CN1811386B - 校准光学扫描器的装置及其制备方法以及利用该装置校准光学扫描器的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种光学扫描器的校准装置，包括其上固定有能够形成激元的分子的基底。本发明还提供一种制备该校准装置的方法和利用该校准装置校准光学扫描器的方法。

Description

校准光学扫描器的装置及其制备方法以及利用该装置校准光学扫描器的方法

技术领域

本发明涉及一种光学扫描器的校准装置，其制备方法，及利用它校准光学扫描器的方法。

背景技术

各种类型的光学扫描器，特别是用于扫描阵列的光学扫描器，是现有技术中公知的。术语“阵列”是指以可物理寻址的方式在空间上界定和排列的探针或结合剂的集合。换言之，术语“阵列”是指其上载有很多探针的基底，其中所述探针在空间上以多种图形固定地排列。所述探针可以是蛋白质、核酸或多糖。

通常，阵列光学扫描器包括将光照射到阵列表面的光源和检测从阵列表面发出的可检测光(例如，荧光)的光检测器。生物聚合的阵列光学扫描器的代表性实例公开于US 5585639和6258593中。并且，型号为G2565AA(Agilent Technology有限公司)的微阵列扫描器在商业上可以得到。

如上所述，适于本文中的光学扫描器通常包括产生至少一束具有特定波长的相干光束的至少一个光源，扫描基底如阵列的表面上的该光束的扫描单元，及检测从基底表面上的样品区域发出的光(例如，荧光)的光检测器。

通常，光学扫描器的光学元件在制造过程中被校准。校准光源的方法和仪器是公知的(例如，US 5464960和5772656)。然而，在制造光学扫描器后校准光学元件如光检测器的方法不是公知的。因而，因为目前不能得到用于包括光检测器的各种光学元件的容易、准确和便宜的校准装置，所以这些元件的定期的校准并没有进行。

US 6794424公开了一种新的校准装置，及其校准方法，该校准装置可以用作校准光学扫描器的标准装置。校准装置包括其上形成有包括荧光剂的聚合物层的基底。然而，因为照明光必须穿过基底和聚合物层到达荧光剂，所以基底和聚合物层应该由透明材料制成。而且，聚合物层必须均匀地涂布在透明基底上，但是对于形成非常薄且均匀的薄膜来说，涂布法如旋涂是不合适的。也难于将荧光剂均匀地分散在聚合物层中。另外，聚合物层必须具有粘结基底的性质并平坦和均匀地粘附到基底上。当聚合物层和基底之间存在缺陷时，可能得到不均匀的扫描信号。

通过将称为CyDye(Full Moon Biotechnology有限公司)的荧光材料溶解在溶剂中，及把混合的溶液放置在微阵列上制得的CyDye标准阵列，也已知作为光学扫描器校准的标准。然而，CyDye标准阵列必须储存在黑暗的地方，因为它容易化学分解，并且储存周期仅为约一个月。

考虑到上述常规技术中的问题，仍然需要可以容易制得，具有长寿命，及提供稳定的荧光信号的标准光学扫描器的校准装置。

发明内容

本发明提供一种光学扫描器校准装置，其可以容易制得，具有长寿命，并且提供稳定的荧光信号。

本发明还提供一种容易制备该光学扫描器校准装置的方法。

本发明还提供一种利用所述光学扫描器校准装置校准光学扫描器的方法。

附图说明

通过参考附图详述其示例性实施方案，本发明的上述和其它特点和优点将变得更加显而易见，附图中：

图1为从用照明光以预定的时间间隔照射的基底发出的荧光强度的测量图；

图2为在实施例1中制得的基底的连续荧光测量图；

图3为在激发光被照射到在实施例1中制得的基底上20次后的荧光发射特性的恢复图；

图4为利用Axon 1和Axon 2(Genepix 4000B型，Axon)在200～700的PMT范围内扫描作为校准标准的实施例1中制得的基底后的荧光数据图；及

