CN1834249A - β－葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因、构建方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β－葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1，该融合基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。本发明还公开了该融合基因的构建方法，以及该融合蛋白的制备方法。本发明的融合蛋白能同时水解木聚糖和β－葡聚糖。

Description

β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因、构建方法及用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域及蛋白质表达领域，尤其涉及一种β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因构建，和该融合基因的表达方法及其表达产物的用途。

背景技术

据统计，世界粮食年产量为19亿吨左右，其中植物纤维类(fibre material)加工副产品高达2.3亿吨，但这种形式的生物量很难被单胃动物有效利用。其主要原因是其中的非淀粉多糖(non-starch polysaccharides，NSP)具有抗营养作用，NSP的主要抗营养机理为增加食糜粘度和营养屏障，严重时造成肠道微生物区系紊乱。对于禾谷类饲料而言，NSP通常以阿拉伯木聚糖，β-葡聚糖，纤维素，甘露聚糖和半乳糖等几种多糖的复合形式存在，其中又以阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖为主要组分，如小麦、黑小麦和黑麦含有较高水平的阿拉伯木聚糖，而燕麦和大麦富含β-葡聚糖。研究表明：向以小麦或黑麦为基础日粮的饲料中添加木聚糖酶，或者向以大麦为基础日粮的饲料中添加β-葡聚糖酶，均能降低NSP的抗营养作用。

β-葡聚糖酶(1，3-1，4-β-D-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶)和木聚糖酶(1，4-β-D-木聚糖水解酶)是养殖业上使用最为广泛的两种酶。β-葡聚糖酶特异性的水解葡聚糖中与β-1，3-糖苷键毗邻的1，4-β-D-糖苷键，而木聚糖酶则特异水解阿拉伯木聚糖主链的内部β-1，4-糖苷键。实际生产中，β-葡聚糖酶和木聚糖酶单独添加均不能使NSP的抗营养作用达到显著降低的效果。因此为了达到有效降低NSP抗营养作用的目的，并较充分的利用其中的多糖，往往需要多种酶制剂的同时添加。Salobir(1998)和Mathlouthi等(2001)的研究均表明：β-葡聚糖酶和木聚糖酶的协同使用与两者的分别单独使用相比，在肉仔鸡肠道粘度的降低和营养的利用率方面，前者均显著优于后者。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能翻译成具有双功能活性的β-葡聚糖酶和木聚糖酶融合基因。

本发明为达到以上目的，是通过这样的技术方案来实现的：提供一种β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1，命名为gx-endo。

本发明同时提供了上述融合基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

本发明还提供了上述融合基因的构建方法，包括以下步骤：

1)、设计扩增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因片段的PCR引物；

2)、在β-葡聚糖酶基因下游引物和木聚糖酶基因上游引物中加上一段柔性的连接肽序列，然后通过PCR反应扩增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因；

3)根据基因重叠延伸技术，以步骤2)所得的两个PCR反应产物的混合物为模版，分三步进行基因重叠延伸，获得融合基因。

本发明的构建方法，步骤2)是在两基因间引入连接子序列SEQ ID NO：7。首先根据连接子的序列，设计恰当的引物，通过PCR延伸反应，使β-葡聚糖酶基因的下游和木聚糖酶基因的上游含有完整的连接子序列。步骤3)根据基因重叠延伸技术，以步骤2)所得的两个PCR产物的混合物为模版，不加引物进行互为引物扩增，此时已获得融合基因。回收扩增产物作为进一步PCR反应的模板，以β-葡聚糖酶基因的上游引物和木聚糖酶基因的下游引物为引物进行扩增反应，获得更大量的融合基因产物。然后依次进行了目的片段割胶回收，并插入克隆载体或表达载体、质粒提取等步骤。

利用上述β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因所制得的融合蛋白，同时具有β-葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性，因此该种融合蛋白能同时水解大麦β-葡聚糖和桦木木聚糖。

