CN1794908B - 通过核移植克隆大鼠的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用核移植克隆大鼠的方法，其包括以下步骤：a)取出大鼠卵母细胞并维持在适当培养基中；b)将大鼠细胞核插入预先体外维持的受体大鼠卵母细胞中，以获得重构卵母细胞；c)激活步骤b)中获得的重构卵母细胞，以获得重构胚。本发明还涉及由此获得的胎鼠或成年期大鼠，以及用于生产感兴趣分子或作为研究模型的用途。
Description
本发明涉及通过核移植克隆大鼠的方法。本发明还涉及由此获得的大鼠，及其用于生产感兴趣分子或作为研究模型的用途。
与用作核来源之前对细胞的遗传修饰一起，核移植技术使建立遗传修饰为特异性状的动物品系成为可能。核移植技术是公知的，且已开发用于克隆几种动物物种，尤其是哺乳动物，如绵羊(Wilmut et al.，1997；WO 97 07669)、小鼠(Wakayama etal.，1998；WO 99 37143)、牛(Wells et al.，1999)、山羊(Baguisi et al.，1999；WO 0025578)、猪(Polejaeva et al.，2000)和兔(Chesne et al.，2002)。Compbell等人已具体描述了核移植方法(Nuclear transfer in practice，School of Biosciences，University ofNottingham，Leicestershire，United Kingdom)。
这些核移植方法一般含有以下步骤：
a)取出卵母细胞并维持于适当的培养基中；
b)然后在中期阶段去除这个卵母细胞的细胞核，即通过显微操作去除其细胞核；
c)在重构的去核卵母细胞中插入胎儿或成年体细胞的或胚胎细胞的或生殖系细胞的细胞核(核移植)；
d)激活在步骤c)中获得的重构卵母细胞，以获得重构胚。
然后重构胚或者移植到雌性受者以便发育成可能的胎儿并进一步发育成新生儿，或者在放置入雌性受者的输卵管或子宫之前在移植前发育的初步阶段体外培养。
在使得卵母细胞有效去核以及受体卵母细胞和外源核之间的细胞周期同步化并随后产生胚并继续发育成为可能方面，卵母细胞收获时所达到的细胞周期阶段及其核移植之前被维持在此阶段的能力是一种限制因素。
大鼠卵母细胞核移植已经在科学文献中描述(Iannacone & al.，2001；Hayes &al.，2001；Hirabayashi & al.，2003；Hirabayashi & al.，2003)。然而，既没有报道可使移植胚发育的核移植，也没有明显的从这些重构卵母细胞中发育胎鼠及之后的新生大鼠。
根据本发明的克隆方法是首次报道，该方法使得产生能发育成活胎鼠及之后生育能力已经验证的活大鼠的重构大鼠卵母细胞成为可能。
直到目前，通过从处死动物快速取出输卵管、然后准备并体外维持卵母细胞在只是减缓卵母细胞激活过程进度的适当环境中(温度、pH、钙)(例如暴露于缺乏钙的培养基)，已经明确在哺乳动物、具体在大鼠中可体外维持卵母细胞在“非激活”状态、即维持在第二次减数分裂的阶段。这种激活过程在自然条件下由精子激发，其特征是贮存于内质网囊泡中钙离子的脉冲释放并导致MPF因子(成熟促进因子)活性的突然降低，MPF是以细胞周期蛋白B和一种激酶(cdc2)结合以及相关细胞周期蛋白的蛋白酶降解为特征的蛋白质复合体。当前使用并在前面引用的维持卵母细胞在第二次减数分裂中期阶段的方法的主要缺点，一方面是不可能有效抑制卵母细胞的体外生化发育，另一方面是维持卵母细胞在生理状态使之可能得经受显微操作的机械约束。事实上，这种生化发育迅速变得不适于卵母细胞去核后的核移植情况(克隆)，因为它迅速导致卵母细胞表现出高度的膜易裂性，并因此导致显微操作后的更频繁裂解，尤其导致重构胚发育潜能降低，因为其细胞核随后迅速经历伴随激活过程触发而进入间期的固有变化。当在核移植前自发发生激活过程时，可能有两个对外源细胞核重新编程的不利后果：
