CN1809750A - 作为脂肪调控和胰岛素作用靶标的乙酰辅酶a羧化酶2 - Google Patents

作为脂肪调控和胰岛素作用靶标的乙酰辅酶a羧化酶2 Download PDF

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Abstract

本发明通过乙酰辅酶A羧化酶在调控脂肪酸氧化和合成、葡萄糖代谢和能量稳态中的产物丙二酰辅酶A强调了乙酰辅酶A羧化酶的作用。本发明披露转基因小鼠用乙酰辅酶A羧化酶的乙酰辅酶A羧化酶2同工型的内源基因失活突变。乙酰辅酶A羧化酶2的失活导致小鼠显示的表型在骨骼肌和心脏中丙二酰辅酶A水平减少，无限制的脂肪氧化和在肝脏及脂肪储存细胞中脂肪积累降低。结果，小鼠消耗多的食物但比喂养同样食物的野生型小鼠积累的脂肪少且仍瘦。这些结果证明抑制ACC2乙酰辅酶A羧化酶可用于调节脂肪氧化和积累以控制重量。本发明提供了有用的动物模型通过肌肉、心脏、肝脏和其它组织调节脂肪酸氧化中由ACC2调控丙二酰辅酶a产生。他们鉴定了研究脂肪代谢和重量控制机制的潜在抑制剂。

Description

作为脂肪调控和胰岛素作用靶标的乙酰辅酶A羧化酶2
发明背景
联邦基金
本发明部分使用联邦政府N.I.H.G.M.19091的资金。因此，联邦政府对本发明拥有一定权利。
发明的领域
本发明一般涉及脂肪代谢和重量控制。更具体地说，本发明涉及乙酰辅酶A羧化酶ACC2同工型在调控脂肪酸积累和氧化中的作用。
相关技术的说明
乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，一种含生物素酶，催化乙酰辅酶A羧化形成在调控脂肪酸代谢中起关键作用的中间代谢物丙二酰辅酶A。已发现丙二酰辅酶A是肉碱棕榈酰转移酶I(CPTI，参与线粒体氧化长链脂肪酸的脂肪酸穿梭系统的组成部分的锅调节物。此发现提供了2种相反途径-脂肪酸合成和脂肪酸氧化间的重要联系。因此，可能通过共有中间物丙酮酸脱氢酶产物乙酰辅酶A使脂肪酸代谢和碳水化合物代谢相互关连。结果，在脂肪生成(肝脏和脂肪)和非脂肪生成(心脏和肌肉)组织的能量代谢中丙二酰辅酶A的作用成为许多研究的焦点。
在原核生物中，乙酰辅酶A羧化酶包括3种不同蛋白质-生物素羧基载体蛋白、生物素羧化酶和转羧基酶。然而，在真核生物中，这些活性包含在一个由单基因编码的单一多功能蛋白质中。
在动物包括人类中，有2种在大部分细胞表达的乙酰辅酶A羧化酶的同工型，ACC1(Mr～265,000)和ACC2(Mr～280,000)由2个分离基因编码并显示不同组织分布。ACC1ACC2都产生丙二酰辅酶A，丙二酰辅酶A是脂肪酸合成的“C2单位”供体和参与线粒体氧化长链脂肪酸的肉碱棕榈酰辅酶A穿梭系统的调节物。因此，乙酰辅酶A羧化酶连接脂肪酸合成和脂肪酸氧化，并使它们与葡萄糖利用和能量生成相关，因为羧化酶底物乙酰辅酶A是丙酮酸脱氢酶产物。这个发现与ACC1在脂肪生成组织如肝脏和脂肪中高度表达且ACC2主要在心脏和骨骼肌中表达的发现一起，在脂肪生成和脂肪酸氧化组织中能量代谢的比较研究中开辟了新的前景。
饮食，特别是无脂肪饮食，诱导合成ACC’s并增加它们的活性。饥饿或糖尿病抑制ACC基因表达并减少酶的活性。早期的研究涉及特异区别ACC1和ACC2间的羧化酶的总活性。动物羧化酶的研究显示这些酶在转录和翻译水平受长期控制及磷酸化/去磷酸化靶Ser残基和柠檬酸或棕榈酰辅酶A诱导的别构修饰的短期调控。
发现一些激酶磷酸化两种羧化酶并降低它们的活性。为响应饮食葡萄糖，胰岛素通过去磷酸化活化羧化酶。饥饿和/或应激导致通过磷酸化使羧化酶失活的糖原和肾上腺素水平上升。用经过锻炼的大鼠进行的实验显示，在骨骼肌中它们的丙二酰辅酶A和ACC活性下降作为有利于脂肪酸氧化的锻炼强度的功能。这些变化与AMP-激酶活性上升有关。AMP-活化蛋白激酶(AMPK)由与低水平ATP同时的高水平AMP活化。这是通过锻炼和消耗ATP的细胞应激物活化的级联反应中包括别构调节和蛋白激酶(AMP激酶)磷酸化的机制。通过这些机制，当代谢燃料少且需要ATP时，ACC活性都由磷酸化关闭，导致低丙二酰辅酶A水平，低水平通过提高脂肪酸氧化和用于脂肪酸合成的ATP消耗减少使ATP合成增加。
最近，有报道人ACC1和ACC2的cDNA-衍生的氨基酸序列共有80％同一性，且它们之间最显著不同是ACC2的N-末端序列。ACC2的N-末端前218个氨基酸代表包括部分此同工型中发现的其它137个氨基酸残基中114个的独特肽。多克隆抗体增强抗与来自人、大鼠和小鼠组织的ACC2蛋白特异反应的独特ACC2N-末端肽。这些发现可能建立ACC1和ACC2的亚细胞定位，并在后来证明ACC2与线粒体相关且ACC2蛋白疏水的N-末端在将ACC2靶向线粒体中起重要作用。另一方面，ACC1定位到细胞溶质。
尽管这些发现和ACC1及ACC2的不同组织分布表明ACC2参与调节脂肪酸氧化，且ACC1主要在脂肪生成组织中参与脂肪酸合成，它们没有提供基因ACC1和ACC2的产物有不同作用的直接证据。
2种ACC同工型间的这些不同不能在这里描述的Acc2敲除小鼠产生前预测。此外，ACC1和ACC2的产物丙二酰辅酶A，似乎存在肝脏中并可能在不混合的2个独立库中的其他组织中且在组织的生理和代谢中起不同的作用。ACC1产物丙二酰辅酶A，作为“C2-碳”的供体参与脂肪酸合成。另一方面，ACC2产物丙二酰辅酶A参与调节肉碱棕榈酰辅酶A穿梭系统，从而参与脂肪酸氧化。基于用Acc2小鼠获得的结果，ACC1和ACC2产物的作用间功能不同不预期也不能在此研究前预测。
