CN1793362A - 重组人甲3型流感病毒基质蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程产品的生产及应用技术领域，具体涉及一种重组人甲3型流感病毒基质蛋白以及该蛋白的生产方法及应用领域。本发明通过对人甲3型流感病毒M1蛋白抗原性的分析，选取抗原性较高的区域运用分子生物学方法进行抗原基因片段的体外重组并制备抗原基因片段对应的抗原蛋白，从而制备相应的抗体，解决了目前临床对甲型流感病毒感染不能早期、快速诊断的缺点。

Description

重组人甲3型流感病毒基质蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物工程产品的生产及应用的技术领域，具体涉及一种重组人甲3型流感病毒基质蛋白(matrix protein，M1)以及该基质蛋白的生产方法及其应用技术领域。

背景技术

流感病毒感染至今仍未得到很好的控制，仍然是引起人类死亡的主要病因之一。流行性感冒病毒(influenzavirus，IFV)，简称流感病毒，属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，根据病毒核蛋白(nucleoprotein，NP)和基质蛋白抗原性不同，分为甲、乙、丙3型；甲型流感病毒易发生变异，形成新的亚型，如甲1、甲3型。甲型流感病毒是反复流行最为频繁和引起流感全球流行的重要病原体。基质蛋白(M1蛋白)位于病毒脂质包膜下面，并与膜结合的蛋白。基质蛋白是由病毒RNA第7片段编码的，是病毒颗粒的主要结构蛋白，其大小为252个氨基酸残基。X线分析M蛋白晶体结构显示，M蛋白2-158氨基酸残基片段包含9个α-螺旋(H1-9)，8个环(L1-8)，没有β-片层(β-strand)。文献报道，重组表达M蛋白可用于检测感染患者体内流感病毒特异性的抗体；并且，Westernblot检测显示，体外重组表达的M蛋白，能够与针对M蛋白的表位特异(epitope-specific)单克隆抗体发生特异性反应。M1蛋白是流感病毒的主要抗原性蛋白之一，并且在型内具有很高的同源性，可以作为流感病毒病原学快速诊断的靶位点。

目前，临床通用的流感病毒诊断试剂，血清学诊断(如特异性IgG、IgA检测，血凝素抑制试验、补体固定试验等)、基因诊断、病原学诊断等。

血清学诊断基于感染患者体内特异性IgG或IgA的出现，不容易在病毒感染早期进行检测；并且，血凝素抑制试验由于血凝素抗原易于变异的特点而需要适时调整病毒抗原的制备。

临床上通用的流感病毒诊断试剂是针对流感病毒感染患者体内病毒特异性抗体，而病毒特异性抗体产生一般在发病两周后，此时即使检测出对临床的诊断治疗贡献不是很大。

亦有用流感病毒特异的单克隆抗体检测呼吸道感染标本中的病毒抗原，但这种抗体来源于从病毒感染细胞中制备的抗原所诱导产生，劳动成本大，并且受单克隆抗体针对唯一抗原位点的局限性，以及流感病毒的高变异性，容易造成假阴性。临床上对流感病毒感染的早期、快速诊断显得极为迫切。

基于人甲3型流感病毒M1蛋白抗原性预测分析，体外重组抗原片段并制备高效价抗体的生产工艺较传统病毒抗原获得、抗体制备有大量的优点，具有良好的应用前景，可以用于流感病毒抗原的快速检测。

发明内容

针对市场上现有的试剂不能高效、快速诊断的缺点，本发明人对流感病毒M1蛋白的核苷酸序列进行了分析，发明了高效、快速诊断流感疾病的抗体和其对应的抗原。

本发明第一个目的在于公开了编码重组人甲3型流感病毒M1蛋白抗原蛋白的基因序列及其编码的抗原蛋白序列。

本发明第二个目的在于公开了重组M1蛋白抗原的制备方法及其对应抗体的制备方法及其应用。

为了达到以上目的，本发明人采用了以下技术方案：

1、M蛋白的抗原性预测分析

用ClustalX(国家生物技术信息中心)、DNAsis(日本日立软件公司研发)软件，对来源不同的甲型流感病毒以及乙型流感病毒M1蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列的亚型间、型间同源性。比较分析发现，甲型流感病毒(A1、A3)内各亚型病毒M1蛋白的氨基酸序列同源性较高，约在95％以上，而甲、乙型之间序列同源性较低，约为30％。经Antheprot软件(法国蛋白质生物学和化学研究所研发)，进行M1蛋白的抗原性预测分析发现，在M1蛋白的N、C端分别有多个抗原性高峰分布区，中间区域(氨基酸残基：110-145)为α-螺旋跨膜区。