本发明还提供了上述融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

1)、将SEQ ID NO：1的核苷酸序列插入表达载体，形成融合基因重组表达载体；

2)、将上述融合基因重组表达载体转入表达宿主细胞，形成含融合基因表达载体的阳性细胞；

3)、在适合该融合蛋白表达的条件下，培养上述步骤中的阳性细胞；

4)、分离纯化出其中所表达的并正确加工的融合蛋白。

本发明融合基因gx-endo的序列，同时具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的特征，基因的5’端为SEQ ID NO：3序列，来自于β-葡聚糖酶基因，全长为717bp，其中1-717位是基因开放阅读框，1-3位是起始密码子ATG，无终止密码子。3’端为SEQ ID NO：4序列，来自木聚糖酶成熟肽基因序列，全长为558bp，其中735-1293位是该基因开放阅读框，1291-1293位为终止密码子。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4之间的连接肽L-endo编码序列SEQ ID NO：7。

本发明的融合基因gx-endo序列编码的多肽同时具有SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6中的氨基酸序列，并同时具有葡聚糖酶活性和木聚糖酶活性，将在高效低价的食品和饲料添加剂应用中具有广阔的前景。

本发明的融合基因gx-endo所用的重组克隆载体，均含有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所述的DNA；克隆宿主细胞为上述重组克隆载体转化的原核细胞。

本发明的设计原理如下：与β-葡聚糖酶和木聚糖酶的单独添加相比，两者的协同使用能更为显著减轻禾谷类饲料中NSP所导致的抗营养作用。因此选择淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等来源的β-葡聚糖酶和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等来源的木聚糖酶构建同时具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性的融合蛋白。又因为当两个功能单位的蛋白(或结构域)融合时，两部分可能会因为靠的较近而影响各自的正确折叠，因此常在两融合单位间加一柔性较强的连接肽序列；同时连接肽的氨基酸组成、氨基酸性质、长短等均影响连接肽的特性，从而影响功能单位的融合。因此本发明设计了含有连接肽序列SEQ ID NO：7的融合蛋白，该连接肽根据亲水性原理，运用网络服务器LINKER( http://chem250a.chem.temple.edu/cgi-bin/linker/linker.pl)辅助设计而成，其结构推测为一柔性环肽。将该融合基因在大肠杆菌表达系统中进行表达，以期获得具有双功能的重组蛋白生产菌株。在完成β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因克隆和测序基础上，把β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因通过SOE技术进一步连接成融合基因，并在相互间融合了连接子序列，构建成含有多糖酶活性的融合基因，融合基因成功的在大肠杆菌中获得表达，获得同时具有β-葡聚糖酶和木聚糖酶活性的双功能融合蛋白。

对本发明的序列表作如下说明：

一、SEQ ID NO：1代表gx-endo融合基因序列：

序列特征如下：长度：1293碱基；类型：核酸；链性：双链；拓扑：线性。

分子型：DNA。

二、SEQ ID NO：2代表gx-endo融合基因编码的氨基酸序列：

序列特征如下：长度：430个氨基酸；类型：氨基酸；拓扑结构：果冻卷状(jellyroll-like)。

分子型：多肽。

三、SEQ ID NO：3代表β-葡聚糖酶基因序列：

序列特征如下：长度：720碱基；类型：核酸；链性：双链；拓扑：线性。

分子型：DNA。

四、SEQ ID NO：4代表木聚糖酶成熟肽的编码基因序列：

序列特征如下：长度：558碱基；类型：核酸；链性：双链；拓扑：线性。

分子型：DNA。

五、SEQ ID NO：5代表β-葡聚糖酶基因编码的氨基酸序列：

序列特征如下：长度：239个氨基酸；类型：氨基酸；拓扑结构：果冻卷状(jellyroll-like)。

分子型：多肽。

六、SEQ ID NO：6代表木聚糖酶基因编码的成熟肽氨基酸序列：

序列特征如下：长度：185个氨基酸；类型：氨基酸；拓扑结构：果冻卷状(jellyroll-like)。

分子型：多肽。

七、SEQ ID NO：7代表连接肽L-endo的编码序列：

序列特征如下：长度：18碱基；类型：核酸；链性：双链；拓扑：线性。

分子型：DNA。

八、SEQ ID NO：8代表连接肽L-endo的氨基酸序列：

序列特征如下：长度：6个氨基酸；类型：氨基酸；拓扑结构：线性。

分子型：多肽。

具体实施方式

实施例1、PCR引物设计

在保留β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因的功能区域基础上，设计PCR引物，本发明为由连接肽过渡连接的融合蛋白，因此在两基因的连接区引入连接肽编码序列(Linker)。

