CN1831104A - 一种筛选d－核糖高转化率菌种的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种筛选D－核糖高转化率菌种的方法，其步骤是：以常规方法诱变转酮酶缺失的D－核糖生产菌株，涂布平板分离单菌落，挑取单菌落移接斜面，35－37℃培养45－55小时，选成熟斜面再以35－37℃、200转/分钟条件进行发酵培养55－72小时，取发酵液4000－5000转/分钟离心10－15分钟，然后测定离心后发酵清液中的3－羟基丁酮、还原糖及葡萄糖含量，选择3－羟基丁酮、葡萄糖含量低、还原糖含量高的菌株再进行复筛，即可得到D－核糖产率及转化率高的菌株。本发明的方法操作简便、重复性好、成本低，特别适合生产菌种的分离筛选，在D－核糖的工业化生产中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种产D-核糖菌种的筛选方法，尤其涉及一种通过测定中间代谢产物筛选D-核糖高转化率菌种的方法，属于生物技术领域。
背景技术
D-核糖是一种具有醛基的五碳糖，是生物体内核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)以及核苷酸的重要组成部分，是合成部分氨基酸、辅酶和碱基的中间产物，具有重要的生理功能。D-核糖产品主要用于合成维生素B2和生产食品鲜味剂，还可用来合成类固醇、前列腺素类、萜类化合物、凝乳酶抑制因子等。近年来利用D-核糖为原料合成抗病毒和抗癌药物等核酸类药物的研究也十分活跃。D-核糖还具有一定的医疗保健作用，具有增强心脏抵抗心肌局部缺血的能力，还可用于治疗由于剧烈运动引起的肌肉酸痛和由于腺苷脱氢酶缺失引起的肌肉僵硬等病症。
D-核糖的生产方法主要有三种，一是由核酸类物质水解提取，二是以葡萄糖、阿拉伯糖等为原料化学合成，三是利用微生物发酵生产。比较而言微生物发酵法生产D-核糖生产效率高、工艺简便、生产成本低。微生物发酵法生产D-核糖通常采用转酮酶缺失菌株，一般是以从土壤获得或保藏菌株作为亲株，通过诱变筛选积累D-核糖的转酮酶缺失突变株，然后通过诱变筛选不生孢子的突变株来提高D-核糖产率。利用转酮酶缺失微生物菌株发酵生产D-核糖的专利有US3919046(1975)，US3970522(1976)，US4904587(1990)，US5281531(1994)。
从微生物代谢途径分析，转酮酶缺失菌种自身不能合成莽草酸，表现为莽草酸营养缺陷型，所以D-核糖生产菌株的筛选一般采用诱变以后，以莽草酸营养缺陷型为标记筛选转酮酶缺失菌株。具体做法为菌种通过诱变处理以后涂布完全培养基平板，然后挑取单菌落同时点种于基本培养基平板和添加有莽草酸的基本培养基平板，放置合适的培养条件下培养，然后挑取在基本培养基没有生长，在添加有莽草酸的平板有生长的菌落，再通过摇瓶培养筛选积累D-核糖的菌株。
经检索，文献报道进一步提高D-核糖产率的方法有以下几种：
1.采用传统诱变方法以芽孢杆菌不生内生孢子为依据筛选高产D-核糖菌株。
2.据文献报道D-核糖生产菌株一般都在发酵液中积累D-葡萄糖酸，这样不但减少了D-核糖的收率，并给D-核糖提取带来了一定的困难。D-葡萄糖酸是通过D-葡萄糖脱氢酶旁路合成，基于这样一个事实，Eur.Pat.0501756-A1提出并实施了一种通过基因工程技术选育高产D-核糖菌种的策略，即通过提高D-核糖生产菌株的葡萄糖酸操纵子的表达量，加快葡萄糖酸被利用并转化为D-核糖速率。
3.采用传统诱变方法通过测定发酵液中D-核糖含量筛选高产菌株，是目前D-核糖菌种选育过程中最常使用的方法，但这种方法工作量大，并且带有盲目性，另外D-核糖的分析测定方法也限制了该方法的大量使用。D-核糖是一种具有还原性的呋喃型单糖，没有特异性的化学分析测定方法，目前使用的苔黑酚比色法是测定五碳糖的方法，专一性不强，容易受其它五碳糖的干扰。另外该方法所用化学试剂苔黑酚稳定性差，需要新鲜配制，并且用量较大，价格偏高，不适合做大量的菌种选育的分析。用高压液相色谱分析，测定专一性强，但运行费用昂贵，直接测定发酵液，分离柱容易受到污染，同样不适合菌种筛选工作。
目前工业生产中使用的生产菌株绝大多数仍是通过传统诱变的方法选育获得的，通过代谢工程选育生产菌株仍处于研究阶段。然而，在生产实践中建立一套行之有效的菌株选育方法对保证生产的正常运行非常必要。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是：在发酵法生产D-核糖技术深入研究的基础上提出一种筛选高产、高转化率D-核糖生产菌种的方法。
实验表明：本发明提供的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，简便易行，准确度高，特别适用于企业、科研对D-核糖生产菌株的日常选育和定期复壮。
本发明涉及的筛选D-核糖高转化率菌种的方法是基于以下原理设计的。
