CN1763122A

CN1763122A - 水溶性聚合物链烷醛

Info

Publication number: CN1763122A
Application number: CN 200510113391
Authority: CN
Inventors: A·柯泽罗斯克
Original assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Current assignee: Nektar Therapeutics AL Corp
Priority date: 2002-09-09
Filing date: 2003-09-09
Publication date: 2006-04-26
Anticipated expiration: 2023-09-09
Also published as: CN1329427C; CN1688631A; TNSN05055A1; CN100369953C; ZA200501977B; ZA200502507B

Abstract

本发明涉及水溶性聚合物如聚(乙二醇)的链烷醛衍生物，它们的相应水合物和缩醛，和涉及制备和使用此类聚合物链烷醛的方法。本发明的聚合物链烷醛是以高纯度制备的和显示出贮存稳定性。

Description

水溶性聚合物链烷醛

本发明的领域

本发明涉及水溶性聚合物的特定醛衍生物，和涉及制备该聚合物醛衍生物的方法和使用它的方法。

本发明的背景

近年来，人类治疗学已经突破过去传统的小分子药物进入到生物药物领域中。新型蛋白质和肽的发现已经导致了许多蛋白质和多肽生物药物的开发。不幸地，蛋白质和多肽，当用作治疗剂时，常常显示出一些性能使得它们极难配制或给药，如短的循环半衰期，免疫原性，蛋白水解降解，和低溶解度。改进生物药物的代谢动力学或药物动力学性能的一种途径是接合到天然或合成聚合物如聚乙二醇(PEG)上。PEG以共价键连接于治疗蛋白质上能够得到许多优点，如(i)遮蔽蛋白质的抗原性表位，因此减少它的网状内皮的清除和被免疫系统的识别，(ii)减少蛋白水解酶引起的降解，和(iii)减少肾脏过滤。

对于偶联于生物药物如肽上的聚合物衍生物的开发，尤其对于偶联于蛋白质的反应活性氨基上的聚合物衍生物的开发已经投入许多工作。此类聚合物衍生物称为“亲电活化的”，因为它们携带适合与亲核试剂如胺反应的亲电子基团。此类PEG衍生物的例子包括PEG二氯三嗪，PEG tresylate，PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯，PEG羰基咪唑，和PEG琥珀酰亚胺基琥珀酸酯。不幸地，这些特定试剂的使用能够导致一个或多个下列问题：在进行偶联所需要的反应条件下发生不希望有的副反应，选择性的缺乏，和/或在生物药物与PEG之间形成弱(即不稳定的)键。

为了克服这些问题中的一些，已经开发了许多新的或“第二代”亲电活化的PEG，如PEG丙醛和PEG乙醛(分别参见，例如，US专利5,252,714和5,990,237)。醛衍生物是用于偶联于蛋白质和其它生物分子上的特别有吸引力的试剂，因为醛类仅仅与胺反应(即，在它们的连接化学性质上是有选择的)。上述试剂提供许多优点：它们能够在制备时避免PEG二醇污染的问题，不局限于低分子量mPEG，在偶联时形成稳定的胺键，并且是选择性的。虽然以上指出的衍生物与第一代PEG试剂相比提供许多优点，但是申请人已经指出了这些醛试剂的一些特殊的缺陷，使得它们在某些情况下不太理想。

更具体地说，申请人已经在针对这些试剂的大量工作中认识到，PEG乙醛是非常不稳定的，特别在碱性介质中，并且由于反应混合物的中和所引起的过多盐形成而难以分离。尤其，PEG乙醛对于经由醛醇缩合的二聚作用是非常敏感的。PEG丙醛，尽管就它的稳定性而言是好得多的试剂，但仍具有一些缺点，由于在制备过程中发生的副反应，使得它难于以高的纯度获得PEG丙醛产物。

更具体地说，申请人已经发现当从它的前体PEG醛水合物原位制备PEG丙醛时，产物收率一般是仅仅约50％，这归因于消耗了较大部分的乙缩醛试剂的消除反应。虽然能够使用用于PEG丙醛的合成的改进合成路线，即，利用3-羟基丙醛二乙基缩醛与PEG甲磺酸盐的碱催化反应，但是申请人已经这些发现这一反应路线也会导致产生较大量的不稳定的PEG乙烯基醚和产生难以除去的母体二羟基PEG(也称作PEG二醇)的消除副反应。因此，这一反应的产率一般低于约85至90％。另外，使用上述PEG丙醛合成中的任何一个将需要在极低pH下，例如在2或2以下的pH下的缩醛中间体的水解。在如此低的pH下的水解是不希望有的，这归因于为了中和反应混合物到适合于接合的pH所需要的大量碱。另外，PEG丙醛在碱性pH下偶联到蛋白质上也会因为大量相当难以除去丙烯醛(由逆Michael型副反应产生)的形成而存在问题。这些所不希望有的副产物的形成需要彻底的提纯以获得药物纯等级产物。

因此，仍然需要接合到生物活性分子和表面上的改进的亲电活化聚合物衍生物，尤其符合下列条件的聚合物衍生物：(i)在它们的偶联化学性质上是选择性的，(ii)能够以高产率和较少的反应步骤制得，(iii)在宽的pH范围内是稳定的，(iv)能够容易地分离，(iv)能够以高纯度制备(即，基本上不存在聚合物派生的杂质和副产物)，和(v)克服了已知的聚合物衍生物例如如上所述的那些衍生物的缺陷当中的至少一些。

本发明概述

本发明提供了独特家族的聚合物链烷醛-即，包括至少一个由一个或多个中间碳原子联接于聚合物链段上的醛官能团的聚合物。

在很大程度上，本发明的聚合物链烷醛比现有技术醛衍生物有更低的反应活性，因此，更有选择性。此外，本发明的聚合物链烷醛是以高的产物制得，某些结构能够在简单的单步骤方法中制备。在这里描述的某些聚合物醛在碱性pH下比现有技术的已知的醛衍生物有更高的稳定性，并且在没有显著的或甚至没有可检测量的逆Michael型反应副产物下形成。另外，本发明的聚合物链烷醛是在温和的酸性条件下，即在不如PEG乙醛或PEG丙醛所需要的苛刻的酸性条件下，由水解作用从相应的缩醛前体形成的。这一温和条件允许本发明的聚合物衍生物与蛋白质，肽，或其它分子靶物的直接原位接合，无需中间的分离步骤。本发明的聚合物链烷醛还以高的纯度制得，使得它们特别有利地偶联于药物和生物药物上而得到具有足以对哺乳动物受试者给药的纯度的聚合物接合组合物。

更具体地说，在一个方面，本发明涉及具有以下结构的水溶性聚合物：

在以上结构中，POLY表示水溶性聚合物链段；X’是连接基结构部分；z’是1-约21的整数；R¹，在各情况下，独立地是H或选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基中的有机基团；和R²，在各情况下，独立地是H或选自烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有机基团。

在一些情况下，本发明的聚合物链烷醛将具有某些特征。例如，根据本发明的一个实施方案，当POLY是线形：(a)在聚合物中存在的羰基的总数(排除/不计数该醛羰基碳)是0或2或2以上，而当X’包括一个或多个邻接(-CH₂CH₂O-)或(-CH₂CH₂NH-)链段时则除外。当X’包括一个或多个邻接(-CH₂CH₂O-)或(-CH₂CH₂NH-)链段时，则在聚合物中存在的羰基的总数是0，1，2，或更大。

在又一个实例中，根据另外的实施方案，当X’是氧或包括至少一个(-CH₂CH₂O-)链段和z’是2-12时，则在至少一种情况下R¹或R²的至少一个是如以上所定义的有机基团或聚合物是非同类双官能化的，其中POLY包括在一端的不是羟基的反应活性基团。

