CN1803228A - 受对氯硝基苯类化合物污染的环境的生物修复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种受对氯硝基苯类化合物污染的环境的生物修复方法。该方法是将萌发出根芽的苜蓿种子浸泡于OD600值为1.8－2.2的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas tes tosteroni)CNB－1 CGMCC No.1028的菌悬液中进行包被，再将经睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB－1 CGMCC No.1028包被的苜蓿种子植入受氯硝基苯类化合物污染的环境中进行培养，环境得到修复。本发明将在受对氯硝基苯类化合物污染的环境的生物修复中发挥巨大作用，并为开发新型的污染土壤生物修复技术以及污水土地处理技术具有重要的实际应用意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种受污染环境的生物修复方法，特别是涉及一种受对氯硝基苯类化合物污染的环境的生物修复方法。
背景技术
随着我国工、农业的迅速发展，环境污染问题日益成为我国社会发展过程中十分严重和迫切需要解决的问题，它不仅制约了我国的经济发展和人民生活水平的提高，而且严重限制了我国社会的可持续发展，对人民健康产生极大威胁，因此，对污染土壤的修复治理成为人们十分关注的问题。80年代中期，利用生物修复技术对污染土壤进行整治开始得到应用，多年的研究表明，生物修复，既利用微生物或其他生物将土壤、水体中的污染物降解为二氧化碳和水等无害物质的技术，是一种安全又经济的方法。在有机污染的生物修复过程中，起到关键作用的是具有降解不同污染物能力的微生物，其次是植物。目前，人们逐渐将目光转移到利用微生物与植物根系之间的相互作用促进污染物的降解。植物根系能够改变土壤的物理结构，增加土壤通气量、含水量以及改变pH值；更重要的是，植物的根系能够分泌大量物质，包括氨基酸、糖类、有机酸以及多肽等，这些物质可以为微生物的生长与繁殖提供营养物质，延长其存活时间；另外，某些有机化合物能够刺激或诱导微生物的代谢活性，加速污染物的降解；此外，植物根系还能够深入土壤，促进微生物的广泛分布，并且还能吸收土壤中的水分，因此一些水溶性的污染物可以聚集在根系附近，有利于根系周围微生物充分发挥其降解能力，达到快速高效降解污染物的目的；另一方面，降解菌株通过对污染物进行降解，降低了污染物对植物的毒害作用，保护了植物，使得双方受益，从而相互促进，加速了污染物的降解过程。
氯代硝基苯类化合物(chloronitrobenzens，CNB)是一类重要的化工原料和中间体，被广泛地运用于橡胶制造、染料以及农药生产等领域。目前，我国氯代硝基苯工业经过50多年的发展，生产厂家达20多家，总年产能力近20万吨，已占世界总年产能力的50％以上。然而，随之而来的是氯代硝基苯等芳香化合物通过各种途径进入环境成为污染物。例如，生产过程中排放的污水中含有大量残留物，或者环境中其他芳香化合物经过不彻底的降解或转化形成了一些硝基取代的芳香化合物；在自来水的氯化消毒过程中，也会产生氯代硝基苯类化合物。研究表明，氯代硝基苯类化合物具有致畸、致癌、致突变的“三致”作用。在氯代硝基苯类化合物中，又以氯代硝基苯最为严重，例如，对氯硝基苯能够引起人或动物的高铁血红蛋白症(methemoglobinemia)或贫血(anemia)，因此欧盟已经将氯代硝基苯确定为特别有害的化合物。
目前，国内外对氯代硝基苯类化合物降解的研究报道较少，只有个别报道了有关对氯硝基苯的微生物降解，而将这些微生物运用于实际的生物修复中则更少。
发明内容
本发明的目的是提供一种受对氯硝基苯类化合物污染的环境的修复方法。
本发明所提供的受对氯硝基苯类化合物污染的环境的修复方法，是将萌发出根芽的苜蓿种子浸泡于OD600值为1.8-2.2的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-l CGMCC No.1028的菌悬液中进行包被，再将经睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿种子植入受氯硝基苯类化合物污染的环境中进行培养，随着苜蓿的生长，环境中的硝基苯类化合物逐步得到降解，起到修复作用。
睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028已在专利“一种降解对氯代硝基苯的睾丸酮丛毛单胞菌及其用途”中公开，专利申请号：200310114337.7。
在上述修复方法中，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028菌悬液的OD600值优选为2.0；睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028的菌悬液的制备方法可为：将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028菌体重悬于质量百分浓度为0.9％NaCl溶液中。