此外，当前研究证明ACC2通过其产物丙二酰辅酶A，是调控肥胖的一个潜在重要的靶。抑制ACC2会减少丙二酰辅酶a产生，导致连续脂肪酸氧化和能量生成。此连续氧化脂肪酸可能获得消耗新合成脂肪酸和甘油三酯，消耗脂肪中的身体脂肪和导致身体脂肪减少的其它脂肪组织。
以前的技术缺乏对ACC1和ACC2在脂肪酸代谢途径中独立作用的了解。以前的技术也在分配ACC1产生的丙二酰辅酶A与ACC2产生的在调节脂肪酸代谢中差异作用上不足。同样，以前的技术缺少产生缺乏ACC2的转基因敲除小鼠和使用这些转基因小鼠的方法。本发明实现了此技术中长期存在的需要和愿望。
发明的概述
由乙酰辅酶A羧化酶ACC1和ACC2产生的丙二酰辅酶A(Ma-CoA)，在调节脂肪酸(FA)代谢中是关键代谢物。Acc1-/-突变小鼠胚胎致死，也许由于缺少用于生物膜合成所需脂肪酸合成的“C2单位”。Acc2-/-突变小鼠正常繁殖并有正常的寿命。喂食正常饮食的Acc2-/-小鼠在肝脏中没有象野生型小鼠那样积累脂肪且过夜禁食导致酮体产生5倍增加，显示较高的脂肪酸氧化。Acc2-/-和Acc2+/+小鼠肝脏中ACC1和脂肪酸合酶活性和丙二酰辅酶A含量一样，表明脂肪酸合成没有受到干扰，尚没有丙二酰辅酶A用于抑制线粒体脂肪酸穿梭系统，因此脂肪酸氧化相对高。此结果没有早于此发现预测，区别ACC1产生的丙二酰辅酶A和ACC2产生的丙二酰辅酶A在调节脂肪酸代谢中作用很重要。
缺少ACC2导致肌肉和心脏的丙二酰辅酶a含量分别低30和10倍。Acc2-/-比目鱼肌肉中脂肪酸氧化比Acc2+/+小鼠高30％。加入胰岛素不影响Acc2-/-比目鱼肌肉中的脂肪酸氧化，但如预期的，与突变型相比它在野生型比目鱼肌肉中使脂肪酸氧化降低50％。由于首次证明Acc2在糖尿病中胰岛素作用和调节脂肪酸氧化中的作用，这是一个非常重要的观察。胰高血糖素的类似物异丙肾上腺素，对Acc2-/-小鼠肌肉中脂肪酸氧化作用很小，但引起比目鱼肌肉中脂肪酸氧化增加50％。而且，此结果强调ACC2在调节脂肪酸氧化和作为调控肥胖的靶的潜力方面的重要作用。与野生型小鼠相比，突变小鼠中较高的脂肪酸氧化使脂肪组织中的脂肪贮藏相降低50％。这些结果对了解和控制在正常、糖尿病和肥胖动物包括人中的脂肪酸代谢和能量稳态是有价值的。
在本发明的一个实施例中，提供了在患者中促进重量减少和/或脂肪氧化的方法。此方法可包括对患施用的乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)的抑制剂。同样的方法也可用于减少体重。
在本发明的另一个实施例中，提供了促进脂肪酸氧化的方法以治疗如肥胖和糖尿病，包括对有这些病况的患者施用乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)的抑制剂。
在本发明的又一个实施例中，提供了对患者施用乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)的抑制剂减少血糖的方法。本发明可用于治疗糖尿病患者。
在本发明的另一实施例中，提供了使蛋白质失活的乙酰辅酶A羧化酶的ACC2同工型的内源基因突变的转基因小鼠。ACC2基因可通过缺失基因的一个或多个外显子突变，可由异源DNA序列如HPRT表达盒替换。在一较佳实施例中，编码ACC2的生物素结合基序的外显子由HPRT表达盒替换。此领域内的人预料不到的是，这些小鼠显示的表型由骨骼肌和心脏中丙二酰辅酶A水平减少、无限制的脂肪氧化和在肝脏及脂肪储存细胞中脂肪积累降低组成。转基因小鼠比野生型小鼠消耗更多食物但仍瘦弱。
在本发明的又一实施例中，提供了筛选ACC2同工型活化的抑制剂的方法，由对野生型小鼠施用潜在抑制剂和筛选显示Acc2-/-转基因小鼠相同表型的小鼠步骤组成。
在本发明的其它实施例中，提供了上述方法鉴定的ACC2抑制剂。此抑制剂可掺入对患者施用的药物组合的用于增强脂肪酸氧化和抑制脂肪积累以促进重量减少或维持的目的。
本发明对治疗糖尿病动物包括人有进一步潜力，它有助于防止施用胰岛素的I型和II型糖尿病患者增重。此外，增强的脂肪酸氧化会通过提高糖酵解，降低糖异生和糖原合成和不依赖胰岛素的脂肪酸氧化积累影响碳水化合物代谢。因此，它有助于糖尿病患者消耗脂肪和减少重量。
在本发明的进一步实施例中，描述了通过从Acc2-/-转基因小鼠纯化ACC1获得完全没有ACC2同工型的ACC1蛋白的纯化制备。
在本发明的另一实施例中，提供了通过在Acc2-/-转基因小鼠中产生抗体获得增强的抗ACC2抗体的方法。
在本发明的又一实施例中，提供了来自Acc2-/-转基因小鼠的细胞系。预期来自肌肉、心脏、脂肪细胞和肝脏细胞的细胞系在生物测定和药物靶研究中特别有用。包括那些下丘脑的脑细胞系在研究参与调节饲养行为和食欲和脂肪和碳水化合物代谢的神经肽中有用。
在本发明的其它实施例中，提供了筛选ACC2的激动剂和拮抗剂的方法。此方法包括对Acc2-/细胞系和来自野生型小鼠细胞系施用候选化合物然后进行检测细胞活性改变的实验的步骤。特异作用于ACC2的化合物会改变野生型细胞中的细胞活性、脂肪和碳水化合物代谢，但对Acc2-/-细胞没有作用。可监控的细胞活性包括mRNA表达、蛋白质表达、蛋白质分泌和参与脂肪酸和脂质和碳水化合物代谢的催化活性蛋白(酶)。