申请人研究发现：转酮酶缺失D-核糖生产菌株在发酵过程中产生一种与斐林试剂发生反应的非糖类化合物，经色质联用仪分析鉴定该化合物为3-羟基丁酮。经文献检索，文献(J.Appl.Microbiol.83：25-30.)曾报道D-核糖生产菌株ATCC21951在发酵液中也积累3-羟基丁酮，本申请人又进一步对多株D-核糖生产菌株进行发酵分析，发现并证实D-核糖生产菌株在发酵液中积累3-羟基丁酮具有普遍性。
通过对糖代谢途径分析发现3-羟基丁酮是由丙酮酸通过2，3-丁二醇环途径合成的。微生物一般通过两条代谢途径降解葡萄糖生成丙酮酸：糖酵解途径(EMP)和磷酸戊糖循环途径(PPC)途径。在EMP途径中葡萄糖转化成1，6-二磷酸果糖后，在醛缩酶的催化下，裂解成两个3碳化合物(3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮)，由此转化成2分子丙酮酸；在PPC途径中葡萄糖转化生成6-磷酸葡萄糖酸后，通过戊糖磷酸循环生成3-磷酸甘油醛，3-磷酸甘油醛直接进入EMP生成丙酮酸。D-核糖是生产菌株经由PPC途径合成的，但D-核糖生产菌株因为转酮酶缺失，PPC途径不完整，不能合成3-磷酸甘油醛，因此D-核糖产生菌株发酵液中积累的3-羟基丁酮可以断定是通过EMP途径生成的。
在D-核糖发酵过程中EMP和PPC途径对底物葡萄糖形成竞争性消耗，从代谢调控的角度来讲，如果能有效抑制EMP途径的代谢流，减少葡萄糖通过EMP途径的代谢量，使葡萄糖最大限度的通过PPC途径代谢，合成D-核糖，则有利于提高葡萄糖生成D-核糖的转化率，增加D-核糖产率。
理想的D-核糖生产代谢菌株，EMP代谢途径缺失或越弱越好。通过上述分析可知转酮酶缺失的D-核糖生产菌株副产物3-羟基丁酮主要通过EMP途径合成。因此通过测定D-核糖发酵液中3-羟基丁酮的含量就可以估计D-核糖发酵菌株EMP途径代谢流的强弱，以此来评价D-核糖发酵菌株转化葡萄糖生产D-核糖的能力的大小。
基于上述原理，申请人提出了一种筛选高产、高转化率D-核糖生产菌种方法。
本发明所述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其步骤是：以常规方法诱变转酮酶缺失的D-核糖生产菌株，涂布平板分离单菌落，挑取单菌落移接斜面，35-37℃培养45-55小时，选成熟斜面再以35-37℃、200转/分钟条件进行发酵培养55-65小时，取发酵液4000-5000转/分钟离心10-15分钟，然后测定离心后发酵清液中的3-羟基丁酮、还原糖及葡萄糖含量，选择3-羟基丁酮、葡萄糖含量低、还原糖含量高的菌株再常规方法进行复筛，即可得到D-核糖产率及转化率高的菌株。
在应用上述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法时：所述3-羟基丁酮含量低，可判定D-核糖发酵菌株糖酵解途径(EMP)代谢流弱；葡萄糖含量低说明菌株转化葡萄糖的能力强、速度快；在本发明中斐林试剂测定的D-核糖发酵液中还原糖含量是葡萄糖、D-核糖和3-羟基丁酮含量之和，因此如果发酵液中葡萄糖、3-羟基丁酮含量一定，还原糖含量越高就证明D-核糖含量越高。选择3-羟基丁酮、葡萄糖含量越低低、还原糖含量越高的菌株转化葡萄糖生产D-核糖的能力的越大，该转酮酶缺失的D-核糖生产菌株越有选择价值。
在上述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法中：所述斜面培养条件优选是37℃培养48小时。
在上述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法中：所述发酵培养条件优选是37℃、200转/分钟条件发酵培养60小时。
在上述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法中：所述3-羟基丁酮含量的测定方法是：将离心后发酵清液稀释至可测定范围浓度后取1ml，加蒸馏水4ml，充分混匀后再加入以蒸馏水配制的浓度为1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的浓度为5g/L的α-萘酚1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，根据标准曲线计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
在上述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法中：所述还原糖含量的测定采用斐林试剂定糖法。
在上述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法中：所述葡萄糖含量的测定采用SBA-40C型葡萄糖测定仪。
在上述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法中：
