CN1824676A - 猪生产性状相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪生产性状相关蛋白及其编码基因与应用。该蛋白为具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：10；2)将序列表中SEQ ID №：10的氨基酸残基序列经过一或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。本发明的猪生产性状相关蛋白的基因组基因中存在一个单核苷酸多态性位点，该位点与猪的生产性状，尤其是猪肌内脂肪含量和腿臀比率相关。本发明的猪生产相关蛋白及其编码基因将在猪的育种中发挥重要作用。

Description

猪生产性状相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白质及其编码基因与应用，特别是涉及一种猪生产性状相关蛋白及其编码基因与利用该蛋白编码基因的单核苷酸多态性和限制片段长度多态性检测猪生产性状的方法。

背景技术

随着生活水平不断提高，人们对肉品质的要求也越来越高，尤其是肉的风味。因此选择合适的遗传标记对于开展标记辅助选择，加快遗传进展是极其重要的。

肌内脂肪含量是影响猪肉质的一项重要指标，与肉质呈正相关，影响肉的嫩度、风味及多汁性，尤其肉的嫩度。Patrici等人对丹麦商品猪肉质研究发现，肉的风味多汁性随肌内脂肪含量的增加而持续改善，因此增高肌内脂肪含量可以增加肉的嫩度及多汁性，增强肉的可口性(Patrici等，Eating quality of pork inDenmark.PigFarming(supplement).1985，10，56～57)。由于肌内脂肪含量的测定在活体中较难实现，并且研究表明肌内脂肪含量具有较高的遗传力(Hovenier等，Livest Prod Sci，1992，32，309～321)，所以利用分子标记进行辅助选择，提高肌内脂肪含量，改善猪肉品质是一个行之有效的方法。在国外，已经把提高肌内脂肪含量作为猪育种的重要选择性状。

到目前为止，一些与肌内脂肪含量有关的候选基因也已相继发现，主要有：Gerbens等人对心脏脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP)多态研究发现其与肌内脂肪含量及背膘厚有显著的相关性(Gerbens等，Effect of genetic variants of the heartfatty acid-binding protein gene on intramuscular fat and performance traitsin pigs.Journal of Animal Science.1999，77(4)：846-852)。H-FABP基因定位于猪6号染色体上(Gerbens等，Characterization，chromosomal localization，and genetic variation of the porcine heart fatty acid-binding protein gene.Mamm Genome.1997，8(5)：328-32)。在心脏及骨骼肌中高效表达。而脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)是另一个与肌内脂肪含量有关的基因，位于猪4号染色体上，对A-FABP基因第一内含子(CA)21微卫星序列多态性分析显示A-FABP的遗传变异和肌内脂肪含量有关(Gerbens等，The adipocyte fatty acid binding proteinlocus：characterization and association with intramuscular fat content inpigs.Mamm Genome.1998，9(12)：1022-1026)。而Janss等对19头梅山公猪和126头荷兰母猪杂交产生的850头F2的肉质性状进行分析，结果发现一个影响肌内脂肪含量的主效基因(命名为MI基因)，并且是隐性遗传(Janss等，Bayesian statisticalanalyses for presence of single genes affecting meat quality traits in acrossed pig population.Genetics.1997，145：395～408)，但其进一步的研究还未见报道。

数量性状基因座(QTL)的研究显示猪2、4、6、7号染色体上存在影响肌内脂肪含量的QTL(De Koning等，Detection of quantitative trait loci for backfatthinknes and intramuscular fat content in pigs(sus scrofa).Genetics，1999，152：1679～1690；Bidanel等，Mapping of quantitative trait loci(QTL)in F2crosses between Meishan and Large white pig breeds in France.Pro of InternConf on Pig Production.1998，51～55)。

碳酸酐酶3(Carbonic anhydrase 3，CA3)是碳酸酐酶家族的一个成员。碳酸酐酶是一个编码锌金属酶的家族，可以催化 的可逆反应，维持机体内酸碱平衡及体液平衡(Dodgson等，The carbonic anhydrases：cellular physiologyand molecular genetics.New York：Plenum，1991)。在人上至少有14个家族成员已被发现，由于它们在细胞中的位置及结构不同而在机体中显示不同的作用，其中CA1，CA2，CA3，CA7和CA13位于细胞质中，CA5A和CA5B位于线粒体中，CA6位于分泌颗粒中，而CA4，CA9，CA12和CA14和细胞膜结合，另外还包含三个相关的蛋白：CA8，CA10，and CA1(Kuo等，The differential expression of cytosolic carbonicanhydrase in human hepatocellular carcinoma.Life Sciences.2003，73：2211-2223)。但在猪中关于碳酸酐酶家族成员的研究较少。

人的CA3基因定位到8号染色体的长臂，和CA1及CA2基因位于同一条染色体上并紧密连锁(Wade等，Nucleotide sequence，tissue-specific expression，andchromosome location of human carbonic anhydrase III：The human CAIII gene islocated on the same chromosome as the closely linked CAI and CAII genes.Proc.Natl.Acad.Sci.1986，83：9571-9575)，基因组全长为10817bp，由7个外显子和6个内含子组成，其cDNA全长为2357bp，编码260个氨基酸。

CA3主要存在于I型骨骼肌纤维中，同其它成员相比具有不同的特征，例如具有较低的CO₂水解酶活性、磷酸酶活性等，在调控能量的组织(肌肉、肝脏及脂肪)中含量较高。研究显示抑制CA3的活性可以提高抗疲劳的能力，降低在机体中具有磷酸己糖的浓度并能提高糖原利用率(Cté等，Metabolic and contractile influence ofcarbonic anhydrase III in skeletal muscle is age dependent.Am J Physiol RegulIntegr Comp Physiol.1999，276：559-565.)。而基因敲除试验显示CA3可能参与谷胱苷肽介导的抗氧化反应(Zimmerman等，Anti-oxidative response of carbonicanhydrase III in skeletal muscle.IUBMB Life.2004，56：343-347)。虽然CA3占骨骼肌肌质可溶性蛋白的8％左右，但CA3在骨骼肌中的具体生物学作用还不太清楚。

基因突变研究是分析基因功能的一个重要手段。通过群体中性状关联分析寻找与猪重要经济性状相关的基因，进行分子育种是科研工作者的一项重要且艰巨的任务。并且性状关联分析也是研究猪CA3基因在骨骼肌中的作用的一个重要的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪生产性状相关蛋白及其编码基因。

本发明所提供的猪生产性状相关蛋白，名称为CA3，来源于猪，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：10；

2)将序列表中SEQ ID №：10的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与猪生产性状相关的蛋白质。

其中，序列表中的序列10由260个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述猪生产性状相关蛋白的编码基因(CA3)也属于本发明的保护范围。

上述猪生产性状相关蛋白的编码基因包括猪生产性状相关蛋白的cDNA基因和猪生产及免疫性状相关蛋白的基因组基因。其基因组基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：9的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：10蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：9由10489个碱基组成，自5′端的第1-237位核苷酸为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第949-1146位核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第3548-3666位核苷酸为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第5389-5481位核苷酸为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第6803-6865位核苷酸为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第8392-8547位核苷酸为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第9524-10489位核苷酸为该基因组基因的第七个外显子；自5′端的第204-206位核苷酸为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第9644-9646位核苷酸为该基因组基因的终止密码子TGA；自5′端的第238-948位核苷酸为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第1147-3547位核苷酸为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第3667-5388位核苷酸为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第5482-6802位核苷酸为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第6866-8391位核苷酸为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第8548-9523位核苷酸为该基因组基因的第六个内含子。

其cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：10蛋白质序列的DNA；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由1837个碱基组成，自序列表序列1的5’端第183-965位核苷酸为开放阅读框，自5’端第1-182位核苷酸序列为5’非翻译区，自5’端第963-1794位核苷酸序列为932bp的3’非翻译区，自5’端第1795-1800位核苷酸序列为AATAAA加尾信号，自5’端第1812-1837位核苷酸序列为PolyA尾巴。

含有本发明的猪生产性状相关蛋白编码基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种检测猪生产性状的方法。

本发明所提供的检测猪生产性状的方法，是检测自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸为G还是A，确定猪的基因型，然后通过基因型确定生产性状。

如果自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸为A时，其纯合体的基因型为BB；自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸为G时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AB。

所述方法中，检测自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸为G还是A的方法包括先PCR扩增含有自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用HinfI酶切扩增产物。

所述扩增产物可为自序列表中SEQ ID NO：3的5′端第1-817位核苷酸的817bp的片段。

HinfI酶切所述PCR扩增产物，若得到553bp 202bp，62bp三个酶切片段，其基因型为AA纯合体；若得到755bp，553bp，202bp及62bp四个酶切片段时，其基因型AB杂合体；若得到755bp和62bp两个片段时，其基因型为BB纯合体。

AA与AB基因型猪以及AB与BB基因型猪的肌内脂肪含量呈极显著差异(P＜0.01)，而AA型与BB型猪的肌内脂肪含量差异不显著(P＝0.098)。同时AA与AB基因型猪的腿臀比率差异显著(p＝0.02)，而AA型与BB猪及AB型与BB型猪的腿臀比率差异不显著。并且AB和BB基因型猪在达90kg日龄，背膘厚及剪切力方面存在相关趋势(P值分别为0.098，0.107，0.076)。

本发明的猪生产相关蛋白及其编码基因可用于检测猪腿臀比率、背膘厚、肉质、肌内脂肪等生产性状，为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，将在猪的育种中发挥重要作用。

附图说明

图1为猪CA3基因的HinfI-RFLP的三种基因型电泳结果

具体实施方式

下述实施例中所用实验方法，如无特别说明均为常规方法。

实施例中所用材料通城猪(Tongcheng pig)；大白(Yorkshire)；长白(Landrance)；杜洛克(Duroc)；莱芜猪(Laiwu pig)；五指山小型猪(Wuzhishan mini-pig)；巴马小型猪(Bama mini-pig)；贵州小型猪(Guizhou mini-pig)

实施例1、猪CA3及其全长cDNA基因和基因组基因的获得

1、猪CA3及其全长cDNA基因的获得

提取大白猪55天胚胎骨骼肌总RNA，经过mRNA的纯化、cDNA合成、蛋白酶K和Sfi I消化以及cDNA分级分离后，将获得的cDNA与pBluescript II SK⁺载体连接，从而构建猪骨骼肌cDNA文库(朱正茂，博士论文，华中农业大学，2003)。随机挑取克隆子进行商业测序，将测序所获得的序列经美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)检索并根据比较基因组的信息获得相应的猪的基因，其中有一个克隆子序列所对应的基因为猪CA3基因。该猪CA3基因序列具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列。

为验证该拼接得到的cDNA为猪CA3全长cDNA序列，用TRIZOL的方法提取长白猪的总RNA，按照大连宝生物公司提供的方法合成cDNA第1条链，再设计1对特异性引物F1：5’CAGTGCCCACGAAGACGAC 3’，R1：5’TGAAGTTCGTGAAGGGTGCC 3’，进行PCR扩增。其中，PCR扩增体系为20μl：2μL cDNA(50ng)，含1×buffer，1.5mM MgCl₂，dNTP终浓度为150μM，引物终浓度为0.2μM，2.0U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序是：先94℃5min；然后94℃30s，58℃40s，72℃1min循环35次；最后72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖电泳分离，然后按照下述方法进行PCR扩增产物的纯化、克隆和测序：

(1)PCR产物的纯化：用PCR产物纯化试剂盒(北京天为时代科技有限公司)纯化上述PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶上切下，放入1.5ml Ependorff管中，加入3倍体积的PN溶胶液(如果胶重0.1g，其体积可视为100ul，则加入300ul溶胶液)，于50℃水浴10分钟至凝胶完全融化，将上一步所得的凝胶液加入吸附柱中，12,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，倒掉废液。将吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2分钟。将吸附柱放到一个干净的离心管中向吸附膜中间加入20ul超纯水，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。

(2)连接反应：将纯化的PCR产物与pGEM-Teasy载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的pGEM-Teasy载体，1.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4连接酶，混匀后置于16℃水浴12小时。

(3)感受态细胞的制备：从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有100ml LB的锥形瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD₆₀₀达到0.3-0.4时将锥形瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl₂重悬沉淀，置4℃保存备用。

(4)转化：无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的上述连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入600μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养60min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。

(5)菌液PCR鉴定及测序：分别挑取上述转化后平板上的单菌落，接种于2-3mlLB中，37℃300r/min培养过夜。以菌液为PCR扩增模板进行扩增，引物分别为上述F1：5’CAGTGCCCACGAAGACGAC 3’，R1：5’TGAAGTTCGTGAAGGGTGCC 3’，PCR扩增体系为20μl，其中菌液1ul，含1×buffer，1.5mM MgCl₂，dNTP终浓度为150μM，引物终浓度为0.2μM，2.0U Taq DNA聚合酶。另外设一个不含模板的阴性对照。PCR扩增程序是：94℃5min，然后循环35次94℃30s，58℃40s，72℃1min，最后72℃延伸10min。PCR反应产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测后，将阳性克隆子的菌液送到测序公司(北京英骏生物技术有限公司)测序，测序结果表明，该PCR扩增产物具有序列表中序列1的猪CA3全长cDNA序列。该猪CA3cDNA全序列长为1837bp，自序列表序列1的5’端第183-965位核苷酸为开放阅读框，编码具有序列表中序列10的氨基酸残基序列的猪CA3；自序列表序列1的5’端第1-182位核苷酸序列为5’非翻译区，自5’端第963-1794位核苷酸序列为932bp的3’非翻译区，自5’端第1795-1800位核苷酸序列为AATAAA加尾信号，自5’端第1812-1837位核苷酸序列为PolyA尾巴。在GenBank中的同源检索表明该基因在物种间具有较高的同源性，其中CDS编码区序列(自序列表序列1的5’端第183-962位核苷酸)与人和小鼠的同源性都为87％。