在ACC2中缺少Ser 1201代表ACC1和ACC2调控间的重要区别，并有利于设计和/或产生ACC1和ACC2差异抑制剂[药物]。本发明其它和进一步的方面、特征和优点，包括ACC2的独特疏水氨基末端，有利于设计和/或产生ACC1和ACC2差异抑制剂[药物]。同样，对ACC2和抗ACC1抗体的差异反应对设计和产生ACC1和ACC2差异抑制剂[药物]是重要的。而且，从下列用于披露本发明实施例描述中其它方面中显而易见。
附图简述
可获得本发明上述特征、优点和目的以及其它方面变得清楚的内容，并可以详细理解，用上述简要更具体的描述本发明，可供在附图中阐明的一些实施例参考。
这些附图形成说明书的一部分。然而，要指出的是，附图阐述了本发明的实施例因此不认为是限制它们的范围。
图1A说明用于Acc2座位靶突变的策略。在小鼠基因组克隆中鉴定的2个外显子(黑框)中，含生物素结合基序(Met-Lys-Met)的外显子为次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)表达盒替换以产生靶构建物。表明通过DNA印迹分析用于鉴别目标物的3’和5’探针。
图1B说明提取自小鼠尾部基因组DNAs的DNA印迹分析。BglI消化的DNA’s用5’探针探测；Bam H1和Kpn1消化的DNAs用3’探针探测。来自野生型(+/+)、杂合(+/-)和Acc2-null(-/-)小鼠的DNAs给出预期的片段大小。
图1C说明从野生型(+/+)、杂合(+/-)和Acc2-null(-/-)小鼠骨骼肌制备的总RNA的RNA印迹用32P-标记的362-bp cDNA片段探测，用于筛选基因组库。探针在Acc2+/-和Acc2+/+RNAs中检测到10-kbp RNA带，但在Acc2-/-RNAs中没有检测到。杂交用小鼠β-肌动蛋白质cDNA探针的同样滤器(剥离后)确认等量的RNA加入凝胶中。
图1D证实在Acc2-null小鼠中缺少ACC2蛋白。小鼠肝脏、骨骼肌和心脏的提取物(每个50μg)用SDS-PAGE(6％)分离。蛋白质转到硝化纤维素滤器并用抗生物素蛋白-过氧化物酶探测以检测含生物素蛋白。表明了2种羧化酶-280kDa ACC2和265kDa ACC1-的定位。
图2显示在野生型(填满符号)和Acc2-/-突变(空心符号)小鼠组织中的丙二酰辅酶A的相对量。指示小鼠组织的酸可溶性提取物中的丙二酰辅酶a是通过在还原烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和高度纯化的鸡脂肪酸合酶(4，29)存在时在棕榈酸中掺入[3H]乙酰辅酶A未测量的。合成的[3H]棕榈酸用石油醚提取并测量放射性。小鼠在过死前喂食正常食物或禁食48小时。数据是3种动物的平均数±SD。
图3A-3E显示喂食标准饮食的32周令雄性小鼠肝脏的组织学分析。图3A显示野生型(左面)和Acc2-/-突变小鼠饥饿24小时后的肝脏。野生型和突变肝脏的冷冻的片用油Red-O染色以检测脂质小滴和用迈耶苏木精复染。与Acc2-/-突变肝脏中红染色小滴剧烈下降相比，野生型小鼠的肝脏的片(图3B)显示红染色脂质小滴丰富(图3C)。来自相同肝脏的冷冻切片并用高碘酸希夫方法染色糖原和苏木精复染。野生型肝脏(图3D)含糖原(粉红色染色)和未染色的脂质液泡，而突变肝脏(图3E)有很少或没有糖原和少数脂质液泡。
图4显示小鼠用子宫颈脱位处死的实验的总结，且比目鱼肌肉-2个来自各后肢-切除自每只小鼠并浸泡在1.5ml含4％无脂肪酸牛血清白蛋白、10mM葡萄糖和0.3mM[9，10(n)-3H]棕榈酸(3mCi/小瓶)[Ibrahimi，1999#423]的Krebs-Henseleit缓冲液(pH7.4)。显示的地方，加入胰岛素(10mM)或异丙肾上腺素(3mM)，小瓶37℃在增湿O2/CO2(95/5％)大气温育30分钟。在温育阶段末期，[3H]2O从标记底物中分离，并计数。
图5A-5E显示Acc2-/-和野生型小鼠中食物摄入、生长(体重)和脂肪组织。2组雌性小鼠(分别为1和2号；3和6周令)和1组5周令雄性-每组有5个Acc2-/-突变体(M，填满圆)5个野生型(W，空心符号)-喂食标准饮食27周。在图5A中，每周测量食物摄入并以每只鼠27周时期累积食物摄入表达。每周测量各组中每只小鼠的重量，且数据以平均数±SD在图5B中表示。图5C显示32周令以标准饮食喂养的雄性同宣传员仔鼠的背侧图。Acc2-/-小鼠(33.6g重)皮肤下观察到的白脂肪量比野生型小鼠(34.2g重)的少很多。图5D显示Acc2-/-和野生型小鼠(+/+)皮肤下脂肪垫的腹部图。图5E显示分离自突变体(0.75g)和野生型((1.4g)小鼠的附睾脂肪垫。Bar，1cm。
图6A-6B显示Acc1座位的靶突变。图6a显示用于产生靶突变的策略。含生物素结合基序(Met-Lys-Met)外显子(黑框)用HPRT表达盒替换。显示用于DNA印迹分析的3’和5’探针。图6B显示通过DNA印迹分析提取自小鼠尾部的基因组DNA在基因型中观察到的典型模式。DNAs用ShpI消化一式两份。印迹用图6a表明的5’和3’探针探测。仅存在野生型(+/+)和杂合((+/-)基因型，表明没有纯合的(-/-)小鼠出生。
发明的详细描述
