ITMI981684A1 - Metodo di monitoraggio dell'avanzamento della reazione di substrati su supporto solido - Google Patents
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Description
Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "METODO DI MONITORAGGIO DELL'AVANZAMENTO DELLA REAZIONE DI SUBSTRATI SU SUPPORTO SOLIDO"
La presente invenzione si riferisce a un metodo per la determinazione di un conposto reversibilmente legato a un supporto solido, in particolare a un metodo per monitorare l'avanzamento di una reazione chimica condotta su supporto solido.
Si registra un notevole interesse legato all'uso della chimica combinatoria e della sintesi variomerica (parallela), in particolare su supporti in fase solida, per generare librerie di composti da testare in saggi biologici, per trovare nuovi composti guida nel "drug discovery". Il brevetto US 5.324.483 descrive un'apparecchiatura per la sintesi multipla simultanea su un supporto in fase solida seguita dal distacco per dare i composti di interesse. La resina REM rappresenta uno dei sistemi di supporto in fase solida sinteticamente più flessibili, e permette di ottenere composti con un alto grado di diversità o purezza (Brown A.R. et al. J. Am. Chem. Soc. (119)3288-3295 (1997) e Ouyang X. et al. J.Org.Chem. (63) 1027-1032 (1998)).
Uno svantaggio della chimica in fase solida è che spesso è difficile applicare tecniche analitiche comuni, quali la cromatografia o la spettroscopia, in modo convenzionale per monitorare l'avanzamento dei passaggi di una reazione. Per esempio, la spettrometria di massa (MS), anche se è una tecnica utile per l'analisi di librerie combinatoriali,è soggetta alla formazione di addotti e alla degradazione dell'analita che complicano l'interpretazione dei dati. L'NMR in fase solida è stato usato per il monitoraggio di reazioni, ma rappresenta una tecnica specialistica che richiede un'apparecchiatura complessa (Brown A.R. et al. J. Am. Chem. Soc. (119) 3288-3295 (1998)). Anche i metodi spettrofotometrici sono stati applicati a librerie combinatoriali, per esempio Chu e Reich hanno descritto l'uso di nitrofenil isotiocianato-O-tritile (NPIT) per l'analisi quantitativa o qualitativa di ammine su supporto solido (Biorganic and Medicinali Chemistry Lettere 5(10) 1053-1058 (1995). Shah et al. hanno descritto l'uso del reagente di Ellman [acido 5,5'-ditio bis(2-nitrobenzoico)(DTNB)] per la quantificazione di residui di cisteina legati a una matrice polistirenica utilizzando una molecola di glieina come connettore (Analytical Proceedings Including Analytical Communications,Aprile 1995, 32, 149-153).
Tuttavia, resta la necessità di disporre di metodi rapidi ed affidabili basati su tecniche convenzionali che possano essere usati per monitorare l'avanzamento di una reazione durante la preparazione di composti su supporto in fase solida.
La cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) è una tecnica analitica molto diffusa nell'analisi di conposti organici e la forma di determinazione più comune in HPLC è il rilevamento nell'ultravioletto (UV). Questo metodo di rilevamento si basa sulla presenza di un cromoforo nel componente di interesse in grado di assorbire la radiazione ultravioletta. L'assorbenza può essere usata per quantificare il componente presente. Lo svantaggio del rilevamento UV è che i conposti che non possiedono un cromoforo UV non possono essere determinati.
Si è ora trovato che la derivatizzazione di un conposto legato a una resina con un cromoforo e il successivo distacco del conposto derivatizzato con il cromoforo dalla resina, fornisce un metodo facile e riproducibile per la determinazione quantitativa di un conposto. In particolare, quando combinato con un opportuno sistema HPLC, il metodo permette la determinazione quantitativa dei singoli conponenti di una miscela di conposti, conpresi per esempio il substrato non reagito e il prodotto o i prodotti di una reazione chimica.
Pertanto, l'invenzione fornisce un metodo per la determinazione di un conposto reversibilmente legato a un supporto solido, che conprende la derivatizzazione di detto conposto con un grippo marcatore e il distacco del derivato marcato così ottenuto dal supporto solido, permettendo la determinazione del derivato marcato.
Conposti idonei sono i prodotti o i substrati di reazioni chimiche quali le reazioni di chimica combìnatoriale in fase solida.