-首先染色质非常快速变形，所述染色质从导入卵母细胞的时间起就暴露于解凝聚的动态过程，导致多种结构改变并形成几个微核；
-然后细胞核暴露于细胞质环境，其中重编程需要的因子被降解，防止形成功能性核。
尽管这些因子未知，但已知当细胞核导入处于一个细胞阶段(因此已经激活)并去核的卵中时不能获得重编程，这种事实清楚表明了这些因子的重要性。
根据本发明的方法，从输卵管收集卵母细胞后可以体外维持卵母细胞在生理稳定状态几个小时，并因而防止在很多物种尤其是在大鼠中观察到的卵母细胞的体外自发激活(Zernicka-Goetz，1990)。本发明方法可以使外源细胞核暴露于促进染色质组织成中期型结构的细胞质环境，这种结构与替换之前的卵母细胞核相似。根据本发明的方法也可以含有重构适于再激活的胚的快速技术，这是通过以下内容使之成为可能(i)缩短卵母细胞暴露于阻止其激活的化合物的时间和(ii)增加外源染色质暴露于参与细胞核功能性重编程的卵母细胞因子的时间，它们在激活之前在细胞质中仍然存在和/或有功能。
本发明因此涉及通过核移植重构的大鼠胚的生成方法，其中包括以下步骤：
a)从雌性大鼠中取出卵母细胞并维持在适当培养基中；
b)将来自大鼠细胞的细胞核插入预先体外维持的受体大鼠卵母细胞中，以获得重构卵母细胞(核移植)；
c)激活步骤b)中获得的重构大鼠卵母细胞，以获得重构胚；
其特征在于
-通过维持于包含可逆蛋白酶体抑制剂的适当培养基(维持培养基)中，取出的受体大鼠卵母细胞被维持在第二次减数分裂中期阶段，和
-通过暴露于含激活诱导剂的适当培养基(激活培养基)中，激活重构的卵母细胞。
体外维持和/或激活卵母细胞、尤其是大鼠卵母细胞的适当培养基是本领域技术人员熟知的，具体描述于前面引用的参考文献以及Miyoshi等人的文献中(1997，Stagedependant development of rat 1-cell embryos in a chemically defined medium afterfertilization in vivo and in vitro.Biol.Reprod.；56：180-185)。
可逆蛋白酶体抑制剂也是本领域技术人员公知的，具体由Hee Lee和Goldberg(Proteasome inhibitors：valuable new tools for cell biologists，Trends in Cell Biology(Vol.8)，October 1998)描述。它们最有利地选自肽醛(peptide aldehyde)Cbz-LLL-H(MG132)、肽硼酸(peptide boronate)Cbz-LLL-B(OH)2、乙烯基砜Cbz-LLL-Vs、lactacystine和β-内酯、亮抑酶肽(leupeptine)、MG101、MG115、MG262和PSI(Cbz-ile-glu)，优选MG132。
无需预先判断其功能模式，通过限制收获并体外维持的受体卵母细胞暴露于这些蛋白酶体抑制剂的时间，可以获得一些蛋白酶体抑制剂作用的可逆特征。
本领域技术人员可以通过试验测定最大暴露时间，在此期间收获的卵母细胞可以体外维持于第二次减数分裂的中期阶段，而不丧失被激活发育成胚、然后发育成胎鼠并最后发育成活新生大鼠的能力。
优选地，受体卵母细胞在维持培养基中暴露于可逆蛋白酶体抑制剂的这种暴露时间少于8小时，优选在1-6小时。
受体卵母细胞维持培养基中可逆蛋白酶体抑制剂的量可以由本领域技术人员根据每种抑制剂的具体特性来决定，该方式可以可逆的将卵母细胞维持在第二次减数分裂的中期阶段。维持培养基中这种抑制剂的浓度优选为1-10μm。
对于核移植步骤b)，受体卵母细胞的培养基基本没有可逆性蛋白酶体抑制剂。这可使供体核细胞免于暴露于所述抑制剂的作用，并避免对重构卵母细胞随后发育成功能性胚、及随后的功能性胎儿和新生儿的能力的潜在负作用。
