CN1830237A - 一种培育耐旱高羊茅的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育耐旱高羊茅的方法。该方法是利用植物表达载体将豇豆的△¹－吡咯啉－5－羧酸合成酶的突变型P5CS－F129A基因导入高羊茅的胚性愈伤组织中，经培育得到耐旱高羊茅；所述P5CS－F129A基因具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列。本发明为高羊茅生物性状的改良提供了一条其它方法所无法比拟的全新途径，通过基因工程方法将抗旱、耐盐基因P5CS－F129A导入高羊茅，在不影响高羊茅产量和抗病性的前提下，可使高羊茅的生物性状大大改善，具有巨大的经济效益和社会效益。

Description

一种培育耐旱高羊茅的方法

技术领域

本发明涉及一种培育植物新品种的方法，特别是涉及一种培育耐旱高羊茅的方法。

背景技术

高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)又称苇状羊茅，具有极高的营养价值，是世界上重要的禾本科牧草。因其具有抗干旱、耐瘠薄、抗病、适应性广等特点，在城市绿化和运动场地的建设中应用广泛，并显示出显著的社会、生态和环境效益，高羊茅作为草坪草越来越受到人们的重视。然而我国北方的水资源比较缺乏，而高羊茅作为草坪草，其种植面积不断扩大，在管理时又需要大量水，因而培育抗旱节水的高羊茅新品种成为当务之急。

和其它大多数植物一样，草坪草的改良一直依赖于传统的育种手段，即通过有性杂交的方法使基因重组达到传递遗传信息的目的。虽然许多性状，如吸引性、持久性、抗逆性以及产量都已得到长足的改进，但同时改良的局限性也日益明显。

从发展具有中国特色的现代草坪业出发，需要借助现代生物技术手段改良草坪草种。尤其是利用转基因技术改良草坪草的某些性状，获得改良的转基因植物，提高草坪草的抗逆性，减少灌溉用水，减少各种农药的应用，达到低成本、低污染的目的。目前有关转基因草坪草的研究只有很少量的阶段性报告，其抗逆性的研究尚在进一步试验中。

组织培养阶段是目前培育大多数转基因植物所必需的，但草坪草—高羊茅一直难以进行组织培养。难点在于高羊茅共生着一种顶孢霉属(Acremonium coemphialum)真菌，诱导时容易污染，加上出愈时间过长及分化率过低等，给组培再生造成了一定的难度，而组织培养是进行植物包括草坪草在内遗传操作的基础。胚性愈伤组织(embryogenic callus)是目前草坪草遗传转化广泛应用的起始材料。

高羊茅的成熟种子、幼穗、节外植体、未成熟胚、叶片基部的切片都可用于胚性愈伤组织的诱导。钱海丰和薛庆中将高羊茅的成熟种子剥去种壳，表面灭菌，暗培养后，获得无色较透明的愈伤组织(钱海丰，薛庆中.中国草地，2002，24(1)：46-49.)。支月娥等报道高羊茅的幼穗、节外植体可形成愈伤组织(支月娥，何亚丽，田龚.上海农学院学报，1998，16(1)：46-48.)。陈文品等将四倍体高羊茅和多花黑麦草F1杂种用幼胚培养诱导出愈伤组织(陈文品，曹明树，张航宁等.南京农业大学学报，1997，(1)：12-15)。Takamizo T等报道了叶片基部的切片可用于高羊茅胚性愈伤组织的诱导(Takamizo T，Suginobu K.，Ohsugi R.plant science，1990，72：125-131)。在获得高羊茅愈伤组织后，通过一定的培养基来诱导分化以获得再生植株，更是遗传转化必须解决的难题。陈文品等用幼胚培养得到了再生植株(陈文品，曹明树，张航宁等.南京农业大学学报，1997，(1)：12-15)，钱海丰和薛庆中用愈伤组织分化成苗(钱海丰，薛庆中.中国草地，2002，24(1)：46-49.)。Dalton从高羊茅的原生质体中获得了再生植株(Dalton SJ，Bettany AJE，Timms E，et al.Plant Science，1998，132：31-43.)。但以高羊茅幼苗的下胚轴作为外植体来诱导愈伤还鲜有报道。