1、β-葡聚糖酶基因引物：

以淀粉液化芽孢杆菌的基因组为模版，参照Genbank上已由本申请人克隆登录β-葡聚糖酶基因，设计上下游引物，pG5和pG3，用于扩增删除终止密码子的β-葡聚糖酶基因。在上游引物中引入BamH I酶切位点序列。

上游引物序列如下，引物名称为pG5：

5′-AGG

ATGAAACGAGTGTTGCTA-3′

BamH I

下游引物序列如下，引物名称为pG3：

5′-TTGCCAGTAGTCTGTGCTAGCTTTTTTT-3′

2、木聚糖酶基因引物：

参照Genbank上所登录的木聚糖酶基因序列，进行同源性分析，根据保守序列设计上下游引物，pX5和pX3：用于扩增完整的木聚糖酶基因。在下游引物中引入Xhol I酶切位点序列。

上游引物序列如下，引物名称为pX5：

5′-ATGTTTAAGTTTAAAAAGAAT-3′

下游引物序列如下，引物名称为pX3：

5′-GAT TTACCACACTGTTACGTTA-3′，

Xhol I

3、融合基因gx-endo构建引物：

参照β-葡聚糖酶基因和木聚糖酶基因序列，进行设计。

设计两对对引物，第一对引物(pG5和pE1)，用于克隆β-葡聚糖酶基因序列和编码连接肽L-endo的完整序列SEQ ID NO：7，第二对引物(pE2和pX5)，用于克隆编码连接肽L-endo的完整序列SEQ ID NO：7和木聚糖酶成熟肽部分的编码基因。其中第二对引物中pE1对连接肽的完整克隆和第三对引物中pE2对连接肽的完整克隆，导致了重叠序列的存在，因此可以用SOE方法连接两个基因，融合基因构建后将在5′和3′分别引入BamH I和Xhol I酶切位点序列。

第一对引物：

上游引物名称为pG5，序列同上；

下游引物序列如下，名称为pE1：

5′-ATTCTAAGAGCTCCCCATTTTTTTTTGTATAGCGCAC-3′

第二对引物：

上游引物序列如下，名称为pE2：

5′-ATGGGGAGCTCTTCGAATGCTAGCACAGACTACTGG-3′

下游引物名称为pX3，序列同上。

实施例2、PCR扩增

1、扩增β-葡聚糖酶基因片段：

PCR反应体系：淀粉液化芽孢杆菌基因组DNA 0.5-1.0μl，10×Taq butter5μl，dNTP(2.5mM)2-4μl，上游引物(pG5，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(pG3，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为：94℃变性5min后进入循环，94℃变性45s，50℃复性1min，72℃延伸1min，35个循环后在72℃延伸10min。

2、扩增木聚糖酶基因片段：

PCR反应体系：枯草芽孢杆菌基因组DNA 0.5-1.0μl，10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5Mm)2-4μl，上游引物(pX5，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(pX3，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)0.2-0.5μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为：94℃变性5min后进入循环，94℃变性45S，47℃复性45s，72℃延伸1min，35个循环后在72℃延伸10min。

3、β-葡聚糖酶基因和木聚糖酶基因的PCR扩增结果

β-葡聚糖酶基因和木聚糖酶基因的PCR产物长约720bp和640bp，和目的基因的大小一致。

实施例3、融合基因gx-endo的构建(SOE方法)

以含β-葡聚糖酶基因的重组质粒为模板，以pG5和pE1为引物扩增融合基因的5’端，得到剔除终止密码子的β-葡聚糖酶基因序列及连接肽L-endo的编码全序列，凝胶回收PCR产物；PCR扩增条件体系同上，退火温度43℃，35个循环结束后直接结束反应，不进行72℃ 10分钟加碱基腺嘌呤核苷酸A。

以含木聚糖酶基因的重组质粒为模板，以pE2和pX3为引物扩增融合基因的3’端，得到编码木聚糖酶成熟肽的全序列及连接肽L-endo的编码全序列，凝胶回收PCR产物；PCR扩增条件同上，退火温度47℃，35个循环结束后直接结束反应，不进行72℃ 10分钟加碱基腺嘌呤核苷酸A。

