它如磷酸盐，碳酸盐，硫酸盐，镁，钙，钾，铁，锰，锌等盐类，特定氨基酸，特定维生素等则按需要添加。
培养温度可在适宜细菌生长和产生修饰PQQGDH的范围内变化，对于上述能产生PQQ的微生物来说，可以是20～42℃。培养时间随条件不同而有所差异，可以把预计修饰的PQQGDH产量达到最高时的合适时间作为结束培养时间。通常时间为小时。培养基的pH值，可在适宜细菌生长和产生修饰PQQGDH的范围内变化，优选是pH6.0～9.0范围内。
可以直接收集含有在培养物中产生修饰PQQGDH的菌体加以利用，但根据常规方法，当修饰PQQGDH存在于培养液中时，是通过过滤，离心分离使含有修饰PQQGDH的溶液和微生物菌体分离后再利用。当修饰PQQGDH存在于菌体内时，则通过过滤，离心分离等手段收集菌体，然后用机械方法或溶菌酶的酶学方法破坏菌体，再根据需要加入EDTA等螯合剂和表面活性剂，使GDH可溶化，以水溶液形式收集。
如上所述得到的含有GDH的溶液，可以用减压浓缩，膜浓缩，硫酸铵或硫酸钠等盐析处理，或亲水性有机溶剂(例如甲醇，乙醇，丙酮等)分级沉淀等方法使之沉淀。加热处理和等电点处理也是有效的提纯方法。然后，借助吸附剂或凝胶过滤剂等进行凝胶过滤，吸附层析，离子交换层析，亲和层析等可以得到精制的GDH。
例如利用Sephadex胶(PhamaciaBiotech)等进行凝胶过滤，DEAE-Sephrose CL-6B(PhamaciaBiotech)OctylSepharose CL-6B(Phamacia Biotech)等柱层析进行分离纯化，可以得到纯化的酶制剂。优选纯化的酶制剂显示电泳(SDS-PAGE)为单一条带，说明纯度满意。
可以用冷冻干燥，真空干燥或喷雾干燥等方法使其粉末化而便于分发。此时纯化的酶可溶解在磷酸缓冲液，Tris缓冲液或GOOD缓冲液中的使用。较好的是GOOD缓冲液，优选PIPES，MES或MOPS缓冲液特。此外，加入钙离子或它的盐，以及谷氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸等氨基酸，还可加入血清白蛋白等，能够使GDH更稳定。
本发明的修饰的蛋白质制备方法并无特别限制，可以按以下显示的方法制备。修饰组成蛋白质的氨基酸序列的方法，可采用通用的改变遗传信息的手法。即通过改变含有蛋白质遗传信息的DNA的特定碱基，或通过插入或缺失特定碱基，制备成含有修饰蛋白质的遗传信息的DNA。改变DNA中碱基的具体方法，可使用市售的试剂盒(Transformer Mutagenesis Kit；Clonetech制，EXOIII/Mung Bean DeletionKit；Stratagene制，QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit；Stratagene制，等等)，或利用多聚酶链式反应(PCR)方法。
本发明中，以序列编号1所示PQQGDH的第76位，167位，168位，170位和245位为目标，对其进行氨基酸的置换，获得了底物特异性增强的修饰PQQGDH。与底物特异性特别有关的特别优选的位点是：Q76K，Q168A，A170P，E245D，(Q168A+L169G+E245D)，(Q168A+L169P+E245D)，(Q168S+L169S)，(Q168A+L169D)，(Q168S+E245D)，(Q168S+L169E)，(Q168A+L169G)，(Q168S+L169P)，(Q168A+L169A)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169E)，(Q168A+L169K)，(Q168A+L169M)，(Q168A+L169N)，(Q168A+L169P)，(Q168A+L169S)以及(Q168A+L169T)。
本发明中，以序列编号1所示PQQGDH的第20位，76位，89位，168位，169位，245位，246位和300位为目标，对其进行了氨基酸的置换，获得了稳定性增强的修饰PQQGDH。与热稳定性特别有关的特别优选的置换位点是：K20E，(K89E+K300R)，Q168A，(Q168A+L169D)，(Q168S+L169S)，(Q168S+L169E)，(Q168S+L169P)，(Q168A+L169G)，Q168D，Q168E，Q168F，Q168G，Q168H，Q168M，Q168P，Q168S，Q168W，Q168Y，(Q168A+L169A)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169E)，(Q168A+L169F)(Q168A+L169H)，(Q168A+L169K)，(Q168A+L169N)，(Q168A+L169P)(Q168A+L169Q)(Q168A+L169R)，(Q168A+L169T)(Q168A+L169Y)，(Q168A+L169G+E245D)以及Q246H。
本发明中，或者以序列编号1所示PQQGDH的第74位，146位，168位，169位，170位，245位和342位为目标，对其进行氨基酸的置换，获得了底物特异性增强的修饰PQQGDH。关于底物特异性，特别优选的位点是：D74V，M342I，M342V，M342P，M342A，S146A，Q168A，L169P，A170L，A170M，A170I，A170F，(S146A+L170L)，(Q168A+L169P+A170L)，(S146A+L170M)，(Q168A+L169P+A170M)，(S146A+Q168A+L169P+A170L)，(S146A+Q168A+L169P+A170M)(Q168A+L169P+A170L+E245D)，(Q168A++L169P+A170M+E245D)，(S146A+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+M342I)，
(Q168A+L169P+A170M+M342I)，(S146A+M342V)，(Q168A+L169P+A170L+M342V)，(Q168A+L169P+A170M+M342V)，(S146A+M342P)，(Q168A+L169P+A170L+M342P)，(Q168A+L169P+A170M+M342P)，(S146A+M342A)，(Q168A+L169P+A170L+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+M342A)，
(D74V+S146A)，(D74V+Q168A+L169P+A170L)，(D74V+Q168A+L169P+A170M)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342V)，
(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342V)，，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A)。
经修饰的蛋白质可以有液态(水溶液，悬浊液)，粉末，冷冻干燥物等种种形态。冷冻干燥的方法并无特别要求，按常法进行即可。含有本发明酶的组合物，不仅以冷冻干燥物的形态存在，还可以将冷冻干燥物再溶解成溶液状态。同时，葡萄糖的测定，可以通过葡萄糖检测试剂盒或葡萄糖传感器进行。这种已纯化的修饰的蛋白质可以用以下方法使其保持稳定。
单独或组合加入氯化钙、乙酸钙、柠檬酸钙等钙盐，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、赖氨酸等氨基酸，或α-酮戊二酸，α-酮基葡糖酸，苹果酸等有机酸，或血清白蛋白等，可以使改造后的蛋白质保持稳定。
将纯化的修饰的蛋白质与(1)选自天冬氨酸，谷氨酸，α-酮戊二酸，α-酮基葡糖酸，α-环状糊精和它们的盐类中的一种或两种或以上的化合物；(2)白蛋白等共存，可以使修饰的蛋白质保持稳定。
在冷冻干燥组合物中，PQQGDH的含量因酶的来源不同而不同。通常在大约5～50％(重量比)范围内即可。如换算为酶活性，则以100～2000U/mg范围内为佳。
天冬氨酸，谷氨酸，α-酮戊二酸，苹果酸和α-酮基葡糖酸的盐类，可以是钠，钾，铵，钙和镁盐等，但不限于此。上述化合物及其盐类，以及α-环状糊精的添加量，可以在1～90％(重量比)的范围内添加，可以单独使用这些化合物，也可以两个或多个的组合使用。
溶解该蛋白质的缓冲液并无特别限制，可以用Tris缓冲液，磷酸缓冲液，硼酸缓冲液，Good缓冲液。该缓冲液的pH在大约5.0～9.0范围内根据使用目的调整。在冷冻干燥物中缓冲液的用量没有特别限制，优选为0.1％或以上，更优选为0.1～30％(重量比)范围内。
可用的白蛋白，有牛血清白蛋白(BSA)，卵清白蛋白(OVA)等。特别优选BSA。该白蛋白的含量，优选在1～8％(重量比)，更优选是在5～70％(重量比)范围内使用。
在组合物中还可以加入其它稳定剂，其添加量的范围以不对PQQGDH反应造成特别不好的影响为原则。本发明中，没有对稳定剂的组合方法作出特别限制。这些方法包括将含PQQGDH的缓冲液与稳定剂组合的方法，在含稳定剂的缓冲液中配入PQQGDH的方法以及将PQQGDH和稳定剂同时和缓冲液配合的方法等。
此外，加入钙离子也可以得到稳定效果。即可以通过含有钙离子或钙盐使修饰的蛋白质稳定化。示例的钙盐有氯化钙，乙酸钙或柠檬酸钙等无机酸或有机酸的钙盐。在水剂组合物中，钙离子的含量最好在1×10-4～1×10-2M之间。
通过使其含有钙离子或钙盐而起到的稳定化效果，可以使其含有从谷氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸等氨基酸中选择的氨基酸而进一步加强。
从谷氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸等氨基酸中选择的氨基酸，可以是一种，也可以是两种或更多种。上述水剂组合物中，从谷氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸等氨基酸中选择的氨基酸的含量，优选为0.01～0.2重量％。
亦可含有血清白蛋白。在上述水剂组合物中加入血清白蛋白时，其含量优选为0.05～0.5重量％。
缓冲剂可以是通常使用的缓冲剂，一般以维持组合物的pH为5～10为好。具体而言，使用Tris盐酸盐缓冲液，硼酸缓冲液，Good缓冲液，不会与钙形成不溶性盐类的缓冲液都可以使用。
上述水剂组合物中，如有必要，还加入其它成分，例如表面活性剂，稳定剂和赋形剂等。
本发明是葡萄糖检测试剂盒，其中含有对双糖的作用比野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)更低的修饰PQQGDH。或含有该修饰PQQGDH的葡萄糖传感器，和含有该修饰PQQGDH的葡萄糖测定方法。
本发明可以通过以下各种方法来测定葡萄糖。
葡萄糖检测试剂盒
本发明以含有根据本发明的修饰PQQGDH的葡萄糖检测试剂盒为特征。本发明的葡萄糖检测试剂盒含有至少足够一次使用的根据本发明而产生的修饰PQQGDH。通常，试剂盒除含有本发明的修饰PQQGDH外，还包括检测所必须的缓冲液，介体，为制备标准曲线所需的葡萄糖标准溶液以及使用说明书。本发明的修饰PQQGDH有各种形态，例如能够以冷冻干燥试剂的形态或溶解在适当保存液中的溶液形态供应。优选是以本发明的修饰PQQGDH的全酶形态提供，但也可以提供脱辅基酶，在使用时制备成全酶。
葡萄糖传感器
本发明以含有根据本发明的修饰PQQGDH的葡萄糖传感器为特征。电极可以使用碳电极，金电极或铂电极，在该电极上固定化本发明的酶。固定化酶的方法有采用交联试剂的方法，包埋在高分子基质中的方法，用透析膜、光敏交联聚合物、导电性聚合物和、氧化还原聚合物涂布的方法。或者，酶也可以和以二茂铁或它的衍生物为代表的电子介体一起固定在聚合物中，或吸附/固定在电极上。也可以将这些方法组合应用。优选是将本发明的修饰PQQGDH以全酶的形式固定在电极上，也可以以脱辅基酶形式固定，而在另外的层上或在溶液中提供PQQ。通常用戊二醛将本发明的修饰PQQGDH固定在碳电极上，然后用带有胺基的试剂处理以封闭戊二醛。
萄萄糖浓度的测定按以下所述进行。在恒温的小杯中加入缓冲液，加入PQQ和CaCl2以及介体，维持恒定温度。介体可以用铁氰化钾，N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(Phenazine Methosulfate)等。工作电极采用固定了本发明的修饰PQQGDH的电极，并使用辅助电极(如铂电极)和参比电极(例如Ag/AgCl电极)。在碳电极上施加恒压，待电流稳定后，加入含葡萄糖的样品，测定电流的增加。根据以标准溶液制备的标准曲线，可以计算出样品中的葡萄糖浓度。
将依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶用于生物传感器时，在该试纸片上酶溶解在标本中的血液。由于血液比水或用在其它通用试剂上的溶剂粘度高，溶解性低。所以希望在试纸片上加入的酶量，即蛋白质量要少些更好。
如果采用本发明的方法，可以获得比活性大于1的本发明的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶，优选比活性为1.1或以上的，更优选为1.5或以上。
如果比活性高，就能满足减少蛋白质添加量。所以本发明的葡萄糖传感器中稳定剂添加量的上限被降低，提高了确保高度稳定的可能性。
实施例
以下根据实施例更详细说明本发明。
实施例1：依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的表达质粒的构建
野生型依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的表达质粒pNPG5，是将编码来自鲍氏不动杆菌NCIMB11517菌株的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的结构基因插入载体pBluescript SK(-)的多克隆位点而构建的质粒。其碱基序列表示如序列表中的序列编号2，根据该碱基序列推定的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列表示如序列表中的序列编号1。
实施例2突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的制备