本发明涉及促进患者重量减少的方法。通过给所述患者施用乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)抑制剂减少体重同样的方法也可用于脂肪减少。
本发明提供了促进脂肪酸氧化的方法以治疗如肥胖和糖尿病，通过给有这些病况的患者施用乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)的抑制剂。
本发明提供了对患者施用乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)的抑制剂减少患者血糖水平的方法。本方法可用于治疗糖尿病患者。
本发明也提供了乙酰辅酶A羧化酶的ACC2同工型的内源ACC2基因突变的转基因小鼠，导致缺少功能性ACC2同工型的表达。此基因可通过缺失Acc2基因的一个或多个外显子突变，它可由异源DNA序列如HPRT表达盒替换。较佳的是编码ACC2生物素结合基序的外显子由HPRT表达盒替换。所得的小鼠显示的表型由骨骼肌、心脏和其它组织中产生的丙二酰辅酶A水平减少、无限制的脂肪氧化和在肝脏及脂肪储存细胞中脂肪积累降低组成。转基因小鼠比野生型小鼠消耗更多食物但积累的脂肪更少。
本发明还证明了筛选Acc2同I型活性的抑制剂的方法，由对野生型小鼠施用潜在的抑制剂和筛选显示Acc2-1-转基因小鼠的表型的小鼠组成。
本发明也涉及由上述方法鉴定的ACC2抑制剂。此抑制剂可掺入到药物组合物用于患者增强脂肪酸氧化和抑制脂肪积累以促进重量减少或维持。
本发明也提供了获得没有ACC2同工型的ACC1蛋白的纯化方法。这是通过纯化来自缺少ACC2同工型的本发明的Acc2-/-转基因小鼠组织的ACC1完成的。
本发明也提供了通过在Acc2-/-转基因小鼠中产生抗体制备增强的抗ACC2抗体的方法。不像野生型小鼠，这些小鼠由于ACC2在产生免疫自身耐受期间不存在，所以这些小鼠的ACC2免疫耐受更小。结果，来自用ACC2免疫接种的Acc2-/-转基因小鼠的抗体比野生型小鼠产生的类似抗体更针对ACC2独特的抗原区域。
本发明进一步涉及来自Acc2-/-转基因小鼠的细胞系。这些细胞系在ACC1和ACC2生物测定和药物靶研究中有用。衍生自肌肉、心脏、脂肪和肝脏组织的细胞系在这些研究中特别有用。
本发明也包括筛选ACC2的激动剂和拮抗剂的方法。对Acc2-/-细胞系和野生型细胞系都施用候选化合物。随后监控细胞在细胞功能中的变化如mRNA表达、蛋白质表达、蛋白质分泌、蛋白质活性和脂质代谢。特异作用于ACC2的化合物会改变野生型细胞中的细胞活性，但对Acc2-/-细胞系没有作用。
给出下列实施例为了阐述发明的不同实施例，但并不想要以任何方式限制本发明。
实施例1
Acc2 -/- 转基因小鼠的产生
用Acc2 cDNA探针分离小鼠Acc2基因组克隆。基于人和小鼠ACC2基因间的同源性(Abu-Elheiga，L.，Almaraz-Ortega，D.B.，Baldini，A.和Wakil，S.J.，J Biol Chem.272，10669-10677，1997)，来自生物素结合区域的2个寡核苷酸基于人ACC2 cDNA序列设计：正向引物(5’-CTGAATGATGGGGGGCTCCTGCTCT-3’；核苷酸2551-2575)(SEQ ID No.1)和反向引物(5’-TTCAGCCGGGTGGACTTTAGCAAGG-3’；核苷酸2890-2913)(SEQ ID No.2)。这些引物用于扩增来自Quick-Clone小鼠心脏cDNA库(Clontech)模板的cDNA。
获得的cDNA片断测序并用于筛选129/SvEv小鼠基因组库以分离16-kbpλ基因组克隆。用不同限制酶消化16-kbpλ基因组克隆，建立限制图和构建含正-负选择标记且缺少含生物素结合基序Met-Lys-Met外显子的基因靶载体(图1A)。此载体用于产生ACC2基因一个突变拷贝的鼠129SvEv ES细胞(突变等位基因称为Acc2tm1 LAE)。
2个独立的EA细胞克隆注入小鼠胚泡中，随后植入假孕雌性的子宫角中。在产生的幼畜中，确定了8只高水平嵌合体并与C57BL/6J雌性杂交。每只雌性产下几只花白色幼畜，表明ES细胞基因组的种系传递。基因组DNA的DNA印迹分析确定了在F1杂合子中存在内源和中断的等位基因。杂合小鼠杂交，它们的后代测基因型。DNA印迹分析显示DNA用图1A中所示5’和3’探针杂交并给出预期来自野生型(+/+)、杂合(+/-)和纯合-null(-/-)动物的信号(图1B)。在测超过300只小鼠尾部基因型后，确定24％子代是Acc2-/-，22％是Acc2+/+，54％是Acc2+/-；这些结果与孟德尔遗传一致。Acc2-/-突变可存活，正常繁殖且似乎有正常寿命。
实施例2
在Acc2 -/- 转基因小鼠中的Acc2表达
从野生型、杂合和纯合-null动物切除的骨骼肌组织的总RNA的RNA印迹分析显示在纯合-null动物中没有可检测的Acc2 mRNA，且如预期的那样，杂合动物中的Acc2 mRNA水平是野生型的一半(图1C)。用抗生物素蛋白过氧化物酶探测含生物素蛋白的Acc2/-突变小鼠的心脏、骨骼肌和肝脏组织的蛋白质印迹分析显示没有ACC2蛋白的表达(图1D)。ACC2蛋白水平(280kDa)比野生型小鼠的心脏和骨骼肌组织中ACC1蛋白(265kDa)水平高，尽管ACC1蛋白在它们的肝脏组织中更占主导。