涉及的3-羟基丁酮的测定原理是：3-羟基丁酮与肌酸和甲萘酚反应形成粉红色复合物，3-羟基丁酮的含量在0-100ug时该复合物的在530nm吸光度(A)与3-羟基丁酮的含量呈线性关系。该方法是经典的测定3-羟基丁酮的方法，反应灵敏、专一性强、操作简便，适合批量分析。
涉及的3-羟基丁酮标准曲线及其制作方法是：配制10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分别加入10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸馏水，使总体积至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸馏水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，以3-羟基丁酮的量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
在斐林试剂定糖法实验中：斐林试剂是常用的单糖的定量测定方法之一，测定原理是根据单糖中含有的醛基和羰基具有还原性，能和斐林试剂中的二价铜离子定量发生氧化还原。D-核糖，葡萄糖和3-羟基丁酮都可以与斐林试剂发生定量反应。
在应用SBA-40C型葡萄糖测定仪测定葡萄糖中：测定原理是利用固定化葡萄糖脱氢酶与葡萄糖进行专一性反应，不受其它化合物的干扰。
涉及菌种的诱变和培养方法是：出发菌种经常规诱变后，涂布平板分离单菌落，挑取单菌落移接斜面，待斜面菌种成熟后将1～2环活化的菌种，接种于装有30ml种子培养基的250ml的三角瓶中，200转/分钟条件振荡培养55～72小时，发酵液离心去菌体，发酵清液用来测定其中的3-羟基丁酮、还原糖及葡萄糖含量，以还原糖含量高、葡萄糖和3-羟基丁酮含量低的为标准，选育本发明所述的D-核糖产率及转化率高的菌株。
本发明是通过测定D-核糖生产菌株发酵液中一种副产物3-羟基丁酮的含量，间接考查该菌株生产D-核糖的效率的，通过测定D-核糖发酵液中3-羟基丁酮的含量就可以估计D-核糖发酵菌株EMP途径代谢流的强弱，以此来评价D-核糖发酵菌株转化葡萄糖生产D-核糖的能力的大小，实现了快速、准确、简便、高效的设计目的，且本发明所涉及的3-羟基丁酮、还原糖和葡萄糖的测定方法都是被普遍采用的，操作简便、重复性好、成本低，实践证明本发明提出的生产D-核糖菌种的选育方法，特别适合生产菌种的分离筛选，一方面可以逐步提高生产菌种D-核糖产率和转化率，另一方面可以防止菌种优良性状的退化和消失，在D-核糖的工业化生产中具有重要意义。
下面结合实施例对对本发明进行详细说明，但本发明又不受实施例所局限。
具体实施方式
实施例1
采用紫外线按照常规方法对转酮酶缺失D-核糖生产菌株(枯草芽孢杆菌ATCC21952)进行诱变，然后适当稀释涂布平板(平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2)，37℃培养，待长出单菌落，挑取单菌落并移接斜面(斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2)，共挑取单菌落移接斜面647支，斜面放置37℃培养48小时，取成熟斜面一支对一支接种摇瓶(250ml三角瓶装30ml发酵培养基：葡萄糖120-150g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆20g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸镁0.4g/L，pH 6.0-7.2)，37℃、200转/分钟摇瓶培养60小时，发酵液4000转/分钟离心10分钟，留取上清液，备用。
将离心后发酵清液稀释至3-羟基丁酮的含量约10mg/L左右，然后取1ml，加蒸馏水4ml，充分混匀后再加入以蒸馏水配制的浓度为1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的浓度为5g/L的α-萘酚1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，根据标准曲线计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
上述涉及的3-羟基丁酮标准曲线的制作方法是：配制10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分别加入10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸馏水，使总体积至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸馏水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，以3-羟基丁酮的量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