在这里提供的聚合物链烷醛可以具有大量的将在这里更详细地描述的总体几何形状或结构当中的任何一些。优选，当POLY是支化的时，则(i)在至少一种情况下R¹或R²的至少一个是如以上所定义的有机基团或(ii)对于POLY包括赖氨酸残基的情况，X’包括-(CH₂CH₂O)_b-，其中b是1-约20。另外地，当POLY是支化的和具有两个聚合物分支时，则对于其中POLY包括“C-H”作为分支点的情况，没有聚合物分支包括氧作为唯一的杂原子。

一般而言，本发明的聚合物链烷醛具有一种结构，其中z’是在下列范围中的一个范围之内：z’是约2-21，约3-12，约3-8，或3-约6。

在本发明的一个特定的实施方案中，聚合物具有以下结构：

其中POLY，X’，各R¹，各R²和R³如上所定义。在前面的结构中，C₁表示醛羰基碳；C₂表示与羰基碳或C₁相邻的或在其α位的碳；C₃表示从羰基碳隔开一个的或处于β位的碳原子；和C₄表示在γ位的碳原子。具有由I-A描述的总体结构的聚合物链烷醛一般在这里称作聚合物丁醛。在以上通式I-A的优选变型中，连接于C₂上的R¹是烷基，和全部其它R¹和R²变量是H。优选，连接于C₂的R¹是低级烷基。另外地，聚合物链烷醛对应于以上结构I-A，其中连接于C₃的R¹是烷基，和全部其它R¹和R²变量是H。在又一个优选实施方案，聚合物链烷醛由结构I-A描述，其中连接于C₄的R¹是烷基，和全部其它R¹和R²变量是H。

在又一个特定的实施方案中，本发明的聚合物链烷醛对应于通式I，和当与结构I-A对比时，在亚烷基链中具有另外的碳原子。在这一实施方案(在这里参见结构I-B)中，z’是4，连接于C₂的R¹是烷基，和全部其它R¹和R²变量是H。或者，连接于C₃或C₄的R¹是烷基，和全部其它R¹和R²变量是H。

在属于通式I的又一个特定的实施方案中，z’是5，连接于C₂的R¹是烷基，和全部其它R¹和R²变量是H(在这里参见结构I-C)。或者，连接于C₃或C₄或C₅上的R¹变量中的一个是烷基，和全部其它R¹和R²变量是H。

在某些实施方案中，根据通式I的聚合物链烷醛具有一般由下面结构式描述的连接基结构部分：-(CH₂)_c-D_e-(CH₂)_f-或-(CH₂)_p-M_r-C(O)-K_g-(CH₂)_q-，其中c是0到8；D是O，NH，或S；e是0或1；f是0到8；p是0到8；M是-NH或O；K是NH或O；q是0至8，以及r和s各独立地是0或1。属于这一通式的特定的连接基在下面更详细地描述。

该连接基结构部分可以任选包括对应于结构-(CH₂CH₂O)_b-或-(CH₂CH₂NH)_g-的低聚链段，其中b和g各自独立地是1-20。优选，b和g各自独立地是约1-10，和甚至更优选是约1-约6。这些低聚连接基为本发明的链烷醛提供附加的稳定性，并且还在制备聚合物的合成方法中提供一些优点，下面将详细描述。

更具体地说，在某些实施方案中，X’包括对应于以下结构的结构部分：-(CH₂)_c-D_e-(CH₂)_fP-或-(CH₂)_p-M_r-C(O)-K_g-(CH₂)_q-T-，其中P和T各自独立地是-(CH₂CH₂O)_b-或-(CH₂CH₂NH)_g；和b和g各独立地是1-约20。在根据通式I的聚合物链烷醛的特定实例中，X’包括-C(O)NH-(CH₂)_1-6NH-C(O)-或-NHC(O)NH-(CH₂)_1-6NH-C(O)-。

优选，本发明的聚合物链烷醛的水溶性聚合物链段是聚(烯化氧)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚噁唑啉，聚(丙烯酰基吗啉)，或聚(乙氧基化的多元醇)。在优选的实施方案中，聚合物链段是聚(烯化氧)，优选聚(乙二醇)。

根据一个实施方案，该聚(乙二醇)链段包括下面结构：Z-(CH₂CH₂O)_n-或Z-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，其中n是约10-约4000和Z是包括下述官能团的结构部分，该官能团选自羟基，氨基，酯，碳酸酯，醛，链烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，异氰酸酯，异硫氰酸酯，酰肼，马来酰亚胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，苄氧基，硅烷，类脂，磷脂，生物素，和荧光素。

或者，POLY可以被封端结构部分如烷氧基，取代的烷氧基，链烯氧基，取代的链烯氧基，炔氧基，取代的炔氧基，芳氧基，和取代的芳氧基所封端。优选的封端基团包括甲氧基，乙氧基，和苄氧基。

一般，POLY具有属于下列范围中的一个范围内的标称平均分子量：约100道尔顿到约100,000道尔顿，约1,000道尔顿到约50,000道尔顿，或约2,000道尔顿到约30,000道尔顿。POLY的优选的分子量包括250道尔顿，500道尔顿，750道尔顿，1kDa，2kDa，5kDa，10kDa，15kDa，20kDa，30kDa，40kDa，和50kDa，或甚至更大。

在又一个特定的实例中，本发明的聚合物链烷醛包括以下结构：

其中POLY，各X’，各(z’)，各R¹，各R²，和各R³如前面所定义。在特定的实例中，POLY是线形的和聚合物是同类双官能化的。

如上所述，在聚合物链烷醛内的聚合物链段可以具有大量的几何形状中的任何一些，如线形，支化，分叉，多分支，或树枝状的，下面将更详细描述。

本发明的特定实例包括对应于下列结构的聚合物链烷醛：

在上述结构中，PEG是聚(乙二醇)，以及b和g各自独立地是0到20，a是0到6。对于在本节中提供的通用化结构，变量对应于前面提供的范围/值，除非另作说明。

在特定的实例中，根据本发明的聚合物链烷醛对应于下面结构：

属于通用化结构III-D中的一种特别优选的聚合物链烷醛具有下面结构：

根据另一个方面，本发明涉及包括具有下面结构的水溶性聚合物的组合物：

VII

其中组合物不含有可检测量的含有碘的物质或逆Michael型反应产物。这是特别有利的，因为含碘的物质能够导致由于链断裂的聚(乙二醇)链的降解，得到具有高的多分散性数值，例如大于约1.2的聚合物产物。优选地，本发明的聚合物链烷醛将具有低于约1.2，优选低于约1.1，和甚至更优选低于约1.05的多分散性数值。甚至更优选的是聚合物链烷醛，如以1.04，1.03或更小的多分散性为特征的在这里描述的那些。

根据又一个方面，本发明涉及包括具有下面结构的水溶性聚合物的组合物：

其中POLY是线形、末端封闭的水溶性聚合物链段并且该组合物不存在可检测量的二醛聚合物衍生物。

本发明的聚合物链烷醛的另一个特征是它们与其它已知的聚合物醛组合物相比的稳定性，例如，贮存稳定性。例如，在这里提供的是当在40℃下贮存15天时显示聚合物醛基的10％或10％以下降解(由NMR测得)的聚合物链烷醛组合物。

在优选的实施方案中，本发明的组合物包括对应于下列结构的聚合物链烷醛：

在甚至更优选的实施方案中，根据结构VII-A，POLY具有结构Z-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-，其中X是0，n是约10-约4000，和Z包括官能团，靶结构部分，报道基团，封端基团，等等。

本发明的另一种组合物包括根据下面结构的聚合物：

在本发明的又一个方面，提供的是上述聚合物链烷醛的水合物或缩醛形式。

本发明的缩醛包括二甲基缩醛，二乙基缩醛，二异丙基缩醛，二苄基缩醛，2，2，2-三氯乙基缩醛，双(2-硝基苄基)缩醛，S，S’-二甲基缩醛，S，S’-二乙基缩醛，和二氧戊环。

