CN1807641A - 从嗜冷菌分离的低温脂肪酶基因序列及其表达重组菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明采自南极深海的嗜冷菌(Moritella sp.)分离的重组低温脂肪酶基因。该基因核苷酸序列是由834bp组成的DNA片断，该DNA片断测序结果：显示插入片断含有长834bp的开放阅读框架。该重组低温脂肪酶的氨基酸序列具有至少80－100％的同源性，是由278个氨基酸组成的蛋白质；该重组低温脂肪酶基因的重组大肠杆菌DH5αLIP的保藏号为CGMCC No.1287，保藏日期：2005.01.07。该基因表达产物脂肪酶与中高温脂肪酶相比作用温度低，在低温条件下显示活性，该脂肪酶作为酯类化合物合成分解和酯交换的催化剂，可以广泛应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性及添加于洗涤剂中以提高去污能力，因此可应用在洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域，并有着广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及低温脂肪酶的改造，具体讲是一种从嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因序列及其表达重组菌株，其属于酶基因和酶工程技术领域。本发明分离的低温脂肪酶的DNA序列，设计了含有该低温脂肪酶酶基因的重组质粒和表达相应脂肪酶的重组菌株。
背景技术
现有技术的脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)是一种特殊的水解酶，其分解脂肪，催化分解三酸甘油酯，产生甘油酯，游离脂肪酸和甘油。脂肪酶是水溶性的，其催化反应的特点是它们只能在异相系统，即在油(或脂)-水的界面上作用，对均匀分散的或水不溶底物不作用，即使有作用也极缓慢。因此脂肪酶也可以说是专门在异相系统，或水不溶系统的油(或脂)-水的界面上水解酯的酶。这一点在有机合成中合成手性中间体方面具有很多的优越性，例如通常用化学催化剂金属钠或烷基醇钠来加快酰基在甘油酯分子间的迁移，但并无位置特异性，如用1，-3，-专一性脂肪酶催化时，酰基迁移限制在1，-3，-位上，可以生成化学法不能生产的特殊的甘油三酯混合物。由于具有不需要辅酶就能催化正逆反应的优点，近些年来，脂肪酶作为酯类化合物合成分解和酯交换的催化剂，已广泛应用于油脂水解、食品风味和香味的改进、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性及添加于洗涤剂中以提高去污能力。
现有技术披露，脂肪酶已从多种不同的微生物中分离，如青霉、白地霉、根霉菌、类产碱假单胞菌、假单胞菌[William等。其中多数脂肪酶的最适作用温度在50℃左右，在低温时酶活力很低。而低温酶在低温条件下具有极高的催化常数(Kcat)，较低和较稳定的米氏常数(Km)，并以较低的活化能和低温下的酶活力为主要特征。在某些领域低温酶有着中温酶所不可比拟的优越性，种类多，来源不同的脂肪酶具有多方面不同性质，从而导致微生物的脂肪酶各具特色的应用范围，因此低温酶的应用前景广阔。因而需要持续不断地开发新特性脂肪酶以更好地满足工业需要。
关于脂肪酶基因已有专利和文献报道，如：Rey等报道了Fusarium venenatum的脂肪酶基因(美国专利US Patent 6,432,898，2002)；Lin等报道了Pseudomonaspseudoalcaligens的脂肪酶(美国专利US Patent 5,766,913，1998)；Claudia等报道了Candida rugosa的脂肪酶基因(欧洲专利，WO991438，1999)；Harumi等报道了Pseudomonas sp.的脂肪酶基因(欧洲专利，EP0812910，1997)；Yuji等报道了Geotrichum candidum的脂肪酶基因(日本专利，JP2174680，1990)。薛燕芬等报道了嗜热菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)的高温脂肪酶、其编码基因序列及其用途的专利(CN 1500868A)是涉及一种编码嗜热厌氧菌MB4脂肪酶的DNA序列，还涉及含有该酶基因的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。