Acc2-/-突变小鼠中缺少ACC2蛋白进一步由使用亲和纯化抗ACC2特异抗体的共焦免疫荧光显微镜分析证实(Abu-Elheiga，L.，W.R.Brinkley，L.Zhong，S.S.Chirala，G.Woldegiorgis，and S.Wakil.Proc Natl Acad Sci USA.，97：1444-1449，2000)。尽管野生型小鼠的心脏、骨骼肌和肝脏有丰富的ACC2抗原表达，此蛋白质在Acc2-/-突变小鼠中没有表达(数据没有列出)。因此，通过所有的测量，Acc2-/-突变等位基因是null等位基因。
实施例3
在Acc2 -/- 转基因小鼠中的丙二酰辅酶A水平
由于动物组织中丙二酰辅酶A水平归因于ACC1和ACC2的活性，在这些组织中丙二酰辅酶A水平缺少ACC2的后果和ACC1是否可补偿，从而确定这些组织中丙二酰辅酶A水平的提高。比较野生型和Acc2-/-突变小鼠的肝脏组织，丙二酰辅酶A水平和总体ACC活性没有显著区别，说明肝脏中几乎所有丙二酰辅酶A是由ACC1提供的(图2)。
另一方面，比较同样2组小鼠骨骼肌和心脏组织，发现Acc2-/-突变小鼠的这些组织中丙二酰辅酶A水平比野生型小鼠分别约低30倍和10倍。这说明ACC2是骨骼肌肉和心脏中丙二酰辅酶a的主要提供(图2)。
在禁食期间，野生型和Acc2-/-突变小鼠的肝脏组织中丙二酰辅酶A水平都同等地下降，说明ACC1受饮食情况影响(图2)。禁食的Acc2-/-突变小鼠的心脏和肌肉组织中丙二酰辅酶A水平很低，说明这些组织中ACC1也受饮食情况影响(图2)。由于肌肉中丙二酰辅酶A主要由ACC2产生(Thampy，K.G.，J Biol Chem.，264：17631-17634，1989)，饥饿野生型小鼠使其肌肉水平比很好喂食的小鼠减少70％，说明这些小鼠中ACC2活性可能由饮食调控。ACC2活性可通过ACC2表达量下降或其活性下调或两者都有而显著下降。
实施例4
在Acc2 -/- 转基因小鼠中的脂肪酸积累
因为ACC2反应在脂肪酸合成中是定速步骤(Wakil，S.J.，Stoops，J.K.和Joshi，V.C.，Ann Rev Biochem.，52：537-579，1983)，且野生型肝脏和Acc2-/-肝脏中丙二酰辅酶A水平类似。确实，通过掺入[14C]-乙酰辅酶A测量的棕榈酸合成2组都相同。然而，野生型小鼠的肝脏颜色比突变体肝脏浅，说明它们含更多脂肪(图3A)。
为证实此推测，肝脏组织用油Red-O染色以检测脂质并评估它们的脂质和甘油三酯含量。野生型肝脏含丰富的主要是甘油三酯的脂质小滴(图3B)，而Acc2-/-肝脏含脂质小滴少很多(图3C)。用薄层层析提取和分析总脂质显示突变体肝脏比野生型肝脏所含脂质少20％，脂质的甘油三酯含量比野生型低80-90％。
实施例5
ACC1和ACC2调节不同的丙二酰辅酶A库
由于野生型和Acc2-/-突变体的肝脏提取物中ACC活性和脂肪酸合酶(FAS)活性相同，肝脏脂质含量的差异必须次要于Acc2-/-肝脏中未受控制的线粒体脂肪酸氧化而不是由于脂肪酸合成的抑制。同样，因为丙二酰辅酶A是线粒体肉碱棕榈酰辅酶A穿梭系统的负调节物(McGarry，J.D.，和N.F.Brown.，Eur.J.Biochem.，244：1-14，1997)，在Acc2-/-肝脏中缺少预期会增加脂肪酸转运穿越线粒体膜和随后的β氧化。因此，这些结果表明由ACC2合成的丙二酰辅酶A通过控制脂肪酸氧化影响肝脏中脂肪积累。由于2组小鼠肝脏中都有丰富的ACC1-产生的丙二酰辅酶A，显然不抑制脂肪酸的β氧化，可推断ACC1和ACC2产生的丙二酰辅酶A分别存在于细胞的2个不同区室细胞质和线粒体，并在这些区室中执行不同功能。因为ACC1和ACC2在大鼠肝脏的门静脉周(1区)和静脉周(3区)肝细胞中都存在，所以不太可能2个丙二酰辅酶A库衍生自在这些肝脏不连续区域中ACC1和ACC2的差异表达。
实施例6
在Acc2 - 转基因小鼠肝脏中糖原的分析
糖原，肝脏和肌肉中葡萄糖的储存形式，是动物包括人中能量移态的重要调节物。它的合成和降解与葡萄糖代谢紧密相关。参与糖原代谢的酶由激素高度调节如胰岛素、胰高血糖素和肾上腺素。
为检查ACC2丧失是否影响糖原水平，从野生型和Acc2-/-突变小鼠切除的肝脏冷冻切片针对糖原染色(图3D和3E)。在有营养的状态下，野生型肝脏含丰富量的糖原(410±10μmol/g湿组织)，而Acc2-/-小鼠肝脏所含糖原少20％(325±14μmol/g湿组织)。推测在Acc2-/-肝脏中更多的糖原在脂肪酸合成和随后氧化中利用，因此消耗糖原。在24小时禁食的野生型小鼠肝脏中，糖原明显存在(图3D)，而在Acc2-/-突变体肝脏中检测不到(图3E)。
实施例7
在Acc2 -/- 转基因小鼠中血糖和脂质的分析
下一步是分析喂食标准饮食的野生型和Acc2-/-小鼠的胆固醇、葡萄糖、甘油三酯、游离脂肪酸和酮体的血清水平。胆固醇水平在2组小鼠中相似(92.8±3.1和95.1±7.4mg/dl)，葡萄糖水平在突变小鼠中低20％(176.6±6.5比136.2±5.4mg/dl)。脂肪酸水平在突变小鼠中低(1.37±0.31比0.84±0.12mM)，而甘油三酯水平在突变小鼠中高30％(35.1±2.5比45.2±5.9mg/dl)，也许由于动用来自肝脏和/或脂肪的甘油三酯和脂肪酸将它们输送到心脏和肌肉作为氧化底物。酮体的血清水平(β-羟丁酸)在野生型和突变小鼠中几乎都检测不到。然而，过夜禁食(10到20小时)使Acc2-/-小鼠的血液β-羟丁酸浓度比野生型提高4倍(2.5±0.6mM比0.7±0.0.5？mM，n＝5)，与突变小鼠中脂肪酸氧化程度高相一致。