文献报道显示，在M1蛋白存在抗原性位点，57-68氨基酸残基区域是细胞毒T细胞的抗原表位。根据M1蛋白抗原表位分布情况，我们将M1蛋白分为M1P1(4-321碱基对)，M1P2(439-756碱基对)，以及M1全长片段(4-756碱基对)。根据Antheprot软件分析预测，M1蛋白含有如下抗原性位点：

M1P1：(4-321碱基对)含有的高抗原性表位，包括氨基酸残基：11-19；66-77；81-92；98-104；抗原表位分布较稀疏、抗原性波峰狭窄。M1P2：(439-756碱基对)含有的高抗原性表位，包括氨基酸残基：150-160；189-198；218-231；233-242。M1P2含有的抗原性表位较丰富、抗原性波峰高、宽，并且亲水性较高，相应的，疏水性较低，预测显示该抗原片段的抗原性较高。M1蛋白跨膜区位于氨基酸残基：57-63；120-133；140-149。

我们选择M1P2抗原性片段作为研究的靶位点，并预期有较高的抗原性。

2、M1抗原性片段基因的获得

2.1引物的设计和合成

对Genbank号为M19374的核苷酸序列进行分析，选取M1P2为研究对象，用Primer Premier软件(加拿大Premier生物软件国际公司)设计并合成如下引物(包含BamH I、Xho I限制性内切酶切位点)：

上游引物，5’cgg gat cct agt atg cgc aac ctg tg 3’

下游引物，5’tcc gct cga gct tga atc dtt gca tc 3’

2.2RT-PCR反应获得目的基因片断

用Trizol从人甲3型流感病毒标准株感染的MDCK细胞中提取病毒RNA，并逆转录为cDNA，以cDNA为模板，通过PCR扩增，获得序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因片段。

其中逆转录反应体系：向9μL RNA加入1μL Oligo dT(40μg/μL)，70℃，5分钟。冷却至室温。追加5×MLV buffer，5μL；10mmol/L dNTP，2.5μL；25mmol/L MgCl₂，3.75μL；RNasin，0.5μL；MMLV(200U/μL)，1μL；DEPC-H₂O，2.25μL。37℃，水浴，1小时。

PCR反应体系：10×buffer，5μL；10mmol/L dNTP，1μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；Taq聚合酶，1μL；25mmol/LMgCl₂，3μL；DW，37μL；模板，1μL。94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，1分钟，以上反应30个循环，72℃，5分钟。取6μL反应产物，走1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR扩增结果。

3、构建重组pET-28c(+)/IFV.ml原核表达质粒

将双限制内切酶BamH I、Xho I切割后的目的基因片段与内切酶BamH I、Xho I切割后的载体pET-28c(+)静置在反应体系中反应12-16小时，制备含有目的基因的重组质粒pET-28c(+)/IFV.ml。具体步骤如下：

3.1目的基因的酶切步骤：

将15μL目的基因片断放入2μL Xho I，2μL 10×buffer，37℃的反应体系中，静置反应12-16小时后，在反应体系中加入2μL BamH I，在37℃的温度条件下继续酶切2小时；

3.2pET-28c(+)质粒载体的酶切步骤：

将6μL pET-28c(+)质粒放入2μL BamH I、2μL Xho I、4μL10×buffer、26μL dH₂O、37℃的反应体系中，静置反应2小时；

3.3连接子的制备

取3μL酶切后的pET-28c(+)质粒载体、5μL酶切后目的基因片段置于1μL T4 DNA连接酶、1μL 10×buffer、16℃的反应体系中反应12-16小时；

4、用重组表达载体转化BL21细胞，并筛选阳性菌株

4.1制备感受态细胞

制备SolA和SolB溶液，SolA溶液：75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris-Cl(PH＝6.5)；SolB溶液：75mmol/L CaCl2、10mmol/L Tris-Cl(PH＝6.5)、10mmol/L RuCl。