以含有野生型依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pNPG5和根据序列编号3表示的合成寡核苷酸和与其互补合成寡核苷酸为基础，采用QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene制)，按其操作程序进行诱变操作，并进一步确定碱基序列，得到重组质粒(pNPG5M1)，该质粒编码的序列编号1表示的氨基酸序列中第76位的谷氨酰胺被置换为天冬酰胺的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号4表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M2)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第76位的谷氨酰胺被置换为谷氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号5表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M3)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第76位的谷氨酰胺被置换为苏氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号6表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M4)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第76位的谷氨酰胺被置换为甲硫氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号7表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M5)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第76位的谷氨酰胺被置换为甘氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号8表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M6)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第76位的谷氨酰胺被置换为赖氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号9表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M7)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为异亮氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号10表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M8)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为缬氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号11表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M9)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号22表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M10)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第20位的赖氨酸被置换为谷氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号23表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第89位的赖氨酸被置换为谷氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。再以这个质粒和序列编号24表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M11)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第89位的赖氨酸被置换为谷氨酸，第300位的赖氨酸被置换为精氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号25表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M12)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第246位的谷氨酰胺被置换为组氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号26表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M13)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丝氨酸，第169位的亮氨酸被置换为丝氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号27表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M14)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸，第169位的亮氨酸被置换为天冬氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号66表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M15)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丝氨酸，第169位的亮氨酸被置换为谷氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号67表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M16)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丝氨酸，第169位的亮氨酸被置换为脯氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号68表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M17)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸，第169位的亮氨酸被置换为甘氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
pNPG5，pNPG5M1，pNPG5M2，pNPG5M3，pNPG5M4，pNPG5M5，pNPG5M6，pNPG5M7，pNPG5M8，pNPG5M9，pNPG5M10，pNPG5M11，pNPG5M12，pNPG5M13，pNPG5M14，pNPG5M15，pNPG5M16和pNPG5M17各重组质粒转化大肠杆菌的感受态细胞(大肠杆菌(Eschrichia coli)JM109，东洋纺织制)，分别得到该质粒转化的转化子。
实施例3能在假单胞杆菌属细菌中复制的表达载体的构建
实施例2得到的重组质粒pNPG5M1的DNA5μg用限制性内切酶BamHI和XHoI(东洋纺织制)切断，分离突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的结构基因部分。将分离到的DNA和用BamHI和XhoI切断的TM33(1μg)一起，用1单位T4DNA连接酶在16℃使其反应16小时，将DNA连接。连接好的DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞。得到的表达质粒命名为pNPG6M1。
pNPG5，pNPG5M2，pNPG5M3，pNPG5M4，pNPG5M5，pNPG5M6，pNPG5M7，pNPG5M8，pNPG5M9，pNPG5M10，pNPG5M11，pNPG5M12，pNPG5M13，pNPG5M14，pNPG5M15，pNPG5M16和pNPG5M17等各个重组质粒也依上法得到表达质粒。得到的表达质粒分别命名为pNPG6，pNPG6M2，pNPG6M3，pNPG6M4，pNPG6M5，pNPG6M6，pNPG6M7，pNPG6M8，pNPG6M9，pNPG6M10，pNPG6M11，pNPG6M12，pNPG6M13，pNPG6M14，pNPG6M15，pNPG6M16和pNPG6M17。
实施例4假单胞杆菌属细菌转化子的制备
恶臭假单胞杆菌TE3493(微工研寄12298号)在LBG培养基(LB培养基+0.3％甘油)中30℃培养16小时，离心(12000rpm，10分钟)分离回收菌体，向该菌体中加入冰冷的含300mM蔗糖的5mM磷酸钾缓冲液(pH7.08ml)，以悬浮菌体。再离心(12000rpm，10分钟)分离回收菌体，向菌体中加入冰冷的含300mM蔗糖的5mM磷酸钾缓冲液(pH7.0 0.4ml)悬浮菌体。在该悬浊液中加入实施例3得到的表达质粒pNPG6M1(0.5μg)，用电穿孔法转化。在含100μg/ml链霉素的LB琼脂培养基上培养出菌落，得到所需转化子。
pNPG6，pNPG6M2，pNPG6M3，pNPG6M4，pNPG6M5，pNPG6M6，pNPG6M7，pNPG6M8，pNPG6M9，pNPG6M10，pNPG6M11，pNPG6M12，pNPG6M13，pNPG6M14，pNPG6M15，pNPG6M16和pNPG6M17等表达质粒，也按上述同样方法分别得到转化子。
试验例1
GDH活性的测定方法(非测定比活性时使用)
测定原理
D-葡萄糖+PMS+PQQGDH→D-萄糖酸基-1，5-内酯+PMS(还原态)
2PMS(还原态)+NTB→2PMS+二甲
由于N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(PMS)(还原态)还原硝基四唑氮蓝(Nitro Tetrazolium Blue NTB)形成二甲(diformazane)，用分光光度计在570nm波长测定。
单位定义
在以下所述条件下，一个单位指每分钟形成0.5mM二甲的PQQGDH量。
(3)方法
试剂
A.葡萄糖溶液：0.5M(0.9g D-葡萄糖(分子量180.16)/10ml H2O)
B.PIPES-NaOH缓冲液，pH6.5，50mM(悬浊在60mL水中的1.51gPIPES(分子量302.36)，溶解在5N NaOH溶液中，加入2.2ml 10％TritonX-100。在25℃下用5N NaOH溶液调整到pH到6.5±0.05，加水成100ml。)
C.PMS溶液：3.0mM(9.19mg N-甲基吩嗪甲基硫酸盐(分子量817.65)/10ml H2O)还原硝基四唑氮蓝
D.NTB溶液：6.6mM(53.96mg硝基四唑氮蓝(分子量817.65)/10ml H2O)。
E.酶稀释用液：含1mM CaCl2，0.1％Triton X-100，和0.1％BSA的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)
测定步骤
以下反应混合物在深色瓶中制备，在冰上储存(用时配制)。
1.8ml D-葡萄糖溶液(A)
24.6ml PIPES-NaOH溶液(pH6.5)(B)
2.0ml PMS溶液(C)
1.0ml NTB溶液(D)
表1
| 检测混合物中的浓度 | |
| PIPES缓冲液 | 42mM |
| D-葡萄糖 | 30mM |
| PMS | 0.20mM |
| NTB | 0.22mM |
3ml反应混合物被装入试管中(塑料制)37℃预温5分钟。加入0.1ml酶液，轻慢地反转试管加以混合。
保持37℃，用分光光度计在570nm波长下，以水为对照，记录4～5分钟。根据曲线的开始呈直线的部分的一段计算ΔOD(OD试验)。
用酶稀释用液(E)代替酶溶液，按同样方法重复操作，测定空白值(ΔOD空白)。
临检测前用冰冷的酶稀释用液(E)溶解酶粉末，用同一缓冲液稀释为0.1-0.8U/ml(由于该酶的吸附性，优选使用塑料试管)
按以下公式计算活性
U/ml＝{ΔOD/min(ΔOD试验-ΔOD空白)×Vt×df}/(20.1×1.0×Vs)
U/mg＝(U/ml)×1/C
Vt：总体积(3ml)
Vs：样品体积(1ml)
20.1：二甲1/2毫摩尔分子吸光系数
1.0：光径(cm)
df：稀释系数
C：溶液中的酶浓度(c mg/ml)
全酶型表达的酶纯品的制备方法(本节只适用于实施例1～14)
500mlTB培养基装入2L的坂口摇瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却后加入单独除菌的链霉素，使其浓度达到100μg/ml。用事先在含100μg/ml链霉素的PY培养基中30℃培养24小时的恶臭假单胞杆菌TE3493菌株(pNPG6M1)培养液5ml接种上述培养基，30℃通气振荡培养40小时。结束培养时，按上述活性测定，依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的活性为大约120U/ml。
离心分离收集上述菌体，悬浊在20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，用超声波破碎。再进行离心，得到的上清液即为粗酶液。所获粗酶液用HiTrap-SP(AmershamPhamacia)离子交换柱进行层析分离和纯化。酶溶液对10mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)透析后，加入氯化钙使其终浓度为1mM。最后用HiTrap-DEAE(AmaciaPhamacia)离子交换柱进行层析分离和纯化。得到纯酶。本方法所得纯酶在SDS-PAGE时几乎只显示一条带。
用pNPG6，pNPG6M2，pNPG6M3，pNPG6M4，pNPG6M5，pNPG6M6，pNPG6M7，pNPG6M8，pNPG6M9，pNPG6M10，pNPG6M11，pNPG6M12，pNPG6M13，pNPG6M14，pNPG6M15，pNPG6M16和pNPG6M17等在恶臭假单胞杆菌TE3493菌株中得到的转化子中，也按上述同样方法得到纯酶。
将获得的这些纯酶用来进行性能评价。
Km值的测定
根据上述活性测定方法，测定PQQGDH的活性。对葡萄糖Km值的测定，通过改变上述活性测定方法中底物浓度的办法来进行。对麦芽糖Km值的测定，则将上述方法中的葡萄糖溶液换成麦芽糖溶液，与测定对葡萄糖Km值一样通过改变底物浓度的办法来进行。结果见表2A，表2B，表6，表9和表14。
底物特异性(本节只适用于实施例1～14)
根据上述活性测定方法，测定PQQGDH的活性。测定以葡萄糖为底物溶液时的脱氢酶活性值和以麦芽糖为底物溶液时的脱氢酶活性值，将以葡萄糖为底物时的测定值定为100，求得相对值。在以麦芽糖为底物溶液时的脱氢酶活性值时，配制0.5M的麦芽糖溶液作活性测定用。结果见表2A，表2B，表4，表5，表6，表8，表9，表11，表13和表14。
热稳定性测定
将各种PQQGDH均以5U/ml的浓度保存在缓冲液(含1mM CaCl2，1μM PQQ的10mM PIPES-NaOH，pH6.5)中，得到经58℃热处理后的活性残存率。结果见表2A，表2B，表6，表9和表14。热处理的时间，除表2B是30分钟外，其余试验都是20分钟。
最适pH测定
在含有0.22％Triton-X100的50mM磷酸缓冲液(pH5.0～8.0)，含有0.22％Triton-X100的50mM乙酸缓冲液(pH3.0～6.0)，含有0.22％Triton-X100的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.0～7.0)，含有0.22％Triton-X100的50mM Tris-盐酸缓冲液(pH7.0～9.0)中测定酶活性。结果见图1所示。在表2A中表示了显示最高活性的pH。在该表中，比活性用酶活性(U/mL)/A280nm的吸光度(ABS)表示。Km值则分别以Km(Mal)表示对麦芽糖的Km值(mM)，以Km(Glc)表示对葡萄糖的Km值(mM)。
表2
| A | ||||||
| 突变位置 | 比活性 | 底物特异性 | Km(Mal) | Km(Glc) | 最适pH | 热稳定性 |
| Q76N | 49 | 66％ | 13.6 | 3.1 | 6.4 | 49.1％ |
| Q76E | 36 | 68％ | 13.6 | 3.7 | 5.6 | 42.5％ |
| Q76T | 32 | 84％ | 10.3 | 2.5 | 6.4 | 49.0％ |
| Q76M | 108 | 81％ | 8.7 | 2.2 | 6.4 | 55.3％ |
| Q76G | 32 | 84％ | 10.6 | 2.2 | 6.4 | 58.5％ |
| Q76K | 84 | 32％ | 29.9 | 7.9 | 6.8 | 48.4％ |
| Q168I | 231 | 69％ | 11.9 | 5.3 | 6.8 | 27.3％ |
| Q168V | 377 | 71％ | 13.0 | 6.4 | 6.4 | 32.2％ |
| Q168A | 333 | 37％ | 35.3 | 10.4 | 6.4 | 59.2％ |
| 野生型 | 1469 | 103％ | 4.1 | 6.5 | 6.4 | 46.7％ |
注：比活性：酶活性(U/mL)/280nm的吸收值(ABS)
Km(Mal)：麦芽糖的Km值
Km(Glc)：葡萄糖的Km值
B
| 突变 | 比活性 | 底物特异性 | 热稳定性 |
| K20E | 924 | 105％ | 49.7％ |
| Q76M | 108 | 81％ | 52.3％ |