图5A和图5B分别为在Axon1和Axon2的562和567的PMT范围内扫描在实施例1中制得的基底后的荧光测量图。

具体实施方式

本发明提供一种用于光学扫描器的校准装置，该装置包括其上固定有能够形成激元(excimer)的分子的基底。

在本发明的校准装置中，术语“激元"是指其中两个或多个原子或分子在激发态结合，并且所结合的原子或分子从基态彼此释放或基本释放出来的物质。能够形成激元的分子(在下文中，仅称为“形成激元的分子”)可以是选自芘，2-苯基吲哚，及其衍生物的荧光剂，但是本发明不限于此。基底为透明或不透明基底，并且可以是本领域公知的固体材料。基底可以选自硅晶片，玻璃，及塑料。基底的尺寸、表面形状和材料可以根据要与基底一起使用的光学扫描器变化。基底可以是柔软的或硬的。柔软的基底的实例包括膜和柔软的塑料薄膜。软的和硬的基底都必须提供物理支撑和结构，以在其上制备生物聚合的阵列。基底可以具有各种构型。由形成在基底上的形成激元的分子构成的层的厚度不具体限制，但是可以为1～100

与公开于US 6794424中的校准装置不同，本发明的校准装置可以具有简单的结构和均匀的分子层厚度，因为没有使用聚合物层，并且荧光物质即形成激元的分子直接固定在基底上或经过连接件固定在基底上。形成激元的分子在基底上的固定，可以通过用于将化合物固定在基底的公知方法实施。例如，可以通过将官能团如氨基涂布在基底上并使该官能团与形成活化激元的分子反应，完成形成激元的分子的固定。更具体地，氨基硅烷如3-氨丙基三乙氧基硅烷的氨基以自组装的方法结合到固体载体的表面。然后，允许作为形成激元的分子的包含良好离去基团的芘分子如琥珀酰亚胺酯，与结合氨基的固体载体发生反应，从而将形成激元的分子固定在基底上。形成激元的分子必须被固定，以便在基底上局部和整体荧光变化最小，即局部和整体不均匀性最小。通常，必须使局部和整体不均匀性最小到足以使具体的光学扫描器的校准适于本发明的校准装置的程度。

在本发明的校准装置中，基底可以包括校准区以外的区域，即在其上没有固定形成激元的分子的背景区。本发明的校准装置通常可以包括很多安置在装置表面的背景区。

本发明的校准装置用于校准光学扫描器，具体地用于校准生物聚合的阵列光学扫描器(在下文中，简单称为“光学扫描器”)，更具体地用于校准生物聚合的阵列光检测器，透镜，平台(stage)，及发射镜。现在将简要描述要由本发明的校准装置校准的光学扫描器。

光学扫描器

各种类型的光学扫描器，具体地，用于扫描阵列的光学扫描器，在本领域是公知的。术语“阵列”是指以可物理寻址的方式在空间上界定和排列的探针或结合剂的集合。换言之，术语“阵列”是指其上载有很多在空间上以多种图形固定排列的探针的基底。所述探针可以是蛋白质、核酸或多糖。

通常，阵列光学扫描器包括将光照射到阵列表面的光源和检测从阵列表面发出的可检测光(例如，荧光)的光检测器。生物聚合的阵列光学扫描器的代表性实例公开于US 5585639和6258593中，型号为G2565AA(AgilentTechnology有限公司)的微阵列扫描器在商业上可以得到。然而，本发明不限于此。

如上所述，适于本文中的光学扫描器通常包括产生至少一束具有特定波长的相干光束的至少一个光源，扫描在基底如阵列的表面上的该光束的扫描单元，及检测从基底表面上的样品区发出的光(例如，荧光)的光检测器。

光源通常为能够用可以被光学扫描器的光电倍增管(PMT)检测到的电磁光谱的部分光照射基底表面，例如阵列的表面的光源。有时，使用两个或多个光源或者两个或多个波长照射基底的表面。例如，可以使用双波长激光器扫描器。光源可以是发光二极管、激光二极管或滤光灯(filtered lamp)。染料激光器，钛蓝宝石激光器，Nd：YAG激光器，氩激光器，或者任何其它激光器可以用于激光器光源。光源还可以包括将照明光集中在阵列的所需尺寸的照明区域上的扫描透镜系统。