更具体地说，本发明的聚合物链烷醛的缩醛或水合形式可以一般由下面结构来描述：

其中W^a和W^b各自独立地是O或S，以及R³和R⁴各自独立地是H，或选自甲基，乙基，异丙基，苄基，1，1，1-三氯乙基，和硝基苄基中的有机基团，或当连接在一起时，是-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-，当与W^a、C₁和W^b一起考虑时形成5员或6员环。聚合物缩醛是本发明的链烷醛的有用前体，并能够水解得到聚合物链烷醛。

在一个特定的实例中，所提供的是具有以下结构的水溶性聚合物：

在结构IX-A中，链烷醛是有仅仅亚甲基或-(CH₂)-碳将该分子的缩醛或醛水合物部分与该连接基X’分开的一种链烷醛。

此外，本发明涉及由生物活性剂与在这里描述的聚合物链烷醛的反应所形成的接合物，它们的水合物和/或相应链烷醛。

优选地，该接合物对应于下列结构：

其中“NH-生物活性剂”表示包括氨基的生物活性剂。

还构成本发明的一部分的是由在这里描述的聚合物链烷醛或它们的前体形成的水凝胶。

根据又一个方面，本发明提供了受保护的醛试剂。这些被保护的醛试剂特别可用于形成本发明的聚合物链烷醛，并且一般对应于下列结构：

其中G是官能团，和剩余变量具有以上所给出的值。

在结构XI-A，B和C的优选实例中，G是离去基团如氯，溴，对-甲苯基磺酸酯，甲基磺酰酯，三氟磺酸酯，和三氟乙基磺酸酯。

或者，G是选自-OH，-NH₂，-SH，和它们的被保护形式中的官能团。

本发明的另一种方面涉及制备水溶性聚合物链烷醛(任选为受保护的形式)的方法。简言之，该方法包括下述步骤：在有效形成被保护形式的水溶性聚合物链烷醛的条件下，让包含至少一个反应活性基团Y的水溶性聚合物与包括约2到20个碳原子和反应活性基团K(适合于被Y置换)的受保护的链烷醛试剂进行反应，或者与Y反应。在这一方法中，活化的聚合物联接于含有最终产品的链烷醛部分的试剂或它的前体上。

优选，反应是在惰性气氛下进行。

在一个特定的实例中，POLY-Y通过直接聚合来制备的。

方法也可包括例如在酸性条件下，将已保护的水溶性聚合物链烷醛水解形成相应水溶性聚合物链烷醛的附加步骤。

在优选的实施方案中，该水解步骤是在不低于约3的pH下进行的。

用于进行该方法的链烷醛试剂的被保护形式包括缩醛如二甲基缩醛，二乙基缩醛，二异丙基缩醛，二苄基缩醛，2，2，2-三氯乙基缩醛，双(2-硝基苄基)缩醛，S，S’-二甲基缩醛，和S，S’-二乙基缩醛，环状缩醛和环状硫缩醛。

在又一个实例中，所生产的聚合物链烷醛通过将反应混合物的pH提高到约6.0-7.5，将聚合物链烷醛萃取到有机溶剂中，和除去溶剂来回收。

在该方法的优选实施方案中，水溶性聚合物对应于结构“POLY-Y”，并且受保护的链烷醛试剂对应于以下结构：

优选，POLY包括可以封端或不封端的聚(乙二醇)。

在该方法的一个具体的实施方案中，POLY-Y包括结构Z-(CH₂CH₂O)_nH，其中n是约10-约4000，和Z选自-OCH₃，-OCH₂CH₃和-OCH₂(C₆H₅)。在另一实施方案中，POLY-Y包括结构Z-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂O^-M⁺，其中POLY-Y是通过环氧乙烷的阴离子开环聚合到封端的醇盐Z-CH₂CH₂O^-M⁺(用强碱使Z-CH₂CH₂OH的末端-OH基团金属取代而制得)上所制备的。M⁺表示金属抗衡离子如Na⁺，K⁺，Li⁺，Cs⁺，Rb⁺。所制备的POLY-Y适合与如上所述的受保护的链烷醛试剂反应。

在另一个特别优选的实施方案中，回收的链烷醛不存在可检测量的未反应的POLY-Y(例如，Z-(CH₂CH₂O)_nH)和逆Michael型反应产物。

在该方法的叉一个实施方案中，POLY-Y对应于PEG-二醇，即POLY-Y具有结构HO-(CH₂CH₂O)_nH，其中n是约10-约4000，K选自：

和该方法导致具有以下结构的受保护的聚合物链烷醛的形成：

在该方法的又一个实施方案中，POLY-Y包括结构Z-(CH₂CH₂O)_nH，其中n是约10-约4000，和Z是保护的羟基。在这一情况下，该方法的优选实施方案包括在反应步骤之后将受保护的羟基去保护，任选地接着将聚(乙二醇)的末端羟基转化成除羟基之外的官能团。

举例的官能团包括氨基，酯，碳酸酯，醛，链烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，异氰酸酯，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，和硅烷。优选，该官能团选自N-羟基琥珀酰亚胺基酯，苯并三唑基碳酸酯，胺，保护的胺，乙烯基砜，和马来酰亚胺。

根据本发明的又一个实施方案，在POLY-Y中的“Y”是可电离的基团或是可电离的基团如羧酸、活性酯或胺的衍生基团。优选，在用于反应步骤中之前，POLY-Y已经进行色谱提纯。在一个特殊的实施方案中，POLY-Y在使用之前由离子交换色谱法提纯。理想地，用于反应步骤中的此类色谱提纯的POLY-Y基本上不存在可检测量的聚合物杂质。在这一方法的一个此类实施方案中，POLY-Y是封端的，并且基本上不存在可检测量的PEG-二醇或双官能的PEG杂质。

另外地，在实施本发明的方法时，该链烷醛试剂包括以下结构：

或

其中g和b各自独立地是约1-约20。例如，优选的链烷醛试剂对应于下面的结构：

和该反应步骤的产物具有下面通式化的结构：

在制备本发明的聚合物链烷醛的又一个途径中，在这里所述的聚合物链烷醛是通过将聚合物链段直接构造在缩醛前体上，例如，通过直接聚合来制备的。更具体地说，这一方法包括下面的步骤：

(i)提供包含适合于引发聚合反应的至少一个活性阴离子部位的缩醛前体，

(ii)让缩醛前体与能够聚合的反应活性单体相接触，由此引发该反应活性单体聚合到缩醛前体之上，

(iii)作为该接触步骤的结果，将附加的反应活性单体加成到该缩醛前体中以形成聚合物链，

(iv)让接触继续进行，直至达到了聚合物链的所需长度为止，和

(v)终止反应获得本发明的聚合物醛前体。

如果需要，所形成的聚合物醛前体能够进一步水解成如以上所述的相应链烷醛。

在以上方法的一个特定的实施方案中，反应活性单体是环氧乙烷并且含在缩醛前体之内的反应活性阴离子部位是醇盐阴离子(O-)，优选伴有碱金属或其它合适的抗衡离子。在缩醛前体中存在的醇盐端基对于环氧乙烷的阴离子开环聚合形成本发明的聚合物链烷醛而言是有活性的。

该缩醛前体一般具有对应于下式的结构：

其中变量具有如上所述的值，例外的是X’是以氧阴离子或O^-终端(例如，在它的中性形式，X’典型地以羟基或-OH终端，和在强碱存在下，转化成相应醇盐)。合适的抗衡离子包括Na⁺，K⁺，Li⁺和Cs⁺。该终止步骤一般包括中和该反应，例如，通过添加酸。任选地，聚合物链段可以通过烷基化试剂或适合提供非反应活性末端的其它试剂的添加来封端。

当结合下面的详细说明进行阅读时，本发明的这些和其它的目的和特征将变得更加清楚。

附图的简述

图1是由环氧乙烷(EO)的阴离子开环聚合到具有阴离子部位的缩醛前体上来制备本发明的聚合物链烷醛的一般性反应示意图。

本发明的详细说明

在详细地描述本发明之前，需要理解的是，本发明不局限于特定的聚合物、合成技术、活化剂等等，这些可以变化。需要理解的是，这里所使用的术语是为了描述仅仅特定的实施方案和不希望是限制意义。