目前，转基因技术在草坪草育种中正在得到越来越广泛的应用。基因转化的方法主要有：农杆菌介导的基因转化方法、植物病毒载体介导的基因转化方法、种质系统介导的基因转化方法和DNA直接导入的基因转化方法。

干旱和土壤盐渍是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。因此，利用转基因手段来获得抗干旱耐盐渍的转基因植物，已成为当今植物生物技术领域研究的热点之一。研究发现，耐旱植物在干旱条件下，能显著地积累一些低分子量的代谢物如脯氨酸，使细胞维持较高的细胞质渗透压，有利于植物在干旱条件下的水分吸收。普遍认为，植物对渗透胁迫的适应是多基因控制，也可能是受单基因控制，或由为数不多的几个基因控制。用原生质体培养法筛选到的烟草耐寒耐盐突变体，脯氨酸积累提高6-12倍，而总氨基酸不变，脯氨酸积累为单基因控制。表明应用细胞工程和遗传工程赋以植物抗胁迫能力是行得通的。由此，可通过转基因技术使植物本身在干旱条件下产生更多的渗透调节保护物质，从而可大大提高植物的抗旱性。

随着对植物抗旱耐盐的基础分子生物学研究的不断深入和对抗性基因的不断发现和挖掘，迄今为止，已有数十种植物被转化并获得了具有不同程度抗旱和/或耐盐性的转基因植物。现已证实，在转基因植物中超量积累低分子量化合物如甘露醇、脯氨酸、芒柄醇等，能够赋予转基因植物抗水分胁迫(也称渗透胁迫)的能力。

在植物体内，脯氨酸的合成是通过谷氨酸途径和鸟氨酸途径进行的。其中谷氨酸途径在渗透胁迫条件下占主要地位。从谷氨酸生物合成脯氨酸的前两步反应是由Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)催化的。P5CS是一种双功能酶，具有明显的γ-谷氨酸激酶(γ-GK)和γ-谷氨酰磷酸还原酶(γ-GRP或GSADH)的活性，是脯氨酸合成的关键酶，在胁迫条件下，P5CS基因的表达活性增强，在胞质中增加脯氨酸的合成，从而增加细胞的保水能力，提高植物的抗旱性。而P5CS活性又受到脯氨酸的变构调节。豇豆P5CS多肽129位的苯丙氨酸被丙氨酸替代后(P5CS-F129A)会导致脯氨酸反馈抑制急剧降低，使植物体内脯氨酸的积累量增加。

除草剂草丁膦(phosphinothricin，商品名为Glufosinate ammonium，主要成分为PPT)是一种非选择性灭生除草剂，为谷氨酰胺类似物，它可有效阻断与抑制植物谷氨酰胺合成酶(GS)的作用，从而造成NH⁴⁺的大量积累，使植物细胞氨中毒死亡。从潮湿链霉菌分离出来的bar基因所编码的PPT乙酰转移酶(PAT)，可以乙酰辅酶A为辅助因子，使PPT乙酰化而失去抑制GS活性的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育耐旱高羊茅的方法。

本发明所提供的培育耐旱高羊茅的方法，是利用植物表达载体将豇豆的Δ¹-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的突变型P5CS-F129A基因导入高羊茅的胚性愈伤组织中，经培育得到耐旱高羊茅；所述P5CS-F129A基因具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列。

所述P5CS-F129A基因在Genbank中的登记号为M92276.Vigna aconitifolia.