2、猪CA3基因组基因的获得

从40头通城猪血液中提取基因组DNA，根据序列表中序列1的cDNA序列设计引物：CF1：5’-AGTGCCCACGAAGACGAC-3’，CR1：5’-GCGATTGGTTGTCTCCCT-3’；CF2：5’-GCCAAGGGAGACAACCAAT-3’，CR2：5’-GAGCCCCAGTGAAGATGAA-3’；CF3：5’-GGAGTCAAGTATGCTGCGG-3’，CR3：5’-CTCCATCAGGGTGCTTCA-3’；CF4：5’-GCTCTGAAGCACCCTGATG-3’，CR4：5’-AGGACTAGTTGGAACTCGCC-3’；CF5：5’-GGCGAGTTCCAACTAGTCCT-3’，CR5：5’-TGGTCAGAGCTCACGGTGA-3’；CF6：5’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’，CR6：5’-GCTCTCACCTTCATTGCTC-3’，PCR扩增体系为20μl，其中基因组DNA 50ng，含1×buffer，1.5mM MgCl₂，dNTP终浓度为150μM，引物终浓度为0.2μM，2.0U Taq DNA聚合酶。PCR扩增程序是：94℃5min，然后循环35次94℃30s，58℃40s，72℃1min，最后72℃延伸10min。在猪的基因组DNA中进行扩增，得到6条特异条带，用软件DNAStar中的Seqman程序拼接得到一条10489bp的序列，表明具有序列表中序列9的核苷酸序列，该序列即为猪CA3的基因组序列，编码具有序列表中序列10的氨基酸残基序列(猪CA3)。自5′端的第1-237位核苷酸为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第949-1146位核苷酸为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第3548-3666位核苷酸为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第5389-5481位核苷酸为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第6803-6865位核苷酸为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第8392-8547位核苷酸为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第9524-10489位核苷酸为该基因组基因的第七个外显子；自5′端的第204-206位核苷酸为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第9644-9646位核苷酸为该基因组基因的终止密码子TGA；自5′端的第238-948位核苷酸为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第1147-3547位核苷酸为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第3667-5388位核苷酸为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第5482-6802位核苷酸为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第6866-8391位核苷酸为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第8548-9523位核苷酸为该基因组基因的第六个内含子。

其中，自序列表中序列9的5′端第8603位为多态位点，有2头通城猪的自序列表中序列9的5′端第8603位为G，该2头通城猪为纯合体，将其基因型命名为AA；有26头通城猪的自序列表中序列9的5′端第8603位为A，该26头通城猪为纯合体，将其基因型命名为BB，有12头通城猪的自序列表中序列9的5′端第8603位为G和A，该12头通城猪为杂合体，将其基因型命名为AB。

DNA序列同源性检索鉴定：通过NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息，结果表明猪CA3基因具有和人CA3基因相似的基因组结构，即都是由7个外显子和6个内含子组成，而编码序列在物种间具有较高的同源性说明猪CA3基因可能具有和人CA3基因相似的功能。

实施例2、CA3基因组基因的物理定位

1、用于物理定位的实验材料

用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，IMpRH)进行染色体精确定位，两套体细胞杂种板的制备方法见参考文献(Yerle等，A somatic cell hybrid panelfor pig regional gene mapping characterized by molecular cytogenetics.Cytogenet Cell Genet.1996，73：194-202；Yerle等，Construction of awhole-genome radiation hybrid panel for high-resolution gene mapping in pigs.Cytogenet Cell Genet.1998，82：182-188)。

其中SCHP包括27个体细胞杂种细胞系，1-19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20-27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系，并以仓鼠、小鼠和猪基因组DNA作为阳性对照(Yerle等，A somatic cell hybrid panel for pig regional gene mappingcharacterized by molecular cytogenetics.Cytogenet Cell Genet.1996，73：194-202)。经细胞遗传学鉴定该杂种板保留了猪的除Y染色体外的全部18条常染色体以及X染色体，其中含有127个非重叠的染色体区域，各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从WWW(http：//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)获得。

IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29.3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。结果在IMpRH定位程序中进行分析(http：//imprh.toulouse.inra.fr/)。

2、猪CA3基因的定位

分别以SCHP和IMpRH克隆板中的DNA为模板，进行PCR扩增反应，引物为：ML1：5’-AGTGCCCACGAAGACGAC-3’(正向，如序列表SEQ ID：4所示)和MR2：5’-GCGATTGGTTGTCTCCCT-3’(反向，如序列表SEQ ID：5所示)进行扩增的PCR反应总体积为10μl，其中模板DNA为20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，1.5U Taq DNA聚合酶(Promega)。PCR扩增程序是：先94℃5min；然后94℃30s，59℃30s，72℃40s，共循环35次；最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

SCHP克隆板PCR分型结果表明，19个猪×中国仓鼠体细胞杂种细胞系(1-19号)中，1，5，6，9，12，14，15，18，19号出现与猪基因组DNA阳性对照扩增一致的818bp(序列表中序列2)的目的片段，而在8个猪×小鼠体细胞杂种细胞系(20-27号)中，20，25，27号杂种细胞系均扩增得到818bp(序列表中序列2)的目的片段。将上述实际观测的PCR分型数据提交给HybWeb(http：//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果是猪CA3基因定位于猪4号染色体上(P＝1.000)，进一步的区域定位结果为SSC4 q11-q14(P＝0.9864，与该区域标记间的相关系数为1.000，P＜0.1％)。

用IMpRH克隆板对CA3进行精确定位。统计分析结果表明CA3基因定位于SSC4q，与猪4号染色体上的SW317紧密连琐，LOD值为6.28，RH图距是61Ray。

实施例3、猪CA3的部分DNA序列的单核苷酸多态性和RFLP多态性检测

1、猪CA3的部分DNA序列的单核苷酸多态性的检测

分别以大白猪、杜洛克、莱芜猪、五指山小型猪和巴马小型猪各2头的基因组为模板，用引物SL1：5’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’(正向，如序列表SEQ ID：6所示)，SR1：5’-GCTCTCACCTTCATTGCTC-3’(反向，如序列表SEQ ID：7所示)扩增猪部分基因组DNA，均得到了1369bp特异性扩增片段(序列表中序列3)，进行测序和序列分析。序列分析结果表明在序列表中序列3的自5′端第200位(即自序列9的5′端第8603位)核苷酸处存在1个HinfI酶切位点(G↓ANTC)，在此处存在G200-A200的突变。当200位核苷酸处为G时，序列可以被HinfI酶切开(定为等位基因A)，而当200位核苷酸处为A时，序列不能被HinfI酶切开(定为等位基因B)，纯合体为AA和BB，杂合体为AB。

为了进一步分析这个突变位点，右端引物重新设计，得到下述引物：SL1：5’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’(正向，如序列表SEQ ID：6所示)，SR2：5’-GGGGAAGACAGTATCAGGG-3’(反向，如序列表SEQ ID：8所示)此时扩增产物为817bp(自序列3的5′端第1位至817位核苷酸)，该扩增产物并包含两个HinfI酶切位点(自序列3的5′端第200-204位核苷酸和自序列3的5′端第753-757位核苷酸)。这两个等位基因组成三种等位基因型为AA(HinfI酶切为553bp 202bp，62bp三个片段)，AB(HinfI酶切为755bp，553bp，202bp及62bp四个片段)，BB(HinfI酶切为755bp和62bp两个片段)。

2、PCR-RFLP-HinfI多态性在不同猪品种中的分布情况

分别以通城猪(Tongcheng pig)；大白(Yorkshire)；长白(Landrance)；杜洛克(Duroc)；莱芜猪(Laiwu pig)；五指山小型猪(Wuzhishan mini-pig)；巴马小型猪(Bama pig)和贵州小型猪(Guizhou mini-pig)的基因组DNA为模板，具体取样的分配如表1所示，以下述序列为引物进行扩增反应：