向25mL LB培养基中加入300μL BL21细胞，37℃、160r/m、培养2小时，冰浴5分钟。4℃，5000r/m，离心5分钟。弃去上清液，加入10mL SolA、4℃、5000r/m、离心5分钟。再加入10mL SolB，冰浴30分钟。4℃，5000r/m，离心5分钟。弃去上清，加800μL SolB，4℃保存。

4.2转化感受态细胞，筛选阳性细胞

取2μL重组质粒pET-28c(+)/IFV.ml加入到200μL BL21DE3感受态细胞中，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴，热休克90秒。冰浴2分钟，加入200μL 37℃预热的LB培养基，37℃，150r/m培养50分钟。取转化细胞100μL涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板，37℃，培养过夜。

依据重组质粒载体含有卡那霉素抗性基因，并且只有重组质粒转化成功的BL21细胞才能够在含有卡那霉素的LB琼脂平板上能够生存这一特性进行阳性克隆筛选。

5、重组M1蛋白片段的诱导表达

从LB琼脂平板挑选2-3个阳性克隆单菌落，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/m培养2-3小时，至OD600值达0.5-0.7时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3-4小时，4℃，4000r/m，离心收集菌体。

6、重组M1蛋白片断的纯化

收集离心菌体，超声波破碎细菌，每次10秒，间隔30秒，破碎4-6次，至液体清亮。4℃离心后将上清液及沉淀分别走10％ SDS-PAGE凝胶电泳鉴定，显示为可溶性蛋白表达，目的蛋白相对分子量为11.4Kda，与预期蛋白相对分子量相符合。利用融合蛋白上的组氨酸标签，经镍琼脂糖柱进行亲和层析，得到氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的纯化蛋白，并且，重组蛋白表达量为10-15mg/L LB菌液，所述镍琼脂糖柱亲和层析的步骤为：4℃离心表达菌液，弃上清，加入5-10mL裂解液(50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，10mmol/L imidazole，pH8.0)裂解离心沉淀。Ni-NTA Agarose装柱，用平衡液(50mM NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，20mmol/L imidazole，pH8.0)平衡后与裂解产物在4℃结合60min。用5-10倍柱床体积的漂洗液(50mmol/LNaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，20mmol/L imidazole，pH8.0)洗涤3遍。最后用洗脱液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，300mmol/L imidazole，pH8.0)洗脱3-5遍。收集洗脱液。

7、抗重组M1蛋白的抗体的制备

用纯化重组M蛋白免疫家兔，具体步骤如下：第一天，取500μg重组蛋白，与弗氏完全佐剂(1∶1＝V∶V)充分乳化，背部皮下多点注射(1.0ml/只家兔)。第21天，取500μg重组蛋白，与弗氏不完全佐剂(1∶1＝V∶V)充分乳化，背部皮下多点注射(1.0ml/只家兔)。第35天，再次加强免疫，免疫成分、剂量、途径同第二次免疫。第42天，耳中动脉多次采血或颈动脉放血，1500r/m，15分钟，离心制备抗血清，置-20℃冻存备用。

8、抗血清免疫活性鉴定

用间接免疫荧光方法，将所制备的抗血清与人甲3型流感病毒感染MDCK细胞进行反应，同时设立阴性对照，将抗血清与正常MDCK细胞进行反应。取所制备的抗M1重组蛋白的抗血清与细胞涂片反应，并经FITC标记的山羊抗兔IgG(稀释度为1∶1000)放大反应，荧光显微镜下观察。结果显示在所制备的抗血清滴度为1∶1200时，在人甲3型病毒感染细胞核内点状荧光着色。

由于采用了以上技术方案，本发明具有以下效果：

本研究发明基于体外在原核系统中大量制备流感病毒重组M1蛋白抗原片段。原核表达体系，可以在体外表达目的片段，并经纯化获得大量抗原。免疫动物制备高效价多克隆抗体，所制备的抗体与相应型别流感病毒感染的MDCK细胞具有较好的反应特异性，抗体滴度(稀释度)达到1∶1200。