合并上述割胶回收产物，不加引物进行PCR扩增，反应体系如下(50μl)：PCR反应体系：10×Taq butter 5μl，dNTP(2.5Mm)2-4μl，上游引物(pG5，13pmol/μl)1-2μl，下游引物(pX3，13pmol/μl)1-2μl，Taq-plus DNA pol.(1U/μl)2.5-5.0μl，加ddH₂O至总体积50μl。扩增条件为94℃变性5min后进入循环，65℃复性1-1.5min，72℃延伸1.5-2.0min，30-35个循环后在72℃延伸10min。割胶回收产物加入引物pG5和pX3进一步进行PCR扩增，扩增条件同上，除Taq-plus DNA pol.(1U/μl)1.0μl。

实施例4、融合基因gx-endo克隆

β-葡聚糖酶-木聚糖酶融合基因7.0μl，pUCm-T Vector 1.0μl，10×连接酶缓冲液1μl，T₄DNA连接酶(1U/μl)1μl，ddH₂O 4μl，总体积10μl。16℃连接过夜，将基因定向插入到质粒pUCm-T中。

实施例5、连接产物转化

连接产物转化、感受态的制备、阳性克隆筛选、质粒DNA的提取均按文献所记载的现有技术进行。融合基因片段与质粒pUCm-T连接并导入宿主菌Top10后，经氨苄青霉素抗性及α-互补筛选后，筛选阳性重组质粒，pUCm-T/g-x。

实施例6、DNA序列分析

用碱法提取质粒，用BigDye terminator v2.0测序试剂盒(EpicentreTeclnologies)对抽提的质粒在全自动测序仪(ABI Prim 377-18，PE公司)进行测序，融合基因gx-endo序列全长为1293bp，详细序列见SEQ ID No：1。

gx-endo开放读框分别位于1-1293位核苷酸，1-717bp来自β-葡聚糖酶基因，序列长为717bp；718-736bp为连接肽L-endo的DNA序列，共18bp；737-1293bp来自木聚糖酶基因，序列长为558bp。该融合基因全长序列具有起始和终止密码子，编码430个氨基酸残基。融合基因对应的氨基酸序列详见SEQ ID No：2。其中1-239位来自β-葡聚糖酶，240-245位为连接肽L-endo的序列，246-430位来自木聚糖酶。由于翻译后加工，融合蛋白的前体所存在β-葡聚糖酶来源的信号肽被切割掉，融合蛋白成熟肽共有405个氨基酸残基。

实施例7、融合基因在大肠杆菌BL21中的表达

重组质粒pUCm-T/g-x酶切，酶切体系如下：10×M Buffer 2.0μl，10×BSA2.0μl，BamH I限制性内切酶(10U/μl)1.0μl，Xhol I限制性内切酶(10U/μl)1.0μl，pUCm-T/g-x重组克隆载体14.0μl，反应液混匀，37℃酶切过夜。之后电泳，割胶回收目的基因。同时表达载体用相同的内切酶酶切，酶切反应体系同上，割胶回收目的片段。

目的基因和表达载体pET-30a酶切的割胶回收产物连接，连接反应体系如下：酶切载体DNA 4.0μl，目的基因4.0μl，T4DNA连接酶1.0μl，10×T4 DNA连接酶反应缓冲液1.0μl，于12℃连接过夜。连接产物大肠杆菌BL21感受态细胞，筛选重组表达子。

实施例8、融合表达产物纯化及活性检测

将筛选到的大肠杆菌重组阳性表达子分别接种于LB液体培养基中，30℃静置培养过夜，以2.0％接种量转接于250ml LB液体培养基中，100rpm旋转式摇床，28℃培养至OD600为0.6左右，加入终浓度为0.5mMol/mL IPTG诱导6-8h，此时菌液OD600为2.5左右。