必须指出，正如在本说明书中所使用，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数对象，除非该文本清楚地另外指定。因此，例如，“聚合物”的含义包括单种聚合物和两种或多种相同或不同的聚合物，“接合物”的含义指单种接合物和两种或多种相同或不同的接合物，“赋形剂”的含义包括单种赋形剂和两种或多种相同或不同的赋形剂，等等。

在描述和要求保护本发明时，下列术语将根据如下所述的定义来使用。

定义

在这里使用的下面术语具有所指定的含义。

如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数对象，除非上下文另外清楚地指明。

在这里使用的“PEG”或“聚(乙二醇)”意指包括任何水溶性聚(环氧乙烷)。典型地，用于本发明的PEG包括下列结构中的一种：“-(CH₂CH₂O)_n-”或“(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂-”，这取决于末端氧是否被替代，例如在合成转化过程中。该变量(n)是3-3000，并且整个PEG的端基和结构可以变化。当PEG进一步包括连接基结构部分(下面将更详细描述)时，构成该连接基(X’)的原子当以共价键连接于PEG链段时，不会导致(i)氧-氧键(-O-O-，过氧键)，或(ii)氮-氧键(N-O，O-N)的形成。“PEG”指含有主要的，即大于50％的子单元-CH₂CH₂O-的聚合物。用于本发明中的PEG包括具有各种分子量、结构或几何形状(例如，支化，线形，分叉的PEG，树枝状体，等等)的PEG，下面将更详细描述。

在本发明的聚合物的范围内的“水溶性”或“水溶性聚合物链段”是在室温下可溶于水中的任何链段或聚合物。典型地，水溶性聚合物或链段将透射由同一溶液在过滤之后所透射的光的至少约75％，更优选至少约95％。按重量计，水溶性聚合物或它的链段优选至少约35％(按重量)可溶于水，更优选至少约50％(按重量)可溶于水，再更优选约70％(按重量)可溶于水，和再更优选约85％(按重量)可溶于水。然而，最优选的是，水溶性聚合物或链段约95％(按重量)可溶于水或完全可溶于水。

“封端”基团或“封端的”基团是在聚合物如PEG的末端上存在的惰性基团。封端基团是在典型的合成反应条件下不容易经历化学转变的基团。封端基团一般是烷氧基，-OR，其中R是1-20个碳组成的有机基团和优选是低级烷基(例如甲基，乙基)或苄基。“R”可以是饱和或不饱和的，并且包括芳基，杂芳基，环状基团，杂环基团，和任何上述基团的取代形式。例如，封端的PEG将典型地包括结构“RO-(CH₂CH₂O)_n-”，其中R如上所定义。另外地，封端基团也可以有利地包括可检测到的标记物_(label)。当聚合物具有包括可检测到的标记物的封端基团时，聚合物和/或聚合物所偶联到的结构部分(例如活化剂)的量或位置能够通过使用合适的检测器来测定。此类标记物包括，但不限于、荧光增白剂、化学发光剂、用于酶标记中的结构部分、比色(例如，染料)，金属离子、放射性结构部分，等等。

对于本发明的聚合物所说的“非天然”指聚合物在其实体上在自然界中是无法发现的。然而本发明的非天然聚合物可含有天然的一种或多种子单元或天然的子单元类的一种或多种链段，只要整个聚合物结构在自然界中没有发现就行。

本发明的水溶性聚合物如PEG相关的“分子量”指聚合物的标称平均分子量，典型地由尺寸排阻色谱法，光散射技术，或在1，2，4-三氯苯中的特性速度测定法来测定。本发明的聚合物典型地是多分散的，具有低于约1.20的低多分散性数值。

术语“反应活性”或“活化的”当与特定的官能团相结合使用时，指容易与典型地在另一个分子上存在的亲电子或亲核基团反应、发生转化的官能团。这与为了反应需要强烈的催化剂或苛刻的反应条件的那些基团(即“非反应活性”或“惰性”基团)不同。

术语“保护的”或“保护基团”或“保护基”指在某些反应条件下防止或阻断特定的化学反应活性官能团的反应的结构部分(即，保护基团)的存在。该保护基团将取决于被保护的化学反应活性基团以及所使用的反应条件和另外的反应活性或保护基团(如果有的话)在分子中的存在来变化。在现有技术中已知的保护基团能够在Greene，T.W.等人，PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS，第三版，John Wiley& Sons，Inc.，New York，NY(1999)中见到。

在这里使用的术语“官能团”或它的任何同义词是指包括它们的被保护的形式。

术语“连接基结构部分”在这里用于指任选地用于连接互联结构部分如聚合物链段和链烷醛的原子或多个原子。本发明的连接基结构部分是对水解表现稳定的或可以包括生理可水解的或酶促可降解的连接键。

“生理可断裂的”或“可水解的”或“可降解的”键是在生理条件下与水反应(即水解)的较弱键。键在水中水解的趋势不仅取决于连接两个中心原子的连接键的一般类型而且取决于附着于这两个中心原子上的取代基。合适的水解不稳定的或弱的键包括但不限于羧酸酯，磷酸酯，酸酐，缩醛，酮缩醇，酰氧基烷基醚，亚胺，原酸酯，肽和低聚核苷酸。

“酶促可降解的连接键”指由一种或多种酶发生降解的连接键。

“水解稳定的”连接键或键意指化学键，典型地共价键，它在水中是充分稳定的，即，在较长时间中在生理条件下不发生任何显著程度的水解。水解稳定的连接键的例子包括但不限于下列这些：碳-碳键(例如，在脂族链中)，醚，酰胺，脲烷等。一般，水解稳定的连接键是在生理条件下显示出每天低于约1-2％的水解速率的一种连接键。代表性的化学键的水解速率能够在大多数标准的教科书中找到。

“链烷醛”指本发明的水溶性聚合物的醛部分(CHO)，其中包括羰基碳和任何另外的亚甲基或取代的亚甲基(-C(R¹)(R²)-)，一直到将聚合物的链烷醛部分连接于聚合物链段上的那一连接基结构部分为止。在命名链烷醛链段时，C₁对应于羰基碳。在这里使用的术语“链烷醛”意指包括醛基的水合和保护形式，以及硫属元素(chalcogen)类似物。本发明的链烷醛的一个特别优选的保护形式是缩醛。

在关系到本发明的某些聚合物链烷醛时的“羰基的总数”是包含在聚合物链烷醛中的羰基的总数，不计醛碳。

在关系到聚合物的几何形状或整体结构时的“支化”指具有两个或多个聚合物“分支”的聚合物。支化聚合物可以具有2个聚合物分支，3个聚合物分支，4个聚合物分支，6个聚合物分支，8个聚合物分支或更多。一个特殊类型的高度支化的聚合物是用于本发明的目的的树枝状聚合物或树枝形聚合物，被认为是具有与支化聚合物的结构不同的结构。

“分支点”指包括一个或多个原子的分叉点，在该分叉点上聚合物从线形结构分裂成或支化成一个或多个附加聚合物分支。

“树枝形聚合物”是具有规则支化图形和具有每个构成分支点的许多个重复单元的球状的、尺寸单分散聚合物，其中全部的键从中心的焦点或芯上径向发散。树枝形聚合物显示出某些树枝状性能如芯的包围，使得它们与其它类型聚合物表现不同。

“主要地”或“基本上”是指某给定量的几乎总量或全部，例如95％或95％以上。

“逆Michael型产物”指从Michael型加成反应的逆反应得到的产物。Michael加成反应(向前方向)指亲核的碳物质加成到吸电子双键上。典型地，但不一定地，该亲核试剂是烯醇盐或烯胺，虽然亲核试剂也能够是醇盐或胺或其它物质。亲电子试剂典型地是α，β-不饱和酮、酯、或腈，虽然其它吸电子基团也能够活化碳-碳双键以便实施亲核攻击。从如上所述的Michael型加成反应的逆反应(或向后方向)，即，导致亲核碳物质(它可以但不一定是烯醇盐或烯胺)的损失和如上所述的吸电子双键如α，β不饱和酮等的形成的消去反应，所产生的产物被认为是逆Michael型产物。例如，mPEG-丙醛的逆Michael型反应导致得到逆Michael型产物，mPEG-OH和丙烯醛(CH₂＝CH-CHO)。