扫描单元通常与光源相连以扫描(scan or raster)基底表面上的一个或多个方向的光束。适宜的扫描单元包括由马达如电流-扫描器马达控制的反射镜，例如扫描器反射镜。扫描单元可以以预定长度移动表面上的光束。

光学扫描器还包括能够检测从基底发出的可见光，例如荧光的光检测器。该光检测器可以是光电二极管、PMT、光电检测器或光电晶体管，但是本发明不限于此。设计使响应光源从基底的表面发出的光在能够与光检测器排列成行的成像平面里成像的成像透镜系统，可以与光检测器相连。该成像透镜系统可以包括用于选择性地阻挡从基底表面反射的光束的滤光器。

可操作地连接至少到扫描器马达的微处理器，控制反射镜和光检测器的移动和位置，以接收与被光检测器检测到的发光水平相关的数字或模拟信号。

在一般的扫描过程中，当使至少一束照明光束掠过阵列基底时，在其中结合荧光-标记的分析物的各扫描的线性阵列的每个区域中激发出荧光。所发出的光在检测器上成像，而且所发出的光的强度也进行测量。所测量的与阵列的各区相关的强度和相关区域一起记录并存储下来。在完全扫描阵列后，一般由扫描器自动产生显示阵列的各区相关的光强度的输出图。该输出可以包括其中观察到荧光信号的分子种类的强度或分析物的序列信息。

本发明还提供一种制备光学扫描器校准装置的方法，该方法包括使涂有官能团的基底与能够形成活化激元的分子发生反应，以将分子固定在基底上。

在本发明的制备方法中，官能团的实例可以包括，但不限于，氨基、羟基和硫醇基。氨基可以得自选自腐胺，亚精胺，及精胺的化合物。涂有官能团的基底可以通过本领域公知的方法制得。例如，包含该官能团的分子可以旋涂或浸涂在基底上，或者作为自组装单层形成在基底上。

在本发明的制备方法中，能够形成活化激元的分子没有具体限制，只要它是结合良好离去基团的形成激元的分子即可。例如，可以使用通过醚键连接到N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的芘、2-苯基吲哚或其衍生物。然而，本发明不限于此。例如，能够形成活化激元的分子可以是下式1所示的化合物：

(1)

反应条件可以根据所选择的基底上的官能团和形成活化激元的分子变化。应该理解本领域的普通技术人员能够确定最佳的反应条件。

本发明还提供一种校准光学扫描器的方法，该方法包括：(a)用从至少一个光源发出的光照射本发明的光学扫描器校准装置的表面；(b)从校准装置的表面获得荧光数据；及(c)基于该荧光数据校准光学扫描器。

通常，如上所述，校准装置的表面用从至少一个光源发出的光照射，并且从该照射的表面上获得荧光数据。有时，将本发明的校准装置布置在支撑台等上，以便其上固定有形成激元的分子的基底侧面向光源。然而，当基底由透明材料如玻璃制成时，其上固定有形成激元的分子的基底侧不必面向光源，并且其上固定有形成激元的分子的基底侧也可以面向光源的相反方向，该相反方向与常规光校准装置相反。基于该荧光数据，确认(即，不进行调整)，或者调整或校准光学扫描器。在文本中，“调整或校准”是指下面的至少一项被调整：(1)标度因数(即，光检测器的灵敏度)，(2)焦点位置(即，扫描器的平台和至少一个透镜之间的距离)，及(3)动态聚焦(即，平台的移动速度)，其中这些都将在下面详细描述。

1.标度因数校准

可以使用得自本发明的校准装置的荧光数据来检验光学扫描器的标度因数，即，光学扫描器的检测器的灵敏度，并且如果必需的话，来校准或调整检测器的灵敏度。

如上所述在使本发明的校准装置扫描后，基于荧光信号的强度，计算经验校准值，其定义为在每μm²荧光团上的象素中的光子数。因而，将相应于从每个像素发出的光强度的电流转换为数字读数，其用于确定每个光检测器的校准值。然后将经验得到的校准值和相应的数字信号与标准校准值/信号函数相比较。即，将经验得到的校准值/信号与依赖于所使用的具体荧光物质、所采用的光检测器类型、象素的面积等的函数的标准值相比较。根据比较，调整光学扫描器。得自单个校准装置的标准值可以用于校准很多类似的光学扫描器。