采用超声波破碎仪破碎菌悬液，条件设置为：工作时间5s，间隙时间4s，全程时间1h，工作温度0℃，一次破碎80mL左右的菌液。向菌破碎上清液加入硫酸铵至25％的饱和度，在冰上过夜，10000rpm离心30min去沉淀以去除部分分子量较大的杂蛋白，取上清，再加入硫酸铵至饱和度为65％，过夜冰浴，10000rpm离心30min去上清，取沉淀并用适量的0.2Mol/L的醋酸钠(pH6.0)溶解，0.45μm滤膜过滤液用于脱盐。取2.0mL沉淀溶解液，在KTAexplore 100蛋白纯化仪上，采用G-25脱盐柱进行脱盐，柱名为HiPrepTM 26/10desalting，洗脱缓冲液为0.2MOL/L的醋酸钠(pH6.0)，流速为4.0mL/min，管收集(4mL/管)。在KTA explore 100蛋白纯化仪上，采用阳离子交换柱进行纯化，柱名HiPrep16/10 SourceTM 30S，洗脱程序为：先以2个柱体积的0.2mol/L的醋酸钠(pH6.0)缓冲液平衡，样品上柱后开始以0.5mol/L NaCl进行梯度洗脱，达到100％盐浓度需要4个柱体积的混合缓冲液，然后以1.5个柱体积的0.2mol/L的醋酸钠(pH6.0)缓冲液再次平衡，管收集(2mL/管)。收集OD280和OD260的各个峰对应的试管，用于酶活力测定和SDS-PAGE电泳确定纯化效果。

酶活力测定由还原糖法进行。在试管中加入1000μl浓度为0.5％的桦木木聚糖底物，预热5min，然后加入粗酶液100μl，50℃准确反应10min，加入500μl DNS溶液终止反应，沸水浴5min，冷却后于540nm处比色，测定OD值。

用大麦β-葡聚糖底物替代上述桦木木聚糖底物，重复上述的测试方法。

结果表明，本发明的融合蛋白具有双功能酶活性，纯化后的蛋白电泳均得到单一的，大小与理论分子量一致的目的条带。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