“烷基”指烃链，典型地具有约1到20个原子的长度。此类烃链优选是，但不一定地是饱和的并可以是支化或直链，虽然典型地直链是优选的。示例性的烷基包括甲基，乙基，丙基，丁基，戊基，1-甲基丁基，1-乙基丙基，3-甲基戊基，等等。在这里使用的“烷基”当谈到三个或更多个碳原子时包括环烷基。

“低级烷基”指含有1到6个碳原子的烷基，并且可以是直链或支链，例如有甲基，乙基，正丁基，异丁基，叔丁基。

“环烷基”指饱和或不饱和的环烃链，包括桥连、稠合、螺环状化合物，优选由3到约12个碳原子组成，更优选3到约8个碳原子组成。

“非干扰性取代基”是这样一些基团，当存在于分子中时，它与在该分子内所含的其它官能团典型地无反应活性。

如在例如“取代的烷基”中的术语“取代的”是指被一个或多个非干扰的取代基所取代的结构部分(例如，烷基)，该取代基例如是，但不限于：C₃-C₈环烷基，例如，环丙基，环丁基，等等；卤素，例如，氟，氯，溴，和碘；氰基；烷氧基，低级苯基；取代的苯基；等等。对于在苯基环上的取代，取代基可以是任何取向(即，邻，间，或对)。

“烷氧基”指-O-R基团，其中R是烷基或取代的烷基，优选C₁-C₂₀烷基(例如，甲氧基，乙氧基，丙氧基，苄基，等等)，优选C₁-C₇。

在这里使用的“链烯基”指具有1-15个碳原子的长度的含有至少一个双键的支化或未支化的烃基团，如乙烯基，正丙烯基，异丙烯基，正丁烯基，异丁烯基，辛烯基，癸烯基，十四碳烯基等等。

在这里使用的术语“炔基”是指具有2-15个碳原子的长度的、含有至少一个叁键的支化或未支化的烃基团，如乙炔基，正丙炔基，异丙炔基，正丁炔基，异丁炔基，辛炔基，癸炔基等等。

“芳基”是指一个或多个芳族环，每一个环具有5或6个的核上碳原子。芳基包括多个芳基环，它可以是稠合的，如在萘基中，或是未稠合，如在联苯基中。芳基环也可以与一个或多个环烃、杂芳基或杂环发生稠合或未稠合。在这里使用的“芳基”包括杂芳基。

“杂芳基”是含有一个到四个杂原子(优选N，O或S，或它们的结合物)的芳基。杂芳基环也可以与一个或多个环烃，杂环，芳基或杂芳基环稠合。

“杂环”或“杂环的”是指具有5-12个原子，优选5-7个原子的，有或没有不饱和键或芳香特性并具有至少一个不是碳的环原子的一个或多个环。优选的杂原子包括硫，氧，和氮。

“取代的杂芳基”是具有一个或多个非干扰的基团作为取代基的杂芳基。

“取代的杂环”是具有由非干扰的取代基形成的一个或多个侧链的杂环。

“亲电子试剂”是指离子，原子，或原子的聚集体，它可以是离子的，具有亲电中心即寻求电子的中心，能够与亲核试剂反应。

“亲核试剂”是指离子，原子，或原子的聚集体，它可以是离子的，具有亲核中心即寻求亲电中心的中心，和能够与亲电子试剂反应。

在这里使用的“活化剂”包括可以提供在活体内或活体外所表明的一些药理(常常有益的)效果的任何试剂，药物，化合物，物质的组合物或混合物。这包括食品，食品增补剂，营养物，营养药，药物，疫苗，抗体，维生素类，和其它有益的试剂。在这里使用的，这些术语进一步包括在患者体内产生局部或全身效果的任何生理或药理活性物质。

“可药用的赋形剂”或“可药用的载体”是指能够包括在本发明的组合物中但不对患者引起显著的不利的毒理效果的赋形剂。

“药理有效量”，“生理有效量”，和“治疗有效量”在这里可互换地用于表示为了在血液中或在靶组织中提供预期水平的活化剂和/或接合物所需要的在药物制剂中存在的PEG-活化剂接合物的量。精确的量取决于很多的因素，例如，特定的活化剂，药物制剂的组分和物理特性，预定的患者群体，患者考虑因素等，并且能够容易地由本领域中的技术人员以这里所提供的和在相关文献中可获得的信息为基础来确定。

本发明的聚合物相关的“多官能的”意指具有包含在其中的3个或3个以上官能团的聚合物骨架，其中该官能团可以是相同的或不同的，并且典型地在聚合物末端上存在。本发明的多官能聚合物典型地含有约3-100个官能团，或3-50个官能团，或3-25个官能团，或3-15个官能团，或3-10个官能团，或在聚合物骨架内含有3，4，5，6，7，8，9或10个官能团。

“双官能”聚合物是指具有两个含在其中的官能团的聚合物，典型地在聚合物末端上。当官能团相同时，聚合物被说成是同类双官能的。当官能团不同时，聚合物被说成是非同类双官能的。

这里所述的碱性或酸性反应物包括中性，带电荷的，和它们的任何相应盐形式。

“聚烯烃醇”是指有多个侧挂羟基连接于聚合物骨架上的包括烯烃聚合物骨架如聚乙烯的一种聚合物。举例的聚烯烃醇是聚乙烯醇。

在这里使用的“非肽的”是指聚合物骨架基本上不含肽键。然而，聚合物可以包括少量的沿着重复单体子单元所间隔的肽键，例如，不超过1个肽键每约50个单体单元。

在这里使用的“水合物”是指由水分子加成到醛基上所形成的水合的醛，它以两个羟基替换羰基官能团。醛类与相应的水合物n水达到平衡。

术语“硫属元素类似物”是指醛类似物，其中氧原子被另一个杂原子(一般为硫，硒，或碲)替代。

术语“患者”是指遭受或易患一种病症的活生物并包括人和动物，该病症能够由本发明的聚合物(典型地但不一定是聚合物-活化剂接合物的形式)的给药来防止或治疗。

“任选的”或“任选地”指随后描述的情况可以发生或不发生，这样该叙述包括该情况发生的情形和不发生的情形。

聚合物

在第一方面，本发明提供了具有反应活性醛基的水溶性聚合物。本发明的聚合物在许多方面是独特的。它们不仅以高产率制得，而且因为不存在能够导致聚合物链降解和差的聚合物多分散性的有害反应副产物而是贮存稳定的。该聚合物，尤其封端的聚合物，另外以高纯度制备，例如，不存在可检测量的PEG-二醇派生的和其它聚合物的杂质类。这一特征特别地有利用于制备高分子量封端PEG聚合物，例如，具有约30kDa或更大的分子量，其中在原料如mPEG中PEG二醇杂质的量能够是约2wt％至30wt％或更大，这取决于供应商。而且，在某些实施方案中，本发明聚合物在反应活性上低于其它已知的聚合物醛，使得它们在接合反应中更有区别和在转化，处理，和反应后处理中更稳定。

一般结构特征和链烷醛部分

一般而言，本发明的聚合物具有经由中间连接基结构部分连接到在醛官能团(即，链烷醛部分)上终止的约1-约21个邻接亚甲基或取代的亚甲基上的聚合物链段。对应于本发明的聚合物的通用化结构在下面作为结构I来提供。