| Q76G | 32 | 84％ | 55.1％ |
| K89E+K300R | 1038 | 81％ | 58.8％ |
| Q168A | 333 | 37％ | 55.8％ |
| Q246H | 686 | 192％ | 82.2％ |
| Q168S+L169S | 288 | 33％ | 73.0％ |
| Q168A+L169D | 106 | 18％ | 78.8％ |
| Q168S+L169E | 270 | 19％ | 47.0％ |
| Q168S+L169P | 460 | 25％ | 47.2％ |
| Q168A+L169G | 170 | 18％ | 78.3％ |
| 野生型 | 1469 | 103％ | 43.4％ |
注：比活性：酶活性(U/mL)/280nm的吸收值(ABS)
验证Q76K定量葡萄糖的性能
配制含0.45U/ml Q76K的下列反应试剂
50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)
1mM CaCl2
0.22％Triton-X100
0.4mM PMS
0.26mM WST-1(水溶性四唑盐，同仁化学研究所制)
根据下述测定葡萄糖的方法，用样品，纯水，100mg/dl标准溶液和葡萄糖水溶液(600mg/dl)的十倍系列稀释液测定，确认了它的直线性相关。结果见图2所示。
测定葡萄糖含量的方法
3μl样品中加入300μl试剂，加入2分钟后每隔1分钟记录吸光度的变化，根据纯水和100mg/dl标准葡萄糖溶液之间两点的标准曲线求得葡萄糖含量。测定仪器用日立7150型自动分析装置，测定波长只用主波长480nm，测定温度为37℃。
通过图2，在0到600mg/dl范围内确认有良好的线性关系。
验证Q76K对麦芽糖的活性
配制含0.45U/ml Q76K的下列反应试剂
50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)
1mM CaCl2
0.22％Triton-X100
0.4mM PMS
0.26mM WST-1(同仁化学研究所制)
以100mg/dl或300mg/dl葡萄糖为本底，添加0，120，240，360mg/dl的麦芽糖倍增含量制备样品。根据上述葡萄糖定量方法进行测定。以不含麦芽糖的100mg/dl葡萄糖的测量值为100，以含100mg/dl葡萄糖的样品测定值为基准分别进行相对值评价。同样以以不含麦芽糖的300mg/dl葡萄糖的测定值为100，以含300mg/dl葡萄糖的样品测定值为基准分别进行相对值评价。结果见图3。
验证Q76E对麦芽糖的活性
按验证Q76K对麦芽糖的活性相同的方法，用Q76E对其活性进行评价。酶添加量为0.24U/ml。结果见图4。
验证Q168V对麦芽糖的活性
按验证Q76K对麦芽糖的活性相同的方法，用Q168V对其活性进行评价。酶添加量为0.35U/ml。结果见图5。
验证Q168A对麦芽糖的活性
按验证Q76K对麦芽糖的活性相同的方法，用Q168A对其活性进行评价。酶添加量为0.6U/ml。结果见图6。
验证野生型酶对麦芽糖的活性
按验证Q76K对麦芽糖的活性相同的方法，用野生型酶对其活性进行评价。酶添加量为0.1U/ml。结果见图7。
由图3，图4，图5，图6，图7可见，Q76K，Q76E，Q168V和Q168A对麦芽糖的活性都比野生型酶要低下。
实施例5突变基因文库的构建和筛选
以表达质粒pNPG5为模板，用PCR法在结构基因的167～169区域插入随机突变。PCR在表3所示组成之溶液中，以98℃2分钟，随之98℃20秒，60℃30秒和72℃4分钟进行30个循环的条件下进行。
表3
| 试剂 | 液体量 |
| KOD Dash DNA多聚酶(2.5U/μl) | 1.0μl |
| 模板DNA | 1.0μl |
| 正向引物(序列编号12表示) | 2.5μl |
| 反向引物(序列编号13表示) | 2.5μl |
| 10X缓冲液 | 5.0μl |
| 2mM dNTPs | 5.0μl |
| H2O | 33.0μl |
将得到的突变文库转化大肠杆菌DH5α菌株，将长出的每个菌落分别接种在微量滴定板的孔中，每孔盛有180μl LB培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素和26μM PQQ)，并在37℃培养24小时。将50μl培养液分别转移到另一微量滴定板的孔中，反覆冷冻和融化以破碎菌体，然后离心(2000rpm，10分钟)分离回收上清液。将上清液各10μl分别注入2块血清滴定板的孔中。其中一块以葡萄糖为底物用活性测定试剂测定其活性，另一块以麦芽糖为底物用活性测定试剂测定其活性。然后比较其反应性能。得到多个对麦芽糖的活性发生改变的克隆。
将对麦芽糖的活性发生改变的克隆在分装了5ml LB培养基(含有100μg/ml氨苄青霉素和26μM PQQ)的试管中培养，进行验证实验，得到多个对麦芽糖的活性发生改变的克隆。
结果见表4。
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| N167E+Q168G+L169T | 64％ | N167S+Q168N+L169R | 80％ |
| Q168G+L169T | 42％ | N167G+Q168S+L169Y | 55％ |
| N167L+Q168S+L169G | 45％ | N167G+Q168S+L169S+L174F+K49N | 39％ |
| Q168N+L169N+S189R | 51％ | N167E+Q168G+L169A+S189G | 58％ |
| N167G+Q168R+L169A | 66％ | N167S+Q168G+L169A | 48％ |
| N167G+Q168V+L169S | 42％ | N167S+Q168V+L169S | 71％ |
| N167T+Q168I+L169G | 42％ | N167G+Q168W+L169N | 72％ |
| N167G+Q168S+L169N | 50％ | N167G+Q168S+L169V | 36％ |
| Q168R+L169C | 29％ | N167S+Q168L+L169G | 41％ |
| Q168C+L169S | 33％ | N167T+Q168N+L169K | 68％ |
| N167G+Q168T+L169A+S207C | 24％ | N167G+Q168A+L169P | 63％ |
| N167G+Q168S+L169G | 34％ | N167G+Q168G | 46％ |
| N167G+Q168D+L169K | 35％ | Q168P+L169G | 23％ |
| N167G+Q168N+L169S | 59％ | Q168S+L169G | 22％ |
| N188I+T349S | 64％ | N167G+Q168G+L169A+F215Y | 32％ |
| N167G+Q168T+L169G | 28％ | Q168G+L169V | 43％ |
| N167G+Q168V+L169T | 43％ | N167E+Q168N+L169A | 52％ |
| Q168R+L169A | 72％ | N167G+Q168R | 23％ |
| N167G+Q168T | 69％ | N167G+Q168T+L169Q | 72％ |
| Q168I+L169G+K300T | 24％ | N167G+Q168A | 33％ |
| N167T+Q168L+L169K | 63％ | N167M+Q168Y+L169G | 60％ |
| N167E+Q168S | 32％ | N167G+Q168T+L169V+S189G | 42％ |
| N167G+Q168G+L169C | 37％ | N167G+Q168K+L169D | 41％ |
| Q168A+L169D | 16％ | Q168S+E245D | 29％ |
| Q168S+L169S | 26％ | A351T | 74％ |
| N167S+Q168S+L169S | 51％ | Q168I+L169Q | 51％ |
| N167A+Q168S+L169S | 40％ | Q168A | 35％ |
| Q168S+L169P | 20％ | Q168A+L169G | 16％ |
| Q168S+L169E | 15％ |
同样，在67-69区域(正向引物用序列编号14表示的序列，反向引物用序列编号15表示的序列)，129-131区域(正向引物用序列编号16表示的序列，反向引物用序列编号17表示的序列)，341-343区域(正向引物用序列编号18表示的序列，反向引物用序列编号19表示的序列)引起突变。同时在428和429两位点之间(正向引物用序列编号20表示的序列，反向引物用序列编号21表示的序列)插入突变。这些试验的结果见表5
表5
| 67-69区域 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| P67K+E68K | 79％ | P67R+E68R+169C | 80％ | |
| P67D+E68T+169C | 60％ | |||
| 129-131区域 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| E129R+K130G+P131G | 73％ | E129Q+K130T+P131R | 80％ | |
| E129N+P131T | 67％ | E129A+K130R+P131K | 70％ | |
| 341-343区域 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| E341L+M342P+A343R | 80％ | E341S+M342I | 80％ | |
| A343I | 45％ | E341P+M342V+A343C | 50％ | |
| E341P+M342V+A343R | 76％ | E341L+M342R+A343N | 51％ | |
| 428和429间 | 插入氨基酸 | 对麦芽糖的活性 | 插入氨基酸 | 对麦芽糖的活性 |
| L | 73％ | A | 71％ | |
| K | 79％ |
从其中选出对麦芽糖活性显著降低的变体(Q168S+E245D，Q168A+L169D，Q168S+L169S，Q168S+L169E，Q168A+L169G，Q168S+L169P)，从这些变体中提取质粒。按实施例3和实施例4所述方法转化假单胞杆菌，表达全酶，得到纯化酶后评价其性质。结果见表6。在表6中，比活性用酶活性(U/ml)/A280nm吸光度表示。
表6
| 突变 | 比活性 | 底物特异性 | Km值(Mal) | Km值(Glc) | 热稳定性 |
| Q168S+E245D | 714 | 29％ | 24.3 | 14.4 | 55.5％ |
| Q168A+L169D | 106 | 18％ | 65.9 | 20.8 | 89.4％ |
| Q168S+L169S | 288 | 33％ | 55.1 | 14.4 | 83.9％ |
| Q168S+L169P | 460 | 25％ | 87.1 | 24.1 | 76.3％ |
| Q168A+L169G | 170 | 18％ | 60.4 | 18.6 | 89.5％ |
| Q168S+L169E | 270 | 19％ | 70.7 | 8.9 | 63.3％ |
| Q168A | 313 | 43％ | 64.4％ | ||
| 野生型 | 1469 | 110％ | 59.8％ |
注：比活性：酶活性(U/ml)/A280nm吸光度
实施例6Q168位点突变对底物特异性的影响
依据实施例5的方法制备Q168C，Q168D，Q168E，Q168F，Q168G，Q168H，Q168K，Q168L，Q168M，Q168N，Q168P，Q168R，Q168S，Q168T，Q168W和Q168Y等各种变体。制备各种突变体使用的引物见表7。比较用所制备的各种突变体在试管培养中培养和破碎细胞后的对麦芽糖的活性，其结果见表8。还从各种变体中抽提质粒，依据实施例3和实施例4所述方法转化假单胞杆菌并表达全酶，得到纯酶，对其特性进行评价。结果见表9。表9中比活性用酶活性(U/ml)/A280nm吸光度表示。
表7
| 突变位点 | 正向引物 | 反向引物 |
| Q168C | 序列编号22 | 序列编号23 |
| Q168D | 序列编号22 | 序列编号24 |
| Q168E | 序列编号22 | 序列编号25 |
| Q168F | 序列编号22 | 序列编号26 |
| Q168G | 序列编号22 | 序列编号27 |
| Q168H | 序列编号22 | 序列编号28 |
| Q168K | 序列编号22 | 序列编号29 |
| Q168L | 序列编号22 | 序列编号30 |
| Q168M | 序列编号22 | 序列编号31 |
| Q168N | 序列编号22 | 序列编号32 |
| Q168P | 序列编号22 | 序列编号33 |
| Q168R | 序列编号22 | 序列编号34 |
| Q168S | 序列编号22 | 序列编号35 |
| Q168T | 序列编号22 | 序列编号36 |
| Q168W | 序列编号22 | 序列编号37 |
| Q168Y | 序列编号22 | 序列编号38 |
表8
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| Q168C | 54％ | Q168M | 64％ |
| Q168D | 29％ | Q168N | 82％ |
| Q168E | 36％ | Q168P | 103％ |
| Q168F | 43％ | Q168R | 36％ |
| Q168G | 46％ | Q168S | 60％ |
| Q168H | 55％ | Q168T | 94％ |
| Q168K | 83％ | Q168W | 87％ |
| Q168L | 92％ | Q168Y | 93％ |
| 野生型 | 104％ |
表9
| 突变 | 比活性 | 底物特异性 | Km(Mal) | Km(Glc) | 热稳定性 |
| Q168C | 55 | 58％ | 20.4 | 10.7 | 18.2％ |
| Q168D | 102 | 46％ | 27.4 | - | 61.4％ |
| Q168E | 110 | 51％ | 4.7 | 8.6 | 75.4％ |
| Q168F | 137 | 52％ | 36.4 | 10.3 | 55.5％ |
| Q168G | 667 | 78％ | 11.1 | - | 78.7％ |
| Q168H | 486 | 58％ | 10.2 | 5.4 | 76.0％ |
| Q168K | 5 | 80％ | 9.6 | 2.2 | - |
| Q168L | 110 | 96％ | 8.6 | 4.3 | 37.1％ |
| Q168M | 190 | 68％ | 22.7 | 5.3 | 78.4％ |
| Q168N | 68 | 93％ | 3.6 | 4.1 | - |
| Q168P | 128 | 106％ | 3.5 | 5.1 | 82.3％ |
| Q168R | 57 | 60％ | 18.4 | 3.8 | 32.9％ |
| Q168S | 483 | 81％ | 12.5 | 3.7 | 80.1％ |
| Q168T | 11 | 103％ | 15.0 | 6.9 | - |
| Q168W | 287 | 96％ | 5.3 | 3.2 | 59.2％ |
| Q168Y | 297 | 99％ | 12.1 | 6.9 | 100.0％ |
| 野生型 | 1285 | 106％ | 3.8 | 6.3 | 52.2％ |
实施例7L169位点突变对底物特异性的影响
依据实施例2的方法制备L169A，L169V，L169H，L169Y，L169K，L169D，L169S，L169N，L169G和L169C等各种变体。制备各种突变体使用的引物见表10。比较用所制备的各种变体在试管培养中培养和破碎细胞后的对麦芽糖的活性，其结果见表11。
| 突变位点 | 正向引物 | 反向位点 |
| L169A | 序列编号39 | 与序列编号39互补的合成寡核苷酸 |
| L169V | 序列编号40 | 与序列编号40互补的合成寡核苷酸 |