该酶基因是高温脂肪酶的基因；是采用Sanger双脱氧法对高温脂肪酶DNA片断进行了测序，测序结果显示插入片断含有一个长1209bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个由403个氨基酸组成的蛋白质。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的从嗜冷菌分离的低温脂肪酶及其结构基因、重组质粒和转化重组菌体及其应用，该基因表达产物脂肪酶在低温条件下显示活性，可应用在洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域有着广阔的应用前景。同时本发明提供了一种方法，即通过分子生物学手段，将本发明涉及的酶基因克隆到其他受体菌，由其他菌株或在其他培养条件下产生本发明涉及的脂肪酶。
本发明的任务是由以下技术方案实现的，研制了一种从嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因。该基因具有序列表中SEQ N0.1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列是由834bp组成的DNA片断，在该核苷酸序列中有H-G与G-X1-S-X2-G两个活性中心，该DNA片断测序结果：显示插入片断含有一个长834bp的开放阅读框架。
所述的嗜冷菌(Moritella sp.)，其为采自于南极深海的嗜冷菌(Moritella sp.)，采集地点：66°00′S，70°30′E，采集温度：0.113℃，采集深度：1500m，深海水盐度：34.64‰。
一种从南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)分离的重组低温脂肪酶。该重组脂肪酶的氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少80-100％的同源性，该氨基酸序列是一个由278个氨基酸组成的蛋白质，在该核苷酸序列中的H-G与G-X1-S-X2-G两个活性中心周围的所对应氨基酸位点保守性很强，而对酶活的影响不大的其他氨基酸位点，可进行氨基酸位点的替换，插入或缺失；该重组酶的分子量为32000道尔顿，该重组酶的反应温度为0-30℃，反应pH值6-9。
一种转化从南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因的重组大肠杆菌DH5αLIP。该重组大肠杆菌DH5αLIP的保藏号为：CGMCC No.
1287，分类命名：大肠埃希氏菌，保藏日期：2005.01.07；该重组菌含重组质粒pLIP，插入的该质粒DNA片断的大小为3.5kb，该质粒pLIP中含有序列表中SEQ NO.1所示的834bp的DNA片断序列。
一种从南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因的转化重组大肠杆菌DH5αLIP的制备方法；所述的方法步骤如下：
一、南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因组DNA的提取：
(1)按十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB法)，将培养好的南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)培养液按每管1ml～5ml分装于1.5ml～10ml离心管中；
(2)以8000rpm离心5～10min，取沉淀；
(3)每管加入567μl pH8.0的TE缓冲液，反复吹打使之重悬；
(4)然后每管加入30μl的10％SDS混匀，再3μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于37℃温育2～3小时；
(5)每管加入100μl的5mol/L NaCl混匀，再每管加入80μl的十六烷基三甲基溴化铵/NaCl混匀，65℃水浴温育10～20min；
(6)每管加入等体积的、体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混合后，再12000rpm离心15～20min，将上清液转入新管中；