结构I

参考以上与结构I相结合的叙述，聚合物链段是由POLY表示，连接基结构部分是由X’表示，且邻接的亚甲基(形成亚烷基链)或取代的亚甲基(形成取代的亚烷基链)是由-C(R¹)(R²)-表示。更具体地说，在结构I中，POLY是水溶性聚合物链段；X’是连接基结构部分；和z’是1到约21的整数。R¹，在各情况下，独立地是H或有机基，如烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基。R²，在各情况下，也独立地是H或有机基，如烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基。虽然在这里具体提供的许多结构是醛，但是应该理解的是，这些相同的结构和实际上本发明总体上延伸到相应的醛水合物、保护形式的醛、和硫属元素类似物，其中在结构I中的羰基氧被硫，硒，或碲替代。

本发明提供了对于连接到醛基上的亚烷基链的尺寸而言的相当大的灵活性。该碳链长度应理解为是羰基碳(C₁)加上将羰基碳连接到连接基上的中间碳原子的数目，(例如，构成聚合物的[-C(R¹)(R²)]z’部分的C的总数)。该碳链长度典型地具有3到约22个碳原子，或更典型地约4到约13个碳原子。参考以上结构I，这意味着z’的值典型地是2-约21，或更典型地约3-12。更明确地，z’的值最典型是下列当中的一个：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，或更大。最优选的是在2-约8范围内的z’值。本发明的一个特别优选的聚合物链烷醛是其中z’是3的聚合物链烷醛。

参考以上结构I，某些类型的链烷醛是特别优选的。此类化合物包括具有位于在碳链中的至少一个“C”上的至少一个有机基团的如上所述链烷醛。有机基团可以是上述有机基团中的任何一种，例如烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基，其中烷基是优选的。典型地，该烷基是直链低级烷基或支化低级烷基，如甲基，乙基，丙基，异丙基，正丁基，异丁基，仲丁基，戊基，等等，其中直链一般是优选的。一个特别优选的烷基取代基是甲基。

虽然聚合物的链烷醛部分可以具有位于在碳链中的一个或多个“C”上的一个以上有机基团，但是一种类型的优选链烷醛是其中在碳链中仅仅一个“C”被有机基团取代和全部其它R¹和R²是H的一种链烷醛。例如，不管亚烷基链的长度，优选的是其中全部的R¹和R²变量是H的链烷醛，例外的是：(i)位于C-2上的R¹或R²中的一个是烷基，或(ii)位于C-3上的R¹或R²中的一个是烷基；或(iii)位于C-4上的R¹或R²中的一个是烷基；或(iv)位于C-5上的R¹或R²中的一个是烷基，等等。在这方面一个特别优选类型的取代基是低级烷基如甲基，乙基，或丙基。本发明的示例的2-甲基取代的链烷醛，mPEG-2-甲基丁醛的合成描述在实施例17中。

现在关注聚合物的链烷醛部分，下面示出了某些优选的链烷醛。

结构 I-A.

结构I-A是其中在结构I中的z’的值是3的一种链烷醛。这一结构，不管C₂，C₃或C₄中的任何一个或多个是否被如上所述的烷基或其它有机基团取代，在这里称作“丁醛(butyraldehyde)”或称作“丁醛(butanal)”。本发明的示例的聚合物丁醛包括其中聚合物的链烷醛部分是2-甲基丁醛，异戊醛，或4-甲基丁醛，2-乙基丁醛，3-乙基丁醛，或4-乙基丁醛的那些。

结构I-B

结构I-B是其中在结构I中的z’的值是4的一种链烷醛。这一结构，不管C₂，C₃，C₄或C₅中的任何一个或多个是否被如上所述的烷基或其它有机基团取代，在这里称作“戊醛(pentanal)”或称作“戊醛(valeraldehyde)”。本发明的示例的聚合物戊醛包括其中聚合物的链烷醛部分是2-甲基戊醛，3-甲基戊醛，4-甲基戊醛，或5-甲基戊醛的那些。另外的聚合物戊醛包括其中聚合物的链烷醛部分是2-乙基戊醛，3-乙基戊醛，4-乙基戊醛，或5-乙基戊醛的那些。

结构I-C

结构I-C是其中在结构I中的z’的值是5的一种链烷醛。这一结构，不管C₂，C₃，C₄，C₅或C₆中的任何一个或多个是否被如上所述的烷基或其它有机基团取代，在这里称作“己醛”。本发明的示例聚合物己醛包括其中聚合物的链烷醛部分是2-甲基己醛，3-甲基己醛，4-甲基己醛，5-甲基己醛，6-甲基己醛，2-乙基戊醛，3-乙基戊醛，4-乙基戊醛，或5-乙基戊醛的那些。

本发明的聚合物的另外链烷醛组分包括庚醛，辛醛，壬醛，等等。

连接基结构部分

现在参见连接基结构部分，本发明的连接基结构部分或简单地“连接基”一般由变量X’表示。该连接基结构部分是将聚合物的链烷醛部分与聚合物链段连接的整个聚合物的那一部分(在下面更详细地描述)。本发明的连接基可以是单个原子，如氧或硫，两个原子，或多个原子。连接基典型地但不一定是线形的。连接基的总长度典型地是1-约40个原子，其中长度指在单个链中的原子数目，不计取代基。例如，-CH₂-视为对于整个连接基长度而言的一个原子，-CH₂CH₂O-视为3个原子长度。优选地，连接基将具有约1-约20个原子，或约2-约15个原子的长度。

本发明的连接基能够是单个官能团如酰胺，酯，脲烷，或脲，或可以含有在单个官能团的任一侧翼连接的亚甲基或者其它亚烷基基团。或者，连接基可以含有相同或不同的官能团的结合物。另外，本发明的连接基能够是亚烷基链，任选地含有一个或多个氧或硫原子(即，醚或硫醚)。优选的连接基是水解稳定的那些连接基。当在结构I的范围内观察时，连接基是当被认为是整个聚合物的一部分时不会导致含有过氧键(-O-O-)或-N-O-或-O-N-键的整体结构的一种连接基。

示例性的连接基X’是对应于下列结构中的任何一个的那些连接基：

-(CH₂)_c-D_e-(CH₂)_f-或-(CH₂)_p-M_r-C(O)-K_g-(CH₂)_q-。

在参见以上连接基结构时，变量“c”是0-8；“D”是O，NH，或S；变量“e”是0或1；变量“f”是0-8；变量“p”是0-8；“M”是-NH或O；“K”是NH或O；变量“q”是0-8，和变量“r”和“s”各自独立地是0或1。

在结构I的范围内，本发明的连接基X’可以是下列的任何一种：-O-，-NH-，-S-，-C(O)-，C(O)-NH，NH-C(O)-NH，O-C(O)-NH，-C(S)-，-CH₂-，-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-O-CH₂-，-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-O-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-O-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-O-，-C(O)-NH-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-，-C(O)-O-CH₂-，-CH₂-C(O)-O-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-O-CH₂-，-C(O)-O-CH₂-CH₂-，-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂，-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂，-C(O)-NH-CH₂-，-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-，-O-C(O)-NH-CH₂-CH₂-，-NH-CH₂-，-NH-CH₂-CH₂-，-CH₂-NH-CH₂-，-CH₂-CH₂-NH-CH₂-，-C(O)-CH₂-，-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-CH₂-CH₂-，-CH₂-CH₂-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-，二价环烷基，-N(R⁶)-，-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂-NH-C(O)-CH₂-CH₂-，-O-C(O)-NH-[CH₂]_h-(OCH₂CH₂)_j-，和前述基团中的任何两个或多个的结合，其中(h)是0-6，(j)是0-20，R⁶是H或选自烷基、取代烷基、链烯基、取代链烯基、炔基、取代炔基、芳基和取代芳基中的有机基团。其它特定的连接基具有以下结构：-C(O)NH-(CH₂)_1-6NH-C(O)-，或-NHC(O)NH-(CH₂)_1-6NH-C(O)-或-OC(O)NH-(CH₂)_1-6NH-C(O)-，其中在各亚甲基之后的下标值表示包含在连接基结构中的亚甲基的可能数量，例如，(CH₂)_1-6是指连接基可以含有1，2，3，4，5或6个亚甲基。