所述胚性愈伤组织可由高羊茅的下胚轴、成熟种子、幼穗、节外植体、未成熟胚和叶片基部的切片诱导，优选为下胚轴，用下胚轴进行外源基因的遗传转化操作简便。

所述用高羊茅的下胚轴诱导胚性愈伤组织的方法为：当高羊茅无菌幼苗长到高约2-5cm时，在无菌条件下，切取幼苗基部的下胚轴部位，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，在26±1℃下暗培养35-45d；所述愈伤组织诱导培养基是在MS培养基的基础上添加了2，4-D 10mg/L蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH5.8。在该条件下，胚性愈伤组织的诱导率可达80±5％。

所述高羊茅无菌幼苗的培育方法为：将经消毒的高羊茅种子置于种子接种培养基上，在26±1℃，光照12h/d下培养18-22天；所述种子接种培养基是在MS培养基的基础上添加了BA 1mg/L，IAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH5.8。

所述高羊茅种子的消毒方法为：将高羊茅的种子依次用无菌水中浸泡1-3h，70％酒精消毒30s，无菌水冲洗3-5次，50％次氯酸钠消毒20-25min，用无菌水冲洗3-5次。在该消毒条件下，种子污染率为零，发芽率可达90±3％。

若诱导出的胚性愈伤组织不能分化成苗，高羊茅的遗传转化也就不能很好地进行。所述由高羊茅胚性愈伤组织获得再生植株的方法包括以下步骤：

1)将胚性愈伤组织接种于分化培养基上，在26±1℃，光照12h/d下培养7-10d得到再生小幼苗；所述分化培养基是在MS培养基的基础上添加了BA 1mg/L，IAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH5.8。

2)将再生小幼苗移入生根培养基，在26±1℃，光照12h/d下继续培养28-35天，得到高羊茅再生植株；所述生根培养基是在MS培养基的基础上添加了IAA 0.5mg/L，KT 0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

在上述条件下，由愈伤组织分化再生植株率可达80±6％，完全可用于实际的遗传转化工作。

为便于对转基因植株进行鉴定及筛选，所述植物表达载体可添加有筛选标记基因。

所属筛选标记基因可为抗除草剂PPT的bar基因或GUS基因、萤光素酶基因lux、绿色荧光蛋白基因gfp等可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物或庆大霉素标记物、卡那霉素标记物、潮霉素标记物、氯霉素标记物等抗生素抗性基因，优选为抗除草剂的bar基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有P5CS-F129A基因的植物表达载体可通过使用DNA直接导入法、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导、农杆菌介导等生物学方法转化高羊茅的胚性愈伤组织。

所述DNA直接导入法优选为基因枪法，用基因枪法进行轰击的参数为：金粉直径为1.0μm，轰击压力为1300psi，金粉的轰击量为500μg/枪，质粒DNA的轰击量为0.83μg/枪，质粒DNA与金粉形成复合体的比例为1.66μg·mg^-1(金粉)，轰击距离为12cm或15cm，一般每皿(约60-80愈伤块)轰击1次。

在DNA直接导入的基因转化方法中，基因枪法具有以下优点：(1)不受寄主范围的影响，适合于每一个物种；(2)靶受体类型广泛，几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击转化；(3)可控度高。近代的高压放电或高压气体基因枪已可根据实验要求无级调控微弹的速度和射入浓度，可以较高的命中率把DNA微粒载体射入特定层次的细胞，即感受态细胞和分生区细胞，从而为基因转化提供可靠的技术措施；(4)操作简便快速，甚至可克服无菌的困难。特别是那些由原生质体再生植株较为困难和农杆菌感染不敏感的单子叶植物，可以快速获得第一代种子。

所述高羊茅受体的品种可为羚羊、交战二号或猎狗5号等，优选为羚羊。

本发明提供了一种应用愈伤诱导技术、植株再生技术以及基因工程手段培育耐旱高羊茅的方法。应用本发明的方法将P5CS-129A基因导入高羊茅胚性愈伤组织，再经培育获得转基因植株，经分子检测证实P5CS-F129A基因整合到高羊茅基因组中，从而使高羊茅的耐旱性状得到改良，此外，以bar基因为选择基因，将其导入高羊茅，可使高羊茅具有PPT抗性而免受其伤害。本发明目标单一，无不利基因的连锁问题，已获得的转基因植株抗旱性明显提高，可直接应用于生产，为高羊茅生物性状的改良提供了一条其它方法所无法比拟的全新途径，通过基因工程方法将抗旱、耐盐基因P5CS-129A导入高羊茅，在不影响高羊茅产量和抗病性的前提下，可使高羊茅的生物性状大大改善，具有巨大的经济效益和社会效益。