核移植一般包括去除受体卵母细胞的核的步骤，和随后将供体细胞核导入去核卵母细胞的步骤。
根据本发明的优选实施方案，核移植包括将供体细胞核导入受体卵母细胞的步骤，和随后将受体卵母细胞的核去除的步骤
优选通过显微注射进行供体细胞核向受体卵母细胞的细胞质中转移。优选通过显微吸取来去除受体卵母细胞核。
根据本发明的更优选实施方案，核移植在单一步骤中通过显微注射进行，伴随卵母细胞的快速重构。
常规胚重构技术一般以两步进行。首先是去除卵母细胞核，然后经显微注射或电融合将所期望的核导入去核卵母细胞中。根据本发明的方法首先是从卵母细胞中期细胞核的对侧注射供体细胞的裸核，所述注射优选使用压电系统；然后在抽出注射吸管时通过负压取出卵母细胞中期细胞核，后者从细胞质中抽出时在吸管进入部位带少量质膜。这种方法使质膜可以在吸管穿入部位密封自身，因而很大程度限制卵母细胞裂解。胚因此在极短时间内重构，以此方式避免未成熟卵母细胞在核移植之前被激活。
对于根据本发明方法的步骤c)，激活培养基基本不含可逆蛋白酶体抑制剂是最有利的。
重构卵母细胞的激活诱导剂是本领域技术人员熟知的，具体由Hardcastle等人描述(Designing Inhibitors of Cyclin-Dependant Linases，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2002，42：325-48)。根据本发明的优选实施方案，激活诱导剂是丁内酯-1。
重构卵母细胞培养基中激活诱导剂的量可由本领域技术人员根据每种激活剂的具体特性来决定。对于丁内酯-1，培养基中这种抑制剂的浓度优选为25-150μM。
根据本发明的供体细胞可以是含基因组或遗传物质的任何细胞类型，如体细胞、生殖细胞、胚胎细胞如多能干细胞、全能干细胞，例如胚胎干细胞(ES细跑)。术语“体细胞”是指分化的二倍体细胞。体细胞可同样好的来自动物或来自细胞或组织培养物，这些细胞或组织已经历至少一次培养传代并经过或没有经过冷冻。当体细胞来自动物时，该动物可以处于任何发育阶段，例如胚、胎儿或成年。
优选并以非限制性的方式，体细胞包括成纤维细胞(例如原代成纤维细胞)、上皮细胞、肌细胞、卵丘细胞、神经细胞、乳腺细胞、肝细胞、朗氏细胞、来源于可以形成生物体的三胚层即外、中和内胚层的细胞。优选供体体细胞是胎儿成纤维细胞。例如，体细胞通过系列方法获得：机械或酶方法(一般使用胰酶或蛋白酶)解离组织以获得细胞悬液，细胞悬液一般培养至获得汇合的细胞单层。体细胞可以被收获或制备用于低温保存并保持冷冻直至以后使用。增殖或静息状态的细胞可同样好的用作核供体细胞。可通过接触抑制或血清饥饿(Whitefield et al.，1985)或细胞周期抑制剂(Kues WA et al.2002，Cell cycle synchronisation of porcine foetal fibroblasts：effect ofserum deprivation and reversible cell inhibitors)在培养细胞中获得对应细胞周期G0/G1阶段的静息状态。增殖状态可以认为是对应细胞周期的其它所有阶段。
优选地，当其染色质处于有丝分裂时取出供体细胞核以便插入到受体卵母细胞。
最有利的是，重构卵母细胞移植入雌性受者的输卵管或子宫中，并且使得所述转移的胚植入所述雌性受者的子宫并在其中发育。
本领域技术人员熟知将重构胚转移入雌性受者子宫中的技术。
根据本发明的一个具体实施方案，重构胚在1细胞阶段转移。
根据本发明的另一个具体实施方案，重构胚在2细胞阶段转移。
一旦转移后，胚最有利的发育成胎鼠，然后发育成新生鼠。
本发明因此也涉及大鼠胚、和/或胎鼠、新生大鼠、成年大鼠、或来自它们的细胞，它们由含有或包含前述过程的方法生产。