然而，对于本公开物，当一系列的原子紧邻于聚合物链段POLY且该一系列的原子是另一种单体而使得所建议的连接基结构部分代表了聚合物链的仅仅延伸部分时，该一系列的原子不应认为是连接基结构部分。例如，假设一种部分结构“POLY-X’-”，其中在这一情况下的POLY被定义为“CH₃O(CH₂CH₂O)_n-”，该连接基结构部分将不是“-CH₂CH₂O-”，因为该定义仅仅代表了聚合物的延伸。然而这不是说本发明的连接基不能具有一个或多个邻接-CH₂CH₂O-部分。例如，连接基可以含有一个或多个(-CH₂CH₂O-)子单元，在一侧或两侧翼带有以上所例举的示例性连接基的一种或多种结合物。

也就是说，如以上所述的连接基也能够包括低聚物如-(CH₂CH₂O)_b-或-(CH₂CH₂NH)_g-，其中b和g各自独立地是1-约20。申请人发现，将此类低聚物包含在连接基内通过延长在醛官能团和在连接基内含有的任何反应活性基团之间的距离来为最终的聚合物链烷醛产物提供稳定性。这样，分子内相互作用被削弱，导致在制备过程中提高了产率和改进聚合物链烷醛产物的稳定性。优选地，变量b和g是约1-10，或在某些情况下是约1-6。在连接基中具有四个邻接-(CH₂CH₂O)-单元的示例性聚合物链烷醛的合成描述在实施例5中。

下面给出了含有-(CH₂CH₂O)_b-或-(CH₂CH₂NH)_g-低聚物链段的特定连接基的另外例子，其中X’包括或由下式定义：

-(CH₂)_c-D_e-(CH₂)_f-P-或-(CH₂)_p-M_r-C(O)-K_s-(CH₂)_q-T-。

在以上的示例性结构中，P和T各自独立地是-(CH₂CH₂O)_b-或-(CH₂CH₂NH)_g-，b和g各自独立地是1-20，和剩余变量如以上所定义。这一类型的优选连接基的例子是-O-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_b-，-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_b-，-NH-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_b-，-O-C(O)-NH-(CH₂CH₂NH)_g-，-C(O)-NH-(CH₂CH₂NH)_g-，和-NH-C(O)-NH-(CH₂CH₂NH)_g-。

在某些情况下，例如，当POLY表示线形聚合物链段时，则优选在聚合物链烷醛中存在的羰基的总数是0或2或更大，其中羰基的总数不包括醛羰基。然而，当连接基X’包括一个或多个邻接(-CH₂CH₂O-)链段时，则优选的是在聚合物链烷醛中存在的羰基的总数是0，或1，或2，或3，或更大。

重新参见结构I，在本发明的另一个优选实施方案中，当X’是氧或包括至少一个(-CH₂CH₂O-)链段时，和z’是2-12时，则在至少一种情况下R¹或R²中的至少一个是如以上所定义的有机基团，或者，聚合物是非同类双官能化的。对于聚合物是非同类双官能化的情况，聚合物链段POLY优选在一个末端具有不是羟基的反应活性基团。

优选，该连接基是水解稳定的，和可以含有一个或多个下列官能团：酰胺，脲烷，醚，硫醚，或脲。然而，水解可降解的连接键，如羧酸酯，磷酸酯，原酸酯，酸酐，亚胺，缩醛，酮缩醇，低聚核苷酸，或肽，也可以存在于本发明的连接基中。杂原子连接基如O或S，是特别优选的，对于如上所述的含有低聚-(CH₂CH₂O)_b-或-(CH₂CH₂NH)_g链段的连接基是这种情况。

用于制备聚合物链烷醛的聚合物链段/聚合物

如在以上示例性结构中所示，本发明的聚合物链烷醛含有水溶性聚合物链段。代表性POLY包括聚(亚烷基二醇)如聚(乙二醇)，聚(丙二醇)(“PPG”)，乙二醇和丙二醇的共聚物，聚(烯烃醇)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(羟烷基甲基丙烯酰胺)，聚(甲基丙烯酸羟烷基酯)，聚(糖)，聚(α-羟基酸)，聚(乙烯醇)，聚磷腈，聚噁唑啉，聚(N-丙烯酰基吗啉)。POLY能够是均聚物，交替共聚物，无规共聚物，嵌段共聚物，交替三元共聚物，无规三元共聚物，或任何上述聚合物的嵌段三元共聚物。水溶性聚合物链段优选是，虽然不一定，聚(乙二醇)或“PEG”或它的衍生物。

聚合物链段能够具有许多不同的几何形状中的任何一种，例如，POLY能够是线形，支化，或分叉的。最典型地，POLY是线形的或是支化的，例如，具有2个聚合物分支。虽然这里的许多讨论是针对作为示例性POLY的PEG，但是在这里给出的讨论和结构能够容易地延伸到包括如上所述的水溶性聚合物链段中的任何一种。

具有至少一个反应活性末端的任何水溶性聚合物能够用于制备根据本发明的聚合物链烷醛且本发明在这一方面不受限制。虽然能够使用携带仅仅单个反应活性末端的水溶性聚合物，但是适合于转化成如这里所述的聚合物链烷醛的携带两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个，十一个，十二个或更多个反应活性末端的聚合物都能够使用。有利地，随着在水溶性聚合物链段上羟基或其它反应活性结构部分的数量的提高，供引入链烷醛基团的有效位点的数量增加。与水溶性聚合物链段相结合的羟基和/或反应活性结构部分的数量的上限的非限制性例子包括500，100，80，40，20，和10。

现在参见优选的POLY，PEG，“PEG”包括呈现线形、支化或多分支形式中的任何一种的聚(乙二醇)，其中包括封端PEG，分叉PEG，支化PEG，侧挂PEG，和含有一个或多个分开该单体子单元的可降解的连接键的PEG，下面将更充分地描述。

为了制备本发明的聚合物链烷醛，一种常用的PEG起始原料是游离PEG，一种在每一端以羟基终端的线形聚合物：

HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_m-CH₂CH₂-OH。

以上聚合物α-，ω-二羟基聚(乙二醇)能够以简单形式表示为HO-PEG-OH，在这里也称作PEG-二醇，其中在“HO-PEG-OH”中的“-PEG-”对应于：

-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-1-CH₂CH₂-

和(n)典型地是约3-约4,000，或约3-约3,000，或更多优选约20-约1,000。参见结构I，POLY例如可以是羟基终端的PEG如HO-CH₂CH₂O-(CH₂CH₂O)_n-1CH₂CH₂-。

用于制备本发明的聚合物链烷醛的另一类型PEG是封端的PEG，其中PEG以惰性封端基团来封端。优选的封端PEG是具有作为封端结构部分的基团如烷氧基，取代的烷氧基，链烯氧基，取代的链烯氧基，炔氧基，取代的炔氧基，芳氧基，取代的芳氧基的那些PEG。优选的是封端基团如甲氧基，乙氧基，和苄氧基。

现在参见结构I和I-A至I-C，在某些实施方案中POLY是或包括对应于以下结构的聚(乙二醇)：

“Z-(CH₂CH₂O)_n”或“Z-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-”，其中n是约3到约4000，或约10到约4000，和Z是或包括官能团如羟基，氨基，酯，碳酸酯，醛，链烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，异氰酸酯，异硫氰酸酯，酰肼，马来酰亚胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，烷氧基，苄氧基，硅烷，类脂，磷脂类，生物素，和荧光素。再次，紧接着在以上示出的POLY结构可以表示线形聚合物链段或可以构成支化或分叉聚合物链段的一部分。对于聚合物链段是支化的情况，紧接着在以上的POLY结构可以是，例如，对应于聚合物分支，后者构成了整个POLY结构的一部分。另外地，对于其中POLY具有分叉结构的情况，以上POLY结构例如可以对应于在分支点之前的聚合物链段的线形部分。