下面结合附图对本发明做进一步的说明。

附图说明

图1为高羊茅幼苗

图2为高羊茅幼苗下胚轴

图3为以高羊茅下胚轴为外植体诱导的胚性愈伤组织

图4为由胚性愈伤组织分化再生的高羊茅小植株

图4A为含有P5CS-F129A基因的植物表达载体pBPC-P5CS-F129A的部分物理图谱

图5为高羊茅胚性愈伤组织的抗性筛选与抗性愈伤组织的分化

图6获得草丁膦抗性的转化植株

图7PCR鉴定转基因植株的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图8Southern杂交鉴定转基因植株的结果

图9为高羊茅植株叶片草丁膦抗性分析

图10为高羊茅植株叶片脯氨酸的相对含量

图11为高羊茅植株的抗旱性分析结果

图12为高羊茅萎蔫植株的恢复性分析结果

图13为转P5CS-129A高羊茅植株和非转基因植株的耐旱性田间试验结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用酶试剂均为TaKaRa公司或Promega公司产品。

培养基：

A.种子接种培养基：MS+BA 1mg/L+IAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

B.愈伤组织诱导培养基：MS+2，4-D 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

C.愈伤组织继代培养基：MS+2，4-D 5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

D.分化培养基：MS+BA 1mg/L+IAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

E.生根培养基：MS+IAA 0.5mg/L+KT 0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

F.筛选诱导培养基：MS+2，4-D 5mg/L+草丁膦2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

G.筛选分化培养基：MS+BA 1mg/L+IAA 0.1mg/L+草丁膦2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

H.筛选生根培养基：MS+IAA 0.5mg/L+KT 0.2mg/L+草丁膦1-2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

实施例1、耐旱高羊茅的获得及其转基因植株的检测

一、胚性愈伤组织的诱导

1、种子的消毒：将高羊茅品种羚羊的种子先在无菌水中浸泡1-3h，70％酒精消毒30s，无菌水冲洗3-5次，50％次氯酸钠消毒20-25min，期间不停地摇动，再用无菌水冲洗3-5次。

2、将消毒后的高羊茅种子接种于种子接种培养基上，在26±1℃、光照12h/d下进行培养，3d后种子开始萌发，约20d成苗(图1)。

3、当幼苗长到高约2-5cm时，在无菌条件下，切取幼苗基部的下胚轴部位约0.5-1cm作为外植体，如图2所示，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，在26±1℃下暗培养，约7d后可从外植体上长出愈伤组织，20-25d后长成约0.1-0.2cm的小块，35-45d后长成0.2-0.5cm的小块，得到高羊茅品种羚羊的胚性愈伤组织(图3)。

二、高羊茅胚性愈伤组织分化再生能力的检测

将步骤一获得的高羊茅胚性愈伤组织接种于分化培养基上，在26±1℃、光照12h/d条件下进行培养，约7d后生出绿点并逐渐发育成新的再生小幼苗，然后，将幼苗移入生根培养基中继续培养，约20d后开始生根，30d后根长可达0.5-1cm，得到高羊茅再生植株(图4)，证明用步骤一的方法获得的胚性愈伤组织具有较强的分化能力，可用于下述转基因植株的培育。

三、转P5CS-F129A基因高羊茅植株的获得

1、含有P5CS-F129A基因和除草剂PPT的抗性基因bar的重组载体pBPC-P5CS-F129A的构建

将P5CS-F129A基因用限制性内切酶EcoRI从质粒载体pBI-P5CSF129A(Hong Z，Lakkineni K，Zhang Z，Verma DPS.2000，Plant Physiology，122：1129-1136.)切下并用Klenow酶补平，经琼脂糖凝胶电泳检测后回收该2.5kb的DNA片断，将其与经限制性内切酶Spe I和Kpn I双酶切并补平的含bar的载体pBC31(参见专利申请“一种改良小麦烘烤品质的方法”，专利申请号为02104080.X)连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到重组子，使用E.Z.N.A^Plasmid MiniprepsKit I(200)D6942-02 Box A试剂盒(美国Omega公司)提质粒，经测序验证正确，得到含有P5CS-F129A基因和除草剂PPT的抗性基因bar的质粒载体，命名为pBPC-P5CS-F129A，其部分物理图谱如图4A所示。