                        序列表

SEQ ID NO：1

  1 ATGAAACGAG TGTTGCTAAT TCTTGTCACC GGATTGTTTA TGAGTTTGTG

 51 TGGGATCACT TCTAGTGTTT CGGCTCAAAC AGGCGGATCG TTTTTTGAAC

101 CTTTTAACAG CTATAACTCC GGGTTATGGC AAAAAGCTGA TGGTTACTCA

151 AATGGAGATA TGTTTAACTG CACTTGGCGT GCGAATAACG TCTCTATGAC

201 GTCATCAGGT GAAATGCGTT TGGCGCTGAC AAGTCCGTCT TATAACAAGT

251 TTGACTGCGG GGAAAACCGC TCGGTTCAAA CATATGGCTA TGGACTTTAT

301 GAAGTCAGAA TGAAACCGGC TAAAAACACA GGGATTGTTT CATCGTTCTT

351 CACTTATACA GGTCCAACGG AGGGGACTCC TTGGGATGAG ATTGATATCG

401 AATTTTTGGG AAAAGACACA ACAAAGGTTC AATTTAACTA TTATACAAAT

451 GGCGCAGGAA ACCATGAGAA GTTGGCGGAT CTCGGATTTG ATGCAGCCAA

501 TGCCTATCAT ACGTATGCGT TCGATTGGCA GCCAAACTCT ATTAAATGGT

551 ATGTCGATGG GCAATTAAAA CATACTGCGA CAACCCAAAT ACCGGCAGCG

601 CCGGGGAAAA TCATGATGAA TTTGTGGAAT GGTACGGGTG TCGATGATTG

651 GCTCGGTTCC TACAATGGCG TAAATCCGCT ATACGCTCAT TACGACTGGG

701 TGCGCTATAC AAAAAAAATG GGGAGCTCTT CGAATGCTAG CACAGACTAC

751 TGGCAAAATT GGACTGATGG GGGCGGTATA GTAAACGCTG TCAATGGGTC

801 TGGCGGGAAT TACAGTGTTA ATTGGTCTAA TACCGGAAAT TTTGTTGTTG

851 GTAAAGGTTG GACTACAGGT TCGCCATTTA GGACGATAAA CTATAATGCC

 901 GGAGTTTGGG CGCCGAATGG CAATGGATAT TTAACTTTAT ATGGTTGGAC

 951 GAGATCACCT CTCATAGAAT ATTATGTAGT GGATTCATGG GGTACTTATA

1001 GACCTACTGG AACGTATAAA GGTACTGTAA AAAGTGATGG GGGTACATAT

1051 GACATATATA CAACTACACG TTATAACGCA CCTTCCATTG ATGGCGATCG

1101 CACTACTTTT ACGCAGTACT GGAGTGTTCG CCAGTCGAAG AGACCAACCG

1151 GAAGCAACGC TACAATCACT TTCAGCAATC ATGTGAACGC ATGGAAGAGC

1201 CATGGAATGA ATCTGGGCAG TAATTGGGCT TACCAAGTCA TGGCGACAGA

1251 AGGATATCAA AGTAGTGGAA GTTCTAACGT AACAGTGTGG TAA

SEQ ID NO：2

  1  Met Lys Arg Val Leu  Leu Ile Leu Val Thr  Gly Leu Phe Met Ser

 16  Leu Cys Gly Ile Thr  Ser Ser Val Ser Ala  Gln Thr Gly Gly Ser

 31  Phe Phe Glu Pro Phe  Asn Ser Tyr Asn Ser  Gly Leu Trp Gln Lys

 46  Ala Asp Gly Tyr Ser  Asn Gly Asp Met Phe  Asn Cys Thr Trp Arg

 61  Ala Asn Asn Val Ser  Met Thr Ser Ser Gly  Glu Met Arg Leu Ala

 76  Leu Thr Ser Pro Ser  Tyr Asn Lys Phe Asp  Cys Gly Glu Asn Arg

 91  Ser Val Gln Thr Tyr  Gly Tyr Gly Leu Tyr  Glu Val Arg Met Lys

106  Pro Ala Lys Asn Thr  Gly Ile Val Ser Ser  Phe Phe Thr Tyr Thr

121  Gly Pro Thr Glu Gly  Thr Pro Trp Asp Glu  Ile Asp Ile Glu Phe

136  Leu Gly Lys Asp Thr  Thr Lys Val Gln Phe  Asn Tyr Tyr Thr Asn

151  Gly Ala Gly Asn His  Glu Lys Leu Pro Asp  Leu Gly Phe Asp Ala

166  Ala Asn Ala Tyr His  Thr Tyr Ala Phe Asp  Trp Gln Pro Asn Ser

181  Ile Lys Trp Tyr Val  Asp Gly Gln Leu Lys  His Thr Ala Thr Thr

196  Gln Ile Pro Ala Ala  Pro Gly Lys Ile Met  Met Asn Leu Trp Asn

211  Gly Thr Gly Val Asp  Asp Trp Leu Gly Ser  Tyr Asn Gly Val Asn