实施例8
在Acc2 -/- 转基因小鼠中的脂肪酸氧化
为了向ACC2合成丙二酰辅酶A作为脂肪酸氧化的调节物的作用提供进一步证据，研究了小鼠比目鱼肌肉中的脂肪酸氧化，II型肌肉组织对激素调节起反应(Vavvas，D.，Apazidis，A.，Saha，A.K.，Gamble，J.，Patel，A.，Kemp，B.E.，Witters，L.A.，和Ruderman，W.B.，J Biol Chem.，272：13255-13261 1997；Alam，N.和E.D.Saggerson.Biochem J.，334：233-41，1998；Abu-Elheiga，L.，Jayakumar，A.，Baldini，A.，Chirala，S.S.和Wakil，S.J.Proc Natl Acad Sci.USA92，4011-4015，1995；Abu-Elheiga，L.，Almarza-Ortega，D.B.，Baldini，A.，和Wakil，S.J.J Biol Chem.，272：10669-10677，1997；-Ha，J.，J.K.Lee，K.-S.Kim，L.A.Witters，和K.-H.Him.Proc Natl Acad Sci.USA 93：11466-11470，1996；Rasmussen，B.B.和Wolfe，R.R.，Ann.Rev.Natr.19：463，1999；Bressler，R.和Wakil，S.J.J Biol Chem.，236：1643-1651，1961)。
如图4所示，Acc2-/-突变小鼠分离的比目鱼肌肉中[3H]棕榈酸氧化比Acc2+/+小鼠高30％。已知胰岛素活化ACC1和ACC2，因此分别诱导脂肪酸合成和抑制脂肪酸氧化。加入胰岛素到从野生型和Acc2-/-突变小鼠切除的比目鱼肌肉不影响Acc2-/-突变体肌肉细胞中的脂肪酸氧化(图4)，但在野生型肌肉细胞中减少棕榈酸氧化约45％(图4)。基于这些结果，可断定胰岛素介导β氧化的抑制通过活化ACC2发生，大概通过去磷酸化(Lopaschuk，G.和Gamble，J.Can J Physiol Pharmacol.72：1101-1109.1994；Kudo，N.，Bar，A.J.，R.L.，Desai，S.，Lopaschuk，G.D.JBiol Chem.，270：17513-17520，1995；Dyck，J.R.，N.Kudo，A.J.Barr，S.P.Davies，D.G.Hardie和G.D.Lopaschuk.Eur J. Biochem.，262：184-190，1999；Vavvas，D.，Apazidis，A.，Saha，A.K.，Gamble，J.，Patel，A.，Kemp，B.E.，Witters，L.A.，和Ruderman，W.B.，J Biol Chem.272：13255-13261 1997；Iverson，A.J.，A.Bianchi，A.C.Nordlund和L.A.，Witters.Biolchem J.269：365-371，1990；Kim，K.H.，F.Lopez-Casillas，D.H.Bai，X.Luo和M.E.Pape.Faseb J.3：2250-2256，1989；Thampy，K.G.和Wakil，S.J.J Biol Chem.，263，6454-6458，1988；Mabrouk，G.M.，Helmy，I.M.，Thampy，K.G.和Wakil，S.J.J Biol Chem.，265，6330-6338，1990；Mohamed，A.H.，W.Y.Huang，W.Huang，K.V.Venkatachalam和S.J.Wakil，J Biol Chem.，269：6859-6865.1994；Hardie，D.G.Prog Lipid Res.28：117-146，1989)。
ACC2在调节线粒体脂肪酸氧化中的作用通过使用胰高血糖素类似物异丙肾上腺素进一步确认，胰高血糖素产生胰岛素的反效果。加入异丙肾上腺素到野生型比目鱼肌肉使棕榈酸氧化增加50％(图4)，几乎提高到突变体肌肉细胞中发现的同样水平。值得注意的是，异丙肾上腺素也进一步提高突变体比目鱼肌肉细胞中的脂肪酸氧化(图4)。此额外增加也许由于不依赖丙二酰辅酶A的因子(Kim，K.H.，F.Lopez-Casillas，D.H.Bai，X.Luo和M.E.Pape.Faseb J.3：2250-2256，1989)。
总而言之，这些结果首次证实线粒体相关ACC2，不是细胞溶质的ACC1，负责胰岛素介导的活化和异丙肾上腺素(胰高血糖素)介导的失活，分别导致脂肪酸氧化减少和上升。由于2组小鼠比目鱼肌肉的线粒体CPTI活性很类似(数据未列出)，这些激素观察到的结果仅由于它们对ACC2的作用。
实施例9
Acc2 -/- 转基因小鼠的饲养实验
似乎线粒体脂肪酸β氧化在Acc2-/-突变小鼠中以未调节但持续的方式发生。为了研究此类型脂肪酸β氧化的作用和它对食物消耗和重量增加的效果，饲养实验用3组喂食重量标准饮食随意饲养的小鼠进行(每组有5只野生型和5只Acc2-/-突变小鼠组成)。(图5代表1组的图)。每周测量每组食物消耗(没有注意到溢出)到27周，每周记录每只小鼠重量。