2、基因枪法将质粒载体pBPC-P5CS-F129A导入胚性愈伤组织

1)靶细胞的准备

在转化前3-5d，挑选用步骤一的方法获得的有光泽、突起、致密、直径0.2-0.5cm的胚性愈伤组织置于含愈伤组织继代培养基、直径为9cm的培养皿中，将愈伤块聚集在培养皿中心直径为2-4cm的范围内，每皿放入60-80个愈伤块。

2)微粒子弹的准备

称取60mg金粉(BioRad，直径1μm)于1.5mL离心管中，加入1mL 70％乙醇，用旋涡混合器充分震荡混合3-5min，静置15min，15000rpm离心15min使金粉沉淀，弃上清，用无菌ddH₂O洗3次(加水1mL，涡旋振荡1min，静置1min，15000rpm离心2min使金粉沉淀，弃上清)，加入50％无菌甘油，旋涡混匀。取50μl上述制备的金粉至一无菌1.5mL离心管中，顺序加入5μl质粒DNA(1μg/μl)、50μl 2.5M CaCl₂和20μl 0.1M的亚精胺；继续震荡2-3min，静置1min，12000rpm离心2min，弃上清液。用140μl 70％乙醇和100％乙醇各洗沉淀1次，最后用60μl 100％乙醇重新悬浮颗粒，并用旋涡混合器充分震荡混合，分散颗粒。

3)用基因枪法进行转化

使用Bio-Rad公司的高压放电PDS-100/He基因枪进行轰击，轰击参数：金粉直径为1.0μm，轰击压力为1300psi，金粉为500μg/枪，质粒DNA为0.83μg/枪，质粒DNA与金粉形成复合体的比例为1.66μg·mg^-1(金粉)，轰击距离为12cm或15cm，每皿(约60-80愈伤块)轰击1次，具体操作步骤如下：

(1)先用70％乙醇对基因枪表面及样品室进行消毒，吹干。同时，将可裂圆片(临界压力为1100Psi)浸泡在异丙醇中进行消毒，而阻挡网、微弹载体及其固定器、固定工具、托座和镊子等进行高压灭菌(121℃，20min)。

(2)打开氦气瓶的总阀，顺时针转氦气调节阀，使氦压表指针的示数为1300Psi(高于可裂膜压力200Psi)。

(3)打开基因枪及变压器开关。

(4)将微粒载片嵌入固定环中，取DNA及金粉的混合物加于微粒载片中心，干燥约1-3min。

(5)安装可裂膜于其托座上，顺时针拧到气体加速器上。

(6)将空间环、阻挡网、阻挡网托座、微粒载片及固定环(带有微粒的一面朝下)安装好，旋紧盖子，插入枪中。

(7)把样品放在轰击室中，关好门。

(8)按动真空键，待真空度至26-28英寸汞柱(相当于88.05-94.82kpa)时，迅速按下Hold键，接着按住发射键，并保持不动，直到击发为止。

(9)按通气键待真空表回零后，取出样品。

(10)关机：把氦气瓶的总开关旋紧，打一次空枪，待氦压表(2个表的)指针回零后，再逆时针旋转氦压表调节阀；关闭基因枪的总开关及变压器开关。

3、胚性愈伤组织的筛选及植株再生

1)胚性愈伤组织的恢复培养

将用基因枪轰击后的胚性愈伤组织，在原培养皿中、暗处恢复培养3-5d，以便修复由微弹复合体对受体细胞造成的损伤。

2)胚性愈伤组织的诱导筛选

将恢复培养后的胚性愈伤组织接种在筛选诱导培养基上，部分愈伤组织被杀死。

3)胚性愈伤组织的分化筛选

从经过恢复培养和诱导筛选的愈伤组织中挑选生活力强的愈伤组织块，转接到筛选分化培养基上，25-35d后，大部分(85-95％)愈伤组织会逐渐褐化变黑而死亡，只有少部分(5-15％)愈伤组织能够存活下来(抗性愈伤组织)并逐渐长出绿色的小芽点，再经过10-20d后，发育成具有幼芽和幼叶的小外植体(图5)。