| L169Y | 序列编号41 | 与序列编号41互补的合成寡核苷酸 |
| L169H | 序列编号42 | 与序列编号42互补的合成寡核苷酸 |
| L169K | 序列编号43 | 与序列编号43互补的合成寡核苷酸 |
| L169D | 序列编号44 | 与序列编号44互补的合成寡核苷酸 |
| L169S | 序列编号45 | 与序列编号45互补的合成寡核苷酸 |
| L169N | 序列编号46 | 与序列编号46互补的合成寡核苷酸 |
| L169G | 序列编号47 | 与序列编号47互补的合成寡核苷酸 |
| L169C | 序列编号48 | 与序列编号48互补的合成寡核苷酸 |
表11
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| L169A | 59％ | L169D | 38％ |
| L169V | 78％ | L169S | 57％ |
| L169Y | 107％ | L169N | 74％ |
| L169H | 85％ | L169G | 48％ |
| L169K | 60％ | L169C | 57％ |
| 野生型 | 97％ |
实施例8对Q168突变组合L169部位突变对底物特异性的影响
依据实施例5所述方法制备Q168A+L169A，Q168A+L169C，Q168A+L169E，Q168A+L169F，Q168A+L169H，Q168A+L169I，Q168A+L169K，Q168A+L169M，Q168A+L169N，Q168A+L169P，Q168A+L169Q，Q168A+L169R，Q168A+L169S，Q168A+L169T，Q168A+L169V，Q168A+L169W，Q168A+L169Y等各种变体。制备各种变体使用的引物见表12。比较用所制备的各种变体在试管培养中培养和破碎细胞后的对麦芽糖的活性，其结果见表13。还从各种变体中抽提质粒，依据实施例3和实施例4所述方法转化假单胞杆菌并表达全酶，得到纯酶，对其特性进行评价。结果见表14。表14中比活性用酶活性(U/ml)/A280nm吸光度表示。
表12
| 突变位点 | 正向引物 | 反向引物 |
| Q168A+L169A | 序列编号12 | 序列编号49 |
| Q168A+L169C | 序列编号12 | 序列编号50 |
| Q168A+L169E | 序列编号12 | 序列编号51 |
| Q168A+L169F | 序列编号12 | 序列编号52 |
| Q168A+L169H | 序列编号12 | 序列编号53 |
| Q168A+L169I | 序列编号12 | 序列编号54 |
| Q168A+L169K | 序列编号12 | 序列编号55 |
| Q168A+L169M | 序列编号12 | 序列编号56 |
| Q168A+L169N | 序列编号12 | 序列编号57 |
| Q168A+L169P | 序列编号12 | 序列编号58 |
| Q168A+L169Q | 序列编号12 | 序列编号59 |
| Q168A+L169R | 序列编号12 | 序列编号60 |
| Q168A+L169S | 序列编号12 | 序列编号61 |
| Q168A+L169T | 序列编号12 | 序列编号62 |
| Q168A+L169V | 序列编号12 | 序列编号63 |
| Q168A+L169W | 序列编号12 | 序列编号64 |
| Q168A+L169Y | 序列编号12 | 序列编号65 |
表13
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| Q168A+L169A | 19％ | Q168A+L169P | 24％ |
| Q168A+L169C | 7％ | Q168A+L169Q | 42％ |
| Q168A+L169E | 17％ | Q168A+L169R | 42％ |
| Q168A+L169F | 22％ | Q168A+L169S | 14％ |
| Q168A+L169H | 21％ | Q168A+L169T | 24％ |
| Q168A+L169I | 43％ | Q168A+L169V | 34％ |
| Q168A+L169K | 21％ | Q168A+L169W | 33％ |
| Q168A+L169M | 22％ | Q168A+L169Y | 37％ |
| Q168A+L169N | 19％ | 野生型 | 104％ |
表14
| 突变 | 比活性 | 底物特异性 | Km值(Mal) | Km值(Glu) | 热稳定性 |
| Q168A+L169A | 154 | 19％ | 126 | 33.0 | 86.2％ |
| Q168A+L169C | 63 | 13％ | 103 | 35.6 | 100.0％ |
| Q168A+L169E | 90 | 19％ | 8.6 | 20.4 | 100.0％ |
| Q168A+L169F | 138 | 27％ | 44.7 | 10.4 | 80.4％ |
| Q168A+L169H | 70 | 27％ | 99.2 | 15.5 | 100.0％ |
| Q168A+L169I | 43 | 53％ | 12.5 | 6.0 | 28.7％ |
| Q168A+L169K | 129 | 20％ | 20.4 | 26.7 | 100.0％ |
| Q168A+L169M | 80 | 23％ | 52.3 | 15.6 | - |
| Q168A+L169N | 167 | 22％ | 59.1 | 34.5 | 83.5％ |
| Q168A+L169P | 377 | 24％ | 58.0 | 13.9 | 79.9％ |
| Q168A+L169Q | 117 | 49％ | 156.9 | 5.4 | 100.0％ |
| Q168A+L169R | 32 | 45％ | 59.0 | 9.6 | 100.0％ |
| Q168A+L169S | 42 | 24％ | 15.6 | 21.0 | - |
| Q168A+L169T | 98 | 23％ | 33.5 | 15.2 | 83.7％ |
| Q168A+L169V | 41 | 27％ | 49.1 | 24.7 | 40.4％ |
| Q168A+L169W | 91 | 38％ | 63.3 | 10.8 | 49.4％ |
| Q168A+L169Y | 31 | 52％ | 13.6 | 11.6 | 74.3％ |
| 野生型 | 1285 | 106％ | 3.8 | 6.3 | 52.2％ |
注：比活性：酶活性(U/ml)/A280nm吸光度
实施例9A170位点突变对底物特异性的影响
依据实施例2的方法制备A170C，A170D，A170E，A170F，A170G，A170H，A170K，A170L，A170M，A170N，A170P，A170R，A170S，A170T，A170W，A170Y，A170V，A170I，A170Q等各种变体。制备各种变体使用的正向引物为序列编号69所示之合成寡核苷酸，反向引物为与序列编号69互补的合成寡核苷酸。从制备的突变文库筛选获得所需要的突变体。比较用所制备的各种变体在试管培养中培养和破碎细胞后的对麦芽糖的活性，其结果见表15。
表15
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| A170G | 98％ | A170K | 87％ |
| A170V | 91％ | A170R | 108％ |
| A170L | 86％ | A170C | 92％ |
| A170I | 85％ | A170M | 90％ |
| A170S | 100％ | A170F | 82％ |
| A170T | 92％ | A170Y | 88％ |
| A170D | 102％ | A170W | 79％ |
| A170E | 103％ | A170H | 98％ |
| A170N | 100％ | A170P | 28％ |
| A170Q | 99％ | 野生型 | 98％ |
实施例10E245位点突变对底物特异性的影响
依据实施例2的方法制备E245C，E245D，E245A，E245F，E245G，E245H，E245K，E245L，E245M，E245N，E245P，E245R，E245S，E245T，E245W，E245Y，E245V，E245I，E245Q等各种变体。制备各种变体使用的正向引物为序列编号70所示之合成寡核苷酸，反向引物为与序列编号70互补的合成寡核苷酸。从制备的突变文库筛选获得所需要的变体。比较用所制备的各种变体在试管培养中培养和破碎细胞后的对麦芽糖的活性，其结果见表16。
表16
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| E245A | 99％ | E245Q | 72％ |
| E245D | 49％ | E245S | 98％ |
| E245F | 64％ | E245T | 89％ |
| E245H | 54％ | E245V | 85％ |
| E245I | 114％ | E245W | 92％ |
| E245K | 活性消失 | E245Y | 活性消失 |
| E245L | 活性消失 | E245R | 94％ |
| E245M | 69％ | E245G | 92％ |
| E245N | 59％ | E245C | 75％ |
| E245P | 活性消失 | 野生型 | 98％ |
实施例11N249位点突变对底物特异性的影响
依据实施例2的方法制备N249C，N249D，N249A，N249F，N249G，N249H，N249K，N249L，N249M，N249E，N249P，N249R，N249S，N249T，N249W，N249V，N249I，N249Q等各种变体。制备各种变体使用的正向引物为序列编号71所示之合成寡核苷酸，反向引物为与序列编号71互补的合成寡核苷酸。从制备的突变文库筛选获得所需要的变体。比较用所制备的各种变体在试管培养中培养和破碎细胞后的对麦芽糖的活性，其结果见表17。
表17
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| N249G | 82％ | N249K | 184％ |
| N249A | 77％ | N249R | 191％ |
| N249V | 157％ | N249C | 107％ |
| N249L | 94％ | N249M | 170％ |
| N249I | 137％ | N249F | 活性消失 |
| N249S | 活性消失 | N249W | 活性消失 |
| N249T | 活性消失 | N249H | 343％ |
| N249D | 活性消失 | N249P | 活性消失 |
| N249E | 86％ | 野生型 | 106％ |
| N249Q | 79％ |
实施例12与E245D位点突变组合其它位点突变对底物特异性的影响
依据实施例2的方法制备(Q168A+L169G+E245D)，(Q168A+L169P+E245D)等各种变体。制备各种变体使用的正向引物为序列编号72所示之合成寡核苷酸，反向引物为与序列编号72互补的合成寡核苷酸。模板则用实施例8得到的(Q168A+L169G)或(Q168A+L169P)的质粒。将制备的突变体。在试管培养中培养和破碎细胞后比较对麦芽糖的活性，其结果见表18。
表18
| 突变 | 比活性 | 底物特异性 | Km值(Mal) | Km值(Glu) | 热稳定性 |
| Q168A+L169G+E245D | 138 | 11％ | 228.8 | 59.5 | 97.2％ |
| Q168A+L169P+E245D | 382 | 15％ | 126.8 | 41.6 | 86.2％ |
| 野生型 | 1285 | 107％ | 3.8 | 6.3 | 49.6％ |
实施例13T349位点突变对底物特异性的影响
依据实施例2的方法制备T349S，T349P，T349Y等各种突变体。制备各种突变体使用的正向引物为序列编号73所示之合成寡核苷酸，反向引物为与序列编号73互补的合成寡核苷酸。从制备的突变文库筛选获得所需要的变体。比较在试管培养中培养和破碎细胞后对麦芽糖的活性，其结果见表19。
表19
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| T349S | 49％ | T349Y | 90％ |
| T349P | 32％ |
实施例14N429位点突变对底物特异性的影响
依据实施例2的方法制备N429F，N429P，N429L，N429Y等各种变体。制备各种变体使用的正向引物为序列编号74所示之合成寡核苷酸，反向引物为与序列编号74互补的合成寡核苷酸。从制备的突变文库筛选获得所需要的变体。比较在试管培养中培养和破碎细胞后对麦芽糖的活性，其结果见表20。
表20
| 突变位点 | 对麦芽糖的活性 | 突变位点 | 对麦芽糖的活性 |
| N429F | 69％ | N429L | 97％ |
| N429P | 44％ | N429Y | 68％ |
实施例101：依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的表达质粒的构建
与实施例1所述方法相同。
实施例102：修饰的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的制备
以含有野生型依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pNPG5和序列编号75表示的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸为基础，用QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit(STRATAGENE制)，根据说明书进行诱变处理操作，确定其碱基序列，得到编码序列编号1所表示的氨基酸序列中第74位天冬氨酸被缬氨酸置换的突变突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒(pNPG5-74V)。
以pNPG5与序列编号76表示的合成寡核苷酸和与该序列互补的合成寡核苷酸为基础，以与上述方法相同的方法，得到重组了编码突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒(pNPG5-342I)，该酶中序列编号1表示的氨基酸序列中的第342位蛋氨酸置换成了异亮氨酸。
采用与上述同样方法，用按置换特定部位目标氨基酸的设计而合成的寡核苷酸和与该序列互补的合成寡核苷酸，得到其它重组了编码突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒，这些重组质粒包括：编码突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒(pNPG5-342V)，该酶中序列编号1表示的氨基酸序列中的第342位甲硫氨酸置换成了缬氨酸；编码突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒(pNPG5-342P)，该酶中序列编号1表示的氨基酸序列中的第342位甲硫氨酸置换成了脯氨酸；编码突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒(pNPG5-342A)，该酶中序列编号1表示的氨基酸序列中的第342位甲硫氨酸置换成了丙氨酸。还有编码重组了第146位丝氨酸置换成丙氨酸的突变的酶基因的质粒(pNPG5-146A)，编码重组了第170位丙氨酸置换成亮氨酸的突变的酶基因的质粒(pNPG5-170L)，编码重组了第170位丙氨酸置换成甲硫氨酸的突变的酶基因的质粒(pNPG5-170M)，编码重组了第170位丙氨酸置换成异亮氨酸的突变的酶基因的质粒(pNPG5-170I)，编码重组了第170位丙氨酸置换成苯丙氨酸的突变的酶基因的质粒(pNPG5-170F)。与这重组质粒相应的合成寡核苷酸以序列编号77-84表示。
将pNPG5，pNPG5-74V，pNPG5-342I，pNPG5-342V，pNPG5-342P，pNPG5-342A，pNPG5-146A，pNPG5-170L，pNPG5-170M，pNPG5-170I，pNPG5-170F等各种重组质粒转化大肠杆菌的感受态细胞(Eschrichiacoli JM109，东洋纺织制)，分别得到各自的转化子。