(7)每管加入等体积的、体积比为25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇，混合后离心；重复上述步骤直至界面无白色沉淀为止；
(8)转移上清液于另一新管中，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃过夜，再置于4℃，12000rpm离心15min～25min。以预冷的70％的乙醇洗涤DNA沉淀，取沉淀；
(10)取沉淀溶于含RNA酶的pH 8.0的TE缓冲液中，制成的南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因总DNA溶液，-20℃放置备用；
二、脂肪酶基因的克隆：
(1)取上述一、(10)步的南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因总DNA溶液10～20μl，用限制酶Sau3AI部分酶切；
(2)经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2～10kbDNA片断；
(3)取2～4μl的经Sau3AI酶解的DNA片断；
(4)取1～2μl经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pBluescript DNA；(该pBluescript载体的供应商为Stratagene)。
(5)在20μl连接体系内进行连接反应，该连接体系中含2μl的10×连接缓冲液，1μl的T4DNA连接酶，重蒸水补足20μl；该连接体系在16℃反应10～16h，即连接到pBluescript载体上，得到重组质粒pLIP；
三、转化含重组质粒pLIP的大肠杆菌DH5αLIP：
(1)取-80℃保存的感受态大肠杆菌DH5α细胞一管置冰上融化，同时将1.5ml离心管和电转杯事先置冰上预冷30～60min；
(2)用预冷的移液管枪尖转移40μl感受态大肠杆菌DH5α细胞于预冷的1.5ml离心管中，小心加入1μl重组质粒pLIP的DNA，于冰上静置1～2min；
(3)转移至预冷的电转杯中，轻轻拍击该电转杯杯壁并确认没有气泡产生；
(4)采用高压电穿孔转化法：设置伯乐电转化仪的参数值DNA浓度：50-100ng，按脉冲键一次；其中0.1cm杯对应电转化程序Ec1的电转条件：电压1.8kV，电容强度18kV/cm，脉冲时间5毫秒；0.2cm杯对应电转化程序Ec2的电转条件：电压2.5kV，电容强度12.5kV/cm，脉冲时间5毫秒；
(5)迅速将电转杯内的转化后的感受态大肠杆菌DH5α细胞，加入预冷的1ml LB培养液，于37℃，180～220rpm，培养1小时后准备涂布平板；
(6)将转化的感受态大肠杆菌DH5α细胞，涂于含50μg/ml的氨苄青霉素Amp和三丁酸甘油酯的LB固体培养基上；
(7)在25℃培养至长出肉眼可见的菌落，然后在4℃培养2～4天，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆；
(8)取该阳性克隆在Amp-LB培养基中25℃培养2天，培养液经活性测试该阳性克隆具有低温脂肪酶活性；
(9)对该阳性克隆菌落采用碱裂解法提取其重组质粒，用BamHI水解重组质粒；
(10)经电泳结果证实，该阳性克隆菌落有DNA片断插入质粒pLIP，含此重组质粒pLIP的重组大肠杆菌，即为转化的重组大肠杆菌DH5αLIP，其保藏号为：CGMCC No.
1287，保藏日期：2005.01.07。
本发明的重组大肠杆菌DH5αLIP经发酵生产后，经常规制备方法获得重组酶制剂，然后可应用于：1)食品加工：利用本发明的重组脂肪酶分解油脂释放出脂肪酸，增加或改进食品的风味、香味与质构。2)洗涤剂：本发明的重组脂肪酶作为高活性生物催化剂，避免了三聚磷酸钠作为助洗剂导致江河湖泊富营养化，给生态环境带来危害的弊病。3)制药：本发明的重组脂肪酶作为药物，该重组脂肪酶药物可以帮助消化、降低血脂并治疗局部炎症；还可以作为临床诊断的工具。4)制备化工产品和试剂：利用本发明的重组脂肪酶催化的酯水解反应、酯合成反应或酯转移反应可以制备许多有重要工业价值的化工产品。5)造纸工业：用本发明的重组脂肪酶辅以纤维素酶和木质素酶处理纸浆可以防止树脂在干燥转鼓上的沉淀，保证纸的产量和质量，并减少处理树脂化学品的用量。6)工具酶：利用某本发明的微生物重组脂肪酶对酯键位置专一性及脂肪酸种类专一性，可以分析脂肪类的组成和构型。7)脱脂：利用本发明的重组脂肪酶对如皮革、皮毛、纺织、明胶等加工中的去脂，提高毛皮质量。8)在谷氨酸发酵工业中，利用本发明的重组脂肪酶可以提高酵母细胞渗透性以提高谷氨酸的产量。9)在纺织印染工业中，利用本发明的重组脂肪酶还可以改善纺织品染色效果。10)利用本发明的重组脂肪酶添加于天然橡胶浓乳中，对提高橡胶的机械稳定性有一定效果。11)利用本发明的重组脂肪酶该低温脂肪酶对棕榈油、豆油、花生油、葵花籽油等均有水解作用。