更具体地，检测器如PMT用于检测从单个荧光团发出的光强度，通常为电压测量的形式的光强度。该强度通过软件程序传送给微处理器，即，可操作地连接到包括检测器的光学扫描器上的微处理器，并进行全部必需的操作以确定检测器特性是否在指定的范围内或者需要调整。微处理器还可以实施调整检测器必需的操作。

在检测器的灵敏度是由电压给出的情况下，通过改变检测器的电压，校准或调整检测器。即，得到经验校准值，即来自在已知电压下运行的PMT的信号，然后将其与标准值进行比较。如果与经验校准值有关的电压不同于标准电压，那么改变检测器的灵敏度或电压从而改变检测器的响应。

2.焦点位置校准

本发明提供一种校准或调整光学扫描器的至少一个扫描平台(即，扫描平台和光学透镜之间距离)的方法。根据该方法，可以调整激光器相对于被扫描物体的表面的焦点位置，以使所检测的光强度最佳。

首先，如上所述，本发明的校准装置利用至少一个光源在各个深度扫描。即，光束扫描本发明的校准装置的表面，其上许多不同的焦点位置用于扫描表面。在本发明的校准装置的表面的具体区域在各个深度进行扫描后，选择提供最佳信号的焦点位置，并调整或校准光学或聚焦透镜和扫描平台之间的距离以提供最佳的聚焦深度。然后将焦距存储在可操作地连接到光学扫描器上的微处理器中，以便光学扫描器之后在该焦距进行扫描。即，基于上述扫描确定最佳的聚焦深度，并且通过调整扫描平台的位置以与最佳的构型相应来调整平台和透镜之间的距离，从而为随后的扫描提供最佳的扫描深度。

3.动态聚焦校准

本发明还提供一种调整光学扫描器的光学平台移动速度的方法，在扫描过程中该光学扫描器上放置被扫描物体如生物聚合的阵列。平台将被扫描物体排列在某一位置，以与扫描光束相应。即，在使用中，移动平台来排列光学扫描器与在基底上被扫描物体的区域如某一线性阵列区域相应。光学扫描器的焦点可以根据与光学平台相关的参数如平台的移动速度改变。例如，如果平台移动太快或超出了定位，扫描将离开焦点。

首先，如上所述，本发明的校准装置表面的一系列水平扫描线或平面由至少一个光源扫描。然后，测量了这些扫描的水平面的所检测到的强度的波动。如果波动在特定值范围内，那么增加或降低平台的移动速度以使光学扫描器的焦点最佳。平台所增加的或降低的移动速度存储在可操作连接到光学扫描器的微处理器中，以便用于随后的扫描。

因而，在本发明的校准方法中，照射操作可以包括用能够被光学扫描器的PMT检测到的电磁光谱的部分光照射校准装置的表面。照明光可以是选自紫外、可见和红外的波长范围内的光。

在本发明的校准方法中，获得荧光数据的操作可以包括检测与从形成激元的分子发出的光强度相关的信号。

在本发明的校准方法中，校准操作可以包括校准光学扫描器的标度因数。具体地，标度因数校准可以包括调整光学扫描器的光检测器的灵敏度。校准操作还可以包括校准光学扫描器的焦点位置。例如，焦点位置校准可以包括调整光学扫描器的扫描平台和透镜之间的距离。校准操作还可以包括校准光学扫描器的动态焦点。例如，动态焦点校准可以包括调整光学扫描器的光学平台的移动速度。校准操作还可以包括确定强度图像中的波动量并根据该波动数据调整光学平台的移动速度。

本发明的校准方法还可以包括从所得到的荧光数据中减去背景信号，得到背景校正值。

在下文中，将参考下面的实施例更具体地描述本发明。下面的实施例是为了说明性目的，并不意味着限制本发明的范围。

实施例

实施例1：芘-固定的基底的制备

在该实施例中，允许由式1所示的化合物(1-芘丁酸γ-羟基琥珀酰亚胺酯)与氨基-活化的基底发生反应，将芘分子固定在基底上，从而得到芘-固定的基底。

(1)