226  Pro Leu Tyr Ala His  Tyr Asp Trp Val Arg  Tyr Thr Lys Lys Met

241  Gly Ser Ser Ser Asn  Ala Ser Thr Asp Tyr  Trp Gln Asn Trp Thr

256  Asp Gly Gly Gly Ile  Val Asn Ala Val Asn  Gly Ser Gly Gly Asn

271  Tyr Ser Val Asn Trp  Ser Asn Thr Gly Asn  Phe Val Val Gly Lys

286  Gly Trp Thr Thr Gly  Ser Pro Phe Arg Thr  Ile Asn Tyr Asn Ala

301  Gly Val Trp Ala Pro  Asn Gly Asn Gly Tyr  Leu Thr Leu Tyr Gly

316  Trp Thr Arg Ser Pro  Leu Ile Glu Tyr Tyr  Val Val Asp Ser Trp

331  Gly Thr Tyr Arg Pro  Thr Gly Thr Tyr Lys  Gly Thr Val Lys Ser

346  Asp Gly Gly Thr Tyr  Asp Ile Tyr Thr Thr  Thr Arg Tyr Asn Ala

361  Pro Ser Ile Asp Gly  Asp Arg Thr Thr Phe  Thr Gln Tyr Trp Ser

376  Val Arg Gln Ser Lys  Arg Pro Thr Gly Ser  Asn Ala Thr Ile Thr

391  Phe Ser Asn His Val  Asn Ala Trp Lys Ser  His Gly Met Asn Leu

406  Gly Ser Asn Trp Ala  Tyr Gln Val Met Ala  Thr Glu Gly Tyr Gln

421  Ser Ser Gly Ser Ser  Asn Val Thr Val Trp

SEQ ID NO：3

  1 ATGAAACGAG TGTTGCTAAT TCTTGTCACC GGATTGTTTA TGAGTTTGTG

 51 TGGGATCACT TCTAGTGTTT CGGCTCAAAC AGGCGGATCG TTTTTTGAAC

101 CTTTTAACAG CTATAACTCC GGGTTATGGC AAAAAGCTGA TGGTTACTCA

151 AATGGAGATA TGTTTAACTG CACTTGGCGT GCGAATAACG TCTCTATGAC

201 GTCATCAGGT GAAATGCGTT TGGCGCTGAC AAGTCCGTCT TATAACAAGT

251 TTGACTGCGG AGAAAACCGC TCGGTTCAAA CATATGGCTA TGGACTTTAT

301 GAAGTCAGAA TGAAACCGGC TAAAAACACA GGAATTGTTT CATCGTTCTT

351 CACTTATACA GGTCCAACGG AGGGGACTCC TTGGGATGAG ATTGATATCG

401 AATTTTTGGG AAAAGACACA ACAAAGGTTC AATTTAACTA TTATACAAAT

451 GGCGCAGGAA ACCATGAGAA GTTGCCGGAT CTCGGATTTG ATGCAGCCAA

501 TGCCTATCAT ACGTATGCGT TCGATTGGCA GCCAAACTCT ATTAAATGGT

551 ATGTCGATGG GCAATTAAAA CATACTGCGA CAACCCAAAT ACCGGCAGCG

601 CCGGGGAAAA TCATGATGAA TTTGTGGAAT GGTACGGGTG TCGATGATTG

651 GCTCGGTTCC TACAATGGCG TAAATCCGCT ATACGCTCAT TACGACTGGG

701 TGCGCTATAC AAAAAAATAA

SEQ ID NO：4

  1 GCTAGCACAG ACTACTGGCA AAATTGGACT GATGGGGGCG GTATAGTAAA

 51 CGCTGTCAAT GGGTCTGGCG GGAATTACAG TGTTAATTGG TCTAATACCG

101 GAAATTTTGT TGTTGGTAAA GGTTGGACTA CAGGTTCGCC ATTTAGGACG

151 ATAAACTATA ATGCCGGAGT TTGGGCGCCG AATGGCAATG GATATTTAAC

201 TTTATATGGT TGGACGAGAT CACCTCTCAT AGAATATTAT GTAGTGGATT

251 CATGGGGTAC TTATAGACCT ACTGGAACGT ATAAAGGTAC TGTAAAAAGT

301 GATGGGGGTA CATATGACAT ATATACAACT ACACGTTATA ACGCACCTTC

351 CATTGATGGC GATCGCACTA CTTTTACGCA GTACTGGAGT GTTCGCCAGT

401 CGAAGAGACC AACCGGAAGC AACGCTACAA TCACTTTCAG CAATCATGTG

451 AACGCATGGA AGAGCCATGG AATGAATCTG GGCAGTAATT GGGCTTACCA

501 AGTCATGGCG ACAGAAGGAT ATCAAAGTAG TGGAAGTTCT AACGTAACAG

551 TGTGGTAA

SEQ ID NO：5

  1  Met Lys Arg Val Leu  Leu Ile Leu Val Thr  Gly Leu Phe Met Ser