4)植株再生

将由抗性愈伤组织分化成的小外植体接种在筛选生根培养基上，15-20d开始生根，30d后根长可达0.3-0.8cm，从而发育成具有根、茎、叶的完整再生小植株(图6)。待幼苗株高3-5cm时可移栽到含营养土的花盆进行生长，35d后可进行下述草丁膦涂抹、脯氨酸含量测定和抗旱性检测。

四、转基因高羊茅植株的分子鉴定

1、PCR检测转基因植株

根据P5CS-F129A基因的DNA序列设计引物，引物序列如下：

引物1：(上游引物)5’GTTAGCGGTTGGAAGATT 3’；

引物2：(下游引物)5’CTTGGCGTAGAAACACATTAG 3’

采用SDS微量法提取高羊茅叶片的DNA，然后以此DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，用PTC-100PCR扩增仪(M.J.Research公司)扩增P5CS-F129A基因片段，50μl PCR反应体系为：10Xbuffer 5μl；2mM dNTP 5μl；50μM上、下游引物各1μl，模板DNA(1μg/μl)1μl；Taq DNA聚合酶2.5μl；加水补致50μl。PCR扩增条件为：先94℃5min；然后94℃1min，53℃1min，72℃2min，共30个循环；最后72℃7min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图7所示(泳道1为DNA标准分子量，泳道2-7为转基因植株，泳道8为未转化对照植株，泳道9为阴性对照H₂O，泳道10为阳性对照pBPC-P5CS-F129A质粒载体)，阳性转基因植株可扩增出1832bp的片段，结果共检测出阳性转基因植株25株，其扩增条带的位置与阳性对照的扩增条带的位置相同，而非转基因植株无对应扩增带，其中，轰击距离12cm的3株，轰击距离15cm的22株，转化频率分别为0.8％和1.4％(表1)。

表1不同轰击条件下愈伤组织筛选、植株再生和PCR检测情况

轰击距离	轰击愈伤数	抗性愈伤数	再生植株数	转基因植株数	转化效率
						1215	3581568	1676	740	322	0.8％1.4％

2、转基因再生植株的Southern blot分析

采用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II试剂盒(Roche公司)对步骤1经PCR检测获得的部分阳性转基因株系进行Southern blot分析，具体方法为：采用CTAB大量提取法提取高羊茅叶片的基因组DNA，取30μg高羊茅基因组总DNA经限制性内切酶BamHI(TaKaRa公司)完全消化后，用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行分离，电泳结束后，利用毛细管转移法将DNA转移至带正电荷的Hybond-N⁺尼龙膜上，所用探针为用制性内切酶BamH I和Kpn I从质粒载体pBPC-P5CS-F129A上双酶切切下的含P5CS-F129A的单一片断，用琼脂糖凝胶电泳回收该DNA片段后对其进行标记，探针标记操作流程按上述试剂盒的使用说明书进行。检测结果如图8所示(泳道1为DNA标准分子量，泳道2-5为转基因植株，泳道6为非转基因对照植株)，结果转基因高羊茅存在P5CS-F129A的杂交信号而对照非转基因植株则无此杂交信号，表明P5CS-F129A已整合到高羊茅的基因组中。

实施例2、转基因高羊茅植株的草丁膦抗性分析

从形态指标如株高、长势等基本相似的转基因植株和对照植株中选取长势、面积、颜色相近的叶片，用毛笔将2mg/L的草丁膦液均匀地涂抹在叶片上，随时观察叶片的变化。用草丁膦涂抹高羊茅叶片3d后，对照植株叶片开始出现伤害反应，主要表现为叶片生长减缓，颜色由原来的深绿到浅绿，7d后叶片颜色为浅黄直至白色，而转基因植株叶片只有个别部位出现轻微的伤害症状。初步证实Bar基因在受体植物中已得到表达，赋予受体植物草丁膦抗性，结果如图10所示(1-2为未转化植株，3为转基因植株)。