附图说明

图1为用Antheprot软件对人甲3型流感病毒M1蛋白抗原性的预测分析结果。

图2为人甲3型流感病毒M1基因片段PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。

图3为重组质粒pET-28c(+)/IFV.m1构建示意图。

图4为重组pET-28c(+)/IFV.m1质粒BamH I/Xho I酶切鉴定图。

图5为重组人甲3型流感病毒M1蛋白片段表达纯化SDS-PAGE电泳结果。

图6A为间接免疫荧光反应结果阴性对照图。

图6B为间接免疫荧光反应结果阳性对照图。

附图说明

1、目的基因片段          2、目的蛋白

3、未感染流感病毒的MDCK细胞

4、荧光着色的感染流感病毒的MDCK细胞

具体实施方式

实施例1 M1抗原性片段基因的获得

1、引物的设计和合成

根据Antheprot软件对M1蛋白抗原性的分析，结果如图1所示，M1P2(439-756碱基对)区域含有抗原性较高，选取M1P2为研究对象，用Primer Premier软件设计并合成如下引物(包含BamH I、Xho I限制性内切酶切位点)：

上游引物，5’cgg gat cct agt atg cgc aac ctg tg 3’

下游引物，5’tcc gct cga gct tga atc dtt gca tc 3’

2、RT-PCR反应获得目的基因片段

用Trizol从人甲3型流感病毒标准株感染的MDCK细胞中提取病毒RNA，向9μL RNA中加入1μL浓度为40μg/μL的Oligo dT在70℃下反应5分钟后冷却至室温，追加5μL 5×MLV buffer、2.5μL 10mmol/L dNTP、3.75μL 25mmol/LMgCl₂、0.5μL Rnasin、1μL浓度为200U/μL的MMLV、2.25μL DEPC-H₂O、37℃下水浴1小时进行逆转录为cDNA；

以cDNA为模板进行PCR反应，PCR反应体系为：10×buffer，5μL；10mmol/L dNTP，1μL；上游引物，1μL；下游引物，1μL；Taq聚合酶，1μL；25mmol/L MgCl₂，3μL；DW，37μL；模板，1μL。94℃，5分钟；94℃，1分钟，50℃，1分钟，72℃，1分钟，以上反应30个循环后，72℃，反应5分钟。

PCR反应后取6μL反应产物，走1.5％琼脂糖凝胶电泳，获得318bp的序列如SEQ ID NO.1所示的目的基因片段。电泳结果如图2所示，图中M为PBR322/Hinf I marker、Lane1为M1基因全长序列、Lane2-3为扩增产物目的基因片段。

实施例2 构建重组pET-28c(+)/IFV.m1原核表达质粒

实施例2-1 构建重组pET-28c(+)/IFV.m1原核表达质粒

1、将15μL SEQ ID NO.1片段放入2μL Xho I、2μL 10×buffer、37℃的反应体系中酶切12小时后，加入2μL BamH I，在37℃下继续酶切2小时；

2、将6μL pET-28c(+)放入2μL BamH I、2μL Xho I、4μL10×buffer、26μL dH₂O、37℃反应体系中进行酶切，静置反应2小时；

3、取5μL酶切后的SEQ ID NO.1片段和3μL酶切后的pET-28c(+)在1μL T4DNA连接酶、1μL 10×buffer、16℃的反应体系中进行连接反应12小时，得到重组的pET-28c(+)/IFV.m1原核表达质粒；从卡那霉素抗性的转化菌株中提取重组质粒，在经过BamH I和Xho I限制性内切酶切割重组质粒，用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图4所示，图4中Lane5为pBR322/HinfImarker、Lane1-4为M1目的基因片段，从图中可以看出所获得的酶切片段与预期318bp大小一致，重组的pET-28c(+)/IFV.m1原核表达质粒构建成功。

实施例2-2 构建重组pET-28c(+)/IFV.m1原核表达质粒

按照实施例2-1的步骤，只是将步骤1中的Xho I酶切SEQID NO.1片段的时间延到为14小时；将步骤3中的连接反应时间延长到14小时。

实施例2-3 构建重组pET-28c(+)/IFV.m1原核表达质粒

按照实施例2-1的步骤，只是将步骤1中的Xho I酶切SEQID NO.1片段的时间延到为16小时；将步骤3中的连接反应时间延长到16小时。

实施例3 用pET-28c(+)/IFV.m1质粒转化大肠杆菌BL21细胞

1、制备感受态细胞

制备SolA和SolB溶液，SolA溶液：75mmol/L CaCl₂、10mmol/L Tris-Cl(PH＝6.5)；SolB溶液：75mmol/L CaCl₂、10mmol/LTris-Cl(PH＝6.5)、10mmol/L RuCl。