SL1：5’-CCCTTCACGAACTTCAACC-3’(正向，如序列表SEQ ID：6所示)，

SR2：5’-GGGGAAGACAGTATCAGGG-3’(反向，如序列表SEQ ID：8所示)

PCR扩增条件：PCR反应总体积为20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl₂，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.3μmol/L，2.0U Taq DNA聚合酶(Promega)。

PCR扩增程序是：先94℃4min；然后按：94℃30s，58℃30s，72℃40s，循环35次；最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到扩增片段的长度均为817bp(自序列3的5′端第1位至817位核苷酸)。

(3)RFLP检测条件

PCR产物酶切反应体积是10μl，其中1×buffer 1.0μl，PCR产物3-5μl，限制性内切酶HinfI为0.5μl(5U)，用H2O补足10μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用2％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。HinfI酶切PCR产物，得到553bp、202bp和62bp三个片段的基因型为AA，得到755bp，553bp，202bp及62bp四个片段的基因型为AB，得到755bp和62bp两个片段的基因型为BB。猪CA3基因的HinfI-RFLP的三种基因型(AA、AB、BB)电泳结果如图1所示，图1中M：DNA分子量标准(100bp Ladder)。PCR-RFLP-HinfI多态性在不同猪品种中的分布和不同品种中分布的差异性检验结果分别如表1和表2所示，表1的基因型和基因频率的结果显示，PCR-RFLP-HinfI多态性在国内外猪品种中存在着较大的差异。其中，国内品种B等位基因占优势(五指山小型猪除外)，而国外品种A等位基因占优势。

       表1.PCR-RFLP-HinfI多态性在不同猪品种中的分布

品种	个体数	基因型			等位基因频率
							AA	AB	BB	A	B
		通城猪	40	2	12	26						0.20	0.80
大白	30						26	4	0	0.93	0.07
		长白	29	28	1	0						0.98	0.02
杜洛克	13						6	6	1	0.69	0.31
		莱芜猪	35	0	3	32						0.04	0.96
五指山小型猪	41						41	0	0	1.00	0.00
		巴马小型猪	48	0	0	48						0.00	1.00
贵州小型猪	23						3	3	17	0.20	0.80
		总计	259

表2.猪CA3基因HinfI-RFLP多态性位点在不同品种中分布的差异性检验结果

品种	大白	长白	杜洛克	莱芜猪	五指山小型猪	巴马小型猪	贵州小型猪
								通城猪	50.167**	57.550**	18.088**	7.722*	73.371**	19.978**	3.124
大白		1.858	8.509*	58.102**	5.793	78.000**	35.072**
								长白			14.869**	60.973**	1.434	77.000**	37.975**
杜洛克				32.962**	25.365**	55.159**	14.569**
								莱芜猪					76.000**	4.269	5.338
五指山小型猪						89.000**	51.858**
								巴马小型猪							13.678**

注：肩注^*表述P＜0.05；肩注^**表述P＜0.01。

3、标记性状关联分析

利用湖北省通城猪群做性状关联分析，分别来自143头猪的143个DNA样品用于基因型检测。

所分析的性状有部分生产性能及部分肉质性状。为了减少系统效应先建立如下的分析模型：

Y_ijk＝μ+BATCH_i+SEX_j+COMBINATION_k+(BS)_ij+(BC)_ik+ε_ijkl，

其中，Y_ijk是性状观察值，μ为总体均数，BATCH_i为批次效应，SEX_j为性别效应，COMBINATION_k为组合的效应，(BS)_ij为批次和性别的互作效应，(BC)_ik为批次和组合的互作效应，ε_ijkl为随机误差，假定服从N(0，σ²)分布。

将获得的残差值作为新的性状值，应用最小二乘法及两两比较分析基因型的效应。

对猪CA3基因Hinf^*I-RFLP多态性位点基因型检测结果表明在143个个体中AA基因型有85个，AB基因型有32个个体，BB基因型有26个个体。在与部分生产性状进行关联分析中，所分析的性状有肌内脂肪含量，达90kg日龄，背膘厚，大理石花纹，剪切力及腿臀比率。基因型间扣除系统效应(性别、组合及批次效应)后的残差值均值和标准差分析结果总结于表3、表4。性状关联分析结果表明该突变位点与肌内脂肪含量呈极显著相关(P＝0.002)，并且还与腿臀比率显著相关(P＝0.039)。进一步分析显示，AA与AB基因型猪以及AB与BB基因型猪的肌内脂肪含量呈极显著差异(P＜0.01)，而AA型与BB型猪的肌内脂肪含量差异不显著(P＝0.098)。同时AA与AB基因型猪的腿臀比率差异显著(p＝0.02)，而AA型与BB猪及AB型与BB型猪的腿臀比率差异不显著。并且AB和BB基因型猪在达90kg日龄，背膘厚及剪切力方面存在相关趋势(P值分别为0.098，0.107，0.076)。

表3：不同CA3基因HinfI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	个体数	肌内脂肪含量(％)	达90kg日龄(天)	背膘厚(厘米)	大理石花纹	剪切力	腿臀比率(％)
								AA	85	2.668±0.101	186.414±0.104	3.352±0.105	2.333±0.105	44.510±0.105	30.409±0.103
AB	32	2.139±0.165	186.095±0.170	3.589±0.171	2.601±0.171	44.335±0.170	29.946±0.168
								BB	26	3.016±0.183	186.519±0.189	3.176±0.189	2.616±0.189	44.790±0.189	30.061±0.187
P value
								AA-AB		0.007	0.112	0.238	0.183	0.382	0.020
AA-BB		0.098	0.629	0.417	0.193	0.198	0.105
								AB-BB		0.000	0.098	0.107	0.953	0.076	0.649

表4：不同CA3基因HinfI-RFLP基因型与部分生产性状的关联分析

基因型	个体数	肌内脂肪含量(％)	腿臀比率(％)
				AA	85	2.668B±0.101	30.409a±0.103
AB	32	2.139AB±0.165	29.946a±0.168
				BB	26	3.016A±0.183	30.061b±0.187

注：相同的大写字母(黑体显示)代表差异极显著(P＜0.01)，相同的小写字母(黑体显示)代表差异显著(P＜0.05)。^*代表扣除系统误差后所得残差值的均值±标准差。