Il conposto e il grippo marcatore, come unica condizione, devono essere in grado di fornire un derivato marcato: pertanto quando il conposto è un'ammina, il gruppo marcatore può essere un grippo in grado di fornire un derivato marcato rivelabile, per esempio un arilisocianato, quale fenilisocianato. In alternativa, quando il gruppo marcatore è fenilisocianato, il conposto può essere qualsiasi composto che fornisca un derivato marcato rivelabile, per esempio un'ammina quale β-alanina.
Un composto preferito è un‘annidila,per esempio β-alanina.
Supporti solidi idonei comprendono: resina Wang, resina Merrifield, resina acidica di Rink, resina ammidica di Sieber e resina idrossimetilica "photolinker - AM".
Il gruppo marcatore è convenientemente un cromoforo, specialmente un cromoforo UV che pertanto fornisce un derivato marcato rivelabile attraverso metodi di rilevamento UV.
Un esempio di un cromoforo UV è fenilisocianato (PIC).
Il derivato marcato può essere qualsiasi derivato formato dal composto e dal gruppo marcatore, che quindi è rilevabile grazie alla presenza del gruppo marcatore o di una sua porzione. Per esempio il derivato marcato prodotto da β-alanina e PIC è un'urea.
L'uso di fenilisocianato nel metodo descritto sopra è nuovo. Pertanto, secondo un ulteriore aspetto, l'invenzione fornisce fenilisocianato per uso come cromoforo UV, in particolare per uso nella derivatizzazione di un composto reversibilmente legato a un supporto solido che dopo distacco di detto derivato marcato ne consente la determinazione del derivato marcato con metodi di rilevamento UV.
Il distacco del composto derivatizzato dal supporto solido viene condotta usando metodologie standard adatte alla natura del composto e del derivato marcato.Per esempio,può essere usata l'idrolisi con acido trifluoroacetico. Altri metodi sono quelli descritti in "Protective Groups in Organic Synthesis (2<a >Edizione) Green T.W. e Wuts P.G.M., Wiley-Interscience,New York (1991)e Protecting Groups Koscienski P.J., Georg Thieme Verlag Stuttgart,New York".
Anche se il rilevamento UV è il metodo di rilevamento preferito dell'invenzione,qualsiasi metodo di rilevamento può essere usato purché sia in grado di rivelare il derivato marcato, per esempio MS (ESI o -APcI)O NMR.
Inoltre, il metodo dell'invenzione può essere usato per determinare un singolo composto o i componenti di una miscela di composti. Un'applicazione comune della determinazione di componenti separati di una miscela di conposti è il monitoraggio dell’avanzamento di una reazione chimica, quale ima reazione chimica in fase solida, quando sono presenti uno o più prodotti di reazione e inoltre è presente il substrato non reagito.
Quando è presente una miscela di composti, il gruppo marcatore che rende possibile la derivatizzazione viene scelto in modo tale da consentire di derivatizzare ciascuno dei composti nella miscela.
Quando è presente una miscela di composti, il metodo analitico è scelto in modo tale da consentire la separazione della miscela di derivati marcati, permettendo così la detezione di ciascun derivato marcato, per esempio con cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC).
Convenientemente, il metodo dell'invenzione è usato per la determinazione quantitativa di un composto, conpreso un conposto componente una miscela di conposti.
Secondo un aspetto preferito il metodo comprende:
(a) la derivatizzazione di un campione del conposto legato con PIC
(b) il distacco del composto derivatizzato dal supporto solido,
(c) la determinazione della quantità di conposto derivatizzato con HPLC usando rilevamento UV.
In maggior dettaglio, un’aliquota del volume di reazione contenente il substrato di reazione immobilizzato su supporto di resina viene sospesa in tetraidrofurano (THF), e vengono aggiunti n-propilammina e fenilisocianato. Il solvente viene quindi rimosso a pressione ridotta e il residuo sospeso in acido trifluoroacetico (TFA). I reagenti in eccesso vengono rimossi per evaporazione e il residuo disperso in metanolo. La miscela viene filtrata e il filtrato analizzato per HPLC in fase inversa. Questo metodo può essere usato per quantificare i conponenti presenti, dopo opportuna calibrazione con standard idonei. I metodi di calibrazione dei sistemi HPLC sono ben noti agli esperti del settore.
Secondo un ulteriore aspetto, il metodo può essere usato per la quantificazione di un determinato grippo funzionale su un supporto in fase solida,per esempio per valutare il caricamento di una resina in un passaggio preliminare di reazione.