本发明的重组脂肪酶是一新型的低温脂肪酶，属于脂肪酶Class2家族中的一员。该新的重组脂肪酶的一级结构与已知的脂肪酶的不同，与其他已报道的脂肪酶的氨基酸序列相比，相似性小于40％，与中高温脂肪酶相比，作用温度低。
附图说明及其具体实施方式
本发明的实施例结合附图进一步详细描述如下：
图1为本发明重组质粒pLIP的构建图。
图2为本发明重组低温脂肪酶的活性与pH值的关系曲线。
图3为本发明重组低温脂肪酶的活性与作用温度的关系曲线。
本发明的实施例体现了如下技术方案：研制的一种从嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因。该基因具有序列表中SEQ NO.1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列是由834bp组成的DNA片断，在该核苷酸序列中有H-G与G-X1-S-X2-G两个活性中心，该DNA片断测序结果：显示插入片断含有一个长834bp的开放阅读框架。
所述的嗜冷菌(Moriteila sp.)，其为采自于南极深海的嗜冷菌(Moritella sp.)，采集地点：66°00′S，70°30′E，采集温度：0.113℃，采集深度：1500m，深海水盐度：34.64‰。
一种从南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)分离的重组低温脂肪酶。该重组脂肪酶的氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少80-100％的同源性，该氨基酸序列是一个由278个氨基酸组成的蛋白质，在该核苷酸序列中的H-G与G-X1-S-X2-G两个活性中心周围的所对应氨基酸位点保守性很强，而对酶活的影响不大的其他氨基酸位点，可进行氨基酸位点的替换，插入或缺失；该重组酶的分子量为32000道尔顿，该重组酶的反应温度为0-30℃，反应pH值6-9。
一种转化从南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因的重组大肠杆菌DH5αLIP。该重组大肠杆菌DH5αLIP的保藏号为：CGMCC No.
1287，分类命名：大肠埃希氏菌，保藏日期：2005.01.07；该重组菌含重组质粒pLIP，插入的该质粒DNA片断的大小为3.5kb，该质粒pLIP中含有序列表中SEQ NO.1所示的834bp的DNA片断序列。
实施例1.
(一)南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因组DNA的提取：
按Ausubel等描述的方法(CTAB法)，将培养好的嗜冷菌培养液1.5ml每管分装于离心管中，8000rpm离心5分钟，每管加入567μl TE缓冲液(pH8.0)，反复吹打使之重悬，然后加入30μl 10％SDS混匀，再加入3μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于37℃温育2小时。加入100μl 5M NaCl混匀，80μl CTAB/NaCl混匀，65℃水浴温育10分钟。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)混合后，12000rpm离心15分钟。转移上清液于一新管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混合后离心。重复上述步骤直至界面无白色沉淀为止。加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃沉淀DNA过夜。再置于4℃，12000rpm离心15min。以70％的乙醇(预冷)洗涤DNA沉淀。溶于含RNA酶的pH 8.0的TE中，-20℃放置备用。
(二)脂肪酶基因的克隆：
取前面所述的总DNA溶液10μl(约50μgDNA)，用限制酶Sau3AI部分酶切，经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2～10kbDNA片断。取2μl(约5μgDNA)Sau3AI酶解DNA片断与1μl(1μg)经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pBluescript DNA在20μl连接体系内进行连接反应，其中含2μl(10×连接缓冲液)，1μ1T4DNA连接酶，14μl重蒸水。即连接到pBluescript载体上，得到重组质粒pLIP；
(三)转化含重组质粒pLIP的大肠杆菌DH5αLIP：
取-80℃保存的感受态大肠杆菌DH5α细胞一管置冰上融化，同时将1.5ml离心管和电转杯事先置冰上预冷30～60min；用预冷的移液管枪尖转移40μl感受态大肠杆菌DH5α细胞于预冷的1.5ml离心管中，小心加入1μl重组质粒pLIP的DNA，于冰上静置1～2min；转移至预冷的电转杯中，轻轻拍击该电转杯杯壁并确认没有气泡产生；
采用高压电穿孔转化法：设置伯乐电转化仪的参数值DNA浓度：50-100ng，按脉冲键一次；其中0.1cm杯对应电转化程序Ec1的电转条件：电压1.8kV，电容强度18kV/cm，脉冲时间5毫秒；0.2cm杯对应电转化程序Ec2的电转条件：电压2.5kV，电容强度12.5kV/cm，脉冲时间5毫秒；迅速将电转杯内的转化后的感受态大肠杆菌DH5α细胞，加入预冷的1ml LB培养液，于37℃，180～220rpm，培养1小时后准备涂布平板；将转化感受态大肠杆菌DH5α后，涂于含50μg/mlAmp(氨苄青霉素)，橄榄油与聚乙烯醇(PVA)的LB固体培养基上，25℃培养至长出肉眼可见的菌落，然后在4℃培养4天，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆。阳性克隆在Amp-LB培养基中25℃培养2天，经活性测试具有低温脂肪酶活性。对阳性菌落采用碱法提取重组质粒，用各种限制酶水解重组质粒，根据电泳结果证实有DNA片断插入质粒，其大小约为4kb。含该DNA片断的重组质粒称为pLIP，含此重组质粒的重组大肠杆菌称为大肠杆菌DH5αLIP。
此重组质粒可高频转化大肠杆菌表达脂肪酶活性和抗氨苄性能。将重组质粒中的DNA插入片断用地高辛DNA标记检测试剂盒标记，与嗜冷菌(Moritella sp.)的染色体DNA进行Southern blot DNA杂交实验，证实重组质粒pLIP中插入的DNA片断来自嗜冷菌(Moritella sp.)的染色体DNA。
采用Sanger双脱氧法对此DNA片断进行了测序。测序结果显示插入片断含有一个长834bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个由278个氨基酸组成的蛋白质。
实施例2.
本发明的重组大肠杆菌DH5αLIP表达的条件为：25℃培养；获得的重组菌E coli DH5αLIP的菌体悬于的菌体悬于磷酸缓冲液(pH7)中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组脂肪酶的粗酶液。此上清液70℃加热15min，离心去除变性蛋白，上清酶液经离子交换柱层析，羟基磷灰石吸附柱层析和PAGE制备电泳等步骤进行纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。利用已知的蛋白质化学标准方法测定此重组脂肪酶的基本特性。用SDS-PAGE测得的重组酶的分子量为32000道尔顿，与理论上推测的分子量(32800道尔顿)相似。获得的重组酶经活性测定，参照《生物化学实验原理和方法》中脂肪酶的测定方法。该重组大肠杆菌DH5αLIP的酶蛋白具有低温脂肪酶活性，反应的作用温度为0℃-30℃，最适作用温度为30℃，在0℃仍可保持37％的相对酶活；该重组酶作用pH6～9的性质，如附图中的图2，图3所示。
实施例3.
应用本发明的重组大肠杆菌DH5αLIP表达的重组脂肪酶水解橄榄油：
向50％的橄榄油溶液(用pH 7，0.2M的磷酸缓冲液配制)，加适量重组脂肪酶液，在30℃保温，以每分钟200转搅拌16h。色谱法测得油相含有脂肪酸，水相含有甘油，说明重组脂肪酶可水解橄榄油产生甘油和脂肪酸。
实施例4.
对本发明的重组低温脂肪酶提交ExPASy服务器执行BLAST进行同源性搜索，最终筛选到13条脂肪酶的氨基酸序列作为作为同源性分析的原始数据，序列相关信息见表1。
表1 同源性检索搜索到的相关脂肪酶序列
Table 1 lipase sequences by Blast searching
| 来源物种拉丁文名称 | Accession number | 来源 |
| Chlorobium tepidum | Q8KCU8 | Eisen，2002 |
| Sulfolobus acidocaldarius | 073957 | Arpigny，1998 |
| Psychrobac ter immobilis | Q02104 | Arpigny，1993 |
| Vibrio cholerae | Q9KQA3 | Heidelberg，2000 |
| Haemophilus influenzae | Q57427 | Fleischmann，1995 |
| Methanosarcina ace ti vorans | Q8TMG8 | Galagan，2002 |
| uncultured proteobacterium | Q8KZ32 | Beja，2002 |
| uncultured bacterium 442 | AAR37801 | DeLong.2003 |
| Streptococcus sp | Q93MV2 | Tripathi，2001 |
| Salmonella typhi | Q8Z8F2 | Parkhill，2001 |
| Mycoplasma pulmonis | Q98RH2 | Chambaud，2001 |
| Mycoplasma gallisepticum | Q7NBQ1 | Papazisi，2003 |
| Thermotoga maritima | Q9X171 | Nel son，1999 |
对上述13条氨基酸序列利用Bioedit软件进行比对分析结果如附后所示氨基酸序列。
从同源性分析比对的结果可以看出，本发明的重组低温脂肪酶基因序列之间的保守性较低，但活性位点的保守性很强，在这些活性位点周围的氨基酸序列保守性也比较大，如图中H-G与G-X1-S-X2-G两个活性中心为所有脂肪酶所共有，且其周围的氨基酸保守性也很强。其他位点的氨基酸对酶活的影响不大，可进行替换，插入或缺失。
本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。
本发明的低温脂肪酶基因的序列表：
SEQ NO.1
<110>国家海洋局第一海洋研究所
<120>从南极深海嗜冷菌分离的低温脂肪酶基因序列及其表达重组菌株
<130>DNA
<140>Moritella sp.
ATG TCA GAA GTC TTC GCC ACA AAA ATT AAA AGT GTA AGC CAC CAC 45
ACA GAG TTA CAT GTC GAT ATT GTC GGT GAC GGC CCA GAC TTA GTG 90
TTA TTA CAT GGC TGG GGA TTA AAT AGC GCG TGC TGG CAA TCT ATT 135
GTT CCG TCA CTA TCT GCG CAT TAT CGA TTA CAT TTA GTT GAT CTA 180
CCT GGT TTT GGT TTT AGT CAT GAT AGT TAT TTT GCG AGT CGG TCG 225
CTG GCT GAT ATT ACT GAT GCA TTA GTT AAA GTT GTA CCT GAC AAT 270
GCC GTT TGG TTG GGT TGG TCG TTG GGT GGG TTG TGC GCT ACT CAT 315
TTT GCG CTA GTG CAT CCC CAA CGA GTT TCT GCA TTG GTG ACA GTC 360
GCC AGT TCA CCT AAA TTC ATG GCT ACA TCA CAA GTG AAT GAA TCA 405
GCA GCT TGG CCT GGT ATT GCT GGA AAA GTA TTA GCG CAA TTC CAA 450
CAA CAG CTA AAA CAG AAT CTA TCA CAA ACT ATT AAT CGT TTT TTA 495
GCC ATT CAA GCG ATG GGC AGT GAA ACG GCT AAA CAA GAC ATT AAA 540
CAA TTA AAG TCT TTA TTA GCG GCA CGT CCG CAG CCG CAT GAA CAA 585
GCA TTA AGT AAC GGT TTA CGA TTA TTA GAG ACG GTG GAC TTA CGC 630
GGG CAG TTA GCT TCG TTA ACA ATG CCA TTT TAT CGC TGC TAT GGT 675
CGG TTA GAT TCG CTG GTG CCG CAA GCT ACA GTG GTG TGG ATG GAC 720
CGT TAT CTA CCG CAA TCA CCG AGT CTT ATA TTT AAA GCT TCT TCT 765
CAT GCG CCT TTT ATT TCA GAA CCG ATA CTT TTT GTT AAT AAA CTG 810
CAG GCA TTT ATT AA 834
本发明的低温脂肪酶氨基酸的序列表：
SEQ NO.2
<210>2
<211>PRT