用具有厚度为1000的SiO₂层的硅基底作氨基．活化的基底。硅基底用作为偶合剂的γ-氨丙基三乙氧基硅烷(GAPS)处理，将氨基连接到硅基底上，随后进行嵌入剂结合。

(1)用偶合剂(GAPS)处理硅基底

在表面处理之前，用纯丙酮和水小心地清洗硅基底，然后利用由过氧化氢和硫酸(1∶3)构成的piranha溶液从硅基底上除去有机污染物。最后，用大量的水和丙酮洗涤硅基底并干燥。在文本中，清洗过程在用于半导体制备过程的湿站中进行，硫酸浴用于piranha溶液，并且用水洗涤过程通过QDR法进行。将硅基底固定在由Teflon制成的硅晶片载体上，然后清洗。在清洗后，利用旋转式脱水机干燥硅基底。

在清洗后立即将GAPS在乙醇(20％，v/v)中的溶液旋涂在硅基底上。旋涂利用旋涂机(型号为CEE 70，CEE)进行。旋涂分为速度为500rpm/10秒的初始涂布和速度为2000rpm/10秒的主要涂布。在完成旋涂后，将硅基底固定在Teflon晶片载体上并在120℃下凝固40分钟。将所凝固的基底浸渍在水中10分钟，超声波洗涤15分钟，再次浸渍在水中10分钟，并干燥。干燥利用旋转式脱水机进行。把所干燥的基底剪切成正方形或长方形的小片用于实验。所有实验都是在其中充分除去大部分尘粒的1000级的净化室中进行。

(2)芘分子的固定

在(1)中得到的硅烷化过的基底上浸涂由式1所示的化合物(1-芘丁酸γ-羟基琥珀酰亚胺酯)。首先，将1-芘丁酸γ-羟基琥珀酰亚胺酯溶解在二氯甲烷溶液中，制得浸渍溶液(0.5g 1-芘丁酸γ-羟基琥珀酰亚胺酯/200ml+0.1ml三乙胺)。将该浸渍溶液和硅烷化过的基底放入反应器中，并在室温下熟化(incubate)5小时。反应终止后，从浸渍溶液中除去基底，然后用二氯甲烷(3次，各10分钟)和乙醇(3次，各10分钟)清洗。干燥所清洗的基底，并利用GenePix 4000B荧光学扫描器(Axon)测量1-芘丁酸γ-羟基琥珀酰亚胺酯的量。扫描532nm的光，并在570nm下测量荧光强度。

实施例2：芘-固定的基底的荧光发射特性

评价在实施例1中制得的芘-固定的基底的特性。

(1)耐久性试验

测量从基底发出荧光随时间变化的程度。

首先，将在实施例1中制得的基底放置在环境条件中。用照明光以预定的时间间隔照射基底，并测量从基底发出的荧光强度。

图1为从用照明光以预定的时间间隔照射的基底发出的荧光强度的测量图。如图1所示，在约30天内，荧光强度在3～5％的离散值内非常稳定地变化。

接着，评价在实施例1中制得的基底在苛刻条件下的荧光发射特性。为此，在实施例1中制得的基底上连续地照射激发光100次，并测量从基底发出的荧光强度。在完成第100次荧光测量后，基底静置1天，然后进行第101次荧光测量。

图2为在实施例1中制得的基底的连续荧光测量图。如图2所示，当连续照射激发光时，发出的荧光强度降低。然而，在连续照射后约1天，发出的荧光强度恢复到初始水平。

从图2的结果中，可以看出在把激发光照射到在实施例1中制得的基底上后预定时间，恢复了荧光发射特性。为了确定激发光照射后荧光发射特性的恢复时间，测量了激发光照射后荧光强度随时间的变化。

图3为把激发光照射在实施例1中制得的基底上20次后的荧光发射特性的恢复图。参考图3，在激发光照射20次后约5分钟，荧光发射特性得到恢复。

实施例3：利用在实施例1中制得的基底的灵敏度校准

使用在实施例1中制得的基底作为校准标准，并利用Axon 1和Axon 2(Genepix 4000B型，Axon)在200～700的PMT范围内进行扫描，得到荧光数据。然后，计算相对于PMT值的实验的荧光强度。扫描波长为532nm。进行扫描的同时将PMT值由200增加至700。随着PMT值增加，荧光的强度迅速增加。各扫描面积均调整至2～5mm²。