                               序列表

<160>10

<210>1

<211>1837

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>1

cttcccccac cccgcctccc aaataccacc ccaatcctgt ttagcccccc gccccaccct     60

cgctgaccta ataaggccat gcaagtgtgt ggggggaacc tatataaaag gtgtgggttc    120

gcggggacag tgcacggcgt ggaagagaaa gcagcagccg tccagtgccc acgaagacga    180

ccatggccaa ggagtggggc tacgccgacc acaatggtcc tgaccactgg catgaacttt    240

acccaattgc caagggagac aaccaatcgc ccattgaact gcacactaag gacatcaagc    300

acgacccttc tctgctgccc tggacagcat cttatgaccc tggctctgcc aagaccatcc    360

tgaacaatgg gaagacctgc agggttgtat ttgatgatac ttatgacagg tcaatgctga    420

gaggtggtcc tctcactgca gcctaccggc ttcgccagtt tcatcttcac tggggctcct    480

cagatgatca cggatctgag cacactgtgg atggagtcaa gtatgctgcg gagctccatt    540

tggttcattg gaattcaaag tataacagtt ttgcaactgc tctgaagcac cctgatggag    600

tggctgtagt tggcattttt ctgaagatag gacgtgagaa aggcgagttc caactagtcc    660

ttgatgcatt ggacaaaatt aagacaaagg gcaaggaggc acccttcacg aacttcaacc    720

catcctgcct gttccctgcc tgccgggact actggaccta ccatggctcc ttcaccacgc    780

cgccctgcga ggagtgcatt gtgtggctcc tgctgaagga gcccatcacc gtgagctctg    840

accagatggc caagctgcga agcctctact ccagtgcgga gaacgagccc cctgtccccc    900

tagtgaggaa ctggcgcccc ccacagccta tcaagggcag gatagtgaag gcctccttca    960

aatgaggctg ctggagcttg ccctcttcag gaaaggaagc ctgctactgc agagcttggt   1020

tccttgcctc cttttggtgc tccttattcc aagtattatt tcagttttcc acactgagca   1080

atgaaggtga gagctgcaat caccaagaac caaagttact attgacagat ctaatacgaa   1140

agcatttggc ctttgtaaga atcatctttc ctgtaaaaga aaactcttac taagtttcaa   1200

agaaaaagaa acagagatag aaaagatgga gaaaaatggc tgttgggcgc cattttgtgt    1260

catcttaaat ttcgcacaac ttcagttttt actcttttca tgttactagt tatcgatctt    1320

aaagaaataa tgagtaattc tatatgagga gtagaggtat atgaagatca tgtagcaatt    1380

acacataagc cagaaattaa aataattgtg gacgtcaaga attgcaatga tgctgtgtgt    1440

tttaaccctt aaataaaact aactagaggt ccatcattta ttaaaattgg agttctgtaa    1500

aaaagggctg gttttaataa tgaaagtaac acatttgacc gggattaaaa aaaaaaaaaa    1560

gacccatttt ttgaattttt tcttcataaa gatagttgac tttatcctat ttctctttac    1620

ctgaaggagg gccatttatt tttcttttta ctacttttat ctttgcatgc ttattaaaat    1680

aaaaactgcc tctgctatct ttccattttg agggtgggat taatgattcc tagaacacgc    1740

aggagtgaat gactgcactt gaagataaag gcagttgtat tgatcatcaa aactaataaa    1800

gacgtgaatg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa                             1837

<210>2

<211>818

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>2

agtgcccacg aagacgacca tggccaagga gtggggctac gccgaccaca atggtgagcg      60

tgagatggtg ctgttgaaaa agggggcaac tctagagagt gcattgaaaa atgggggagg     120

cggagtcgaa ggaaactaat gttcactgac ccccgctgct gacccctttt acctttatct     180

cacttagttc tccccagtgt gaagctgtta ttactcccat tgggggaaac caaagcacag     240

agaggctggg taccttgccc aggtcacaga gcttctgact gagaagtcag acctctgagg     300

tccagttctg actgtcccct tctccctgat cctgggcaag cacttaacct ctctgagcca     360

ggtgatgata taagcagctc tgcctgcagc tcctgcctac ccatgggaaa agaacatggg     420

tgtgctctga aatccatttg gggtcggtgt tattttattc cagctctagg atagaagagg     480

acattagtaa aacatgtgat gaagtccatt tcaaaaataa gcctttgaag ctatcttctt     540

gagcaagtag aggaaataaa cagagttaaa tacagtctcc aggtacacta ttaacaaagt     600

tatgaaaagg tcttaaactg tgagccttgg gttgcctaat ctgaaatcca ggatctttcc     660

gcaatcattg tccaacccct gtgtatttta ctggtttagt caattagaaa gaaggcttgg    720

attgcaccac caaataagta aatcccctca atttcatttt ctaggtcctg accactggca    780

tgaactttac ccaattgcca agggagacaa ccaatcgc                            818

<210>3

<211>1369

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(200)

<223>n＝a或g

<400>3

cccttcacga acttcaaccc atcctgcctg ttccctgcct gccgggacta ctggacctac     60

catggctcct tcaccacgcc gccctgcgag gagtgcattg tgtggctcct gctgaaggag    120

cccatcaccg tgagctctga ccaggtgagc agtgaccacg ggcgggcctc gtgaataccc    180

ggacttaacc ttcccggctn agtctgtaag atacaggcac tatatctgta tatatctgta    240

tatatttcaa tattctgaaa atgtaaagct ttgctaaata gatattcacc gaacagctct    300

accactagag attttatagt tttgccccag ttaattatga ttggcctggt aactttctaa    360

aactcgactt ccaaagggta ccaggagaaa catcaagcat ttgaagatgg tggtgatgct    420

gaacaatgcc tgaaacttgt gctttagaaa cattgaaggg ttcagatcca tatgagttag    480

tctttgctga tttggagaac tctcaaatac cgagcactgg ttaggagatg ggatagcaaa    540

tacaggcctg ggaagaaggt gctgatggaa ggaattgaac cttcttagga ggtgtagact    600

agttccccag ttttatagct caataagttg aggctcaaaa aggttaagta atttgttcat    660

gatcacagtc aagggcagga tctgagatgc ctgtctgttt tcaatgcctg acctctctgc    720

tcaggccttt cttctaaatg ttcatgtaaa ttgactccat aaacttatat gatgaaggct    780

aattgagctt attctttgcc ctgatactgt cttcccccta cctaagagat agatttcata    840

ccaacccctc aaattaaaag aattttttag agttcaggag aaaaagattt tgaccataag     900

gcatggtgat cctgtataaa atgaaacatg tttttataaa ttttaaaaaa aagggcatta     960

tattattcag gaactagtaa ccaaatagct ctggactgaa cattagggtc aggttttgtg    1020

ttttgcttcc ttgtttagag agctagcgat ttctaactct ttgtcacact catagtgtcc    1080

acttggtatg aatgtctgca tctccccatg ccttttgcag atggccaagc tgcgaagcct    1140

ctactccagt gcggagaacg agccccctgt ccccctagtg aggaactggc gccccccaca    1200

gcctatcaag ggcaggatag tgaaggcctc cttcaaatga ggctgctgga gcttgccctc    1260

ttcaggaaag gaaacctgct actgcagagc ttggttcctt gcctcctttt ggtgctcctt    1320

attccaagta ttatttcagt tttccacact gagcaatgaa ggtgagagc                1369

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

agtgcccacg aagacgac                                                   18

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gcgattggtt gtctccct                                                  18

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

cccttcacga acttcaacc                                                 19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

gctctcacct tcattgctc                                                 19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ggggaagaca gtatcaggg                                                 19

<210>9

<211>10489

<212>DNA

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<220>

<221>misc-feature

<222>(8603)