 16  Leu Cys Gly Ile Thr  Ser Ser Val Ser Ala  Gln Thr Gly Gly Ser

 31  Phe Phe Glu Pro Phe  Asn Ser Tyr Asn Ser  Gly Leu Trp Gln Lys

 46  Ala Asp Gly Tyr Ser  Asn Gly Asp Met Phe  Asn Cys Thr Trp Arg

 61  Ala Asn Asn Val Ser  Met Thr Ser Ser Gly  Glu Met Arg Leu Ala

 76  Leu Thr Ser Pro Ser  Tyr Asn Lys Phe Asp  Cys Gly Glu Asn Arg

 91  Ser Val Gln Thr Tyr  Gly Tyr Gly Leu Tyr  Glu Val Arg Met Lys

106  Pro Ala Lys Asn Thr  Gly Ile Val Ser Ser  Phe Phe Thr Tyr Thr

121  Gly Pro Thr Glu Gly  Thr Pro Trp Asp Glu  Ile Asp Ile Glu Phe

136  Leu Gly Lys Asp Thr  Thr Lys Val Gln Phe  Asn Tyr Tyr Thr Asn

151  Gly Ala Gly Asn His  Glu Lys Leu Pro Asp  Leu Gly Phe Asp Ala

166  Ala Asn Ala Tyr His  Thr Tyr Ala Phe Asp  Trp Gln Pro Asn Ser

181  Ile Lys Trp Tyr Val  Asp Gly Gln Leu Lys  His Thr Ala Thr Thr

196  Gln Ile Pro Ala Ala  Pro Gly Lys Ile Met  Met Asn Leu Trp Asn

211  Gly Thr Gly Val Asp  Asp Trp Leu Gly Ser  Tyr Asn Gly Val Asn

226  Pro Leu Tyr Ala His  Tyr Asp Trp Val Arg  Tyr Thr Lys Lys

SEQ ID NO：6

  1  Ala Ser Thr Asp Tyr  Trp Gln Asn Trp Thr  Asp Gly Gly Gly Ile

 16  Val Asn Ala Val Asn  Gly Ser Gly Gly Asn  Tyr Ser Val Asn Trp

 31  Ser Asn Thr Gly Asn  Phe Val Val Gly Lys  Gly Trp Thr Thr Gly

 46  Ser Pro Phe Arg Thr  Ile Asn Tyr Asn Ala  Gly Val Trp Ala Pro

 61  Asn Gly Asn Gly Tyr  Leu Thr Leu Tyr Gly  Trp Thr Arg Ser Pro

 76  Leu Ile Glu Tyr Tyr  Val Val Asp Ser Trp  Gly Thr Tyr Arg Pro

 91  Thr Gly Thr Tyr Lys  Gly Thr Val Lys Ser  Asp Gly Gly Thr Tyr

106  Asp Ile Tyr Thr Thr  Thr Arg Tyr Asn Ala  Pro Ser Ile Asp Gly

121  Asp Arg Thr Thr Phe  Thr Gln Tyr Trp Ser  Val Arg Gln Ser Lys

136  Arg Pro Thr Gly Ser  Asn Ala Thr Ile Thr  Phe Ser Asn His Val

151  Asn Ala Trp Lys Ser  His Gly Met Asn Leu  Gly Ser Asn Trp Ala

166  Tyr Gln Val Met Ala  Thr Glu Gly Tyr Gln  Ser Ser Gly Ser Ser

181  Asn Val Thr Val Trp

SEQ ID NO：7

  1  ATGGGGAGCT CTTCGAAT

SEQ ID NO：8

  1  Met Gly Ser Ser Ser  Asn

Claims (5)

1、一种β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因，其核苷酸序列是SEQ ID NO：1。

2、如权利要求1所述的β-葡聚糖酶和木聚糖酶的融合基因编码的氨基酸序列是SEQ ID NO：2。

3、如权利要求1所述的融合基因的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、设计扩增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因片段的PCR引物；

2)、在β-葡聚糖酶基因下游引物和木聚糖酶基因上游引物中加上一段柔性的连接肽序列，然后通过PCR反应扩增β-葡聚糖酶和木聚糖酶基因；

3)、根据基因重叠延伸技术，以步骤2)所得的两个PCR反应产物的混合物为模版，分三步进行基因重叠延伸，获得融合基因。

4、如权利要求1所述的融合基因所制得的融合蛋白的用途，其特征在于：该融合蛋白能同时水解木聚糖和β-葡聚糖。

5、如权利要求4所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)、将SEQ ID NO：1的核苷酸序列插入表达载体，形成融合基因重组表达载体；

2)、将上述融合基因重组表达载体转入表达宿主细胞，形成含融合基因表达载体的阳性细胞；

3)、在适合该融合蛋白表达的条件下，培养上述步骤中的阳性细胞；

4)、分离纯化出其中所表达的并正确加工的融合蛋白。