同理，按常规实验室方法，以斐林试剂定糖法测定还原糖的含量；以SBA-40C型葡萄糖测定仪测定葡萄糖的含量。
选择3-羟基丁酮、葡萄糖含量低、还原糖含量高的菌株再进行摇瓶复筛。经多次常规分离筛选后得到4株D-核糖产率和转化率提高的菌株，其中D-核糖产率较现有菌株平均提高30％，转化率提高11％。
实施例2
采用紫外线按照常规方法对转酮酶缺失D-核糖生产菌株(短小芽孢杆菌ATCC21951)进行诱变，然后适当稀释涂布平板(平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2)，37℃培养，待长出单菌落，挑取单菌落并移接斜面(斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2)，共挑取单菌落移接斜面476支，斜面放置，35℃培养55小时，取成熟斜面一支对一支接种摇瓶(250ml三角瓶装30ml发酵培养基：葡萄糖120-150g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆20g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸镁0.4g/L，pH 6.0-7.2)，35℃、200转/分钟摇瓶培养70小时，发酵液5000转/分钟离心15分钟，留取上清液，备用。
将离心后发酵清液稀释至3-羟基丁酮的含量约10mg/L左右，然后取1ml，加蒸馏水4ml，充分混匀后再加入以蒸馏水配制的浓度为1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的浓度为5g/L的α-萘酚1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，根据标准曲线计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
上述涉及的3-羟基丁酮标准曲线的制作方法是：配制10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分别加入10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸馏水，使总体积至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸馏水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，以3-羟基丁酮的量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
同理，按常规实验室方法，以斐林试剂定糖法测定还原糖的含量；以SBA-40C型葡萄糖测定仪测定葡萄糖的含量。
选择3-羟基丁酮、葡萄糖含量低、还原糖含量高的菌株再进行摇瓶复筛。经多次常规分离筛选后得到3株D-核糖产率和转化率提高的菌株，其中D-核糖产率较现有菌株平均提高29％，转化率提高12％。
实施例3
采用紫外线按照常规方法对转酮酶缺失D-核糖生产菌株进行诱变，然后适当稀释涂布平板(平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2)，36℃培养，待长出单菌落，挑取单菌落并移接斜面(斜面培养基：蛋白胨10g/L，酵母浸出物1g/L，硫酸镁2g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，pH 7.0-7.2)，共挑取单菌落移接斜面539支，斜面放置，36℃培养52小时，取成熟斜面一支对一支接种摇瓶(250ml三角瓶装30ml发酵培养基：葡萄糖120-150g/L，硫酸铵5g/L，玉米浆20g/L，硫酸锰0.2g/L，硫酸镁0.4g/L，pH 6.0-7.2)，36℃、200转/分钟摇瓶培养56小时，发酵液4500转/分钟离心12分钟，留取上清液，备用。
将离心后发酵清液稀释至3-羟基丁酮的含量约10mg/L左右，然后取1ml，加蒸馏水4ml，充分混匀后再加入以蒸馏水配制的浓度为1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的浓度为5g/L的α-萘酚1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，根据标准曲线计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