向25mL LB中加入300μL BL21细胞，37℃，160r/m，培养2小时，冰浴5分钟；4℃，5000r/m，离心5分钟；弃去上清液，加入10mL SolB，冰浴30分钟；4℃，5000r/m，离心5分钟；弃去上清，加800μL SolB，4℃保存。

2、转化感受态细胞，筛选阳性细胞

取2μL连接子(重组质粒)加入到200μL 300μL BL21 DE3感受态细胞中，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴，热休克90秒。冰浴2分钟，加入200μL 37℃预热的LB培养基，在37℃下150r/m培养50分钟。取转化细胞100μL涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板，37℃，培养过夜。

实施例4 重组M1蛋白片段的诱导表达

实施例4-1 重组M1蛋白片段的诱导表达

从含卡那霉素LB琼脂平板挑选3个阳性克隆单菌落，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/m培养2小时，至OD600值达0.5-0.7时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导3小时，4℃，4000r/m，离心收集菌体。

实施例4-2 重组M1蛋白片段的诱导表达

步骤如实施例4-1所述，只是将在LB培养基中培养时间延长到2.5小时。

实施例4-3 重组M1蛋白片段的诱导表达

步骤如实施例4-1所述，只是将在LB培养基中培养时间延长到3小时。

实施例5 重组M1蛋白片断的纯化

实施例5-1 重组M1蛋白片断的纯化

收集离心菌体，超声波破碎细菌，每次10秒，间隔30秒，破碎4次，至液体清亮。4℃离心后将上清液及沉淀分别走10％SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定显示为可溶性蛋白表达，目的蛋白相对分子量为11.4Kda，与预期蛋白相对分子量相符合。鉴定结果如图5所示，其中M为蛋白Marker、Lane1为诱导前、Lane2为诱导后、BSA 1μg、Lane3-7为亲和层析洗脱次数(Lane3为洗脱1次、Lane4为洗脱2次、Lane5为洗脱3次、Lane6为洗脱4次、Lane7为洗脱5次)。经镍琼脂糖柱进行亲和层析，得到序列如SEQ ID NO.2所示的纯化重组M1蛋白，并且，重组蛋白表达量为10-15mg/L LB菌液。镍琼脂糖柱亲和层析的步骤为：4℃离心表达菌液，弃上清，加入5-10mL裂解液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L imidazole，pH8.0)裂解离心沉淀。Ni-NTA Agarose装柱，用平衡液(50mM NaH₂PO₄，300mmol/LNaCl，20mmol/L imidazole，pH8.0)平衡后与裂解产物在4℃结合60min。用5-10倍柱床体积的漂洗液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，20mmol/L imidazole，pH8.0)洗涤3遍。最后用洗脱液(50mmol/L NaH₂PO₄，300mmol/L NaCl，300mmol/Limidazole，pH8.0)洗脱4遍。收集洗脱液得到纯化重组M1蛋白。

实施例5-2 重组M1蛋白片断的纯化

所有步骤同实施例5-1所述，在纯化过程中将裂解液的加入量改为8mL，漂洗液的量改为8倍柱床体积。

实施例5-3 重组M1蛋白片断的纯化

所有步骤同实施例5-1所述，在纯化过程中将裂解液的加入量改为10mL，漂洗液的量改为10倍柱床体积。

实施例6 抗重组M1蛋白的抗体的制备

用纯化重组M1蛋白免疫家兔，具体步骤如下：第一天，取500μg重组蛋白，与弗氏完全佐剂(1∶1＝V∶V)充分乳化，背部皮下多点注射(1.0ml/只家兔)。第21天，取500μg重组蛋白，与弗氏不完全佐剂(1∶1＝V∶V)充分乳化，背部皮下多点注射(1.0ml/只家兔)。第35天，再次加强免疫，免疫成分、剂量、途径同第二次免疫。第42天，耳中动脉多次采血或颈动脉放血，4℃，1500r/m，15分钟，离心制备抗血清，置-20℃冻存备用。