图4为利用Axon 1和Axon 2(Genepix 4000B型，Axon)在200～700的PMT范围内扫描作为校准标准的实施例1中制得的基底后的荧光数据图。假如PMT值为x，测量的荧光强度为y，Axon 1和Axon 2的函数值分别由y＝1.9013e^0.014x和y＝1.7768e^0.014x表示。

接着，利用由此得到的实验函数值确定扫描器校准是否可能。当关于基底的荧光强度为5000时，Axon1和Axon2的PMT值分别计算为562和567。分别在Axon1和Axon2的562和567的PMT值扫描在实施例1中制得的基底后，测量荧光强度。

图5为分别在Axon1和Axon2的562和567的PMT值扫描在实施例1中制得的基底后的荧光测量图。如图5所示，Axon 1和Axon2的荧光强度分别为5861(A)和5801(B)。两个扫描器之间的偏差在1％之内。这表明在实施例1中制得的基底适用于灵敏度校准。

本发明的校准装置具有良好的耐久性，并且可以重复扫描荧光。

根据本发明的制备校准装置方法，可以容易制得校准装置。

根据本发明的校准光学扫描器的方法，可以由具有长寿命的相同校准装置重复校准光学扫描器。

Claims (16)

1.一种用于校准光学扫描器的校准装置，包括涂有氨基的基底，能够形成激元的分子通过与所述氨基的反应不使用聚合物而固定在所述基底上，其中所述能够形成激元的分子为由下式(1)表示的化合物：

和所述氨基为γ-氨丙基三乙氧基硅烷。

2.根据权利要求1的校准装置，其中所述基底为硅晶片、玻璃或塑料。

3.根据权利要求1的校准装置，其中所述分子形成厚度为1～100 

的层。

4.一种制备用于光学扫描器的校准装置的方法，该方法包括：

使涂有官能团的基底与能够形成活化激元的分子反应，以将该分子固定在基底上，

其中所述官能团为氨基，所述能够形成活化激元的分子为下面式(1)所示的化合物：

和所述氨基为γ-氨丙基三乙氧基硅烷。

5.一种校准光学扫描器的方法，该方法包括：

(a)用从至少一个光源发出的光，照射权利要求1至3中任一项的校准装置的表面；

(b)从校准装置的表面获得荧光数据；及

(c)基于该荧光数据，校准所述光学扫描器。

6.根据权利要求5的方法，其中所述照射包括用可被光学扫描器的光 电倍增管检测到的电磁光谱部分的光照射校准装置的表面。

7.根据权利要求5的方法，其中所述照射包括用选自紫外、可见和红外波长范围的光照射校准装置的表面。

8.根据权利要求5的方法，其中所述获得荧光数据包括检测与在用从至少一个光源发出的光照射所述校准装置的表面后从所述能够形成激元的分子发出的光的强度相关的信号。

9.根据权利要求5的方法，其中所述校准包括校准光学扫描器的标度因数。

10.根据权利要求9的方法，其中所述校准光学扫描器的标度因数包括调整光学扫描器的光检测器的灵敏度。

11.根据权利要求5的方法，其中所述校准包括校准光学扫描器的焦点位置。

12.根据权利要求11的方法，其中所述校准光学扫描器的焦点位置包括调整光学扫描器的扫描平台和透镜之间的距离。

13.根据权利要求5的方法，其中所述校准包括校准光学扫描器的动态聚焦。

14.根据权利要求13的方法，其中所述校准光学扫描器的动态聚焦包括调整光学扫描器的光学平台的移动速度。

15.根据权利要求5的方法，其中所述校准包括确定由在用从至少一个光源发出的光照射所述校准装置的表面后从所述能够形成激元的分子发出的光得到的强度图像中的波动量，及根据该波动量数据调整光学平台的速度。

16.根据权利要求5的方法，还包括从所得到的荧光数据中减去背景信号，得到背景校正值。 

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