CN1821389A - 一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法 - Google Patents

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Abstract

一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法,涉及转基因,动物克隆,珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上,再使用在DMEM高糖培养基中添加10%小牛血清、2%的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/L β-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素的培养液进行培养。本发明操作简便,可重复性强,为利用鸡原始生殖细胞进行体外操作和鸡胚胎PGCs的进一步建系奠定研究基础。

Description

一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法
技术领域
本发明涉及转基因,动物克隆,珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。
技术背景
鸟类转基因技术对于鸟类生产性能的改良、抗病育种,制造生物反应器方面具有独特的优点和广阔的应用前景。由于鸟类具有独特的生殖生理和解剖学特点,使得转基因鸟类研究明显滞后于哺乳动物,例如哺乳动物的显微注射法在鸟类转基因中行不通。胚胎干细胞具有组建种系和体细胞组织的多潜能性,并以在细胞水平上进行基因修饰,因而可以通过胚胎干细胞生产转基因鸟类。
到现在为止鸟类胚胎干细胞培养方法有两种,一种是利用胚盘细胞培养法,另一种是从原始生殖细胞(即:PGCs)中获取。原始生殖细胞是胚胎生殖谱系最原始形式的细胞,是精子和卵子的祖先细胞。作为胚胎干细胞(ES)分离克隆的重要材料来源之一,原始生殖细胞已成为诸多研究的热点。1870年Waldeyer首先在鸡胚的生殖腺中发现具有多分化潜能的PGCs.1992年Tsai等从胚盘和生殖新月区获得的PGCs进行了体外培养。1994年,Naito等队鸡血液中PGCs的冷冻保存获得成功。之后,饲养层、细胞生长因子对PGCs生长、增殖的影响也进行了大量的研究。
目前,对于禽类PGCs的体外操作主要集中在转基因鸡的研究,同种嵌合体、异种间嵌合体的制备以及通过体外培养PGCs获取干细胞等几个方面。对于鸡胚胎PGCs的长期培养及建系等方面的研究报道很少,仍没有摸索到最适合的传代培养条件。
发明内容
本发明的目的是获得禽类原始生殖细胞长期体外培养的有效方法,为利用鸡原始生殖细胞进行体外操作和鸡胚胎PGCs的进一步建系奠定研究基础。
本发明将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上,再使用培养液进行培养;所述培养液为:在DMEM高糖培养基中添加10%小牛血清、2%的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素。
本发明的优点如下:
1、操作简便,可重复性强,可以满足一般利用PGCs进行体外操作的要求。
2、从胚胎分离用于ES细胞培养的PGCs数目远较来自同一早期胚胎内细胞团得到的细胞数量要多的多,对胚胎来源奇缺的濒危动物具有更为重要的意义。
3、从PGCs建立体外长期存活的EG系为体外研究生殖细胞发育分化提供了无限的细胞源,可在体外摸索生殖细胞发育分化的研究。
4、可以在体外对PGCs进行较长时间的培养,令干细胞大量增殖,进行细胞与组织工程操作。
5、所获得的原始生殖细胞可进行转基因,动物克隆,嵌合体鸡的制备。
附图说明
图1为第19期原代PGCs培养48h后形成的集落×200。
图2为第19期原代PGCs培养96h后形成的集落×200。
图3为第19期第2代PGCs培养72h后形成的集落×200。
图4为PAS染色后的PGCs×1000。
图5为第19期第2代PGCs的碱性磷酸酶染色×200。
图6为四种培养体系中PGCs的增殖生长情况图表。
具体实施例
步骤1:鸡胚胎PGCs的分离
受精蛋孵化到19期,无菌获取鸡胚,在PBS中浸洗3次。在解剖镜下去除头、尾、心凸及肝突,取后肠前1/3的背外侧组织部位(包括生殖嵴部),将取下的生殖嵴及其附带周围组织用PBS浸洗3次,置于75ml三角瓶内,加入37℃预热的0.25%胰蛋白酶+4%EDTA 5~10ml,室温下消化5min,消化时辅以硅化的玻璃吸管轻轻吹打使分散。以消化液用量5%的FCS终止消化。200g离心8min,弃上清,用培养液重新悬浮细胞,进行台盼蓝染色计算活细胞数,调整细胞浓度至104/ml接种到培养瓶中。每个25cm2培养瓶中接种3~5个鸡胚胎生殖嵴来源的PGCs。
步骤2:鸡原始生殖细胞体外培养后的生物学特性检测
分别用形态学鉴定,PAS特异性染色检测,碱性磷酸酶(AKP)染色,鉴定出鸡原始生殖细胞。
形态学鉴定如图1至5所示,图4中,①PGCs②脂肪颗粒③杂质颗粒。
步骤3:同一时期的PGCs在不同培养体系中体外培养
分别制备两种培养液和四种培养体系:
培养液I:DMEM高糖培养基,添加10%小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳和100U/ml硫酸庆大霉素。
培养液II:DMEM高糖培养基,添加10%小牛血清、2%的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF和100U/ml硫酸庆大霉素。
上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’S medium液),即:杜贝克氏改良的恩格氏培养液。
培养体系1:不使用饲养层,使用培养液I
培养体系2:不使用饲养层,使用培养液II
培养体系3:将PGCs接种到CEF饲养层上,使用培养液I
培养体系4:将PGCs接种到CEF饲养层上,使用培养液II
四种培养体系中PGCs的增殖生长情况如图6所示。
如图6所示,在培养体系1中无PGCs的AKP阳性克隆形成;在培养体系2中仅有1代PGCs的AKP阳性克隆形成,克隆形成率为33.33%;在培养体系3中第1代和第2代PGCs有AKP阳性克隆形成,克隆形成率分别为40%和20%;在培养体系4中有1-5代PGCs的AKP阳性克隆形成,克隆形成率分别为80%、66.67%、46.67%、26.67%和13.33%。在各个培养体系中,各代间AKP阳性克隆形成率差异极显著(P<0.01)。说明使用CEF饲养层和富含细胞因子的培养液对PGCs进行体外长期培养,是非常合适的。

Claims (1)

1、一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法,其特征在于将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上,再使用培养液进行培养;所述培养液为:在DMEM高糖培养基中添加10%小牛血清、2%的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/mlIGF、100U/ml硫酸庆大霉素。
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