<223>n＝a或g

<400>9

gcgattacta tggattcatt ggcttccccc ctccgcctcc caaataccac cccaatcctg     60

tttcgccccc cgccccaccc tcgctgacct aataaggcca tgcaagtgtg tggggggaac    120

ctatataaaa ggtgtgggtt cgcggggaca gtgcacggcg tggaagagaa agcagcagcc    180

gtccagtgcc cacgaagacg accatggcca aggagtgggg ctacgccgac cacaatggtg    240

agcgtgagat ggtgctgttg aaaaaggggg caactctaga gagtgcattg aaaaatgggg    300

gaggcggagt cgaaggaaac taatgttcac tgacccccgc tgctgacccc ttttaccttt    360

atctcactta gttctcccca gtgtgaagct gttattactc ccattggggg aaaccaaagc    420

acagagaggc tgggtacctt gcccaggtca cagagcttct gactgagaag tcagacctct    480

gaggtccagt tctgactgtc cccttctccc tgatcctggg caagcactta acctctctga    540

gccaggtgat gatataagca gctctgcctg cagctcctgc ctacccatgg gaaaagaaca    600

tgggtgtgct ctgaaatcca tttggggtcg gtgttatttt attccagctc taggatagaa    660

gaggacatta gtaaaacatg tgatgaagtc catttcaaaa ataagccttt gaagctatct    720

tcttgagcaa gtagaggaaa taaacagagt taaatacagt ctccaggtac actattaaca    780

aagttatgaa aaggtcttaa actgtgagcc ttgggttgcc taatctgaaa tccaggatct    840

ttccgcaatc attgtccaac ccctgtgtat tttactggtt tagtcaatta gaaagaaggc    900

ttggattgca ccaccaaata agtaaatccc ctcaatttca ttttctaggt cctgaccact     960

ggcatgaact ttacccaatt gccaagggag acaaccaatc gcccattgaa ctgcacacta    1020

aggacatcaa gcatgaccct tctctgctgc cctggacagc atcttatgac cctggctctg    1080

ccaagaccat cctgaacaat gggaagacct gcagggttgt atttgatgat acttatgaca    1140

ggtcaagtaa gtatgacact taaatagaga cacatggacc atattggcaa aatgtgattt    1200

atggcacaac gacagaatta gtaggaagag ggggctcttc tctgaaaatg gaaacgacat    1260

ttgaatatgc tgtagtcctg aagaattatg tttatacatt ggaggggaat gtctcacttt    1320

ctaaccttgg ccactttgct cctgcaaaat ggagcaaagg taaaagctgg cagtgcatag    1380

tgaggtgctg gtagtgggtc caaatgagtt ttcttgaggc actgatagtc taaacctgag    1440

aggttttttg cttcttaacc atggctcgga gagtaagacc accattccca cacatggcac    1500

agattccatt ctacaaagca aggaacacag caaagacacc aagtgggtaa tgtcttcccc    1560

tagtgtgtga gtgggggcca atccaaggga gagagcagac tcactatatt agtcaagaag    1620

acctaagcct tctatgcatc agtggagttc atttgactaa ttttgctgag tgtttttgaa    1680

gaatctgaca atttcttctt gagttgtgat ttgtataaaa atgaaaaatt gcatgtttaa    1740

aaaaaatctc tttatttcac ctgtactctt tggcaaatca gtgaaataaa aggttaatta    1800

aaaatgtttt attttactgt aaatgaggta agaacctaac tttaatattt tgttgcttga    1860

tgtacagtta tacactttct tttttataaa aaagttaaaa ttatccttgc tgatgtacac    1920

aaatgaatat tctcagtaat gttgtaagta aagactaacg gtcatgcttt ctacctacta    1980

acagtttcca agtaaggaat atcatagaaa tgtatgtttt cttaaaccat aatctcataa    2040

ctatctgtta gcctttcccc ttctccattt aaatccagtt tcattctgga gagtaaacaa    2100

caaaattaaa cagtatctat taagttgaat catatgaaaa tgcctttttg aaagcaaaaa    2160

tgattgaata ttgacaattt cacatggttc atcctaataa attggactca tatgttcaga    2220

taattgttcc tcgtggttgg acagaaaaaa ttcagttaat caagccactt atgaccaagc    2280

atatacaaac cttgctctgt cattttagac ctatactgtg gctttcagtc tgctatttaa    2340

gtaacaatag ttgatcagtc ctttctagaa tagctaatct gaatcctatt ttgatatagc    2400

ttacattact aaattttgac tttagagttt ttgtacagtt ctcaacatcc tttagaaaat    2460

atttgaactt ggagttcccg tcgtggctca gtggttagca aatccgacta ggaaccatta    2520

ggttgtgggt tctatccctg gccttgctca gtaggttaag gatccagcat tgccgtgagc    2580

tgtggtgtag gtcgcggatg tggctcggat ccctcaattg ctgtagctct ggtataggcc    2640

tggggctaca gctccgattg gacccctagc ctgggaacct ccatatgccg tgggagcggc    2700

ccaagaaatg gcaaaaagac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagaa ggaaagaaaa    2760