实施例7 抗血清免疫活性鉴定

用间接免疫荧光方法，将所制备的抗血清与人甲3型流感病毒感染MDCK细胞进行反应，同时设立阴性对照，将抗血清与正常MDCK细胞进行反应。取所制备的抗M1重组蛋白的抗血清与细胞涂片反应，并经FITC标记的山羊抗兔IgG(稀释度为1∶1000)放大反应，荧光显微镜下观察。结果如图6所示在所制备的抗血清滴度为1∶1200时，在人甲3型病毒感染细胞核内点状荧光着色。其中A图为阴性对照图：抗重组M1蛋白抗体与MDCK细胞的间接免疫荧光反应结果。B图为阳性对照图：抗重组M1蛋白抗体(稀释度1∶1200)与流感病毒感染MDCK细胞的间接免疫荧光反应结果。

                        序列表

<110>首都儿科研究所

<120>重组人甲3型流感病毒基质蛋白及其制备方法和应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>318

<212>DNA

<213>Influenza A virus

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(318)

<223>

<400>1

gta tgc gca acc tgt gaa cag att gct gac tcc cag cat cgg tct cat     48

Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg Ser His

1               5                   10                  15

agg caa atg gtg aca aca acc aat cea cta atc aga cat gag aac aga     96

Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu Asn Arg

            20                  25                  30

atg gtt cta gcc agc act aca gcc aag gct atg gag caa atg gct gga    144

Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met Ala Gly

        35                  40                  45

tcg agt gag caa gca gca gag gcc atg gat att gct agt cag gcc agg    192

Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Asp Ile Ala Ser Gln Ala Arg

    50                  55                  60

caa atg gtg cag gcg atg aga acc gtt ggg act cat cct agc tcc agt    240

Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Val Gly Thr Hi s Pro Ser Ser Ser

65                  70                  75                  80

gct ggt cta aaa gat gat ctt ctt gaa aat ttg cag gcc tat cag aaa      288

Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Gln Lys

                85                  90                  95

cga atg ggg gtg cag atg caa cga ttc aag                              318

Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys

            100                 105

<210>2

<211>106

<212>PRT

<213>Influenza A virus

<400>2

Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg Ser His

1               5                   10                  15

Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu Asn Arg

            20                  25                  30

Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met Ala Gly

        35                  40                  45

Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Asp Ile Ala Ser Gln Ala Arg

    50                  55                  60

Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Val Gly Thr His Pro Ser Ser Ser

65                  70                  75                  80

Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Gln Lys

                85                  90                  95

Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys

            100                 105

Claims (8)

1、一种编码重组人甲3型流感病毒抗原蛋白的基因，其核苷酸序列如序列1所述。

2、权利要求1所述的基因编码表达的重组人甲3型流感病毒抗原蛋白，其氨基酸序列如序列2所述。

3、权利要求2所述的重组人甲3型流感病毒抗原蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的基因插入载体中；

(2)将含有目的基因的载体转化入大肠杆菌中；

(3)用含有卡那霉素的LB培养基对步骤(2)中的含有目的基因的载体的大肠杆菌进行选择；

(4)用含卡那霉素的培养基培养步骤(3)中选择出的含有目的基因的大肠杆菌，收集菌体；

(5)用超声波对步骤(4)中的菌体进行破碎，并用Ni琼脂糖柱进行亲和层析纯化，得到重组人甲3型流感病毒抗原蛋白。

4、权利要求3所述的重组人甲3型流感病毒抗原蛋白的制备方法，其中所述的载体为pET-28c(+)质粒。。

5、包含有权利要求1所述的编码重组人甲3型流感病毒抗原蛋白的基因的重组载体pET-28c(+)/IFV.m1。

6、权利要求3或4所述的重组人甲3型流感病毒抗原蛋白的制备方法，其中所述的大肠杆菌为BL21 DE3大肠杆菌。

7、权利要求2所述的重组人甲3型流感病毒抗原蛋白的抗体，该抗体是用权利要求2中的重组人甲3型流感病毒抗原蛋白对家兔进行免疫获得的，具体步骤如下：

(1)第1天，取重组人甲3型流感病毒抗原蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化，背部皮下多点注射；

(2)第21天，取重组人甲3型流感病毒抗原蛋白与弗氏不完全佐剂充分乳化，背部皮下多点注射；

(3)第35天再次加强免疫，步骤同(2)；

(4)第40天，对家兔耳中动脉多次采血或颈动脉放血，1500r/m，15分钟，离心制备抗血清，于-20℃冻存备用。

8、权利要求2所述的重组人甲3型流感病毒抗原蛋白在制备抗体中的应用。

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