本发明也涉及成年大鼠的后代，这些大鼠由含有或包含前述根据本发明过程的方法生产。
本发明也涉及通过核移植克隆大鼠的体外方法，其中含有或包含前述根据本发明的方法。
根据本发明的一个具体实施方案，供体细胞也可以事先经过遗传操作，特别是通过正或负调节一个基因或整合一个异源基因而进行的遗传操作。本领域技术人员熟知哺乳动物细胞的遗传操作技术。
根据本发明的一个具体实施方案，重构的胚因此是转基因胚。
转基因也即整合入大鼠供体细胞基因组的异源核酸，它不局限于特定DNA序列。可以是编码异源蛋白质的序列，或者是编码能阻断内源基因产生的RNA翻译的RNA的序列，该RNA例如是反义RNA。转基因的核酸序列，尤其是DNA，可以是纯粹合成来源(例如常规使用DNA合成仪构建)，或者可以是通过逆转录而来自mRNA序列，或者可以直接来自基因组DNA序列。当DNA序列通过逆转录来自RNA序列时，可以包含或不包含所有或部分非编码序列，如内含子，根据相应RNA分子是否经受部分或完全的剪接而定。转基因可以小到几百碱基对的cDNA，或大到十万碱基对的、含有外显子-内含子编码序列和获得时空调控表达所需的调控序列的基因座。重组DNA片段大小可以是2.5kb-1,000kb。重组DNA片段也可以小于2.5kb或大于1,000kb，使之可以用YAC进行基因转移(Pook MA & al.2001)。
本发明的转基因或DNA序列优选是天然形式，即直接来源于动物细胞中天然存在的外源DNA序列。这种天然形式的DNA序列可以被修饰，例如插入克隆所需的限制性位点和/或插入位点特异性重组位点(lox和flp序列)。作为替代方案，可以通过化学合成或重组DNA技术，通过结合例如部分基因组DNA和cDNA体外人工创建本发明的DNA序列。
所述转基因优选包含适当的调控序列以指导和控制编码所述多肽的基因在适当细胞类型中的表达。对于控制基因表达的元件，我们理解是指参与调控基因表达，即主要是转录、剪接和翻译的所有核酸序列。在转录调控序列中，应该提及最小启动子序列、上游序列(例如SP1盒、IRE“干扰素应答元件”等)、活化子序列、可能的抑制子序列(“沉默子”)、绝缘子序列(“绝缘子”)和剪接序列。控制基因表达的元件可以实现组成型、广泛、诱导型、细胞类型特异的(“组织特异的”)、或发育阶段特异的表达。这些元件对所述生物体可以是异源的或不是异源的，或天然存在或不存在于所述生物体基因组中。很明显为了得到广受欢迎的结果，本领域技术人员将选择或采用基因表达的调控元件。为了指导转基因在动物生物液体如乳汁中的表达，所用转录调控序列选自在分泌这些生物液的细胞中特异活化的基因的启动子序列，如为指导在乳汁中表达的乳腺细胞。在优选生物液体中，应该提及乳汁、血液、精液和尿液。
根据本发明用转基因克隆大鼠生产感兴趣重组蛋白是本发明的一个目的。感兴趣的重组蛋白可以是任何蛋白，例如治疗性蛋白如α-、β-、δ-珠蛋白、凝血因子(因子VIII和IX)、细胞表面受体、抗体、酶等，和其它蛋白质，例如校正患者遗传缺陷或获得性缺陷所需要的蛋白质。
本发明也涉及根据本发明的克隆大鼠作为人类病理学研究模型的用途，尤其是根据本发明的转基因克隆大鼠作为人类病理学研究模型的用途。对于人类病理学的实例，应该提及粘稠物阻塞症、动脉硬化、癌症、代谢疾病和眼病。根据本发明的克隆大鼠也可用于任何神经生物学研究或行为模型中。
最有利的是，受体卵母细胞和/或供体细胞来源于选自近交系、杂合系和所谓非近交的“远交”系的大鼠品系。优选地，受体卵母细胞和/或供体细胞来源于非近交的“远交”系，如Sprague-Dawley或Wistar系。
通过作用于控制激活的生化过程的上游并通过防止负责将卵母细胞限制在中期的大分子化合物具体是细胞周期蛋白的降解，根据本发明的方法具有严格和可逆的控制卵母细胞激活过程的优点。为此，所述卵母细胞体外暴露于一种或多种蛋白酶体(一种关键的细胞器)抑制剂：对蛋白酶体在细胞周期蛋白上的蛋白裂解作用的抑制使得可以维持高水平的MPF动力学活性，这种活性决定中期限制。因而在收获后几个小时内，多数卵母细胞可以维持于第二次减数分裂的中期(表1)。
表1通过暴露于蛋白酶体抑制剂(MG132)对大鼠卵母细胞自发激活的抑制作用收集后激活卵母细胞的％(t＝0)
| T＝0 | t＝210m | |
| MG132 | 0％(0/68) | 33.8％(23/68) |
| 对照 | 0％(0/46) | 76.1％(35/46) |
重复次数，n＝2
当去除所述抑制剂时，可以触发激活机制，卵母细胞排出第二极体并启动正常发育(表2)。
表2暴露于蛋白酶体抑制剂(MG132)120分钟后大鼠卵母细胞自发激活抑制的可逆性
去除MG132并用丁内酯诱导激活过程后获得的胚(桑椹胚阶段的单性生殖发育)的％
| t＝0去除MG132 | t＝120分钟 |
| 0％(0/71) | 45.9％(34/74) |
重复次数，n＝5
卵母细胞在显微操作中保持其机械性能，使之可以有效的常规实现核移植需要的操作(表3)。
表3去除MG132并暴露于BLI后对通过核移植重构的大鼠胚的切割去除BLI 24小时后2细胞阶段胚的％
| 对照* | 66.5％(117/176) |
| MG132** | 89.2％(166/18) |
*重复次数＝4；**重复次数＝3
用根据本发明的方法，在就要进行重构胚之前将卵母细胞转移到不含抑制剂的培养基中。这样可以使核供体细胞免于直接暴露于抑制剂的作用。然后必须在蛋白酶体再次有功能之前非常快的进行胚重构，以避免卵母细胞的成熟前激活。这种快速重构的目的是延长核中凝缩染色质直接暴露于使外来细胞核活性可以重新编程的卵母细胞因子的时间。然后这样可以在给定时间段内重构更大数目的胚，并因此增加每个雌性受者中进行体内发育的移植胚的数目。这种可能性使得可以避免核移植后大鼠中观察到的低植入率。
表4从预先暴露于蛋白酶体抑制剂(MG132)的卵母细胞重构的大鼠胚的胎鼠发育率
*5只始终存活，11只在D12-D14之间存活
需要注意的是，在这些条件下植入胚发育成胎鼠的比率显著变高。这些胎鼠可以产生活大鼠幼仔(表4)。
材料和方法
1.收获大鼠卵母细胞
材料：
-无菌手术装置
·1把弯头镊子
·2把细直镊子
·1把小剪刀和1把大剪刀
·针头(23Gx1”)+注射器(5ml)
-双目放大镜+加热台
-操作吸管，也用于经吸管吹吸来取出此阶段围绕卵母细胞的细胞冠(“去冠”)
-Petri培养皿，35和60 mm直径
溶液
-M2培养基(Hogan & al，1994 In：Manipulating the Mouse Embryo)
-RECMB2*-MG132培养基(MG132＝1.25μM)
-M2-透明质酸酶-MG132培养基(MG132＝1.25μM；透明质酸酶＝2.5mg/ml)
-M2-MG132培养基(MG132＝5.00μM)
*RECMB2＝mR1ECM-BSA培养基(Oh & al.(1998)Biol.Reprod.)，其中BSA＝4mg/ml，NaCl＝100-130mM。
操作方法：
收获前一天：
-打开加热台并将M2培养基和石蜡油放置于37℃。
-准备含培养基(RECMB)的培养皿并放入37℃、5％CO2孵箱中
1.用37℃的培养基和M2和石蜡油准备用于收获卵巢-输卵管的培养皿(M2-MG132和M2-透明质酸酶-MG132)，并至少在收获前半小时放置于37℃加热台上。
准备：
-每只雌性动物2个35mm Petri培养皿，每个皿含1.5-2ml无油M2-MG132培养基。
-1个另外的无油M2培养皿，用于透明质酸酶后的漂洗-去冠。
-1个含油M2/透明质酸酶培养皿，用于两只雌性动物。
-整个收获期间所有培养皿放置于加热台上。
2.颈椎脱臼法逐个处死大鼠。
3.用70％乙醇擦遍毛皮。
4.用大剪刀和弯头镊子向上在腹部作一切口(皮毛+肌肉)。
5.处死后尽可能快(大约1-2min)的用第二把镊子和剪刀取出两侧卵巢和输卵管单元。沿输卵管向上到卵巢并回收卵巢-输卵管单元。将其转移入M2培养皿中。
6.当收集两个卵巢-输卵管单元时，用安装在5ml注射器上的无菌针头刺破每个输卵管的壶腹部以释放卵丘。
7.用移液器(pipetman P1000)收获卵丘并转移到另一个M2培养皿中，它们可以保存到收获另一个雌性动物的卵丘，或者在立即进行去冠的情况下转移入M2-透明质酸酶-MG132液滴中。
8.用移液器(pipetman P1000)将卵丘转移到一滴M2-透明质酸酶-MG132(500μl)中，等酶开始作用几秒，然后用移液器吹吸卵丘以加速解离。
9.一旦卵丘解离，立即转移卵母细胞到M2皿中(漂洗)，同时如果卵丘细胞太多，用去冠吸管完成机械“去冠”。
10.“去冠”后的卵母细胞转移到一滴RECMB2-MG132培养基中。
最大程度避免卵母细胞的热休克是必要的；因此应非常迅速操作并总是在37℃。
2.通过转移供体细胞的核到去核卵母细胞的细胞质中产生胚
材料：
-带微分干涉差功能的倒置显微镜和x4与x20物镜
-左右Eppendorf电动显微操作仪
-用于卵母细胞和核供体细胞的显微操作室
-用于操作卵母细胞的吸管
-用于维持卵母细胞的微量吸管
-用于去核-注射的微量吸管
-压电打孔(Piezo-Drill)系统
溶液：
-M2培养基
-RECMB2培养基
-RECMB2-MG132培养基(MG132＝1.25μM)
-RECMB2-BLI培养基(BLI＝150μM)
-SIGMA轻石蜡油，用于覆盖培养皿和显微操作室中的培养基
-SIGMA重石蜡油，用于微注射系统
-Fluorinert
操作方法：
所有加药或不加药的培养基(RECM)提前一天制备，用轻石蜡油覆盖并保持于37℃、5％CO2孵箱。
1.根据前述操作方案收获卵母细胞。
2.用合适的盖玻片装配显微操作室。
3.用移液器pipetman取约500μl M2在盖玻片上，形成伸长的液滴并用轻石蜡油覆盖。
4.用针头与橡胶管连接的1ml注射器从非拉出端用Fluorinert填充去核-注射微量吸管。小心不要将空气注射入微量吸管。
确认注射器(Eppendorf注射器)中有足量油。安装吸管前让一些油从吸管固定器中流出以确认在系统中没有气泡。
在对应的吸管固定器上安装维持和去核-注射吸管。
5.定位吸管使其末端水平，即与显微操作室的盖玻片平行并互相面对。
6.用操作卵母细胞的吸管转移卵母细胞和细胞到显微注射室。
7.将卵母细胞维持在维持吸管上，以使质膜变形，卵母细胞中期细胞核定位于所述质膜之下，并定位2-3小时或3-4小时。
8.在第3小时将去核-注射吸管施加于透明区。确认吸管恰好在透明区相同平面。轻吸透明区并驱动压电系统(设置1处)以刺破它。当系统完全调整好时根据理想穿刺刺破透明区几秒。
9.接着将形态对应理想标准的细胞吸入去核-注射吸管并经吸管内几次往复或经压电打孔(Piezo-Drill)(设置2处几次脉冲既已足够)破坏其质膜。维持细胞靠近微量吸管的末端。
10.从前面的穿刺孔刺入卵母细胞的卵周隙，将吸管靠着质膜并将供体细胞推回吸管末端，然后向上推吸管到卵母细胞的另一端但不达到对侧质膜。
11.用压电打孔(Piezo-Drill)(设置2处)一或多个脉冲(1-3)破坏质膜。
12.尽可能少带培养基将细胞注射入卵母细胞的细胞质。
13.轻轻抽出去核-注射吸管并重新封闭卵母细胞，这通过吸破损质膜和卵母细胞中期的两端来完成(去核)。
14.转移重构胚到RECMB2微滴(50μl)中。
15.通过转移卵母细胞到RECMB2-BLI微滴(20μl)中大约1-2小时的激活时间，触发或延长卵母细胞激活。
16.在4-5滴准备在相同培养基中培养的RECMB2(50μl)中漂洗卵母细胞，待转移到假孕雌性动物中或继续体外培养。