上述涉及的3-羟基丁酮标准曲线的制作方法是：配制10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液，取6只比色管，按次序分别加入10mg/L的标准3-羟基丁酮水溶液0ml，0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml，然后在上述比色管中加入蒸馏水，使总体积至5ml，再依次加入1g/L的肌酸(蒸馏水配制)1ml、5g/L的α-萘酚(1mol/L NaOH配制)1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光值(A)，以3-羟基丁酮的量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
同理，按常规实验室方法，以斐林试剂定糖法测定还原糖的含量；以SBA-40C型葡萄糖测定仪测定葡萄糖的含量。
选择3-羟基丁酮、葡萄糖含量低、还原糖含量高的菌株再进行摇瓶复筛。经多次常规分离筛选后得到4株D-核糖产率和转化率提高的菌株，其中D-核糖产率较现有菌株平均提高35％，转化率提高15％。
Claims (7)
1.一种筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其步骤是：以常规方法诱变转酮酶缺失的D-核糖生产菌株，涂布平板分离单菌落，挑取单菌落移接斜面，35-37℃培养45-55小时，选成熟斜面再以35-37℃、200转/分钟条件进行发酵培养55-72小时，取发酵液4000-5000转/分钟离心10-15分钟，然后测定离心后发酵清液中的3-羟基丁酮、还原糖及葡萄糖含量，选择3-羟基丁酮、葡萄糖含量低、还原糖含量高的菌株再进行复筛，即可得到D-核糖产率及转化率高的菌株。
2.如权利要求1所述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其特征是：所述3-羟基丁酮、葡萄糖含量越低、还原糖含量越高，可判定D-核糖发酵菌株糖酵解途径(EMP)代谢流越弱，D-核糖发酵菌株转化葡萄糖生产D-核糖的能力的越大，该转酮酶缺失的D-核糖生产菌株越有选择价值。
3.如权利要求1所述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其特征是：所述斜面培养条件是37℃培养48小时。
4.如权利要求1所述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其特征是：所述发酵培养条件是37℃、200转/分钟条件发酵培养60小时。
5.如权利要求1所述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其特征是：所述3-羟基丁酮含量的测定方法是：将离心后发酵清液稀释至可测定范围浓度后取1ml，加蒸馏水4ml，充分混匀后再加入以蒸馏水配制的浓度为1g/L的肌酸1ml、以1mol/L NaOH配制的浓度为5g/L的α-萘酚1ml，室温反应50分钟，以1cm比色池，波长530nm，测定吸光度(A)，根据标准曲线计算发酵液中3-羟基丁酮的含量。
6.如权利要求1所述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其特征是：所述还原糖含量的测定采用斐林试剂定糖法。
7.如权利要求1所述的筛选D-核糖高转化率菌种的方法，其特征是：所述葡萄糖含量的测定采用SBA-40C型葡萄糖测定仪。
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|---|---|---|---|---|
| CN101928304A (zh) * | 2010-08-27 | 2010-12-29 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 一种d-核糖的制备方法 |
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2006
- 2006-03-14 CN CN 200610043210 patent/CN1831104A/zh active Pending
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| CN101928304A (zh) * | 2010-08-27 | 2010-12-29 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 一种d-核糖的制备方法 |
| CN101928304B (zh) * | 2010-08-27 | 2012-11-28 | 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 | 一种d-核糖的制备方法 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |