CN1807603A - 一种低热原葡激酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程制药领域，提供了一种低热原的葡激酶(Staphylokinase，SAK)及其制备该葡激酶的方法。该葡激酶热原低、纯度高、活性强，完全符合药用要求。本发明制备方法包括以下步骤：a.将含葡激酶的原料破碎离心，取上清液；b.将步骤a产物用DEAE凝胶柱穿滤，除盐，浓缩；c.将步骤b产物过CM凝胶柱，收集样品峰，浓缩洗脱液并转换介质；d.将步骤c产物用Q凝胶柱穿滤后，得葡激酶原液。该方法步骤简便，成本低廉，效果可靠，能够大规模应用。由本发明葡激酶制备成的制剂经研究证实具有良好的溶栓效果，并且没有任何与热原相关的不良反应出现，安全有效，具有良好的市场前景。

Description

一种低热原葡激酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程制药领域，具体地说是涉及一种葡激酶(Staphylokinase，SAK)的制备方法。

背景技术

众所周知，药物中热原的含量直接影响药物使用的安全性，而基因工程药物、微生物来源药物以及其它生化药物由于其来源的特殊性，其中的热原去除和控制一直是其生产和使用中的关键问题。主要的热原物质内毒素在高温、强酸、强碱下都颇稳定，传统的加热、蒸馏、过滤、反相渗透、活性碳粉、各种柱层析方法只能去除或灭活部分内毒素。多数方法都很难将内毒素一次性彻底去除，甚至经过多个步骤后，仍达不到临床要求。而且由于内毒素的性质极不均一，很难找到一种针对性的去除热原的方法(陈昕  下游层析工艺中热原的去除  中国生物工程杂志2002年第4期100-104)。目前基因工程药物生产中热原去除的主要原则是在目标产物纯化过程中尽可能将内毒素除去，尽量不添加额外的除热原步骤和化学制剂。

葡激酶是金葡菌溶源性噬菌体合成的一种胞外蛋白质(de Waart.J.，K.C.Winkler and C.Grootsen Nature 1962，195：407～408 Winkler K.C.，deWaart.J.，and C.Grootsen J.Gen.Microbiol.1965，39：321～333 Kondo.I.，Kiyotaka F.，Infection and Immunity 1977，18：266～272)。由于金葡菌合成和分泌葡激酶水平低、纯化困难及早期在动物模型狗溶栓试验中发生大出血现象等原因，使得葡激酶的临床使用受到限制。迫切需要符合临床用药安全、可控的低热原葡激酶。

目前公开的葡激酶生产制备的方法主要有：

一、国外文献中报道的方法

1、采用CM-cellulose柱层析方法氯化钠连续梯度洗脱一步纯化(Sako TOverproduction of staphylokinase in Escherichia coli and its characterization.FEBS.1985，149(3)：557-63)，SDS-PAGE纯度在90％左右，内毒素含量未报道。

2、采用离子交换层析和分子筛方法纯化(Gerlach D，Kraft R，Behnke DPurification and characterization of the bacterial plasminogen activatorstaphylokinase secreted by a recombinant Bacillus subtilis.Zentralb BakteriolMikrobiol Hyg [A].1988，269(3)：314-22.)，SDS-PAGE纯度在90％左右，内毒素含量未报道。

3、采用SP-Sepharose和Phenyl-Sepharose层析两步纯化方法(Schlott B，Hartmann M，Guhrs KH，etal.Biotechnology 1994，12(2)：185-9.)，SDS-PAGE纯度在95％以上，内毒素小于10Eu/mg。

4、采用金属离子柱方法一步纯化(纯化N端缺失10个氨基酸的葡激酶)(Chattopadhyay D，Stewart JE，DeLucas LJ.Large-scale preparation of the delta10form of staphylokinase by in vitro processing of recombinant staphylokinase withpurified human plasminogen.Appl Biochem Biotechnol.1998，69(3)：147-56.)。

二、国内文献报道的主要纯化方法

1、CN1096325A，菌体破菌用S-Sepharose离子交换，再结合分子筛方法纯化SDS-PAGE纯度为90～99％。

2、CN1307129A，主要使用了两步柱层析(SP-Sepharose F.F，和Phenyl-Sepharose F.F)纯化，未报道纯度及内毒素含量。

3、CN1394952A，菌体破菌后用50KD超滤膜除杂蛋白，加入NaCL，直接在Phenyl-Sepharose H.P疏水层析柱上经梯度纯化。所纯化的葡激酶为N-端缺失10个氨基酸的衍生物，其纯度可达95％以上(电泳纯)。

4、CN1511952A，菌体破菌用100KD超滤膜除杂蛋白，滤出液上pH8.0PB直接在Q-Sepharose F.F柱上经0.25M NaCL洗脱纯化，所纯化的葡激酶为N-端缺失15个氨基酸的衍生物。其电泳纯度和HPLC纯度均可达98％以上

5、CN1446912A，使用了阴离子交换层析(Q-Sepharose F.F)穿滤、阳离子交换层析(SP-Sepharose F.F)、凝胶过滤层析(Sephacryl S-200)三步连用，纯化重组葡激酶，结果为最终洗脱液电泳检测无杂条带。

以上的纯化方法仅仅在于提高葡激酶的纯度，对本领域技术人员来说，针对基因工程药物、微生物来源药物以及其它生化药物，尤其针对葡激酶，同时达到高纯度、低热源，目前尚无合适的方法报道。

发明内容：

本发明的本发明的第一个目的是提供一种葡激酶(Staphylokinase，SAK)。该葡激酶的内毒素含量小于3Eu/mgSAK(“Eu/mgSAK”表示每mg的SAK中的内毒素的含量)。

进一步的，该葡激酶的内毒素含量等于或小于1Eu/mgSAK。

更进一步的，该葡激酶的HPLC纯度等于或大于90％。

第二个目的是提供一种制备上述葡激酶的方法。该方法包括以下步骤：

a、将含葡激酶的原料破碎离心，取上清液；

b、将步骤a上清液用DEAE凝胶柱穿滤，收集滤液，除盐，浓缩；

c、将步骤b浓缩液过CM凝胶柱，收集含葡激酶样品峰的洗脱液，浓缩；

d、将步骤c浓缩液用Q凝胶柱穿滤，收集滤液，浓缩、干燥，即得。

进一步的，上述的DEAE凝胶柱为DEAE-Sepharose F.F柱、CM凝胶柱为CM-Sepharose F.F柱、Q凝胶柱为Q-Sepharose F.F柱。

更进一步的，上述的各种凝胶柱中的层析介质的粒径为50～150μm。

优选的，上述的各种凝胶柱中的层析介质的粒径为70～120μm。

更进一步的，上述方法包括以下步骤：

a、将原料破碎离心后的上清液超滤除盐，将滤液转换介质为磷酸缓冲液，浓缩；

b、将步骤a浓缩液用DEAE-Sepharose F.F柱穿滤，流动相为磷酸缓冲液，将滤液浓缩；

c、将步骤b浓缩液转换介质为NaAc-HAc缓冲液，过CM-Sepharose F.F柱，再以NaAc-HAc缓冲液洗脱，收集样品峰所在的洗脱液后浓缩；

d、将步骤c滤液转换介质为含NaCL的磷酸缓冲液，用Q-Sepharose F.F穿滤，将滤液浓缩、干燥，即得；

上述各步骤中流动相的流速为5～35ml/min。

更进一步的，上述方法中：

a步骤中所述的磷酸缓冲液为pH8.0的8～12mM磷酸缓冲液；

b步骤中所述的磷酸缓冲液为pH8.0的8～12mM磷酸缓冲液；

c步骤中所述的NaAc-HAc缓冲液为18～12mM的NaAc-HAc缓冲液，pH5.0～6.0；

d步骤中所述的含NaCL的磷酸缓冲液为含0.10～0.35mol/L NaCL的20mM磷酸缓冲液，pH7.0；

上述步骤中流动相过凝胶柱时的流速为5～30ml/min。

本发明的第三个目的是提供一种治疗急性心肌梗死或血栓性疾病的药物组合物，它是由上述的葡激酶添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的制剂。

进一步的，上述的药物制剂的剂型为注射制剂或口服制剂。

本发明中方法中用于制备葡激酶的原料是各种常见的能表达葡激酶的工程菌或能分泌表达葡激酶的野生型菌株，如：抗生素检定用金葡球菌。本发明低热原葡激酶是重组葡激酶、天然葡激酶或其突变体。本发明中超滤步骤可以选用截留分子量为5000道尔顿的超滤膜。

本发明方法中所使用的层析柱均为在市场上销售的常规层析柱，使用的各种层析柱填料也是蛋白质纯化制备领域中常用的填料，均按常规方法装柱或购买预装柱。在本发明方法中自DEAE-Sepharose F.F穿滤步骤后所使用的其它溶液均为无热原溶液，所使用的仪器设备也要经过无热原处理和检验，以确保不会在制备过程中产生新的热原物质。本发明方法缓冲液的流速是常规流速，可以做适当调整。本方法各步骤持续的时间可以根据层析柱体积，缓冲液流速，上样量等具体情况按常识进行适当调整。

本发明方法步骤b中的DEAE凝胶柱穿滤或步骤d中的Q凝胶柱穿滤中所述的穿滤是指目的蛋白在此步骤中主要存在于穿出的液体中，而在层析介质上不能结合或结合极少，这时应收集穿出的滤出液作为该步骤的目标产物。

本发明葡激酶与药学上中可以接受的相应药用辅料或载体等辅助添加成分组合，并按相应的相应制药方法加工，可制成为相应的剂型的药物制剂。例如，与注射药物中允许使用的适当溶剂和/或附加剂配合并按相应的工艺操作处理后，即可以制备成相应的水针、粉针或冻干制剂等肌肉或静脉形式的注射制剂药物。与药学上可以被接受的崩解剂、赋形剂、润滑剂、粘合剂、填充剂等常用的辅助添加成份混合后，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为片剂、丸剂、胶囊剂或适当形式的缓释剂、控释剂等固体制剂形式的口服制剂；与常用的增溶剂、乳化剂、润湿剂、起泡或消泡剂等表面活性剂、稀释剂、防腐剂、稳定剂、矫味剂、增稠剂等混合，按相应的常规工艺方法处理，即可制成为水剂、糖浆等液体制剂形式的口服药物或口含制剂。

本发明葡激酶可按下述步骤制备成冻干制剂。按葡激酶蛋白量的1.5～3.0倍加入15％～30％注射用人白蛋白，并用无热原0.15M NaCL pH7.020mM磷酸缓冲液定容，配制成5mg/ml的r-Sak蛋白液，用无热原0.22μm膜过滤后即得半成品，检测内毒素含量符合药用要求后，在100级洁净度下，1ml/瓶分装，冷冻干燥，包装即得成品。

本发明的有益效果在于：本发明葡激酶热原低、纯度高、活性强，整体品质优于目前公开的产品，并且完全符合《中国药典》2005版第三部对该类产品的相关要求。本发明方法明确了纯化制备葡激酶的合适的凝胶柱种类和这些凝胶柱的最佳使用顺序，同时对使用方法进行了优化，使用本发明方法既能高效去除热原，又能同时纯化产品。该方法步骤简便，材料设备易得，成本低廉，效果可靠，是一种优秀的葡激酶制备方法，能够大规模应用。本发明葡激酶添加药学上可以接受的辅助性成分所制备的治疗急性心肌梗死或血栓性疾病的药物制剂，经临床研究证实具有良好的溶栓效果，并且没有任何与热原相关的不良反应出现，是一种安全有效的治疗急性心肌梗死或血栓性疾病的药物，具有很好的市场前景。

附图说明

附图1为重组葡激酶质粒pBV220/Sak构建示意图

附图2为DEAE-Sepharose F.F穿滤收集样品的电泳图其中：上为上柱样品，1-6号为穿透样品，合并2、3号收集样。

附图3为CM-Sepharose F.F纯化样品的电泳图其中：1，纯化样品；2，标准蛋白分子量

附图4为Q-Sepharose F.F穿滤的层析图。

下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的详细描述对本发明进行说明。但这种说明不应理解为是对本发明的限制，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的技术思想，均属于本发明权利要求所定义的范围。

具体实施方式

实施例一  工程菌的制备

以能分泌葡激酶的金黄色葡萄球菌全DNA为模板，以引物1、2为作PCR扩增：引物1(SEQ ID NO.1)：5’GGT GAA TTC ATG TCA AGT TCA TTC GAC AA3’；

引物2(SEQ ID NO.2)：5’GGA GGA TCC TTA TTT CTT TTC TAT AAC AA 3’。

引物1包含EcoR I位点，引物2包含BamH I位点，得到葡激酶基因，该葡激酶基因的DNA序列(5’至3’)见表1：

表1 葡激酶基因的DNA序列(SEQ ID NO.3)

Tcaagttcat tcgacaaagb aaaatataaa     30

aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca     60

acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact     90

ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta    120

tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa    150

cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt    180

gaatactatg tcgaatggga cttagatgcg    210

acagcatata aagagtttad agtagttgaa    240

ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact    270

tattttgata agaataagaa aaaagaagaa    300

acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt    330

tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt    360

aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag    390

gttgttatag aaaagaaa                 408

该DNA序列所编码的氨基酸序列(N端至C端)见表2：

表2葡激酶氨基酸序列(SEQ ID NO.4)

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1               5                   10                  15

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

            20                  25                  30

Glu Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro

        35                  40                  45

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

     50                 55                  60

Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Phe Asp Lys Asn Lys

                85                  90                  95

Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val

            100                 105                 110

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

        115                 120                 125

Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys

  130                   135

将得到的基因进行测序分析确认无误后，克隆到pBV220载体上，插入位点为EcoR I-BamH I，构建质粒pBV220/Sak(构建流程如图1所示)。或者可利用现有常规分子生物学技术合成得到如SEQ ID NO.3所示的DNA。

将制备得到的重组载体用常规方法导入大肠杆菌DH5a以构建重组葡激酶以可溶形式存在于菌体内的基因工程菌，筛选出组建成功的基因工程菌。经稳定性测定和N-末端15个氨基酸分析测定正确后，保存r-SAK表达量不低于25％的工程菌，作为生产用工程菌菌种，并以甘油菌或牛奶冻干菌种形式保存。

将1ml由甘油保存的工程菌种子，接种于400mlLB培养基(含氨苄青霉素100μg/ml)中，在250rpm摇床上，30℃下培养至A6002.0左右，再接种到3600mlLB培养基中同前培养至A6003.0左右作为种子液接种于装有36L的高密度发酵培养基的B.Braun D50发酵罐中，控制pH在7.0左右、溶氧在15～75％、温度30℃培养至A60015.0左右，快速升温至42℃诱导同前培养3～4小时。离心(5～15℃、5000rpm)收集细菌。

实施例二  葡激酶的制备

1、材料和设备

破菌工具：匀质机；

超滤系统：Millipore Pellicon 0.5m²×3，膜截留分子量为5000；

SDS-PAGE电泳扫描仪：DS-700Bio-Rad；

层析柱：50×400mm、100×400mm上海亚荣生化仪器厂；

层析介质：DEAE-Sepharose F.F、CM-Sepharose F.F、Q-Sepharose F.F均为Pharmacia Biotech产品，颗粒直径均为90μm。

层析检测系统：紫外检测仪(HD-93-1型)上海金达生化仪器厂。

2、制备过程

取发酵所得的湿重为1610g工程菌，用10000ml pH8.010mM磷酸缓冲液悬浮菌体，破菌后得上清液9000ml，上清液经SDS-PAGE电泳扫描r-SAK含量为36.9％，蛋白浓度16.60mg/ml，总蛋白量为149400mg，r-SAK含量为55129mg。

将上述上清液用15％(NH₄)₂SO₄沉淀处理后，经超滤(5KD)除盐、转换介质为pH8.010mM磷酸缓冲液。浓缩至1500ml，蛋白浓度为86mg/ml(总蛋白量129000mg)。

DEAE-Sepharose F.F穿滤

层析柱规格为100×400mm(上海亚荣生化仪器厂)、DEAE-Sepharose F.F柱高300mm、流动相为pH8.0的10mM磷酸缓冲液(流速10ml/min)。收集穿透样品，根据凝胶电泳结果合并葡激酶样品，得3000ml溶液，浓度35mg/ml(总蛋白量105000mg)。超滤除盐浓缩并转换介质为20mM的NaAc-HAc缓冲液，pH为5.0。凝胶电泳结果见图1(其中：“上”为上柱样品，1-6号为穿透样品，合并2、3号样品)。

CM-Sepharose F.F纯化层析柱：50×400mm(上海亚荣生化仪器厂)、CM-Sepharose F.F柱高200mm、流动相pH5.0～6.020mM NaAc-HAc缓冲液(流速20ml/min)。先用含0.15mol/L NaCl流动相洗杂蛋白，再用含0.3mol/L NaCl流动相洗脱，收集洗脱峰，得2400ml蛋白溶液，浓度为10.1mg/ml，总蛋白量为24240mg。CM样品超滤浓缩并转换介质为含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸缓冲液，体积1500ml。结果见图2

Q-Sepharose F.F穿滤  层析柱为100×400mm(上海亚荣生化仪器厂)、Q-Sepharose F.F柱高250mm、流动相含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸缓冲液(流速5ml/min)。收集穿透样品峰(见图3)。

经过上述步骤得样品2510ml，是蛋白浓度为8.8mg/ml的原液，其葡激酶纯化得率为40.1％(各步纯化效果对比见表3)

                            表3  各步纯化效果对比

步骤	体积(ml)	蛋白浓度(mg/ml)	蛋白量(mg)	葡激酶量(mg)	得率
						破菌上清	9000	16.60	149400	55129
DEAE-Sepharose F.F穿滤	3000	35.00	105000
						CM-Sepharose F.F纯化	2400	10.10		24240
Q-Sepharose F.F穿滤	2510	8.8		22088	40.1％

纯化所得蛋白产品质量检测项目和结果见表4

                           表4  产品质量检验结果

项目	指标	检定结果
			比活性(Au/mg)	≥4.0×104	5.1×104
电泳纯度	≥95.0％	100
			HPLC纯度	≥95.0％	99.15
分子量(KD)	15.0±10％	14.8
			外源性DNA残留量	＜100pg/剂量	符合规定
宿主菌蛋白残留量	＜0.1％	符合规定
			残余抗生素活性	阴性	阴性
细菌内毒素含量(Eu/mg)	＜3	0.5Eu/mg
			等电点(主区带)	5.5～7.5	6.2
紫外光谱扫描(nm)	λMax；277±3	278
			N-端氨基酸序列(15个)	SSSFDKGKYKKGDDA	SSSFDKGKYKKGDDA
肽图	符合r-SAK图形	符合要求

检测或测定方法均采用《中国药典》2005版三部附录所收录的同种方法。检测结果表明本实施例制得的葡激酶均符合相关要求。

实施例三  葡激酶的制备

1、材料和设备(同实施例二)

2、制备过程

取湿重为800g的工程菌，用5500ml pH8.010mM磷酸缓冲液悬浮菌体，破菌后得上清液5000ml，上清液经SDS-PAGE电泳扫描r-SAK含量为38.9％，蛋白浓度10.40mg/ml，总蛋白量为52000mg，r-SAK含量为20228mg。

将上述上清液用15％(NH₄)₂SO₄沉淀处理后，经超滤(5KD)除盐、转换介质为pH8.010mM磷酸缓冲液。浓缩至1000ml，蛋白浓度为43.4mg/ml(总蛋白量43400mg)。

DEAE-Sepharose F.F穿滤  层析柱：100×400mm(上海亚荣生化仪器厂)、DEAE-Sepharose F.F柱高300mm、流动相pH8.0 10mM磷酸缓冲液(流速15ml/min)。收集穿透样品，根据凝胶电泳结果合并葡激酶样品，得2100ml溶液，浓度16.8mg/ml(总蛋白量35280mg)。超滤除盐浓缩并转换介质为20mM NaAc-HAc缓冲液，pH5.0。

CM-Sepharose F.F纯化  柱层析：50×400mm(上海亚荣生化仪器厂)、CM-Sepharose F.F柱高200mm、流动相为pH5.0～6.020mM NaAc-HAc缓冲液。先用含0.15mol/L NaCl流动相洗杂蛋白，再用含0.3mol/L NaCl流动相洗脱(流速15ml/min)，收集洗脱峰，得1100ml蛋白溶液，浓度为8.2mg/ml，总蛋白量为9020mg。CM样品超滤浓缩并转换介质为含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸缓冲液，体积为700ml。

经Q-Sepharose F.F穿滤  层析柱：100×400mm(上海亚荣生化仪器厂)、Q-Sepharose F.F介质柱高250mm、流动相含0.15mol/L NaCL pH7.020mM磷酸缓冲液(流速25ml/min)。得样品790ml，浓度10.57mg/ml的蛋白原液。

上述步骤持续的时间在不同情况下根据上样量、缓冲液流速的变化等会有所变化。本实施例经过上述步骤后的葡激酶纯化得率为41.2％(各步纯化效果对比见表5)

                        表5  各步骤纯化效果对比

步骤	体积(ml)	蛋白浓度(mg/ml)	蛋白量(mg)	葡激酶量(mg)	得率
						破菌上清	5000	10.40	52000	20228
DEAE-Sepharose F.F穿滤	2100	16.80	35280
						CM-Sepharose F.F纯化	1100	8.20		9020
Q-Sepharose F.F穿滤	790	10.57		8350	41.2％

纯化所得蛋白产品质量检测项目和结果见表6。检测或测定方法均采用《中国药典》2005版三部附录所收录的同种方法。检测结果表明本实施例制得的葡激酶均符合相关要求。

                    表6  产品质量检验结果

项目	指标	检定结果
			比活性(Au/mg)	≥4.0×104	5.8×104
电泳纯度(％)	≥95.0	98.1
			HPLC纯度(％)	≥95.0	99.4

分子量(KD)	15.0±10％	14.7
			外源性DNA残留量	＜100pg/剂量	符合规定
宿主菌蛋白残留量(％)	＜0.1	符合规定
			残余抗生素活性	阴性	阴性
细菌内毒素含量(Eu/mg)	＜3	0.5Eu/mg
			等电点(主区带)	5.5～7.5	6.1
紫外光谱扫描(nm)	λMax：277±3	277
			N-端氨基酸序列(15)	SSSFDKGKYKKGDDA	SSSFDKGKYKKGDDA
肽图	符合r-SAK图形	符合规定

实施例四  本发明制备的葡激酶的热原含量验证实验

取上述实施例二第二步所得产物和最后一步所得产物参照《中国药典》三部相关内毒素测定方法鲎试剂法(0.5Eu/ml)进行热原测定，结果见表7。

                            表7  热原验证实验结果

样品	原液稀释倍数
							0	2	4	8	16	32
	Q-Sepharose F.F穿滤前产物	+	+	-	-	-							-
Q-Sepharose F.F穿滤后产物							-	-	-	-	-	-

在基因工程蛋白质药物的制备过程中，每一步都要注意热原。由表5可见，在经过本发明方法前两步的处理之后，葡激酶原液的热原物质含量已经很低，多数的内毒素已经被去除，但还是不能达到药典的内毒素控制要求，并且残余的少量内毒素极难去除。在前面步骤的基础上，最后一步的Q-Sepharose F.F穿滤可以把剩余的内毒素去除至很低的水平，使产品热原达到要求，是本发明方法中对葡激酶热原量有影响的关键步骤之一。同时，最后一步同时也使葡激酶的纯度达到了99％(HPLC纯度)以上，满足了大规模纯化生产的需要。当然，这样的效果的取得是需要和前几个步骤进行配合才能达到的。

实施五  本发明制备的葡激酶制剂的制备

取实施例三中得到的葡激酶蛋白原液790ml(r-SAK量为8350mg)，按2.0倍的蛋白量加入20％注射用人白蛋白，并用无热原0.15M NaCL pH7.020mM磷酸缓冲液定容至1670ml，配制成5mg/ml的r-Sak蛋白液，迅速用无热原0.22μm膜过滤后即得半成品，检测内毒素含量符合药用要求后，100级洁净度下，1ml/瓶分装，冷冻干燥(-40℃预冻2～6小时后，抽真空，缓慢升温至-20℃，保持4～8小时，1小时内快速升温至0℃，在20～35℃保持2小时，结束冻干后，可真空或充氮封口)，即得成品。

采用《中国药典》2005版三部附录所收录的同种标准方法进行检定。检定结果(见表8)表明本实施例制得的葡激酶均符合相关要求。

                         表8  制剂质量检定结果

项目	指标	检定结果
			外观	白色疏松体，溶液应为无色或微带乳光的澄清液体，不应含有肉眼可见的不溶物	符合规定
效价(Au/瓶)	标示量的80～150％	26.2万
			水分	≤3.0％	1.96％
pH值	6.5～7.5	7.0
			无菌试验	符合《生物制品无菌试验规程》要求	符合规定
异常毒性试验	符合《生物制品异常毒性试验规程》要求	符合规定
			热原质试验	符合《生物制品热原质试验规程》要求	＜0.5EU/mg符合规定

实验例一  本发明制备的葡激酶制剂的药效实验

本发明葡激酶(recombinant staphylokinase，)为一种新型溶栓剂，它通过与人血浆中纤溶酶原结合形成复合物，该复合物特异性地与血栓表面的纤维蛋白结合，使纤维蛋白降解，血栓溶解，具有溶栓能力强，纤维蛋白结合专一性好，纤维蛋白原降解活性低，免疫原性低等特点。

取上述实施例五所制备的葡激酶制剂进行临床试验，结果如下。

一、I期临床试验及结果

经卫生部药政局[(96)制申体第36号文件]批准，中国医学科学院阜外心血管病医院临床药理基地于1999年6月至1999年9月进行了本发明葡激酶制剂I期临床试验。

试验结果显示所有健康志愿者对本发明葡激酶制剂20mg耐受良好，无严重不良反应，无因不良事件停药者。本发明葡激酶制剂人体药代动力学符合静脉注射二室开放模型。药物主要分布于血液中，在血管内发挥作用，消除相半衰期在2.5到20mg无显差，平均为47.21±10.28min。

二、II期临床预试验及结果

经国家药品监督管理局[(2000)制申体字第08号]批准，2000年8月至2001年1月，在中国医学科学院阜外心血管病医院和北京大学第三医院进行了10例20mg本发明葡激酶制剂治疗急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)患者的II期临床试验预试验。

试验结果显示：90分钟冠状动脉造影达心肌梗死溶栓试验(thrombolysisin myocardial ischemia，TIMI)TIMI3级血流者7例，TIMI2级血流者2例，TIMI1级血流者1例。效果良好。

三、II期临床试验及结果

经国家药品监督管理局批准，中国医学科学院阜外心血管病医院作为组长单位，上海第二医科大学瑞金医院、北京大学第三医院、首都医科大学朝阳医院、沈阳军区总医院、辽宁省人民医院、第四军医大学西京医院、大连医科大学附属第一医院、首都医科大学安贞医院、上海市第六人民医院、首都医科大学友谊医院、中国医科大学附属第一医院作为参研单位，于2002年1月至2003年10月进行了本发明重组葡激酶的II期临床试验，本试验为多中心、随机平行对照研究。

1、试验对象及分组

随机分为

①本发明葡激酶制剂组，在30分钟内静脉输注20mg；在试验开始时，由于1例发生脑出血，本发明葡激酶制剂组使用剂量由20mg调整为15mg，其中3mg静脉推注，12mg在30分钟内静脉输注；

②重组人组织纤溶酶原激活剂(Recombinant human tissue plasminogenactivator，rt-PA)组，在90分钟内输注50mg，先静注8mg冲击量，余下42mg在90分钟内静滴完毕；

③直接经皮冠状动脉腔内成形术(Percutaneous TransluminalCoronary Angioplasty，PTCA)组。

12个临床试验中心共纳入本发明葡激酶制剂组108例、rt-PA组107例，直接PTCA组111例。(其中两溶栓组由于误纳年龄大于70岁的病例违反方案的纳入标准而剔除3例)。有3例本发明葡激酶制剂剂量20mg(其中1例年龄大于70岁者剔除)。仅对符合入选标准的治疗病例本发明葡激酶制剂组104例，rt-PA组106例进行了统计。

其中，本发明葡激酶制剂和rt-PA组病例入选时年龄均数及构成比、性别、体重均数、体重指数、身高、血压(收缩压和舒张压)、脉搏、入院时心功能(Killip)分级、高血压病史、既往心绞痛史、既往心肌梗死史、吸烟史及现在仍吸烟者比例、糖尿病史、胰岛素治疗史、冠心病家族史、高胆固醇血症史、CK、MB-CK峰值、症状开始至到达医院时间、到达医院至治疗的间隔时间、症状开始至治疗的间隔时间均无显著差别，具有良好的可比性。本发明葡激酶制剂组99例，rt-PA组101例完成了90分钟冠状动脉造影。

2、试验结果：

A、主要终点

(1)冠状动脉造影结果评价：

本发明葡激酶制剂组90分钟TIMI3级血流为57.58％，rt-PA组为48.51％，P＝0.1929，两组间无显著性差别；

本发明葡激酶制剂组90分钟通畅率(TIMI2级和TIMI3级血流)为77.78％，rt-PA组为63.37％，P＝0.0277，两组间有显著性差别，本发明葡激酶制剂组优于rt-PA组。

本发明葡激酶制剂组90分钟造影校正TIMI血流帧数38.89±21.49，rt-PA组为45.52±37.63，P＝0.2665，两组间无显著性差别。

本发明葡激酶制剂组90分钟梗死相关冠状动脉残余狭窄80.22±19.82％，rt-PA组为82.94±20.49％，P＝0.3412，两组间无显著性差别。

(2)临床复合终点：

一月内本发明葡激酶制剂组死亡9例(8.65％)，对照组rt-PA死亡6例(5.66％)，P＝0.3997，两组间无显著性差别。

一月内非致死性再梗死本发明葡激酶制剂组3例(2.88％)，对照组rt-PA 4例(3.77％)，P＝1.000，两组间无显著性差别。

一月内心绞痛复发本发明葡激酶制剂组9例(8.65％)，对照组rt-PA17例(16.04％)，P＝0.1043，两组间无显著性差别。

一月内进行靶血管重建术(TVR)本发明葡激酶制剂组32例(30.77％)，对照组rt-PA26例(24.53％)，P＝0.3119，两组间无显著性差别。

上述四项的总合(复合临床终点)本发明葡激酶制剂组46例(44.23％)，对照组rt-PA42例(39.62％)，P＝0.5185，两组间无显著性差别。

B、次要终点

(1)心力衰谒或肺水肿发生率：本发明葡激酶制剂组14例(13.46％)，对照组rt-PA 12例(11.32％)，P＝0.6377两组的差别无统计学意义。

(2)一月时左室EF：本发明葡激酶制剂组0.56±0.12，对照组rt-PA 0.70±0.80，P＝0.1969两组的差别无统计学意义。

(3)出血：本发明葡激酶制剂组发生出血30例(28.85％)，对照组rt-PA 29(27.36％)，P＝0.8105，两组的差别无统计学意义。

严重或威胁生命的出血：本发明葡激酶制剂组2例，对照组rt-PA 4例，包括颅内、胃肠道、生殖泌尿道、口咽部、皮肤及导管部位的严重出血。其中颅内出血本发明葡激酶制剂组1例(0.96％)，痊愈出院；对照组rt-PA 4例(3.77％)，其中有2例因颅内出血死亡，2例痊愈出院(1例为可疑颅内出血，未经CT确诊)，P＝0.3691，两组的差别无统计学意义；

中度出血本发明葡激酶制剂组4例，对照组rt-PA 4例；轻度出血本发明葡激酶制剂组24例，对照组rt-PA 21例，P＝0.4597，两组间差别无统计学意义。

(4)其它并发症：心脏破裂、心脏停搏、心房颤动、心房扑动、持续性室性心动过速、心室颤动、2-30房室传导阻滞、持续低血压、心源性休克、心力衰谒与肺水肿、缺血性脑卒中等并发症的发生率两组间差别无统计学意义。

C、不良事件

(1)死亡事件：本发明葡激酶制剂组死亡9例(8.65％)，其中心脏破裂死亡4例，心源性休克死亡5例；对照组rt-PA死亡6例(5.66％)，其中心源性休克死亡3例，介入治疗并发症死亡1例，颅内出血死亡2例，P＝0.3997，两组的差别无统计学意义。

(2)出血：本发明葡激酶制剂组发生出血30例(28.85％)，对照组rt-PA 29例(27.36％)，P＝0.8105，两组的差别无统计学意义。严重或威胁生命的出血本发明葡激酶制剂组2例，对照组rt-PA 4例，包括颅内、胃肠道、生殖泌尿道、口咽部、皮肤及导管部位的严重出血；其中颅内出血本发明葡激酶制剂组1例(0.96％)，痊愈出院；对照组rt-PA 4例(3.77％)，其中有2例因颅内出血死亡，2例痊愈出院(1例为可疑颅内出血，未经CT确诊)，P＝0.3691，两组的差别无统计学意义；中度出血本发明葡激酶制剂组4例，对照组rt-PA 4例；轻度出血本发明葡激酶制剂组24例，对照组rt-PA 21例，P＝0.4597，两组的差别无统计学意义。

(3)本发明葡激酶制剂组及rt-PA组均没有观察到明显的血液系统和肝、肾功能损害及过敏、发热、寒战等不良反应。没有出现任何由内毒素等热原物质引起的不良反应。

(4)给予本发明葡激酶制剂20mg者3例中，(其中1例年龄大于70岁者剔除)，脑出血1例，存活，无死亡。

(5)剔除的3例患者均为70岁以上患者，其中本发明葡激酶制剂组2例，rt-PA组1例，溶栓后90分钟冠状动脉造影均为TIMI3级血流，无死亡。

D、实验结论：

本发明葡激酶制剂在30分钟内静脉输注15mg治疗AMI，其用药后90分钟血管通畅率77.8％，优于对照药rt-PA(63.4％，P＝0.0277)；TIMI3级血流为57.6％，与rt-PA(48.5％)相似，临床复合终点两组无显著差别。出血(包括脑出血)发生率与rt-PA亦无显著差别。结果表明本发明葡激酶制剂是一安全、有效的治疗急性心肌梗死的溶栓药物。

通过以上实例表明，本发明葡激酶热原低，各批次内毒素含量均＜0.5EU/mg，热原含量完全符合《中国药典》三部对同类产品的要求；纯度高，其HPLC纯度在99％以上；活性强，效价高。由本发明葡激酶添加药学上可以接受的辅助性成分所制备的治疗急性心肌梗死或血栓性疾病的制剂，在人体实际临床应用中在表现出很好疗效的同时，也没有出现任何由内毒素等热原物质引起的不良反应，是一种安全有效的治疗急性心肌梗死或血栓性疾病的药物，具有很好的市场前景。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域的技术人员可以根据本发明的思想作出各种改变及变形，比如选用与本发明所使用的凝胶柱内填料的商品名不同但种类相同且指标相同或接近的产品，调节层析步骤的流速等，只要不脱离本发明的精神，均属于本发明所附权利要求所定义的范围。

                    一种低热原葡激酶及其制备方法.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>成都地奥九泓制药厂

<120>一种低热原葡激酶及其制备方法

<130>050234

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物序列1

<400>1

ggtgaattca tgtcaagttc attcgacaa                                       29

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>引物序列2

<400>2

ggaggatcct tatttctttt ctataacaa                                       29

<210>3

<211>408

<212>DNA

<213>金黄色葡萄球菌

<400>3

tcaagttcat tcgacaaagb aaaatataaa aaaggcgatg acgcgagtta ttttgaacca     60

acaggcccgt atttgatggt aaatgtgact ggagttgatg gtaaaggaaa tgaattgcta    120

tcccctcatt atgtcgagtt tcctattaaa cctgggacta cacttacaaa agaaaaaatt    180

gaatactatg tcgaatggga cttagatgcg acagcatata aagagtttad agtagttgaa    240

ttagatccaa gcgcaaagat cgaagtcact tattttgata agaataagaa aaaagaagaa    300

acgaagtctt tccctataac agaaaaaggt tttgttgtcc cagatttatc agagcatatt    360

aaaaaccctg gattcaactt aattacaaag gttgttatag aaaagaaa                 408

<210>4

<211>136

<212>PRT

<213>金黄色葡萄球菌

<400>4

Ser Ser Ser Phe Asp Lys Gly Lys Tyr Lys Lys Gly Asp Asp Ala Ser

1               5                   10                  15

Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met Val Asn Val Thr Gly Val

            20                  25                  30

Glu Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro His Tyr Val Glu Phe Pro

        35                  40                  45

               一种低热原葡激酶及其制备方法.ST25

Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu Lys Ile Glu Tyr Tyr Val

    50                  55                  60

Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Lys Glu Phe Arg Val Val Glu

65                  70                  75                  80

Leu Asp Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr Tyr Phe Asp Lys Asn Lys

                85                  90                  95

Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile Thr Glu Lys Gly Phe Val

            100                 105                 110

Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn Pro Gly Phe Asn Leu Ile

        115                 120                 125

Thr Lys Val Val Ile Glu Lys Lys

    130                 135

Claims (11)

1、一种葡激酶，其特征在于：其内毒素含量小于3Eu/mg SAK。

2、根据权利要求1所述的葡激酶，其特征在于：其内毒素含量等于或小于1Eu/mg SAK。

3、根据权利要求1或2所述的葡激酶，其特征在于：其HPLC纯度等于或大于99％。

4、一种权利要求1～3任一项所述葡激酶的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：

a、将含葡激酶的原料破碎离心，取上清液；

b、将步骤a上清液用DEAE凝胶柱穿滤，收集滤液，除盐，浓缩；

c、将步骤b浓缩液过CM凝胶柱，收集含葡激酶样品峰的洗脱液，浓缩；

d、将步骤c浓缩液用Q凝胶柱穿滤，收集滤液，浓缩、干燥，即得。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的DEAE凝胶柱为DEAE-Sepharose F.F柱；CM凝胶柱为CM-Sepharose F.F柱；Q凝胶柱为Q-Sepharose F.F柱。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的各种凝胶柱中的凝胶填料的粒径为50～150μm。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的各种凝胶柱中的凝胶填料的粒径为70～120μm。

8、根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、将原料破碎离心后的上清液超滤除盐，将滤液转换介质为磷酸缓冲液，浓缩；

b、将步骤a浓缩液用DEAE-Sepharose F.F柱穿滤，流动相为磷酸缓冲液，将滤液浓缩；

c、将步骤b浓缩液转换介质为NaAc-HAc缓冲液，过CM-Sepharose F.F柱，再以NaAc-HAc缓冲液洗脱，收集样品峰所在的洗脱液后浓缩；

d、将步骤c浓缩液转换介质为含NaCL的磷酸缓冲液，用Q-Sepharose F.F穿滤，将滤液浓缩、干燥，即得；

上述b、c、d各步骤中流动相过凝胶柱时的流速为5～40ml/min。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

a步骤中所述的磷酸缓冲液为pH8.0的8～12mM磷酸缓冲液；

b步骤中所述的磷酸缓冲液为pH8.0的8～12mM磷酸缓冲液；

c步骤中所述的NaAc-HAc缓冲液为18～12mM的NaAc-HAc缓冲液，pH5.0～6.0；

d步骤中所述的含NaCL的磷酸缓冲液为含0.10～0.35mol/L NaCL的20mM磷酸缓冲液，pH7.0；

上述步骤中流动相过凝胶柱时的流速为5～30ml/min。

10、一种治疗急性心肌梗死或血栓性疾病的药物组合物，它是由权利要求1或2所述的葡激酶添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成的制剂。

11、根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于所述的制剂为注射制剂或口服制剂。

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