实施例3、转基因高羊茅植株的脯氨酸含量测定

对正常浇水的转基因高羊茅植株和对照非转基因植株的高羊茅叶片的脯氨酸含量进行测定，测定方法可参考(张殿忠，汪沛洪，赵会贤.测定小麦叶片游离脯氨酸含量的方法.植物生理学通讯，1990，(4)：62-65)。取4次独立实验的平均值数据为考题。采用磺基水杨酸法，对正常浇水的转基因植株和对照植株的叶片的脯氨酸含量进行测定，结果如图11所示(2-5为转基因植株，1为对照植株)。高羊茅表明，以对照植株的脯氨酸含量为100％，转基因植株叶片脯氨酸含量比对照株高31％-83％，暗示着目的基因在受体植物中已得到表达，从而增加转基因植株脯氨酸的合成量。

实施例4、转基因植株耐旱性能检测

1、取形态指标如株高、长势等基本相似的转基因植株和对照植株，不浇水进行干旱处理，观察植株的生长情况，14d后，对照植株叶片卷曲，出现萎蔫现象，而转基因植株生长正常，18d后，对照植株萎蔫现象加重，部分叶片干枯，转基因植株仍生长正常(图11)，28d后，待转基因植株和对照植株都萎蔫后，开始浇水，观察植株的恢复生长情况。2d后，转基因植株的部分叶片开始变绿而恢复生长，假如对照植株的叶片还处于萎蔫状态，14d后，转基因植株的生长基本已恢复正常，对照植株仍未能恢复(图12)，表明转基因植株的抗旱性能明显好于对照植株。

2、将温室中的转基因和非转基因高羊茅植株移栽到田间生长，移栽成活后不进行人工浇水，在自然条件下生长5个月的高羊茅植株，当较长时间不下雨时，可以看出转基因植株比对照非转基因植株的耐旱性增强(图13)。

                                      序列表

<160>1

<210>1

<211>2016

<212>DNA

<213>羊茅属高羊茅(Festuca arundinacea Schreb.)