<212>Moritella sp.2-5-10-1
Met Ser Glu Val Phe Ala Thr Lys Ile Lys Ser Val Ser His His 15
Thr Glu Leu His Val Asp Ile Val Gly Asp Gly Pro Asp Leu Val 30
Leu Leu His Gly Trp Gly Leu Asn Ser Ala Cys Trp Gln Ser Ile 45
Val Pro Ser Leu Ser Ala His Tyr Arg Leu His Leu Val Asp Leu 60
Pro Gly Phe Gly Phe Ser His Asp Ser Tyr Phe Ala Ser Arg Ser 75
Leu Ala Asp Ile Thr Asp Ala Leu Val Lys Val Val Pro Asp Asn 90
Ala Val Trp Leu Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu Cys Ala Thr His 105
Phe Ala Leu Val His Pro Gln Arg Val Ser Ala Leu Val Thr Val 120
Ala Ser Ser Pro Lys Phe Met Ala Thr Ser Gln Val Asn Glu Ser 135
Ala Ala Trp Pro Gly Ile Ala Gly Lys Val Leu Ala Gln Phe Gln 150
Gln Gln Leu Lys Gln Asn Leu Ser Gln Thr Ile Asn Arg Phe Leu 165
Ala Ile Gln Ala Met Gly Ser Glu Thr Ala Lys Gln Asp Ile Lys 180
Gln Leu Lys Ser Leu Leu Ala Ala Arg Pro Gln Pro His Glu Gln 195
Ala Leu Ser Asn Gly Leu Arg Leu Leu Glu Thr Val Asp Leu Arg 210
Gly Gln Leu Ala Ser Leu Thr Met Pro Phe Tyr Arg Cys Tyr Gly 225
Arg Leu Asp Ser Leu Val Pro Gln Ala Thr Val Val Trp Met Asp 240
Arg Tyr Leu Pro Gln Ser Pro Ser Leu Ile Phe Lys Ala Ser Ser 255
His Ala Pro Phe Ile Ser Glu Pro Ile Leu Phe Val Asn Lys Leu 270
Gln Ala Phe Ile Asn Asn Ser Leu *** 278
本发明的重组低温脂肪酶的氨基酸序列同源性分析比对结果：
Fig Alignment of amino acid sequences from different mieroorganisms(各序号所代表的氨基酸序列为：0-13：2-5-10-1；Chlorobium tepidum；Sulfolobusacidocaldarius；Psychrobac ter immobilis；Vibrio cholerae；Haemophilus influenzae；unculturedproteobacterium；unculturedbacterium 442；Streptococcussp.；Salmonellatyphi；Methanosarcina acetivorans；Mycoplasma pulmonis；Mycoplasma gallisepticum；Thermotoga maritime.Co：保守域)。
Claims (5)
1、一种从嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因，其特征在于：该基因具有序列表中SEQ NO.1所示的核苷酸序列，该核苷酸序列是由834bp组成的DNA片断，在该核苷酸序列中有H-G与G-X1-S-X2-G两个活性中心，该DNA片断测序结果：显示插入片断含有一个长834bp的开放阅读框架。
2、根据权利要求1所述从嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因，其特征在于：所述的嗜冷菌(Moritella sp.)，其为采自于南极深海的嗜冷菌(Moritella sp.)，采集地点：66°00′S，70°30′E，采集温度：0.113℃，采集深度：1500m，深海水盐度：34.64‰。
3、一种从南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)分离的重组低温脂肪酶，其特征在于：该重组脂肪酶的氨基酸序列与SEQ NO.2所示的氨基酸序列具有至少80-100％的同源性，该氨基酸序列是一个由278个氨基酸组成的蛋白质，在该核苷酸序列中的H-G与G-X1-S-X2-G两个活性中心周围的所对应氨基酸位点保守性很强，而对酶活的影响不大的其他氨基酸位点，可进行氨基酸位点的替换，插入或缺失；该重组酶的分子量为32000道尔顿，该重组酶的反应温度为0-30℃，反应pH值6-9。
4、一种转化从南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)分离的低温脂肪酶基因的重组大肠杆菌DH5αLIP，其特征在于：该重组大肠杆菌DH5αLIP的保藏号为：CGMCC No.