tatctgagct tctgaattac tgccaggctg aatgaagtta aacctaagtt gaggtatttg    2820

gactgcaaac tcagattcat gctaccagta atcacccagt ttagctgtcc acattgcttg    2880

gttccctggg aaattttgga attttccatt tcatctcgtg aataaacaca atctgaacta    2940

gacatggatg aaagttcttg cttgtagtct cgaagaaaag tgtagttgga ggcaagacat    3000

ggagaaggaa ttcacatttg ctcagtgatt actgtgctgg gcactgcgat gaacacttta    3060

aagtccttaa tctcatttaa tcctcacagc agctttgaaa ggttagtatt attatcaccc    3120

tcagagagat gcaaaaatgg gttcagagaa gtttagcaac ttgcctgaga tcacacaact    3180

aggaaagggt gggagctggc gtgggaacct cagtctgtct gactctcaat tctcctgttc    3240

tccccactgc accatgcaac agactcatgc tttgattgtt ttaattggcc atcagctgtt    3300

ttaatttatt ttcaaaactg ttaagtcgac atttaaaaaa taaaacaaca agcaaataaa    3360

atcagaaaga cagaaaagag aaatcattta ttttgatata ccccaagact tggagagaga    3420

ccagtatgtt tgggaatggc atcatcagcc cagactgtca agcctgggct gtaagagcat    3480

tggtttaaag caggactgtg tgaaaagagc ctgagttcac tgctgaccta gcttctctga    3540

atcacagtgc tgagaggtgg tcctctcact gcagcctacc ggcttcgcca gtttcatctt    3600

cactggggct cctcagatga tcacggatct gagcacactg tggatggagt caagtatgct    3660

gcggaggtag gcagaactgc catcaccccc tctggatctc acccagtgaa aactgaaaac    3720

tgaaagataa tgacagaatt gcatctccca cgtttgttcc aagcctgtag ttgcgaaaag    3780

agctgcaatg gttttagcat aagatcaagt taccaaacat tctaggagag tatagatggg    3840

ttagggtcat gcatgaagat tttcaaagtt acatatagaa actgtatagc aacttaatag    3900

taattttaaa tagggcagaa tcctgaatgg aactgaaaag ataaggatag ttaatactta    3960

ttaagtgtct acaagtatta actcatttga tcctctcatc acactatgag atggttatga    4020

tgaggaaact gaggcactgg aaagttacaa gtcacactgc acatgcatgc tagacctggg    4080

gttctacctt atgctgactg gctttagagt tcatcatctt gtccagtacc ctaagctgcc    4140

tcttttacaa gagtgcggtg ctttaaaaat agcacttagt aaatctggct aatgctcatg    4200

ctctagtctc ttaataaagg atgtgcatat gtgtgtgatt ttacacgtac atagatagat    4260

agatagatag atagatacac acacacacaa tttaatgagt taagccatta ctctctgctt    4320

cagttaaccc actaaagaaa acccatgatt tgtagctcag atggaggcat caaatttcaa    4380

ggaaataaga caagcctcct gcatgttccc tgtataaagc caagcattta agggggtgac    4440

aaatgccctg gaggtgagga taattccatt tgcactgcca gactcttttc cagaggtagg    4500

ctctggtcaa cataggagct gagataggaa ccttggaggc acttttaggt actttcttag    4560

gcagaatcat taggcagttt aactattggt taaactaaag tggaggagac ctagagaact    4620

ttcctgtgat cgttctatat ctctacagcc catcttgaaa gccagtgaca ggatgaatta    4680

attgagaatg tcttccacat agcttcccct gaaaatgggg aaagtttagt atatttctca    4740

cagatgtagg caaggcttgt agtttggtct ttacatgggg gattatttca cacttttggt    4800

cgctaataaa atagtgttta actgctatga actattgttt tctcttgcca ttctatatga    4860

ccccatgcca gaaattgggc taaatttaac tggggcatgt tttagcactt tacctttagt    4920

aagataaggt taccactggg ttctagagca cgcattgctg aaaggagcaa gatatacaaa    4980

gacccaagac tttaacccct tatatttcct ctcctacttt ccggttactt gtgattttag    5040

gaggttagca aattcctgtt tatagctcta tgtttcactg tttgctttga tcagaagagc    5100

aatgttaaac aaaactaaaa taaatatttt gacctgattt aataaaagtt cagttttcac    5160

caattatcta ttacacagtt ctaaatctat catgtttatg cattttttat ttgaaccatt    5220

aaaagtttca ccaaatttat tgcatgttca tttttagaat tctgtcaatt ttttatgaga    5280

gtgggcagta accttaaaat gtgtaattat tgcatttata gtgaataatt ttatacttag    5340

tctcttatgc tatgagttta cctcttaacc cttagtcttt ggttttagct ccatttggtt    5400

cattggaatt caaagtataa cagttttgca actgctctga agcaccctga tggagtggct    5460

gtagttggca tttttctgaa ggtaaggtaa aaattgacca tatttttttt aaagtttaat    5520

ttcttatcaa tgcttaggtt tcactctttt tatttaaagg agaaagagga acgaatttca    5580

gtactcattc agctaatcaa gatatttctg ctaagacaag ctcaaaatgt tttgctctcc    5640

cttaaaacca taccttttgc catactctag tactcctggc acttgtaaat tttcccaaga    5700

tgtgggatgt atatatgaat gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgttcca    5760