每只Acc2-/-突变小鼠平均每周比野生型小鼠消耗20-30％更多食物(图5A)并与每只23g野生型小鼠相比维持21g平均体重。Acc2-/-突变小鼠在整个饲养周期一般比野生型小鼠更瘦，重量少约10％(图5B)。此外，Acc2-/-突变小鼠的脂肪组织中积累脂肪更少(图5C和5D)。例如，与1.4g野生型同窝出生雄性相比Acc2-/-雄性中的附睾脂肪垫重0.75g(图5E)。脂肪大小减少导致释放到血浆的瘦蛋白(leptin)下降，从野生型小鼠53±9ng/ml到突变小鼠36±3ng/ml。因此，线粒体脂肪酸β氧化调节脂肪组织中脂肪储存。
实施例10
Acc1 -/- 转基因小鼠的产生
为证明ACC1在脂肪酸从头合成中的重要性，使用与Acc2同样的策略产生Acc1敲除小鼠。像ACC2，ACC1同工型在动物种类中也高度保守(Thampy，K.G.J Biol Chem.264：17631-17634，1989)。设计基于人Acc1 cDNA的正向引物(5’-GGATATCGCATCACAATTGGC-3’)(SEQ ID NO.3)和含生物素结合位点的反向引物(5’-CCTCGGAGTGCCGTGCTCTGGATC-3’)(SEQ ID NO.4)并用于扩增使用人cDNA为模板的335-bp cDNA探针。129/SvEv小鼠基因组库用ACC2描述的PCR片断筛选，分离出14-kbp克隆，用限制酶制图谱并用DNA印迹法分析(图6B)。正确的靶克隆(图6A)显微注射到C57BL/6J小鼠胚泡中，随后植入假孕雌性小鼠的子宫角中。产生的雄性嵌合体与C57BL/6J配偶繁殖，Acc1杂合后代品种间杂交。
通过使用5’和3’探针的DNA印迹法分析来自300多只子代的基因组DNA，没有得到纯合Acc1-null突变后代。这一窝大小为6或7，小于平均值，35％子代是野生型且65％是杂合。这些结果证明Acc1突变是胚胎致死的。
为确定此胚胎致死率的特征，定时杂合体的交配并测所得胚胎的基因型。在妊娠日E12.5和E13.5，存活的胚胎35％是野生型且65％是杂合，表明致死性率早些发生。在妊娠日E9.5，死胎的剩余物恢复，且在妊娠日E8.5，退化的胚胎从外胚锥内恢复。
讨论
肥胖是影响身体对各种疾病敏感性的主要健康因素如心脏病发作、中风和糖尿病。肥胖是沉积在脂肪中脂的评估标准，对应于食物摄入、脂肪酸和甘油三酯合成、脂肪酸氧化和能量消耗。过量食物不仅提供身体所需及时能量，也促进肝脏和肌肉中糖原合成和储存及脂肪组织中的脂肪酸和甘油三酯合成和贮藏。热量限制或饥饿促进所需葡萄糖的糖原分解和提供用于氧化及能量生成的脂肪酸的脂解。胰岛素和胰高血糖素是协调这些过程的激素。丙二酰辅酶A是脂肪酸合成中的关键中间物，且近来承担作为第二信使通过脂肪酸氧化调节能量水平(ATP)的额外作用，依次影响脂肪酸合成和碳水化合物代谢。
上述研究提供了ACC2产生的丙二酰辅酶A在调节脂肪酸合成和能量代谢中的作用的确切特征。ACC1产生的丙二酰辅酶A是脂肪酸合成所需的C2单位的供体。ACC1和ACC2的底物乙酰辅酶A是丙酮酸氧化化产物，因此羧化酶的研究与3种主要代谢途径相关-碳水化合物代谢、脂肪酸合成和脂肪酸氧化。
研究动物羧化酶，通常ACC1和ACC2的混合物，显示这些酶在转录和翻译水平受长期控制及磷酸化/去磷酸化的靶Ser残基和柠檬酸或棕榈酰辅酶A别构修饰的短期调控。发现一些激酶磷酸化两种羧化酶并降低它们活性。胰岛素通过去磷酸化活化羧化酶，而胰高血糖素和肾上腺素磷酸化使羧化酶失活。最值得注意的激酶之一AMP-活化蛋白激酶(AMPK)由与低水平ATP同时的高水平AMP活化，这是通过消耗ATP的细胞应激物活化的级联反应中包括别构调节和蛋白激酶(AMPK激酶)磷酸化的机制。通过这些机制，当代谢燃料少且需要ATP时，ACC活性都由磷酸化关闭，导致低丙二酰辅酶A水平，通过提高脂肪酸氧化和减少用于脂肪酸合成的ATP消耗使ATP合成增加。
ACC1和ACC2在不同组织中差异性表达-ACC1在肝脏和脂肪中高度表达，且ACC2在心脏和肌肉中占主导-它们的细胞定位-ACC1在胞质和ACC2在线粒体膜-表明它们的功能尽管相关但不同。胞质ACC1产生的丙二酰辅酶A也是被用于脂肪酸合成的胞质酶的脂肪酸合酶利用。线粒体ACC2产生的丙二酰辅酶A功能是作为CPTI活性的调节物-CPTI是催化长链脂肪酸穿梭到线粒体中用于β氧化和能量生成的第一个酶。因此，ACC2产生的丙二酰辅酶A是通过脂肪酸氧化调节ATP水平的第二信使，依次影响脂肪酸合成和碳水化合物代谢。
关于Acc2突变小鼠的本研究有力地支持此结论。突变小鼠肝脏中丙二酰辅酶A水平与野生型小鼠肝脏中的相似，说明它由在此组织中主导的羧化酶ACC1合成。在野生型小鼠肝脏中，丙二酰辅酶A用于合成脂肪酸，随后转变成以脂质小滴积累的甘油三酯(图3A)。在Acc2-/-突变小鼠肝脏中，未受控制的CPTI活性导致由肝脏线粒体氧化脂肪酸或脂肪酸转化成脂质(极低密度脂蛋白)，随后通过血流运送至心脏和肌肉以克服这些组织因未受抑制的CPTI活性和增强的脂肪酸氧化而引起对脂肪酸增加的需求。这些结论由Acc2-/-突变小鼠的心脏和骨骼肌组织附近缺少丙二酰辅酶A、Acc2-/-突变小鼠的比目鱼肌肉中较高脂肪酸氧化率和不依赖胰岛素和胰高血糖素类似物异丙肾上腺素的脂肪酸氧化发生支持(图4)。