1287，分类命名：大肠埃希氏菌，保藏日期：2005.01.07；该重组菌含重组质粒pLIP，插入的该质粒DNA片断的大小为3.5kb，该质粒pLIP中含有序列表中SEQ NO.1所示的834bp的DNA片断序列。
5、一种根据权利要求4所述转化的重组大肠杆菌DH5αLIP的制备方法，其特征在于：所述的方法步骤如下：
一、南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因组DNA的提取：
(1)按十六烷基三甲基溴化铵法，将培养好的南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)培养液按每管1ml～5ml分装于1.5ml～10ml离心管中；
(2)以8000rpm离心5～10min，取沉淀；
(3)每管加入567μl pH8.0的TE缓冲液，反复吹打使之重悬；
(4)然后每管加入30μl的10％SDS混匀，再3μl 20mg/ml蛋白酶K，混匀，于37℃温育2～3小时；
(5)每管加入100μl的5mol/L NaCl混匀，再每管加入80μl的十六烷基三甲基溴化铵/NaCl混匀，65℃水浴温育10～20min；
(6)每管加入等体积的、体积比为24∶1的氯仿/异戊醇，混合后，再12000rpm离心15～20min，将上清液转入新管中；
(7)每管加入等体积的、体积比为25∶24∶1的酚/氯仿/异戊醇，混合后离心；重复上述步骤直至界面无白色沉淀为止；
(8)转移上清液于另一新管中，加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃过夜，再置于4℃，12000rpm离心15min～25min。以预冷的70％的乙醇洗涤DNA沉淀，取沉淀；
(10)取沉淀溶于含RNA酶的pH 8.0的TE缓冲液中，制成的南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因总DNA溶液，-20℃放置备用；
二、脂肪酶基因的克隆：
(1)取上述一、(10)步的南极深海嗜冷菌(Moritella sp.)基因总DNA溶液10～20μl，用限制酶Sau3AI部分酶切；
(2)经琼脂糖凝胶电泳，电洗脱回收2～10kbDNA片断；
(3)取2～4μl的经Sau3AI酶解的DNA片断；
(4)取1～2μl经BamHI酶解并脱磷酸化的质粒pBluescript DNA；
(5)在20μl连接体系内进行连接反应，该连接体系中含2μl的10×连接缓冲液，1μl的T4DNA连接酶，重蒸水补足20μl；该连接体系在16℃反应10～16h，即连接到pBluescript载体上，得到重组质粒pLIP；
三、转化含重组质粒pLIP的大肠杆菌DH5αLIP：
(1)取-80℃保存的感受态大肠杆菌DH5α细胞一管置冰上融化，同时将1.5ml离心管和电转杯事先置冰上预冷30～60min；
(2)用预冷的移液管枪尖转移40μl感受态大肠杆菌DH5α细胞于预冷的1.5ml离心管中，小心加入1μl重组质粒pLIP的DNA，于冰上静置1～2min；
(3)转移至预冷的电转杯中，轻轻拍击该电转杯杯壁并确认没有气泡产生；
(4)采用高压电穿孔转化法：设置伯乐电转化仪的参数值DNA浓度：50-100ng，按脉冲键一次；其中0.1cm杯对应电转化程序Ec1的电转条件：电压1.8kV，电容强度18kV/cm，脉冲时间5毫秒；0.2cm杯对应电转化程序Ec2的电转条件：电压2.5kV，电容强度12.5kV/cm，脉冲时间5毫秒；
(5)迅速将电转杯内的转化后的感受态大肠杆菌DH5α细胞，加入预冷的1ml LB培养液，于37℃，180～220rpm，培养1小时后准备涂布平板；
(6)将转化的感受态大肠杆菌DH5α细胞，涂于含50μg/ml的氨苄青霉素Amp和三丁酸甘油酯的LB固体培养基上；
(7)在25℃培养至长出肉眼可见的菌落，然后在4℃培养2～4天，菌落周围有透明圈的即为阳性克隆；
(8)取该阳性克隆在Amp-LB培养基中25℃培养2天，培养液经活性测试该阳性克隆具有低温脂肪酶活性；
(9)对该阳性克隆菌落采用碱裂解法提取其重组质粒，用BamHI水解重组质粒；
(10)经电泳结果证实，该阳性克隆菌落有DNA片断插入质粒pLIP，含此重组质粒pLIP的重组大肠杆菌，即为转化的重组大肠杆菌DH5αLIP，其保藏号为：CGMCC No.1287，保藏日期：2005.01.07。
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