<400>1

atggagagcg cggtggatcc ttctcggggg ttcatgaagg acgtgaagcg tgtgatcatc      60

aaagttggca ccgcggtggt cactcgcgaa gaaggaaggt tagcggttgg aagattggga     120

gctctgtgcg agcagattaa gcaactcaac tctctcggat acgacattat actcgtctcc     180

tctggccccg tcggtattgg acgccaaagg ctacgtttcc gtaaattaat caacagcagc     240

ttcgccgacc ttcagaaacc ccaactcgaa ctcgacggca aggcctgcgc cgccgttgga     300

cagaacagtc tcatggctct ctacgatacg ctgttcactc agctcgatgt gacatcggct     360

cagcttcttg tgacggataa cgatgcccga gataaggatt tcaggaagca gcttactgag     420

actgtgaagt cgctgttggc gctgaaggtt attccggtgt tcaatgagaa cgatgccgtt     480

agtaccagga aggctcccta tgaggattct tctggtatat tttgggataa tgatagttta     540

tctgctttat tagccttgga gttaaaagcc gatctccttg ttttgttgag tgatgtagaa     600

ggtctttaca gtggccctcc aagtgaccct cattcaaagc ttatttatac atataacaaa     660

gaaaaacatc agaatgaaat tacttttggc gacaagtcta gagtgggaag aggcggaatg     720

actgccaaag taaaagctgc ggttcatgca gctgaagctg gcattcctgt tgttattacc     780

agtggttttg cacctgagaa tatcattaat gttctccaag gacaacgtat aggaactctc     840

ttccataaag atgcacatga gtgggctcaa gtaaaagagg ttgatgcacg tgagatggct     900

gttgcagcag ggaatgttcg agaaggctcc aggcgttatc ttcagaggaa aggaaacaaa     960

attttactta aaatagctga tgccctggaa gcaaatgaaa aaataatcag gattgaaaat    1020

gaagctgatg ttactgctgc acaagaagca ggatatgaaa aatccttggt ggctaggcta    1080

gctttaaaac ctgggaagat tgcaagtctt gcaaacaaca tgcgaatcat tgccaatatg    1140

gaagatccaa ttggtcgagt attaaaacgt accgagcttt cagatgggct aattttagaa    1200

aagacatcat ctcctttggg agtgctcctt attgtttttg agtcacgtcc tgatgctctt    1260

gtacagatag cttcattggc aatccgaagt gggaatgggc ttctcttgaa aggtggcaaa    1320

gaagctaagc gatcaaatgc aattttgcac aaagtaatta tcgaggccat accagataat    1380

gttggtggaa aacttatagg acttgtgacc tcaagggaag agatccctga gctacttaag    1440

ttggatgatg taattgatct ggtaattcca agaggcagta acaaacttgt ttctcagatc    1500

aagagttcaa ctaaaattcc tgttttaggt catgctgatg gaatttgcca tgtctatgtt    1560

gataagtctg ctaacgtgga gatggcaaag cggattgtat tagatgcaaa agttgattat    1620

ccggcagcct gcaatgccat ggaaacactt cttatccaca aggatttgat agagaaaggt    1680

tggcttaagg agatcattct tgaccttcga actgaaggcg ttatattata tggtggccct    1740

gtggcaagtt ctctgttaaa tattccacaa gcacattcat ttcatcatga gtacagttcg    1800

ctggcttgca ccgccgaaat tgtggatgac gtgtatgcag ctattgatca tataaatctg    1860

tatggaagtg cacatactga ttcgatcgtt gctgaagata acgaagtagc taatgtgttt    1920

ctacgccaag tagacagtgc tgctgttttt cacaatgcaa gcaccagatt cagtgatggg    1980

gcacgatttg agactaggcg cagaggttgg aattag                              2016

Claims (10)

1、一种培育耐旱高羊茅的方法，是利用植物表达载体将豇豆的Δ¹-吡咯啉-5-羧酸合成酶的突变型P5CS-F129A基因导入高羊茅的胚性愈伤组织中，经培育得到耐旱高羊茅；所述P5CS-F129A基因具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体添加有筛选标记基因。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所属筛选标记基因为抗除草剂PPT的bar基因。

4、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织由下胚轴诱导。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述用下胚轴诱导胚性愈伤组织的方法为：当高羊茅无菌幼苗长到高约2-5cm时，在无菌条件下，切取幼苗基部的下胚轴部位，将其接种于愈伤组织诱导培养基上，在26±1℃下暗培养35-45d；所述愈伤组织诱导培养基是在MS培养基的基础上添加了2，4-D 10mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH5.8。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述高羊茅无菌幼苗的培育方法为：将经消毒的高羊茅种子置于种子接种培养基上，在26±1℃，光照12h/d下培养18-22天；所述种子接种培养基是在MS培养基的基础上添加了BA 1mg/L，IAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH5.8。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述高羊茅种子的消毒方法为：将高羊茅的种子依次用无菌水中浸泡1-3h，70％酒精消毒30s，无菌水冲洗3-5次，50％次氯酸钠消毒20-25min，用无菌水冲洗3-5次。

8、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述由高羊茅胚性愈伤组织获得再生植株的方法包括以下步骤：

1)将胚性愈伤组织接种于分化培养基上，在26±1℃，光照12h/d下培养7-10d得到再生小幼苗；所述分化培养基是在MS培养基的基础上添加了BA 1mg/L，IAA 0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5g/L，pH5.8。

2)将再生小幼苗移入生根培养基，在26±1℃，光照12h/d下继续培养28-35天，得到高羊茅再生植株；所述生根培养基是在MS培养基的基础上添加了IAA 0.5mg/L，KT 0.2mg/L，蔗糖30g/L，琼脂5mg/L，pH5.8。

9、根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述将植物表达载体转化高羊茅胚性愈伤组织的方法为基因枪法。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述用基因枪法进行转化的参数为：金粉直径为1.0μm，轰击压力为1300psi，金粉的轰击量为500μg/枪，质粒DNA的轰击量为0.83μg/枪，质粒DNA与金粉形成复合体的比例为1.66μg·mg^-1，轰击距离为12cm或15cm。

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