实施例103：能在假单胞杆菌属细菌中复制的表达载体的构建
实施例102中得到的重组质粒pNPG5-74V的DNA 5μg用限制性内切酶BamHI和XHoI(东洋纺织制)切断，分离突变突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的结构基因部分。将分离出的DNA与经限制性内切酶BamHI和XhoI切割的pTM33(1μg)，1单位的T4DNA连接酶一起在16℃使其反应16小时，将DNA连接。连接好的DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞。得到的表达质粒命名为pNPG6-74V。
pNPG5，pNPG5-342I，pNPG5-342V，pNPG5-342P，pNPG5-342A，pNPG5-146A，pNPG5-170L，pNPG5-170M，pNPG5-170I，pNPG5-170F等各种重组质粒，也按上述同样方法得到表达质粒。所得到的表达质粒命名为pNPG6，pNPG6-342I，pNPG6-342V，pNPG6-342P，pNPG6-342A，pNPG6-146A，pNPG6-170L，pNPG6-170M，pNPG5-170I，pNPG6-170F。
实施例104：假单胞杆菌属细菌转化子的制备
恶臭假单胞杆菌TE3493(微工研寄12298号)在LBG培养基(LB培养基+0.3％甘油)中30℃培养16小时，离心(12000rpm，10分钟)分离回收菌体。向该菌体中加入冰冷的含300mM蔗糖的5mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，8ml)，悬浮菌体。再离心(12000rpm，10分钟)分离回收菌体，向菌体中加入冰冷的含300mM蔗糖的5mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，0.4ml)悬浮菌体。
在该悬浊液中加入实施例103得到的表达质粒pNPG6-74V(0.5μg)，用电穿孔法转化。在含100μg/ml链霉素的LB琼脂培养基上培养出菌落，得到所需转化子。
pNPG6，pNPG6-342I，pNPG6-342V，pNPG6-342P，pNPG6-342A，pNPG6-146A，pNPG6-170L，pNPG6-170M，pNPG6-170I，pNPG6-170F等各种质粒也按与上述方法同样的方法得到各自的转化子。
实施例105：全酶型表达的酶纯品的制备方法(本节只适用于实施例101～106)
500mlTB培养基装入2L的坂口摇瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却后加入另行过滤除菌的链霉素，使其浓度达到100μg/ml。用事先在含100μg/ml链霉素的PY培养基中30℃培养24小时的恶臭假单胞杆菌TE3493菌株(pNPG6-74V)培养液5ml接种，30℃通气振荡培养40小时。结束培养时，按上述活性测定，PQQ依赖的葡萄糖脱氢酶活性为大约30U/ml。
离心分离收集上述菌体，悬浊在20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，用超声波破碎。再离心分离，得到的上清液即为粗酶液。所获粗酶液用HiTrap-SP(AmaciaPhamacia)离子交换柱进行层析分离和纯化。酶溶液对10mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)透析后，加入氯化钙使其终浓度为1mM。最后用HiTrap-DEAE(AmershamPhamacia)离子交换柱进行层析分离和纯化以得到纯酶。本方法所得纯酶在SDS-PAGE时几乎只显示一条带。
用pNPG6，pNPG6-342I，pNPG6-342V，pNPG6-342P，pNPG6-342A，pNPG6-146A，pNPG6-170L，pNPG6-170M，pNPG6-170I，pNPG6-170F等在恶臭假单胞杆菌TE3493菌株中得到的转化子中，也按上述同样方法得到纯酶。
将获得的这些纯酶用来进行性能评价。
底物特异性(本节只适用于实施例101～106)
根据上述活性测定方法，测定PQQGDH的活性。测定以葡萄糖为底物溶液时的脱氢酶活性值和以麦芽糖为底物溶液时的脱氢酶活性值，将以葡萄糖为底物时的测定值定为100，求得相对值。在以麦芽糖为底物溶液时的脱氢酶活性值时，配制0.5M的麦芽糖溶液作活性测定用。结果见表102。
在野生型PQQGH中，对葡萄糖和麦芽糖的活性几乎相等，而在本发明修饰的PQQGH中，对麦芽糖的活性被降低。
表102
| 氨基酸置换的部位 | 对麦芽糖的活性 |
| M342I | 79 |
| M342V | 74 |
| M342P | 80 |
| M342A | 83 |
| D74V | 90 |
| S146A | 90 |
| A170L | 77 |
| A170M | 76 |
| A170I | 74 |
| A170F | 65 |
| 野生型 | 100 |
实施例106：多位点突变体的制备与底物特异性
用pNPG5，pNPG5-74V，pNPG5-342I，pNPG5-342V，pNPG5-342P，pNPG5-342A，pNPG5-146A，pNPG5-170L，pNPG5-170M，pNPG5-170I，pNPG5-170F等质粒为模板，用序列编号80表示的合成寡核苷酸及与其互补的寡核苷酸，按第168位谷氨酰胺被置换成丙氨酸，第170位丙氨酸被置换成亮氨酸设计的序列编号85表示的序列设计的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸，以及按第168位谷氨酰胺被置换成丙氨酸，第169位亮氨酸被置换成脯氨酸和第170位丙氨酸被置换成甲硫氨酸设计的序列编号86表示的序列设计的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸，还有按第245位谷氨酸被置换成天冬氨酸设计的序列编号87表示的序列设计的合成寡核苷酸和与其互补的合成寡核苷酸，依照实施例102所述方法，得到编码序列编号1表示序列中第146位丝氨酸被置换成丙氨酸和第170位丙氨酸被置换成亮氨酸的突变的PQQGDH的重组质粒(pNPG5-146A+170L)，同样，得到以下各种重组质粒：
pNPG5-168A+169P+170L，pNPG5-146A+170M，pNPG5-168A+169P+170M，pNPG5-146A+168A+169P+170L，pNPG5-146A+168A+169P+170M，pNPG5-Q168A+L169P+170L+E245D，pNPG5-168A+170M+E245D，pNPG5-146A+342I，pNPG5-168A+L169P+170L+342I，pNPG5-168A+169P+170M+342I，pNPG5-146A+342V，pNPG5-168A+169P+170L+342V，pNPG5-168A+169P+170M+342V，pNPG5-146A+342P，pNPG5-168A+L169P+170L+342P，pNPG5-168A+169P+170M+342P，pNPG5-146A+342A，pNPG5-168A+169P+170L+342A，pNPG5-168A+169P+170M+342A，pNPG5-74V+146A，pNPG5-74V+168A+169P+170L，pNPG5-74V+168A+169P+170M，pNPG5-168A+169P+170L+245D+342I，pNPG5-168A+L169P+170M+245D+342I，pNPG5-168A+169P+170L+245D+342V，
pNPG5-168A+169P+170M+245D+342V，pNPG5-168A+169P+170L+245D+342A，pNPG5-168A+169P+170M+245D+342A。再由它们得到转化子。当不能采用不同的合成寡核苷酸通过一次引发的突变得到突变的质粒时，，重复两次操作得到该突变质粒。
另外，依据实施例103～105所述方法，从得到的各种转化子中得到纯化的酶，这些酶的氨基酸序列中以下部位发生了突变：(S146A+A170L)，(Q168A+L169P+A170L)，(S146A+A170M)，(Q168A+L169P+A170M)，(S146A+Q168A+L169P+A170L)，(S146A+Q168A+L169P+A170M)，(Q168A+L169P+A170L+E245D)，(Q168A+L169P+A170M+E245D)，(S146A+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+M342I)，(Q168A+L169P+A170M+M342I)，(S146A+M342V)，(Q168A+L169P+A170L+M342V)，(Q168A+L169P+A170M+M342V))，(S146A+M342P)，(Q168A+L169P+A170L+M342P)，(Q168A+L169P+A170M+M342P)，(S146A+M342A)，(Q168A+L169P+A170L+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+M342A)，(D74V+S146A)，(D74V+Q168A+L169P+A170L)，(D74V+Q168A+L169P+A170M)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342I)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342V)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342V)，(Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A)，(Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A)。
然后对该酶的底物特异性进行评价。结果见表103。
表103
| 氨基酸置换的部位 | 对麦芽糖的活性 |
| S146A+A170L | 73 |
| Q168A+L169P+A170L | 22 |
| S146A+A170M | 73 |
| Q168A+L169P+A170M | 25 |
| S146A+Q168A+L169P+A170L | 18 |
| S146A+Q168A+L169P+A170M | 22 |
| Q168A+L169P+A170L+E245D | 14 |
| Q168A+L169P+A170M+E245D | 14 |
| S146A+M342I | 75 |
| Q168A+L169P+A170L+M342I | 14 |
| Q168A+L169P+A170M+M342I | 15 |
| S146A+M342V | 73 |
| Q168A+L169P+A170L+M342V | 14 |
| Q168A+L169P+A170M+M342V | 16 |
| S146A+M342P | 76 |
| Q168A+L169P+A170L+M342P | 25 |
| Q168A+L169P+A170M+M342P | 25 |
| S146A+M342A | 78 |
| Q168A+L169P+A170L+M342A | 20 |
| Q168A+L169P+A170M+M342A | 20 |
| D74V+S146A | 78 |
| D74V+Q168A+L169P+A170L | 21 |
| D74V+Q168A+L169P+A170M | 24 |
| Q168A+L169P+A170L+E245D+M342I | 6.9 |
| Q168A+L169P+A170M+E245D+M342I | 8.8 |
| Q168A+L169P+A170L+E245D+M342V | 7.9 |
| Q168A+L169P+A170M+E245D+M342V | 8.4 |
| Q168A+L169P+A170L+E245D+M342A | 10 |
| Q168A+L169P+A170M+E245D+M342A | 14 |
| 野生型 | 102 |
实施例201
以下用几种修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶具体说明本发明。这些修饰酶是在由序列编号1表示的序列中发生了以下氨基酸置换：Q168A，(Q168A+L169G)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169P)，(Q168S+L169E)，(Q168S+L169P)。显然本发明不仅限于以下实施例。
本发明所用的Q168A，(Q168A+L169G)，(Q168A+L169C)，(Q168A+L169P)，(Q168S+L169E)，(Q168S+L169P)等各种修饰依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的纯化制品按以下步骤得到。
野生型依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因表达质粒的构建
野生型依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的表达质粒pNPG5，是将编码来自鲍氏不动杆菌NCIMB11517菌株的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的结构基因插入载体pBluescript SK(-)的多克隆位点而构建的质粒。其碱基序列表示如序列表中的序列编号2，根据该碱基序列推定的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列表示如序列表中的序列编号1。
突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的制备
以含有野生型依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶基因的重组质粒pNPG5和根据序列编号88表示的合成寡核苷酸和与其互补合成寡核苷酸为基础，采用QuickChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene制)，按其操作程序进行诱变操作，再确定碱基序列，得到重组质粒(pNPG5M168A)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号89表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M168A+169G)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸，第169位的亮氨氨酸被置换为甘氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号90表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M168A+169C)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸，第169位的亮氨氨酸被置换为半胱氨酸的的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号91表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M168A+169P)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸，第169位的亮氨氨酸被置换为脯氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号92表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M168S+169E)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丝氨酸，第169位的亮氨氨酸被置换为谷氨酸的突变突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