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Claims (20)
1.通过核移植产生重构大鼠胚的方法，其包括以下步骤：
a)取出大鼠卵母细胞并维持在适当培养基中；
b)将大鼠细胞核插入预先体外维持的受体大鼠卵母细胞中，以获得重构卵母细胞；
c)激活步骤b)中获得的重构卵母细胞，以获得重构胚；
其特征在于
-通过维持于包含可逆蛋白酶体抑制剂的适当培养基中，取出的受体大鼠卵母细胞被维持在第二次减数分裂中期阶段，和
-通过暴露于含激活诱导剂的适当培养基中，激活重构的卵母细胞。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于可逆蛋白酶体抑制剂选自Cbz-LLL-H、肽硼酸Cbz-LLL-B(OH)2、乙烯基砜Cbz-LLL-Vs、lactacystine和β-内酯、亮抑酶肽、MG101、MG115、MG262和PSI。
3.如权利要求2中所述的方法，其特征在于可逆蛋白酶体抑制剂是Cbz-LLL-H。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于维持受体卵母细胞的培养基中可逆蛋白酶体抑制剂浓度为1-10μM。
5.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于受体卵母细胞在维持培养基中暴露于可逆蛋白酶体抑制剂的时间小于10小时。
6.如权利要求5中所述的方法，其特征在于受体卵母细胞在维持培养基中暴露于可逆蛋白酶体抑制剂的时间为1-6小时。
7.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于对于步骤b)，受体卵母细胞的培养基中不含可逆蛋白酶体抑制剂。
8.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于步骤b)包括去除受体卵母细胞核的步骤，和随后将供体细胞核导入去核卵母细胞的步骤。
9.如权利要求8中所述的方法，其特征在于供体细胞核向受体卵母细胞的细胞质中的转移通过显微注射实现，和/或去除受体卵母细胞核通过显微吸取实现。
10.如权利要求1-3中的任意一项所述的方法，其特征在于步骤b)包括将供体细胞核导入受体卵母细胞的步骤，和随后去除受体卵母细胞核的步骤。
11.如权利要求10中所述的方法，其特征在于供体细胞核向受体卵母细胞的细胞质中的转移通过显微注射实现，和/或去除受体卵母细胞核通过显微吸取实现。
12.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于含有激活诱导剂的培养基不含可逆蛋白酶体抑制剂。
13.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于激活诱导剂是丁内酯-1。
14.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于所述重构胚是转基因胚。
15.如权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于所述重构胚被转移入雌性受者的输卵管或子宫，并且使得所述胚植入所述雌性受者的子宫中并在其中发育。
16.如权利要求15中所述的方法，其特征在于所述重构胚在1细胞阶段转移。
17.如权利要求15中所述的方法，其特征在于在所述重构胚2细胞阶段转移。
18.如权利要求15中所述的方法，其特征在于所述胚发育成胎鼠。
19.如权利要求18中所述的方法，其特征在于所述胎鼠发育成新生大鼠。
20.通过核移植克隆大鼠的体外方法，其中含有如权利要求1-19中任意一项中所述的方法。
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