Di seguito, l'invenzione viene descritta da un esempio che non -limita in nessun modo l'invenzione.
Esempio
E' stata monitorata la reazione di varie aldeidi aromatiche con 0-alanina legata ad una resina per produrre una serie di immine, mediante HPLC usando il metodo di derivatizzazione PIC (Schema 1) e mediante MS per determinare la quantità di β-alanina non reagita. Il metodo PIC previene la sovrastima della quantità di β-alanina non reagita che risulta dalla formazione di β-alanina aggiuntiva per idrolisi delle immine da parte di TFA (Schema 2). Le immine su supporto solido sono state ottenute per reazione tra β-alanina legata al polimero (Ramage R e Stewart A.S.J. J. Chem. Soc. Perkin Trans. (1) 1947-1950 (1993)) e un doppio eccesso molare di aldeidi aromatiche in sospensione di trimetilortoformiato per 18 ore (Look G.C. et al. Tetrahedron Lett. (36) 2937-2940 (1995)). Per la derivatizzazione PIC, il sipporto solido di resina (circa 3 mg) è stato sospeso in tetraidrofurano (THF) (1 mi), e sono state aggiunti n-propilammìna (10 microlitri di una soluzione 2,6 M in THF) e fani1isocianato (100 microliti di una soluzione 88 M in THF). Dopo circa un'ora, il solvente è stato rimosso in condizioni di pressione ridotta e il residuo sospeso in acido trifluoroacetico (TFA) al 95% per circa un'ora. I reagenti in eccesso sono stati rimossi per evaporazione e il residuo disperso in metanolo (1 mi). La miscela è stata filtrata e il filtrato analizzato per HPLC in fase inversa. Per l'analisi MS, i conponenti sono stati staccati dalla resina con TFA usando procedure standard.
Schema 2
L'analisi HPLC è stata condotta nelle seguenti condizioni:
Strumento: Pompa:SCHIMADZU LC-10AS
Autoiniettore:SHIMADZU SIL-9A
Rivelatore:SHIMADZU SPD-M10A
Colonna: 150 mm 4,6 mm i.d.ULTRACARB ODS305 micron
Fase mobile: A: acqua deionizzata:acetonitrile:acido trifluoroacetico 900:100:0,5 v/v
B: acqua deionizzata:acetonitrile:acido trifluoroacetico 100:900:0,5 v/v
Eluizione in
gradiente: da 20% B (5 min) a 80% B (10 min) in 20 min (gradiente lineare)
Programma: Riequilibrare al 20% di B per 10 min
Tempo di analisi:45 min
Velocità di flusso: 1 mi min-1
Rivelatore: UV a 220 nm
L'analisi MS è stata condotta nelle seguenti condizioni: Strumento: FIINNGAN TSQ700
Metodo di ionizzazione: Elettrospray
Introduzione del campione:iniezione diretta in "loop"
Velocità di flusso: 0,2 mi min-1 in una miscela di acetonitrile e acqua 1:1 v/v
Acquisizione dei dati: monitoraggio ionico selettivo per 0-alanina a m/z 90 [M+H]+ e m/z 131 [M+H+MeCN]+
I risultati sono mostrati in Tabella e chiaramente mostrano i risultati superiori del metodo PIC rispetto al metodo MS (prove 2, 3,4, 7 e 8), tenendo conto della sovrastima della 0-alanina per idrolisi dell'immina. Tre immine (prove 1, 5 e 6) si dimostrarono resistenti all'idrolisi TFA e pertanto fu ottenuto un buon accordo dei risultati con i metodi PIC e MS.
Ciò nonostante,a causa del comportamento inprevedibile delle imitine nei confronti del TFA, il metodo PIC è l'unica procedura affidabile per valutare e inoltre quantificare l'avanzamento di questa reazione.
Claims (4)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la determinazione di un composto legato reversibilmente a un supporto solido, che comprende la derivatizzazione di detto conposto con un grippo marcatore e il distacco del derivato marcato dal supporto solido,consentendo così la determinazione del derivato marcato.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui il gruppo marcatore è fenilisocianato (PIC).
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui il composto legato al supporto solido è 0-alanina.
- 4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3 che comprende: (a) la derivatizzazione di un carpione del composto legato con PIC, (b) il distacco del composto derivatizzato dal supporto solido, (c) la determinazione della quantità di composto derivatizzato mediante HPLC con rilevamento UV.
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