以pNPG5和序列编号93表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础，用与上述相同的方法，得到重组质粒(pNPG5M168S+169P)，该质粒编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丝氨酸，第169位的亮氨氨酸被置换为脯氨酸的突变突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。
pNPG5M168A，pNPG5M168A+169G，pNPG5M168A+169C，pNPG5M168A+169P，pNPG5M168S+169E和pNPG5M168S+169P各重组质粒转化大肠杆菌的感受态细胞(Eschrichia coli JM109，东洋纺织制)，分别得到该质粒转化的转化子。
能在假单胞杆菌属细菌中复制的表达载体的构建
重组质粒pNPG5M168A的DNA 5μg用限制性内切酶BamHI和XHoI(东洋纺织制)切断，分离突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶的结构基因部分。将分离到的DNA和用BamHI和XhoI切断的TM33(1μg)一起，用1单位T4DNA连接酶在16℃使其反应16小时，将DNA连接。连接好的DNA转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞。得到的表达质粒命名为pNPG6M168A。
pNPG5M168A+169G，pNPG5M168A+169C，pNPG5M168A+169P，pNPG5M168S+169E和pNPG5M168S+169P各重组质粒也用上述同样方法获得表达质粒。所得质粒分别命名为pNPG6M168A+169G，pNPG6M168A+169C，pNPG6M168A+169P，pNPG6M168S+169E和pNPG6M168S+169P
假单胞杆菌属细菌转化子的制备
恶臭假单胞杆菌TE3493(微工研寄12298号)在LBG培养基(LB培养基+0.3％甘油)中30℃培养16小时，离心(12000rpm，10分钟)分离回收菌体，向该菌体中加入冰冷的含300mM蔗糖的5mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，8ml)，悬浮菌体。再离心(12000rpm，10分钟)分离回收菌体，向菌体中加入冰冷的含300mM蔗糖的5mM磷酸钾缓冲液(pH7.0，0.4ml)悬浮菌体。
在该悬浮液中加入表达质粒pNPG6M168A 0.5μg，用电穿孔法进行转化。在含100μg/ml链霉素的LB琼脂培养基上培养出菌落，得到所需转化子。
pNPG6M168A+169G，pNPG6M168A+169C，pNPG6M168A+169P，pNPG6M168S+169E和pNPG6M168S+169P等表达质粒，也按上述同样方法分别得到转化子。
全酶型表达的酶纯品的制备方法500mlTB培养基装入2L的坂口摇瓶中，121℃高压灭菌20分钟，冷却后加入另行过滤除菌的链霉素，使其浓度达到100μg/ml。用事先在含100μg/ml链霉素的PY培养基中30℃培养24小时的恶臭假单胞杆菌TE3493菌株(pNPG6M168A)培养液5ml接种，30℃通气振荡培养40小时。离心分离收集上述菌体，悬浮在20mM磷酸缓冲液(pH7.0)中，用超声波破碎。再离心分离，得到的上清液即为粗酶液。所获粗酶液用Hi Trap-SP(AmershamPhamacia)离子交换柱进行层析分离和纯化。对10mMPIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)透析后，加入氯化钙至终浓度为1mM。最后用HiTrap-DEAE(AmershamPhamacia)离子交换柱进行层析分离和纯化。得到纯酶制品。本方法所得纯酶在SDS-PAGE时几乎只显示一条带。
pNPG6M168A+169G，pNPG6M168A+169C，pNPG6M168A+169P，pNPG6M168S+169E和pNPG6M168S+169P等表达质粒在恶臭假单胞杆菌TE3493菌株中得到的转化子中，也按上述同样方法得到纯酶。
将获得的这些纯酶用来进行性能评价。
以铁氰化物离子为介体测定依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶活性的方法
测定原理
D-葡萄糖+铁氰化物离子+PQQGDH→
D-萄糖酸基-1，5-内酯+氰亚铁酸化物离子
由于存在铁氰化物还原产生的氰亚铁酸化物离子，用分光光度法在420nm波长测定吸光度的减少加以确认。
单位定义
在以下所述条件下，氧化1mM D-葡萄糖的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶量。
方法
试剂
A.D-葡萄糖溶液：1M(1.8g D-葡萄糖(分子量180.16)/10ml H2O)
B.PIPES-NaOH缓冲液，pH6.5，50mM(悬浊在60mL水中的1.51gPIPES(分子量302.36)，溶解在5N NaOH溶液中，加入2.2ml 10％TritonX-100。在25℃下用5N NaOH溶液调整到pH到6.5±0.05，加水成100ml。)
C.铁氰化钾溶液：50mM(0.165g铁氰化钾(分子量329.25)/10mlH2O)
D.蒸馏水
E.酶稀释用液：含1mM CaCl2，0.1％Triton X-100，0.1％BSA的50mM PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5)
测定步骤
1.以下反应混合物在深色瓶中制备，在冰上储存(用时配制)。
0.9ml D-葡萄糖溶液 (A)
25.5ml PIPES-NaOH缓冲液(pH6.5) (B)
2.0ml铁氰化钾溶液 (C)
1.0ml蒸馏水 (D)
反应混合物中的浓度显示于表201
表201
| 反应混合液中的浓度 | |
| PIPES缓冲液 | 42mM |
| D-葡萄糖 | 30mM |
| 铁氰化钾 | 3.4mM |
2.3.0ml反应混合液装入试管中(塑料制)37℃预温5分钟。
3.加入0.1ml酶液，轻慢地反转试管加以混合。
4.保持37℃，用分光光度计在420nm波长下，以水为对照，记录4～5分钟吸光度的减少值。根据曲线的开始呈直线的部分的一段计算每分钟的ΔOD(OD试验)。
用酶稀释用液(E)代替酶溶液，按同样方法重复操作，测定空白值(ΔOD空白)。
临检测前用冰冷的酶稀释用液(E)将酶溶液稀释为1.0U/ml(由于该酶的吸附性，建议使用塑料试管)
计算
按以下公式计算活性
体积活性(U/ml)＝{ΔOD/min(ΔOD试验-ΔOD空白)×Vt×df}/(1.04×1.0×Vs)
重量活性U/mg＝(U/ml)×1/C
Vt：总体积(3.1ml)
Vs：样品体积(0.1ml)
1.04：铁氰化钾的毫摩尔分子吸光系数
1.0：光径(cm)
df：稀释系数
C：溶液中的酶浓度(cmg/ml)
比活性的测定
单位液体量中蛋白质含量用依照Bradford法的原理建立的蛋白质测定法测定。实际操作时采用Biorad公司出品的蛋白质检测试剂盒，根据说明书操作。在5倍稀释的市售染色液5ml中加入0.1ml酶溶液，混匀后在室温下放置30分钟，然后测定595nm波长下的吸光度。此时要用已知浓度的牛血清白蛋白进行同样的测定，制作标准曲线，由此测定各酶溶液的单位液体量中的蛋白质含量。
同时，用上述活性测定法测定单位液体量中的活性值，用单位液量中的活性值除以单位液量中的蛋白质含量，求得依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的比活性。
结果见表202
表202
| 突变突变的 | 比活性(U/mg) |
| 野生型 | 1.0 |
| Q168A | 8.6 |
| Q168A+L169G | 2.5 |
| Q168A+L169C | 1.9 |
| Q168A+L169P | 20.1 |
| Q168S+L169E | 1.1 |
| Q168S+L169P | 13.1 |
由比活性测定结果可以确认，以铁氰化物离子为介体测定酶活性时，所有修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的比活性都比野生型要高。
在野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列中，通过使其发生一个到数个氨基酸缺失，置换或添加，提高了比活性。由此可以作以下推论。
依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的具体反应机制，是由于氧化底物D-葡萄糖，电子传递到配位到氧的吡咯并喹啉苯醌上，再经过介体铁氰化物离子传递。由于从吡咯并喹啉苯醌到铁氰化物离子的活性不高，因而酶反应的限速点在电子传递到介体铁氰化物离子的过程。
例如当使活性中心附近氨基酸发生突变时，包括活性中心在内的活性中心附近的酶的立体结构发生改变，这样使氰化物离子易于进入。限制酶反应速度的电子向氰化物离子传递过程变得顺畅，结果便提高了比活性。
可以推论，通过在活性中心附近置换/突变一个或多个氨基酸，在用同样的铁氰化物离子作介体测定酶活性时，有可能提高比活性。换言之，在本发明中，合需的是突变发生在以活性中心为圆心的半径为10的范围内存在的氨基酸上。
活性中心附近的氨基酸，具体可列举第76位，143位，144位，163位，168位，169位，228位，229位，247位，248位，343位，346位，348位，377位，406位，408位，424位等(参见非专利文献5)。
非专利文献5：Protein Science(2000)，9：1265-1273
实施例202
由实施例201确认的提高比活性的效果，可以在非活性中心附近的氨基酸发生置换也能维持其活性的(Q168+L169G+E245D)(Q168A+L169P+E245D)等修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶来具体说明。显然，并不仅限本实施例。
本实施例所用的(Q168A+L169G+E245D)(Q168A+L169P+E245D)等修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶的纯化酶制剂的获得和性能评价，与实施例201相同。制备重组质粒pNPG5M168A+169G+E245D，该质粒是以pNPG5M168A+169G和序列编号94表示的合成寡核苷酸及与其互补合成的寡核苷酸为基础得到的，编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸，第169位的亮氨酸被置换为赖氨酸，第245位的谷氨酸被置换为天冬氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。同样制备重组质粒pNPG5M168A+169P+E245D，该质粒是从pNPG5M168A+169P出发，编码序列编号1表示的氨基酸序列中第168位的谷氨酰胺被置换为丙氨酸，第169位的亮氨酸被置换为脯氨酸，第245位的谷氨酸被置换为天冬氨酸的突变的依赖PQQ的葡萄糖脱氢酶。按与实施例201相同的方法处理，构建表达载体，制备假单胞杆菌属细菌的转化子，制备全酶表达的纯化酶，并进行性能评价。结果见表203。
表203
| 突变 | 比活性(U/mg) |
| 野生型 | 0.9 |
| Q168A+169G+E245D | 7.8 |
| Q168A+169P+E245D | 22.8 |
由实施例202的结果可确认，在非活性中心附近引发氨基酸置换，并不影响在活性中心附近引发氨基酸置换突变导致的比活性提高。
工业实用性
采用本发明，可以得到改善了底物特异性的PQQGDH，优选PQQGDH具有改善的热稳定性。这种修饰的PQQGDH可以用于葡萄糖检测试剂盒和用于葡萄糖传感器。
同时，本发明的修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶由于比活性提高，有可能减少以铁氰化物为介体的测定系统中的酶添加量，，有可能制造便宜的葡萄糖检测试剂盒和用作葡萄糖传感器。本发明能够在临床实验室检验和食品分析等宽广的应用领域中应用，在产业界将大有前途。
序列表
<110>东洋纺织株式会社(Toyo Boseki Kabushiki Kaisya)
<120>改善了底物特异性的依赖吡咯并喹啉苯醌(PQQ)的葡萄糖脱氢酶变体(PQQ dependentglucose dehydrogenase excellent in substrate specificity)
<130>SCT060764-47
<160>94
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>455
<212>PRT
<213>Acinetobacter baumannii
<400>1
Asp Ile Pro Leu Thr Pro Ala Gln Phe Ala Lys Ala Lys Thr Glu Asn
1 5 10 15
Phe Asp Lys Lys Val Ile Leu Ser Asn Leu Asn Lys Pro His Ala Leu
20 25 30
Leu Trp Gly Pro Asp Asn Gln Ile Trp Leu Thr Glu Arg Ala Thr Gly
35 40 45
Lys Ile Leu Arg Val Asn Pro Val Ser Gly Ser Ala Lys Thr Val Phe
50 55 60
Gln Val Pro Glu Ile Val Ser Asp Ala Asp Gly Gln Asn Gly Leu Leu
65 70 75 80
Gly Phe Ala Phe His Pro Asp Phe Lys His Asn Pro Tyr Ile Tyr Ile
85 90 95
Ser Gly Thr Phe Lys Asn Pro Lys Ser Thr Asp Lys Glu Leu Pro Asn
100 105 110
Gln Thr Ile Ile Arg Arg Tyr Thr Tyr Asn Lys Thr Thr Asp Thr Phe
115 120 125
Glu Lys Pro Ile Asp Leu Ile Ala Gly Leu Pro Ser Ser Lys Asp His
130 135 140
Gln Ser Gly Arg Leu Val Ile Gly Pro Asp Gln Lys Ile Tyr Tyr Thr
145 150 155 160
Ile Gly Asp Gln Gly Arg Asn Gln Leu Ala Tyr Leu Phe Leu Pro Asn
165 170 175
Gln Ala Gln His Thr Pro Thr Gln Gln Glu Leu Asn Ser Lys Asp Tyr
180 185 190
His Thr Tyr Met Gly Lys Val Leu Arg Leu Asn Leu Asp Gly Ser Val
195 200 205
Pro Lys Asp Asn Pro Ser Phe Asn Gly Val Val Ser His Ile Tyr Thr
210 215 220
Leu Gly His Arg Asn Pro Gln Gly Leu Ala Phe Ala Pro Asn Gly Lys
225 230 235 240
Leu Leu Gln Ser Glu Gln Gly Pro Asn Ser Asp Asp Glu Ile Asn Leu
245 250 255
Val Leu Lys Gly Gly Asn Tyr Gly Trp Pro Asn Val Ala Gly Tyr Lys
260 265 270
Asp Asp Ser Gly Tyr Ala Tyr Ala Asn Tyr Ser Ala Ala Thr Asn Lys
275 280 285
Ser Gln Ile Lys Asp Leu Ala Gln Asn Gly Ile Lys Val Ala Thr Gly
