CN1821389A

CN1821389A - 一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法

Info

Publication number: CN1821389A
Application number: CNA2006100386074A
Authority: CN
Inventors: 李碧春; 秦洁; 孙鹏翔
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2006-03-02
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2006-08-23

Abstract

一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法，涉及转基因，动物克隆，珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上，再使用在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10－5mol/L β－巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15－20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10－15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL－11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素的培养液进行培养。本发明操作简便，可重复性强，为利用鸡原始生殖细胞进行体外操作和鸡胚胎PGCs的进一步建系奠定研究基础。

Description

一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法

技术领域

本发明涉及转基因，动物克隆，珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。

技术背景

鸟类转基因技术对于鸟类生产性能的改良、抗病育种，制造生物反应器方面具有独特的优点和广阔的应用前景。由于鸟类具有独特的生殖生理和解剖学特点，使得转基因鸟类研究明显滞后于哺乳动物，例如哺乳动物的显微注射法在鸟类转基因中行不通。胚胎干细胞具有组建种系和体细胞组织的多潜能性，并以在细胞水平上进行基因修饰，因而可以通过胚胎干细胞生产转基因鸟类。

到现在为止鸟类胚胎干细胞培养方法有两种，一种是利用胚盘细胞培养法，另一种是从原始生殖细胞(即：PGCs)中获取。原始生殖细胞是胚胎生殖谱系最原始形式的细胞，是精子和卵子的祖先细胞。作为胚胎干细胞(ES)分离克隆的重要材料来源之一，原始生殖细胞已成为诸多研究的热点。1870年Waldeyer首先在鸡胚的生殖腺中发现具有多分化潜能的PGCs.1992年Tsai等从胚盘和生殖新月区获得的PGCs进行了体外培养。1994年，Naito等队鸡血液中PGCs的冷冻保存获得成功。之后，饲养层、细胞生长因子对PGCs生长、增殖的影响也进行了大量的研究。

目前，对于禽类PGCs的体外操作主要集中在转基因鸡的研究，同种嵌合体、异种间嵌合体的制备以及通过体外培养PGCs获取干细胞等几个方面。对于鸡胚胎PGCs的长期培养及建系等方面的研究报道很少，仍没有摸索到最适合的传代培养条件。

发明内容

本发明的目的是获得禽类原始生殖细胞长期体外培养的有效方法，为利用鸡原始生殖细胞进行体外操作和鸡胚胎PGCs的进一步建系奠定研究基础。

本发明将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上，再使用培养液进行培养；所述培养液为：在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素。

本发明的优点如下：

1、操作简便，可重复性强，可以满足一般利用PGCs进行体外操作的要求。

2、从胚胎分离用于ES细胞培养的PGCs数目远较来自同一早期胚胎内细胞团得到的细胞数量要多的多，对胚胎来源奇缺的濒危动物具有更为重要的意义。

3、从PGCs建立体外长期存活的EG系为体外研究生殖细胞发育分化提供了无限的细胞源，可在体外摸索生殖细胞发育分化的研究。

4、可以在体外对PGCs进行较长时间的培养，令干细胞大量增殖，进行细胞与组织工程操作。

5、所获得的原始生殖细胞可进行转基因，动物克隆，嵌合体鸡的制备。

附图说明

图1为第19期原代PGCs培养48h后形成的集落×200。

图2为第19期原代PGCs培养96h后形成的集落×200。

图3为第19期第2代PGCs培养72h后形成的集落×200。

图4为PAS染色后的PGCs×1000。

图5为第19期第2代PGCs的碱性磷酸酶染色×200。

图6为四种培养体系中PGCs的增殖生长情况图表。

具体实施例

步骤1：鸡胚胎PGCs的分离

受精蛋孵化到19期，无菌获取鸡胚，在PBS中浸洗3次。在解剖镜下去除头、尾、心凸及肝突，取后肠前1/3的背外侧组织部位(包括生殖嵴部)，将取下的生殖嵴及其附带周围组织用PBS浸洗3次，置于75ml三角瓶内，加入37℃预热的0.25％胰蛋白酶+4％EDTA 5～10ml，室温下消化5min，消化时辅以硅化的玻璃吸管轻轻吹打使分散。以消化液用量5％的FCS终止消化。200g离心8min，弃上清，用培养液重新悬浮细胞，进行台盼蓝染色计算活细胞数，调整细胞浓度至10⁴/ml接种到培养瓶中。每个25cm²培养瓶中接种3～5个鸡胚胎生殖嵴来源的PGCs。

步骤2：鸡原始生殖细胞体外培养后的生物学特性检测

分别用形态学鉴定，PAS特异性染色检测，碱性磷酸酶(AKP)染色，鉴定出鸡原始生殖细胞。

形态学鉴定如图1至5所示，图4中，①PGCs②脂肪颗粒③杂质颗粒。

步骤3：同一时期的PGCs在不同培养体系中体外培养

分别制备两种培养液和四种培养体系：

培养液I：DMEM高糖培养基，添加10％小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳和100U/ml硫酸庆大霉素。

培养液II：DMEM高糖培养基，添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10^-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF和100U/ml硫酸庆大霉素。

上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’S medium液)，即：杜贝克氏改良的恩格氏培养液。

培养体系1：不使用饲养层，使用培养液I

培养体系2：不使用饲养层，使用培养液II

培养体系3：将PGCs接种到CEF饲养层上，使用培养液I

培养体系4：将PGCs接种到CEF饲养层上，使用培养液II

四种培养体系中PGCs的增殖生长情况如图6所示。

如图6所示，在培养体系1中无PGCs的AKP阳性克隆形成；在培养体系2中仅有1代PGCs的AKP阳性克隆形成，克隆形成率为33.33％；在培养体系3中第1代和第2代PGCs有AKP阳性克隆形成，克隆形成率分别为40％和20％；在培养体系4中有1-5代PGCs的AKP阳性克隆形成，克隆形成率分别为80％、66.67％、46.67％、26.67％和13.33％。在各个培养体系中，各代间AKP阳性克隆形成率差异极显著(P＜0.01)。说明使用CEF饲养层和富含细胞因子的培养液对PGCs进行体外长期培养，是非常合适的。

Claims

1、一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法，其特征在于将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上，再使用培养液进行培养；所述培养液为：在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10^-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/mlIGF、100U/ml硫酸庆大霉素。