最后，在小鼠中敲除ACC2证明缺少线粒体第二信使丙二酰辅酶A，产生的后代表现出脂肪酸氧化增强、脂质积累减少、肝脏中糖原储存降低但形态学仍正常、以预期速度生长并正常繁殖(跟踪它们的寿命和衰老)。所有代谢变化在食物消耗模式和体重中表达-喂食标准饮食的Acc2-/-突变小鼠通常比野生型小鼠多消耗20％食物最终体重仍减少10％。
脂肪含量和脂肪组织大小下降导致释放到血浆的瘦蛋白减少约30％，与禁食的小鼠中发生的相似。这意味着下丘脑部产生促进喂食的刺激食欲神经肽Y。对此观察似乎最合适的解释是，Acc2-/-突变小鼠脂肪储存较少，尽管它们比野生型小鼠消耗更多食物(图5A-5E)。据认为丙二酰辅酶A在通过下丘脑神经元作用发出可利用生理燃料的信号中起作用。此提议基于提高脂肪酸合酶抑制剂处理的小鼠食物摄入的5-(tetradeculoxy)-2呋喃甲酸抑制ACC。尽管此可能性不能在Acc2-/-小鼠中排除，血浆中较低瘦蛋白水平也许足够增加食欲。此外，Acc2-/-小鼠似乎正常，没有明显的神经学异常。
维持脂肪酸氧化的高水平导致脂肪积累和储存减少，人通过锻炼尽力达到的生理状态。药理学抑制ACC2允许患者在维持正常热量吸收同时减少体重。

Claims (23)

1.一种促进患者脂肪酸氧化和体重减少的方法，其特征在于，所述方法包括抑制所述个体乙酰辅酶A羧化酶2活性的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性通过对所述个体施用乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)抑制剂来抑制。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述个体有病理生理状况。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述病理生理状况选自肥胖和糖尿病。
5.一种降低个体血糖的方法，其特征在于，所述方法包括对所述个体施用乙酰辅酶A羧化酶2(ACC2)抑制剂的步骤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述个体患有糖尿病。
7.一种转基因小鼠，其特征在于，所述小鼠包括乙酰辅酶A羧化酶的乙酰辅酶A羧化酶2同工型的内源ACC2基因突变，其中所述突变使上述基因失活并导致功能性乙酰辅酶A羧化酶2同工型的表达缺乏。
8.如权利要求7所述的小鼠，其特征在于，所述ACC2基因缺失一个或多个外显子。
9.如权利要求8所述的小鼠，其特征在于，所述外显子被异源DNA序列替换。
10.如权利要求9所述的小鼠，其特征在于，所述异源DNA序列包括次黄嘌呤磷酸核糖转移酶表达盒。
11.如权利要求10所述的小鼠，其特征在于，编码ACC2的生物素结合基序的外显子被次黄嘌呤磷酸核糖转移酶表达盒替代。
12.如权利要求7所述的小鼠，其特征在于，所述小鼠显示出骨骼肌和心脏中丙二酰辅酶A生成的代谢降低的表型。
13.如权利要求12所述的小鼠，其特征在于，它还有肝脏和脂肪储存细胞中未受限制的脂肪氧化和脂肪积累减少的表型。
14.如权利要求12所述的小鼠，其特征在于，它还有比野生型小鼠消耗更多热量，但比野生型小鼠积累脂肪少的表型。
15.一种筛选乙酰辅酶A羧化酶2同工型活性抑制剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
对野生型小鼠施用潜在的抑制剂；以及
筛选具有如权利要求14所述转基因小鼠的表型的小鼠。
16.一种用如权利要求15所述方法确定的乙酰辅酶A羧化酶2抑制剂。
17.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求16所述的乙酰辅酶A羧化酶2抑制剂和药学上可接受的载体。
18.一种获得没有乙酰辅酶A羧化酶2的乙酰辅酶A羧化酶1蛋白纯化制品的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
从获自如权利要求7所述转基因小鼠的组织中纯化出所述乙酰辅酶A羧化酶1蛋白。
19.一种获得抗乙酰辅酶A羧化酶2的鼠抗体的方法，所述抗体与乙酰辅酶A羧化酶1和其它小鼠蛋白质的交叉反应较少，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
在如权利要求7所述转基因小鼠中产生所述抗体。
20.一种衍生自如权利要求7所述转基因小鼠的细胞系。
21.如权利要求20所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系衍生自选自肌肉细胞、心脏细胞、脂肪细胞和肝脏细胞的细胞。
22.一种筛选ACC2的激动剂和拮抗剂的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
对权利要求20所述的细胞系和衍生自野生型小鼠的细胞系施用候选化合物；
监控所述细胞系细胞活性的改变，其中特异性作用于ACC2的化合物会改变野生型细胞的细胞活性，但对如权利要求20所述的细胞系没有作用。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，受到监控的细胞活性包括mRNA表达、蛋白质表达、蛋白质分泌和脂质代谢。
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