290 295 300
Val Pro Val Thr Lys Glu Ser Glu Trp Thr Gly Lys Asn Phe Val Pro
305 310 315 320
Pro Leu Lys Thr Leu Tyr Thr Val Gln Asp Thr Tyr Asn Tyr Asn Asp
325 330 335
Pro Thr Cys Gly Glu Met Ala Tyr Ile Cys Trp Pro Thr Val Ala Pro
340 345 350
Ser Ser Ala Tyr Val Tyr Thr Gly Gly Lys Lys Ala Ile Pro Gly Trp
355 360 365
Glu Asn Thr Leu Leu Val Pro Ser Leu Lys Arg Gly Val Ile Phe Arg
370 375 380
Ile Lys Leu Asp Pro Thr Tyr Ser Thr Thr Leu Asp Asp Ala Ile Pro
385 390 395 400
Met Phe Lys Ser Asn Asn Arg Tyr Arg Asp Val Ile Ala Ser Pro Glu
405 410 415
Gly Asn Thr Leu Tyr Val Leu Thr Asp Thr Ala Gly Asn Val Gln Lys
420 425 430
Asp Asp Gly Ser Val Thr His Thr Leu Glu Asn Pro Gly Ser Leu Ile
435 440 445
Lys Phe Thr Tyr Asn Gly Lys
450 455
<210>2
<211>1368
<212>DNA
<213>Acinetobacter baumannii
<400>2
gatatacctc tgacacctgc tcagttcgca aaagcgaaaa cagaaaattt tgataaaaaa 60
gtgattctgt ccaatttaaa taaaccacat gctttgttat gggggccaga taatcaaatt 120
tggttaaccg aacgtgcaac tggcaaaatt ttaagagtaa atcctgtatc tggtagcgcg 180
aaaacagtat ttcaggttcc tgaaattgtg agtgatgctg atgggcaaaa tggtttgtta 240
ggttttgctt ttcatcctga ctttaaacat aacccttata tctatatttc aggcactttt 300
aaaaatccaa aatctacaga taaagagtta cctaatcaga cgattattcg tagatatacc 360
tataataaaa ctacagatac atttgaaaag cctattgatt tgattgcagg tttaccgtca 420
tcaaaagatc atcagtctgg tcgtctcgtt attggtccag accaaaaaat ctactatacg 480
attggtgacc aaggtcgtaa tcagttagct tatctgttct taccgaatca ggcacagcat 540
actccgactc agcaagagct caatagtaaa gactaccata catatatggg taaagtatta 600
cgcttaaatc tggacggcag tgtacctaaa gacaacccaa gctttaacgg cgtagtgagt 660
catatctaca ctttagggca ccgtaatcca caaggtttag catttgcccc aaatggaaag 720
cttttacaat ctgagcaagg accaaattct gatgatgaaa ttaaccttgt attaaaaggt 780
ggtaactatg gctggccaaa tgtagctggt tataaagatg acagtggtta tgcctatgca 840
aactattcgg cagcaaccaa taaatcacaa attaaagatt tagctcaaaa cgggataaaa 900
gtagcaacag gtgttcctgt gactaaagag tctgaatgga ctggtaaaaa ctttgtgccg 960
cctttgaaaa ctttatatac ggtacaagat acctataact ataatgaccc tacttgtggt 1020
gagatggcat atatttgctg gccaacggtt gcaccgtcat cagcatatgt atatacggga 1080
ggcaaaaaag cgattccagg gtgggaaaat acattattgg tcccatcttt aaaacgtggg 1140
gtgattttcc gtattaaatt ggacccgaca tatagcacga ctttggatga tgctatccca 1200
atgtttaaaa gcaataaccg ttatcgtgat gtcatcgcta gtccagaagg taatacctta 1260
tatgtgctga ctgatacagc ggggaatgta caaaaagatg atggttctgt cactcatact 1320
ttagagaatc ccggttctct cattaaattt acatataacg gtaagtaa 1368
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>3
agtgatgctg atgggaataa tggtttgtta ggt 33
<210>4
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>4
agtgatgctg atggggagaa tggtttgtta ggt 33
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>5
agtgatgctg atgggacaaa tggtttgtta ggt 33
<210>6
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>6
agtgatgctg atgggatgaa tggtttgtta ggt 33
<210>7
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>7
agtgatgctg atggggggaa tggtttgtta ggt 33
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>8
agtgatgctg atgggaagaa tggtttgtta ggt 33
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>9
gaccaaggtc gtaatatttt agcttatctg ttc 33
<210>10
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>10
gaccaaggtc gtaatgtatt agcttatctg ttc 33
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>11
gaccaaggtc gtaatgcatt agcttatctg ttc 33
<210>12
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>12
cgaatcaggc acagcatact ccgactcagc aagagctcaa tag 43
<210>13
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(25)
<223>n stands for any base
<400>13
gtaagaacag ataagcnnnn nnnnnacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>14
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>14
gatgctgatg ggcaaaatgg tttgttaggt tttgcttttc 40
<210>15
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(15)
<223>
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(15)
<223>n stands for any base
<400>15
actcacnnnn nnnnnaacct gaaatactgt tttcgcgc 38
<210>16
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>16
tttaccgtca tcaaaagatc atcagtctgg tcgtctcgtt attggtccag 50
<210>17
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(26)
<223>n stands for any base
<400>17
cctgcaatca aatcaatnnn nnnnnnaaat gtatctgtag ttttattata gg 52
<210>18
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>18
acggttgcac cgtcatcagc atatgtatat acgggaggc 39
<210>19
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(24)
<223>n stands for any base
<400>19
tggccagcaa atatannnnn nnnnaccaca agtagggtc 39
<210>20
<211>34
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>20
atggttctgt cactcatact ttagagaatc ccgg 34
<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(19)
<223>n stands for any base
<400>21
catctttttg tacattnnnc cccgctgtat cagtc 35
<210>22
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>22
ttaccgaatc aggcacagca tactccgact cag 33
<210>23
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>23
gaacagataa gctaagcaat tacgaccttg gtc 33
<210>24
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>24
gaacagataa gctaartcat tacgaccttg gtc 33
<210>25
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>25
gaacagataa gctaaytcat tacgaccttg gtc 33
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>26
gaacagataa gctaaraaat tacgaccttg gtc 33
<210>27
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>27
gaacagataa gctaagccat tacgaccttg gtc 33
<210>28
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>28
gaacagataa gctaartgat tacgaccttg gtc 33
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>29
vaacagataa gctaayttat tacgaccttg gtc 33
<210>30
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n stands for any base
<400>30
gaacagataa gctaanagat tacgaccttg gtc 33
<210>31
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>31
gaacagataa gctaacatat tacgaccttg gtc 33
<210>32
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>32
gaacagataa gctaarttat tacgaccttg gtc 33
<210>33
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n stands for any base
<400>33
gaacagataa gctaanggat tacgaccttg gtc 33
<210>34
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>n stands for any base
<400>34
gaacagataa gctaancgat tacgaccttg gtc 33
<210>35
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>35
gaacagataa gctaagctat tacgaccttg gtc 33
<210>36
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>36
gaacagataa gctaacgtat tacgaccttg gtc 33
<210>37
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>37
gaacagataa gctaaccaat tacgaccttg gtc 33
<210>38
<211>33
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>38
gaacagataa gctaartaat tacgaccttg gtc 33
<210>39
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>39
gaccaaggtc gtaatcaggc agcttatctg ttcttaccg 39
<210>40
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>40
gaccaaggtc gtaatcaggt tgcttatctg ttcttaccg 39
<210>41
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>41
gaccaaggtc gtaatcagta tgcttatctg ttcttaccg 39
<210>42
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>42
gaccaaggtc gtaatcagca tgcttatctg ttcttaccg 39
<210>43
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>43
gaccaaggtc gtaatcagaa agcttatctg ttcttaccg 39
<210>44
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>44