catgtactgg agacagaacc tttttttttt taaagcttta ttgaagtaga gttgatccac    5820

gaggttgtga taatttctgc tgtacaacaa agtgattcag ttatgcatgt acacacatct    5880

attctctttc agattctttt cctacataga ttatcatgat tattgggtag agttctctgt    5940

gctatatagc aggtctctgt tggccaatca ttccatatac ctgagatgga gcctttgaag    6000

gagcatatta tggtgggggt gagggcaagg acagcattgt tctttaccct ttcttgccac    6060

tccacgtcaa ttgcactgga aaccagaaaa gccaatgttg ggaaccacag tgatgccaag    6120

tccctggctg gatgtcccct gggcttaggg tggccaccac tcacatgatc ccaggctaag    6180

atagcacatg gaatgcgtgt gttgttgagc cagccttggt ttagagagga cttagtgtca    6240

ttaacacacg aatttagtgg taacataatc tagattttaa gccagaggtg aaaatctagc    6300

ttctttcttt tggaatgacc taatttgttt tatgttctga attcattggg ttgttttcag    6360

tgcttgaaca gaagactaca ggaagtgaag tgggtctgag cagaaagaca atgagtatag    6420

ttttagatcc attgagtcca gctctaatcc tatttttaag aaagtggaat gacttttcag    6480

agaaagtcaa ggacatagaa gtaaatcaac ctataatttt gtggttttgt atttcagggg    6540

cctggagtcc tagttcagaa agtatgtact ttaaaatgtt aaggggggaa taaatttatg    6600

tttttgctta gtacaagata ttctggcaga tttataaaca gtagttgtag atggatggat    6660

ggattaaaat cagtttttaa gacataccta aattatggag aagagagaaa tataattgtt    6720

ggttttcttt tccctctttc cttttttctt tctctctctc tctctctctc tctctccttc    6780

cttccttcct tctttctaac agataggacg tgagaaaggc gagttccaac tagtccttga    6840

tgcattggac aaaattaaga caaaggtaaa aaaaaaaaaa tcatttcccc ccagaacata    6900

aagcagggtg tcacttttta cgttttcaag tgtatttctc tcacctaaaa tctgttacta    6960

ggtttggtga atatgctaag tgtacatata aaaacaaatg ccattatatt tgcgtgtata    7020

tttgcctttt agggctgcac ttgtgaccag ctaggagtcc aactgggact atagctgcca    7080

gccacagcaa cgccagatct gagccatgtc tgctaccaac accacagctc accgcaatgg    7140

cggatcccta acccactgag cgaggccagg gatcaaccca caatctcatg gttcctagtc    7200

agatttgatt ccactgtgcc acgacgggaa ctccctaatt acattttcaa tgaagtattt    7260

gagacagaag ttgaggggtt cccctgacca atacacacac acacacacac aggtgcagag    7320

atagtaaatg tttggattct agtgtttccc tttttctcct gggcagcagc tgtatatttt    7380

aaatcttttt aaaaaaatca gaatatgtag gagttccagt cgtagctcag cagtaacaaa    7440

cccgactagt atccatgagg actcgggttc agtccctggc ctcggctgta atgaacctga    7500

ggacatgggt tcaatcccgg cctagctcag agggttaagg atctggtgtt gccatgagct    7560

gtggtgtagg tcgaagacac cgctcggatc ccacatcgct gtggctgtgg tgtaggtcag    7620

tgtctacaac tccgattcga cccctagcct gggaacttcc aaatgccaca ggtgtggccc    7680

taaaaagaaa aaaaaaaaat caaaatacgt ttaatttttt aattttttaa aggtttattg    7740

aagtatagtt gatttacaat gttgtgttaa tttctgctgt gtaacaaggt gattcagtta    7800

tacatataca cttatccatt ctttttcaga atctttcccc gtataggttg tcacagaata    7860

cagagtagaa ttccttttgc tagagcgaag tccgctgttg accatccatt ccatatattt    7920

taaatagtaa cagtaattct tctacttaac agactcattt taaattgtct ttgagactgt    7980

tcttatcaat tgctgtataa ctttatagtc agagaaagtg ttctaagtat gatattgaac    8040

aaaaatgcaa gtttgtcttg tatcatcaag aaccatagca ttaactcata cgaaatactt    8100

atgttacagt ttagatatta gtttatcttt cttattgaga aatgataggt ttatagttct    8160

atctagagtg aataaagaat aaaatattac aatgactgtg ccaaagtcat atcatgctaa    8220

accggcctcc cccctctgcc tattacttct gaaaggcact ttctttgttc acatatcgcc    8280

atcgccttct ctgttgcgtt tgaaatccat tctcccaaaa gggtgagacg ctgggggagc    8340

ggggggagtg cgcatgcgcc ccttcatggc ctgtgcctgt tcccttccca gggcaaggag    8400

gcacccttca cgaacttcaa cccatcctgc ctgttccctg cctgccggga ctactggacc    8460

taccatggct ccttcaccac gccgccctgc gaggagtgca ttgtgtggct cctgctgaag    8520

gagcccatca ccgtgagctc tgaccaggtg agcagtgacc acgggcgggc ctcgtgaata    8580

cccggactta accttcccgg ctnagtctgt aagatacagg cactatatct gtatatatct    8640

gtatatattt caatattctg aaaatgtaaa gctttgctaa atagatattc accgaacagc    8700

tctaccacta gagattttat agttttgccc cagttaatta tgattggcct ggtaactttc    8760

taaaactcga cttccaaagg gtaccaggag aaacatcaag catttgaaga tggtggtgat    8820

gctgaacaat gcctgaaact tgtgctttag aaacattgaa gggttcagat ccatatgagt    8880

tagtctttgc tgatttggag aactctcaaa taccgagcac tggttaggag atgggatagc    8940

aaatacaggc ctgggaagaa ggtgctgatg gaaggaattg aaccttctta ggaggtgtag    9000

actagttccc cagttttata gctcaataag ttgaggctca aaaaggttaa gtaatttgtt    9060

catgatcaca gtcaagggca ggatctgaga tgcctgtctg ttttcaatgc ctgacctctc    9120

tgctcaggcc tttcttctaa atgttcatgt aaattgactc cataaactta tatgatgaag    9180

gctaattgag cttattcttt gccctgatac tgtcttcccc ctacctaaga gatagatttc    9240

ataccaaccc ctcaaattaa aagaattttt tagagttcag gagaaaaaga ttttgaccat    9300

aaggcatggt gatcctgtat aaaatgaaac atgtttttat aaattttaaa aaaaagggca    9360

ttatattatt caggaactag taaccaaata gctctggact gaacattagg gtcaggtttt    9420

gtgttttgct tccttgttta gagagctagc gatttctaac tctttgtcac actcatagtg    9480

tccacttggt atgaatgtct gcatctcccc atgccttttg cagatggcca agctgcgaag    9540

cctctactcc agtgcggaga acgagccccc tgtcccccta gtgaggaact ggcgcccccc    9600

acagcctatc aagggcagga tagtgaaggc ctccttcaaa tgaggctgct ggagcttgcc    9660

ctcttcagga aaggaaacct gctactgcag agcttggttc cttgcctcct tttggtgctc    9720

cttattccaa gtattatttc agttttccac actgagcaat gaaggtgaga gctgcaatca    9780

ccaagaacca aagttactat tgacagatct aatacgaaag catttggcct ttgtaagaat    9840

catctttcct gtaaaagaaa actcttacta agtttcaaag aaaaagaaac agagatagaa    9900

aagatggaga aaaatggctg ttgggcgcca ttttgtgtca tcttaaattt cgcacaactt    9960

cagtttttac tcttttcatg ttactagtta tcgatcttaa agaaataatg agtaattcta    10020

tatgaggagt agaggtatat gaagatcatg tagcaattac acataagcca gaaattaaaa    10080

taattgtgga cgtcaagaat tgcaatgatg ctgtgtgttt taacccttaa ataaaactaa    10140

ctagaggtcc atcatttatt aaaattggag ttctgtaaaa aagggctggt tttaataatg    10200

aaagtaacac atttgaccgg gattaaaaaa aaaaaaaaga cccatttttt gaattttttc    10260

ttcataaaga tagttgactt tatcctattt ctctttacct gaaggagggc catttatttt  10320

tctttttact acttttatct ttgcatgctt attaaaataa aaactgcctc tgctatcttt  10380

ccattttgag ggtgggatta atgattccta gaacacgcag gagtgaatga ctgcacttga  10440

agataaaggc agttgtattg atcatcaaaa ctaataaaga cgtgaatgc              10489

<210>10

<211>260

<212>PRT

<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)

<400>10

Met Ala Lys Glu Trp Gly Tyr Ala Asp His Asn Gly Pro Asp His Trp

1               5                   10                  15

His Glu Leu Tyr Pro Ile Ala Lys Gly Asp Asn Gln Ser Pro Ile Glu

             20                 25                  30

Leu His Thr Lys Asp Ile Lys His Asp Pro Ser Leu Leu Pro Trp Thr

        35                  40                  45

Ala Ser Tyr Asp Pro Gly Ser Ala Lys Thr Ile Leu Asn Asn Gly Lys

    50                  55                  60

Thr Cys Arg Val Val Phe Asp Asp Thr Tyr Asp Arg Ser Met Leu Arg

65                  70                  75                  80

Gly Gly Pro Leu Thr Ala Ala Tyr Arg Leu Arg Gln Phe His Leu His

                85                  90                  95

Trp Gly Ser Ser Asp Asp His Gly Ser Glu His Thr Val Asp Gly Val

            100                 105                 110

Lys Tyr Ala Ala Glu Leu His Leu Val His Trp Asn Ser Lys Tyr Asn

        115                 120                 125

Ser Phe Ala Thr Ala Leu Lys His Pro Asp Gly Val Ala Val Val Gly

    130                 135                 140

Ile Phe Leu Lys Ile Gly Arg Glu Lys Gly Glu Phe Gln Leu Val Leu

145                 150                 155                 160

Asp Ala Leu Asp Lys Ile Lys Thr Lys Gly Lys Glu Ala Pro Phe Thr

                165                 170                 175

Asn Phe Asn Pro Ser Cys Leu Phe Pro Ala Cys Arg Asp Tyr Trp Thr

            180                 185                 190

Tyr His Gly Ser Phe Thr Thr Pro Pro Cys Glu Glu Cys Ile Val Trp

        195                 200                 205

Leu Leu Leu Lys Glu Pro Ile Thr Val Ser Ser Asp Gln Met Ala Lys

    210                 215                 220

Leu Arg Ser Leu Tyr Ser Ser Ala Glu Asn Glu Pro Pro Val Pro Leu

225                 230                 235                 240

Val Arg Asn Trp Arg Pro Pro Gln Pro Ile Lys Gly Arg Ile Val Lys

                245                 250                 255

Ala Ser Phe Lys

            260

Claims (10)

1、一种猪生产性状相关的蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：10；

2)将序列表中SEQ ID №：10的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与猪生产性状相关的蛋白质。

2、根据权利要求1所述的蛋白，其特征在于：所述猪生产性状为猪肌内脂肪含量和/或腿臀比率。

3、权利要求1或2所述的猪生产性状相关蛋白的编码基因。

4、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述猪生产性状相关蛋白的基因组基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：9的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：10蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：9限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

5、根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于：所述猪生产性状相关蛋白的cDNA基因具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的多核苷酸；

2)编码序列表中SEQ ID №：10蛋白质序列的DNA；

3)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

6、含有权利要求3或4或5所述编码基因的载体。

7、含有权利要求3或4或5所述编码基因的细胞系或宿主菌。

8、一种检测猪生产性状的方法，是检测自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸为G还是A，确定猪的基因型，然后通过基因型确定生产性状。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：检测自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸或自序列表中序列3的5′端第200位核苷酸为G还是A的方法包括先PCR扩增含有自序列表中序列9的5′端第8603位核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用HinfI酶切扩增产物。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述猪生产性状为猪肌内脂肪含量和/或腿臀比率。

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