苜蓿种子萌发的条件可为：将苜蓿种子置于湿润滤纸上，在30℃下暗培养。
包被时间为50-70min，优选为60min。
本发明的修复方法既适用于受对氯硝基苯类化合物污染的土壤环境，也适用于受此类化合物污染的无土基质。所述对氯硝基苯类化合物为对氯硝基苯。
可按常规方法对睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028菌进行培养，具体过程可包括以下步骤：
1)将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接种于以对氯硝基苯为底物的无机盐培养基中，在28-30℃下振荡培养12-18h，得到种子液；所述无机盐培养基配方为：磷酸氢二钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5mL，对氯硝基苯200mg，用水定容至1000mL，pH6.8-7.2，所述儆量元素溶液含：EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl2 0.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，FeSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；
2)将步骤1)获得的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的种子液接种于LB液体培养基中，在28-30℃下振荡培养。
所述步骤1)中无机盐培养基的pH值优选为7.0；所述振速为100-150rpm，优选为130rpm。
步骤2)中睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028种子液的接种量为1-2％；所述培养温度优选为30℃，振速为100-150rpm，优选为130rpm，培养时间为12-24h，优选为12-18h。
本发明提供了一种受对氯硝基苯类化合物污染的环境的修复方法。该方法利用了睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028对对氯硝基苯类化合物的降解作用，同时与豆科植物苜蓿建立组合可对受到对氯硝基苯污染的环境进行生物修复。该菌株可定植在苜蓿根系并与其相互促进，从而发挥高效降解污染物-对氯硝基苯类化合物的效能，达到对受此类化合物污染的环境的生物修复作用，使其恢复生态功能。本发明具有以下优点：
1)在污染环境的生物修复过程中，微生物因其具有广泛的代谢途径，以及能够降解多种类型的污染物而起到关键作用，是生物修复的主体，而植物在污染环境的生物修复中也起到重要作用，植物具有发达的根系，不仅能够改善土壤的物理性质，还能够分泌大量有机物质，不仅为微生物提供了生长繁殖所需的营养物质，而且其中一些有机化合物能够诱导或增强微生物的某些代谢途径，促进微生物对污染物的利用和降解，或通过共代谢作用将污染物降解，因此将具有对氯硝基苯类化合物高效降解能力的菌株与具有发达根系的豆科植物苜蓿形成组合可提高生物修复能力；
2)将植物根系与高效降解菌株联合，克服了单一的微生物修复技术或植物修复技术的不足：首先，采用植物根系-微生物系统能较好地延长降解菌株在土壤中的存活时间，由于植物根系能分泌大量营养物质，为降解菌株提供了生长所必须的一些要素或生长因子，根系周围的微观环境优于非根系土壤，延长了降解菌株的存活周期，有利于其发挥降解活性；其次，植物发达的根系能够吸收土壤中的水分，使得一些水溶性的污染物随着水的流动向植物根系靠近，这将有利于降解菌株于污染物接触，加速降解过程，而且植物根系能够进入土壤深处，有利于降解菌株在土壤中的广泛分布；另外，微生物通过降解污染物，降低了土壤中污染物对植物的毒性，间接地增强了植物对污染物的耐受性，使得植物能够更好的生长，从而促进降解菌株的存活，二者通过这种相互作用，起到了相互促进、互利互惠的效果，有利于污染物的降解；
3)所采用的高效降解菌株为从污染源分离得到的野生型菌株，没有经过基因工程改造，因此不会引起生物安全问题，容易被社会接受；
4)该方法应用简便，无需大量资金投入，经济实用，适合大面积的污染环境的修复，且不会产生二次污染。
基于上述优点，本发明将在受对氯硝基苯类化合物污染的环境的生物修复中发挥巨大作用，并为开发新型的污染土壤生物修复技术以及污水土地处理技术具有重要的实际应用意义。
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为实验组和对照组植株在受不同浓度对氯硝基苯污染的土壤中的生长情况
图2为经绿色荧光蛋白标记的降解菌-睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1::gfp2在苜蓿根系定植的共聚焦激光扫描显微照片
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
无机盐培养基：磷酸氢二钠1g，磷酸二氢钾0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5mL，对氯硝基苯200mg，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.0；微量元素溶液：EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl2 0.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，FeSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；121℃灭菌30min。
LB液体培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，用蒸馏水定容至1000mL，pH7.2。
实施例1、检测本发明方法对受对氯硝基苯类化合物污染的无土基质的修复能力
以对氯硝基苯为例，检测本发明方法对受对氯硝基苯类化合物污染的无土基质的修复能力，具体过程包括以下步骤：
1)将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接种于以对氯硝基苯为底物的无机盐培养基中，在28℃、130rpm下振荡培养16h，得到种子液；
2)将步骤1)获得的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的种子液按1％的接种比例接种于LB液体培养基中，在30℃下振荡培养18h；
3)6000rpm离心收集菌体，将其重悬于无菌的质量百分浓度为0.9％NaCl溶液中，使其OD600达到2.0，得到睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌悬液；
4)将苜蓿种子置于湿润滤纸上，30℃避光萌发2天，待长出根芽(约5mm)后，将其浸泡于步骤3)获得的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌悬液中进行包被，浸泡时间为60min；
5)将经睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿种子移栽于营养基质(KNO3 18.5mg，KH2PO4 24.8mg，MgSO4·7H2O 65.9mg，CaCl260mg，FeSO4·7H2O 30mg，EDTA·2Na 20mg，微量元素溶液(同上)1mL，H2O 1000mL，pH 6.8-7.0，蛭石若干)上进行无土栽培，同时设未包被的苜蓿作为对照，在营养基质中添加终浓度分别为0、50、100、200μg/mL的对氯硝基苯，在25℃温室中进行培养，每天光照培养(光照强度为1400lux)18h，避光培养6h，考查苜蓿的生长情况以及对氯硝基苯的降解情况。实验进行8天后进行数据分析，采用菌落计数法(CFU法)对培养体系中苜蓿根系和非根系土壤基质的降解菌数量进行计数，采用HPLC法分析对氯硝基苯的降解情况，结果如表1所示，苜蓿根系区域的降解菌数量明显高于非根系区域，经包被处理的苜蓿其生长量在污染物存在的情况下要明显高于未包被的对照组，表明其本发明的方法对无土基质中的污染物-对硝基苯具有较好的降解效果，可起到环境修复作用。该结果说明本发明方法中所形成的微生物-植物体系中，睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028和苜蓿具有相互促进的作用关系，苜蓿根系为降解菌提供某种有利因素，而降解菌的存在可以很好地保护植物免受污染物的危害，使系统处理污染物的能力充分发挥。
表1对受对氯硝基苯类化合物污染的无土基质的修复能力检测结果
| 实验组别 | 污染物浓度(mg/L) | 苜蓿生长量(干重g) | 降解菌数量(CFU/g) | 降解率(％) | |
| 根系 | 非根系 | ||||
| 未包被苜蓿(对照组) | 0 | 0.26 | - | - | - |
| 50 | 0.20 | - | - | ＜30 | |
| 100 | 不长 | - | - | ＜20 | |
| 200 | 不长 | - | - | ＜20 | |
| 包被苜蓿(实验组) | 0 | 0.26 | 1.9×105 | 7.5×103 | 100 |
| 50 | 0.25 | 4.0×105 | 1.3×101 | 100 | |
| 100 | 0.23 | 1.7×106 | 3.8×101 | 100 | |
| 200 | 0.18 | 1.1×106 | 1.9×101 | 80 | |
实施例2、检测本发明方法对受对氯硝基苯类化合物污染的土壤的修复能力
以对氯硝基苯为例，用盆栽实验检测本发明方法对受对氯硝基苯类化合物污染的土壤的修复能力，具体过程包括以下步骤：
1)将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接种于以对氯硝基苯为底物的无机盐培养基中，在30℃、130rpm下振荡培养16h，得到种子液；
2)将步骤1)获得的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的种子液按1％的接种比例接种于LB液体培养基中，在28℃下振荡培养18h；
3)7000rpm离心收集菌体，将其重悬于无菌的质量百分浓度为0.9％NaCl溶液中，使其OD600达到2.0，得到睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌悬液；
4)将苜蓿种子置于湿润滤纸上，30℃避光萌发2天，待长出根芽(约5mm)后，将其浸泡于步骤3)获得的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的菌悬液中进行包被，浸泡时间为60min；
5)将经睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028包被的苜蓿种子以10粒为一组进行盆载种植作为实验组；以未经包被处理的苜蓿种子10粒为一组进行盆载作为对照组。盆载所用的土壤为：沙土+花卉营养土+蛭石(混合比例1∶1∶1)，每盆土壤350g，所有盆载都在室外自然光照环境条件下进行培养。待苜蓿生长5天后，对照组和实验组中的植株再分为不同浓度处理组，每天分别用15mL含不同浓度(0，50，100，200mg/L)对氯硝基苯的水溶液浇灌一次。经过15天的培养后，测定苜蓿的生长情况以及对氯硝基苯的降解情况。
苜蓿的生长情况如图1所示，数据如表2所示，经包被处理的实验组，在经过10天不同浓度对氯硝基苯浇灌后，各盆苜蓿的平均株高、根长以及总生长量没有明显的差异，特别是经50mg/L对氯硝基苯溶液浇灌的实验组，苜蓿的平均根长和总生长量还略高于其他实验组；而经未包被的对照组，在经过10天不同浓度对氯硝基苯溶液浇灌后，各盆苜蓿的平均株高和根长以及总生长量存在明显差异，且随污染物浓度的提高长势呈现明显的下降趋势。上述检测结果表明在所实验的对氯硝基苯浓度范围内，该降解菌的存在完全可以保护苜蓿免受污染物的危害，也说明了睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028对对氯硝基苯类化合物具有降解作用。
表2对受对氯硝基苯类化合物污染的土壤的修复能力的盆栽实验结果
| 实验组别 | 污染物浓度(mg/L) | 平均株高(cm) | 平均根长(cm) | 苜蓿生长总重(干重g) |
| 未包被苜蓿(对照组) | 0 | 6 | 7 | 2.9 |
| 50 | 4 | 5 | 2.2 | |
| 100 | 2.5 | 4 | 1.7 | |
| 200 | 2 | 3 | 0.95 | |
| 包被苜蓿(实验组) | 0 | 6 | 7 | 2.7 |
| 50 | 7 | 9 | 3.5 | |
| 100 | 6 | 7.5 | 2.6 | |
| 200 | 7 | 7 | 2.4 |
实施例3、睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028在苜蓿根系定植能力的检测
为了便于观察对氯硝基苯降解菌株睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028在生物修复过程中在植物根系的定植情况，现将绿色荧光蛋白(green flouresence protein，GFP)基因整合在睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1的基因组DNA上，具体方法为：(1)睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1感受态细胞的制备：将发明内容步骤1)中得到的种子液按照1％的接种量接入LB液体培养基中，在28℃下，130rpm振荡培养，使其OD600达到0.3-0.4，(以下操作均在4℃进行)4500rpm下离心收集菌体细胞，用4℃预冷的超纯水将菌体细胞重新悬浮，4500rpm下离心收集菌体细胞，重复上述操作两次后，用4℃预冷的10％(v/v)甘油将菌体重新悬浮，4500rpm下离心收集菌体细胞，用10％(v/v)甘油将菌体重新悬浮，使其浓度达到1011个细胞/mL，此即为感受态细胞，置于-70℃保存；(2)取200μL上述感受态细胞，加入1μg质粒pFAJ1820(该质粒含有绿色荧光蛋白基因和卡那霉素抗性基因Xi C，Lambrechts M，VanderleydenJ and Michiels J.Bi-functional gfp-and gusA-containing mini-Tn5 transposonderivatives for combined gene expression and bacterial localization studies.Journal of Microbiological Methods，1999，35：85-92.)，混合后置于电击杯中进行电击转化，转化条件为2.5kV，200Ω，25μF；(3)用1.0mL SOC液体培养基将电击转化的细胞悬浮(SOC液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.5g/L，葡萄糖20mM，pH7.0)，置于28℃，130rpm振荡培养40-60分钟，取200μL上述细胞悬液涂布于含有150μg/mL卡那霉素的LB固体平板上，置于30℃暗培养24h；(4)将生长出菌落的LB固体平板置于手提式紫外灯下观察，将具有明显绿色荧光的菌落挑出，命名为CNB-1::gfp2，经检测该突变株的生长和降解活性与原始菌株相同，并且能稳定地表达绿色荧光蛋白，在荧光显微镜下可观察到明显的绿色荧光。采用与实施例2同样的处理方法，使用苜蓿与睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1::gfp2对含有对氯硝基苯的污染土壤进行修复实验。一定时间后，将苜蓿取出，用无菌水清洗根，取约1cm根组织，放在载玻片上，加几滴无菌水，盖上盖玻片后，在荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜(confocal leaserscanning microscopy，CLSM)下观察，如图2所示，可以看到标记菌株能够定植在根表面，根细胞间隙或死亡的根表皮细胞内，表明降解菌睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028能够在苜蓿根系中定植，这是高效发挥其降解对氯硝基类污染物功效的基础。
Claims (10)
1、一种受对氯硝基苯类化合物污染的环境的生物修复方法，是将萌发出根芽的苜蓿种子浸泡于OD600值为1.8-2.2的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB-1CGMCC No.1028的菌悬液中进行包被，再将经睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028包被的苜蓿种子植入受氯硝基苯类化合物污染的环境中进行培养，环境得到修复。
2、根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于：所述睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌悬液的OD600值为2.0。
3、根据权利要求1或2所述的生物修复方法，其特征在于：所述睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028的菌悬液的制备方法为：将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌体重悬于质量百分浓度为0.9％NaCl溶液中。
4、根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于：所述苜蓿种子萌发的条件为：将苜蓿种子置于湿润滤纸上，在30℃下暗培养。
5、根据权利要求1所述的生物修复方法，其特征在于：所述包被时间为50-70min。
6、根据权利要求1-5任一项所述的生物修复方法，其特征在于：所述对氯硝基苯类化合物为对氯硝基苯。
7、根据权利要求1-5任一项所述的生物修复方法，其特征在于：所述环境包括土壤环境和无土环境。
8、根据权利要求1-5任一项所述的生物修复方法，其特征在于：所述睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1CGMCC No.1028菌的培养方法，包括以下步骤：
1)将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028接种于以对氯硝基苯为底物的无机盐培养基中，在28-30℃下振荡培养12-18h，得到种子液；所述无机盐培养基配方为：磷酸氢二钠1.0g，磷酸二氢钾0.5g，MgSO4·7H2O 0.03g，微量元素溶液5.0mL，对氯硝基苯200mg，用水定容至1000mL，pH6.8-7.2；所述微量元素溶液含：EDTA 0.5g，ZnSO4·7H2O 0.22g，CaCl2 0.055g，MnCl2·4H2O 0.051g，FeSO4·7H2O 0.0499g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.011g，CuSO4·5H2O 0.0157g，CoCl2·6H2O 0.0161g，用水定容至1000mL，pH6.0；
2)将步骤1)获得的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCCNo.1028的种子液接种于LB液体培养基中，在28-30℃下振荡培养。
9、根据权利要求8所述的生物修复方法，其特征在于：所述步骤1)中无机盐培养基的pH值为7.0；所述振速为130rpm。
10、根据权利要求8所述的生物修复方法，其特征在于：所述步骤2)中睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB-1 CGMCC No.1028种子液的接种量为1-2％；振荡培养条件为：在30℃、130rpm下培养12-18h。
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