gaccaaggtc gtaatcagga tgcttatctg ttcttaccg 39
<210>45
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>45
gaccaaggtc gtaatcagtc agcttatctg ttcttaccg 39
<210>46
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>46
gaccaaggtc gtaatcagaa tgcttatctg ttcttaccg 39
<210>47
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>47
gaccaaggtc gtaatcaggg agcttatctg ttcttaccg 39
<210>48
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>48
gaccaaggtc gtaatcagtg tgcttatctg ttcttaccg 39
<210>49
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n stands for any base
<400>49
gtaagaacag ataagcngat gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>50
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>50
gtaagaacag ataagcrcat gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>51
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>51
gtaagaacag ataagcytct gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>52
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>52
gtaagaacag ataagcraat gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>53
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>53
gtaagaacag ataagcrtgt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>54
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>54
gtaagaacag ataagcdatt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>55
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>55
gtaagaacag ataagcyttt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>56
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>56
gtaagaacag ataagccatt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>57
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>57
gtaagaacag ataagcrttt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>58
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n stands for any base
<400>58
gtaagaacag ataagcnggt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>59
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>59
gtaagaacag ataagcytgt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>60
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n stands for any base
<400>60
gtaagaacag ataagcncgt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>61
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n stands for any base
<400>61
gtaagaacag ataagcngat gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>62
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n stands for any base
<400>62
gtaagaacag ataagcngtt gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>63
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n stands for any base
<400>63
gtaagaacag ataagcnact gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>64
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>64
gtaagaacag ataagcccat gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>65
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>65
gtaagaacag ataagcrtat gcattacgac cttggtcacc aatcg 45
<210>66
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>66
gaccaaggtc gtaatagtga ggcttatctg ttctta 36
<210>67
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>67
gaccaaggtc gtaatagtcc cgcttatctg ttctta 36
<210>68
<211>36
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>68
gaccaaggtc gtaatgcagg cgcttatctg ttctta 36
<210>69
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n stands for any base
<400>69
caaggtcgta atcagttann statctgttc ttaccgaat 39
<210>70
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n stands for any base
<400>70
ggaaagcttt tacaatctnn scaaggacca aattctgat 39
<210>71
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n stands for any base
<400>71
caatctgagc aaggaccann stctgatgat gaaattaac 39
<210>72
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>72
gcttttacaa tctgaccaag gaccaaattc tgatgatg 38
<210>73
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>73
ggcatatatt tgctggccan nngttgcacc gtcatcagc 丂 39
<210>74
<211>39
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>Artificial Sequence oligonucleotide
<400>74
gctgactgat acagcggggn nngtacaaaa agatgatgg 39
<210>75
<211>41
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq75
<400>75
gtgagtgatg ctgttgggca aaatggtttg ttaggttttg c 41
<210>76
<211>38
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq76
<400>76
gaccctactt gtggtgagat tgcatatatt tgctggcc 38
<210>77
<211>38
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq77
<400>77
gaccctactt gtggtgaggt tgcatatatt tgctggcc 38
<210>78
<211>38
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq78
<400>78
gaccctactt gtggtgagcc tgcatatatt tgctggcc 38
<210>79
<211>38
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq79
<400>79
gaccctactt gtggtgaggc tgcatatatt tgctggcc 38
<210>80
<211>34
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq80
<400>80
gatcatcagg ctggtcgtct cgttattggt ccag 34
<210>81
<211>39
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq81
<400>81
gaccaaggtc gtaatcagtt actttatctg ttcttaccg 39
<210>82
<211>39
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq82
<400>82
gaccaaggtc gtaatcagtt aatgtatctg ttcttaccg 39
<210>83
<211>39
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq83
<400>83
gaccaaggtc gtaatcagtt aatttatctg ttcttaccg 39
<210>84
<211>39
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq84
<400>84
gaccaaggtc gtaatcagtt attttatctg ttcttaccg 39
<210>85
<211>39
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq85
<400>85
gaccaaggtc gtaatgcacc actttatctg ttcttaccg 39
<210>86
<211>39
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq86
<400>86
gaccaaggtc gtaatgcacc aatgtatctg ttcttaccg 39
<210>87
<211>38
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described as seq87
<400>87
gcttttacaa tctgaccaag gaccaaattc tgatgatg 38
<210>88
<211>39
<212>DNA
<213>synthetic DNA
<400>88
gaccaaggtc gtaatgcgtt agcttatctg ttcttaccg 39
<210>89
<211>39
<212>DNA
<213>synthetic DNA
<400>89
gaccaaggtc gtaatgcggg agcttatctg ttcttaccg 39
<210>90
<211>39
<212>DNA
<213>synthetic DNA
<400>90
gaccaaggtc gtaatgcgtg tgcttatctg ttcttaccg 39
<210>91
<211>39
<212>DNA
<213>synthetic DNA
<400>91
gaccaaggtc gtaatgcgcc agcttatctg ttcttaccg 39
<210>92
<211>39
<212>DNA
<213>synthetic DNA
<400>92
gaccaaggtc gtaattcgga agcttatctg ttcttaccg 39
<210>93
<211>39
<212>DNA
<213>synthetic DNA
<400>93
gaccaaggtc gtaattcgcc agcttatctg ttcttaccg 39
<210>94
<211>38
<212>DNA
<213>The sequence of designed polinucleotide described in Example202
<400>94
gcttttacaa tctgaccaag gaccaaattc tgatgatg 38
Claims (11)
1.对双糖的活性比野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)更低的修饰PQQGDH。
2.稳定性比野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)更高的权利要求1所述的修饰PQQGDH。
3.一种与野生型依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)相比在以铁氰化物离子为介体的检测系统中增强比活性的方法，包括在PQQGDH的氨基酸序列中通过一个或数个氨基酸缺失，置换或添加而使其比活性高于野生型的酶。
4.用权利要求3所述方法修饰的依赖吡咯并喹啉苯醌的葡萄糖脱氢酶(PQQGDH)，其比野生型酶在以铁氰化物离子为介体的检测系统中提高比活性。
5.编码权利要求1或权利要求3所述修饰PQQGDH的基因。
6.包含权利要求5所述基因的载体。
7.用权利要求6所述的载体转化的转化子。
8.生产修饰的PQQGDH的方法，其特征是培养权利要求7所述的转化子。
9.含有权利要求1或权利要求3所述修饰PQQGDH的葡萄糖检测试剂盒。
10.含有权利要求1或权利要求3所述修饰PQQGDH的葡萄糖传感器。
11.含有权利要求1或权利要求3所述修饰PQQGDH的葡萄糖测定方法。
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2004
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