POLY也可以对应于具有2个分支，3个分支，4个分支，5个分支，6个分支，7个分支，8个分支或更多的支化PEG分子。用于制备本发明的聚合物链烷醛的支化聚合物可以具有2到300个左右的反应活性末端基。优选的是具有2或3个聚合物分支的支化聚合物链段。如在US专利No.5,932,462中所述的示例性支化POLY对应于以下结构：

在这些表述中，R″是非反应活性结构部分，如H，甲基或PEG，以及P和Q是非反应活性连接键。在优选的实施方案中，支化PEG聚合物链段是甲氧基聚(乙二醇)二取代的赖氨酸。

在以上特定的支化构型中，支化聚合物链段具有从“C”分支点延伸的单个反应活性部位，后者用于反应活性链烷醛基团经由连接基的定位。支化PEG如用于本发明的这些典型地具有低于4个PEG分支，和更优选，将具有2或3个PEG分支。此类支化PEG带来了具有单个反应活性位点的优点，在其上联接了比它们的线形PEG对应物更大、更致密的聚合物云。

一种特定类型的支化PEG链烷醛对应于以下结构：(MeO-PEG-)_iG-X’-链烷醛，其中i等于2或3，和G是赖氨酸或其它合适的氨基酸残基。

本发明的示例性支化聚合物链烷醛具有下面所示的结构：

在这一情况下，该连接基对应于C(O)-NH，任选含有位于在酰胺氮与聚合物的链烷醛部分之间的低聚-(CH₂CH₂O)_b-或-(CH₂CH₂NH)_g-链段，如在下面的结构V-B中所示。示例性的低聚物链段将具有在约1-约40，或约1-约30的b或g值。优选b或g具有在20或20以下的值。优选，b或g将具有下列值中的一个：2，3，4，5，6，7，8，9，10，或更大。在特别优选的实施方案中，b或g是2-6，和mPEG_a和mpEG_b是相同的或是不同的。

某些实施方案对于具有支化结构的聚合物链烷醛是优选的。例如，在一个特定的实施方案中，例如当在结构I中的POLY是支化的时，则在至少一种情况下R¹或R²中的至少一个是如以上所定义的有机基团。在另一优选实施方案中，例如，对于POLY包括赖氨酸残基的情况，当在结构I中的POLY是支化的时，则X’包括-(CH₂CH₂O)_b-，其中b是1-约20。偶然地当POLY具有2个聚合物分支时，优选的是，对于POLY包括“C-H”作为分支点的情况，聚合物分支包括氧作为唯一的杂原子。

用于制备本发明的聚合物链烷醛的支化PEG另外包括更一般由通式G(PEG)_n表示的那些，其中G是中心或核分子，从它延伸出2个或更多个PEG分支。变量n表示PEG分支的数目，其中聚合物分支能够独立地是封端的或另外在它的末端具有反应活性官能团，如链烷醛或其它反应活性官能团。支化PEG如一般由以上结构式G(PEG)_n表示的那些具有2个聚合物分支到约300个聚合物分支(即，n是2到约300)。支化PEG如这些PEG优选具有2到约25个聚合物分支，更优选2到约20个聚合物分支，和更优选2到约15个聚合物分支或更少。最优选的是有3，4，5，6，7或8个分支的多分支聚合物。

在如上所述的支化PEG中的优选的芯分子是多元醇。此类多元醇包括具有1到10个碳原子和1到10个羟基的脂族多元醇，其中包括乙二醇，链烷烃二醇，烷基二醇，烷叉基烷基二醇，烷基环烷烃二醇，1，5-十氢萘二醇，4，8-双(羟甲基)三环癸烷，环烷叉基二醇，二羟基链烷烃，三羟基链烷烃等等。脂环族多元醇也可以使用，其中包括直链或闭环的糖和糖醇，如甘露糖醇，山梨糖醇，肌醇，木糖醇，白坚木醇，苏糖醇，阿糖醇，赤藓醇，阿东糖醇，卫矛醇，facose，核糖，阿糖，木糖，来苏糖，鼠李糖，半乳糖，葡萄糖，果糖，山梨糖，甘露糖，吡喃糖，阿卓糖，塔罗糖，塔格糖(tagitose)，吡喃糖苷，蔗糖，乳糖，麦芽糖，等等。另外的脂族多元醇包括甘油醛，葡萄糖，核糖，甘露糖，半乳糖，和相关的立体异构体的衍生物。可以使用的其它芯多元醇包括冠醚，环糊精，糊精和其它碳水化合物如淀粉和直链淀粉。优选的多元醇包括甘油，季戊四醇，山梨糖醇，和三羟甲基丙烷。

用于制备本发明的聚合物链烷醛的多分支PEG包括可从Nektar，Huntsville，Alabama获得的多分支PEG。在优选的实施方案中，本发明的多分支聚合物链烷醛对应于下式，其中分子的链烷醛部分的细节在本文其它地方提供。

n＝0 to 4

结构XIII-A。

或者，聚合物链烷醛可以具有总体分叉结构。分叉PEG的例子对应于结构：PEG-Y-CH-(X’-[C(R¹)(R²)]_z-CHO)₂，其中PEG是在这里描述的PEG的任何形式，Y是连接基团，优选水解稳定的连接键，和另一个变量对应于该连接基和该链烷醛部分如以上所定义。

另外的示例性分叉PEG链烷醛衍生物对应于下式：

PEG-Q-CH-[(CH₂)_m-X_0，1-C(O)-Y-V-alkanal]₂

结构XIII-B。

其中PEG是在这里描述的PEG的形式的任何一种。Q是水解稳定的连接键，如氧，硫，或-C(O)-NH-；m是1-10，(即，m能够等于1，2，3，4，5，6，7，8，9，或10)，但优选，m是1，2，3，或4；X是任选的原子，和当存在时，是O或N；Y是NH或O；和V是任选的低聚链段例如前面所述的-(CH₂CH₂O)_b-或(CH₂CH₂NH)_g-。在以上结构式中对应于“PEG”的示例性支化PEG是mPEG二取代的赖氨酸，其中“PEG”对应于：

或者，用于制备本发明的聚合物链烷醛的PEG聚合物链段可以是沿着PEG链长度而不是在末端上具有侧挂反应活性基团的PEG分子，得到了具有由连接基X’连接于PEG链上的一个或多个侧挂链烷醛基团的聚合物链烷醛。

此外，聚合物链段可以具有一个或多个弱或可降解的连接键，如容易发生水解的酯键。可以包含在POLY中的其它的水解可降解的连接键包括碳酸酯，亚胺，磷酸酯，和腙。

一般，水溶性聚合物链段POLY的标称平均分子量将会变化。POLY的标称平均分子量典型地属于下列范围中的一个或多个范围内：约100道尔顿到约100,000道尔顿，约500道尔顿到约80,000道尔顿，约1,000道尔顿到约50,000道尔顿，约2,000道尔顿到约25,000道尔顿，约5,000道尔顿到约20,000道尔顿。用于水溶性聚合物链段POLY的示例性标称平均分子量包括约1,000道尔顿，约5,000道尔顿，约10,000道尔顿，约15,000道尔顿，约20,000道尔顿，约25,000道尔顿，约30,000道尔顿，和约40,000道尔顿。低分子量聚具有约250，500，750，1000，2000，或5000道尔顿的分子量。

代表性聚合物链烷醛

按照以上一般性叙述，下列是说明了根据本发明的优选聚合物链烷醛的一些示例性结构。

例如，本发明的聚合物链烷醛，当为线形时可以具有根据以下结构II的同类双官能化或非同类双官能化的结构。根据以下结构的同类双官能的结构是其中两个末端相同的一种结构。

X’和-CR¹R²-的优选值是如以上所定义。根据结构II的特别优选的结构是这样一些，其中POLY是聚(乙二醇)，和X’是-O-C(O)-NH-，-C(O)-NH-，-NH-C(O)-NH-，-O-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_b-，-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_b-，或-NH-C(O)-NH-(CH₂CH₂O)_b-，和z’是2到约12，和更优选2，3，4，5或6。更具体地，本发明的代表性聚合物链烷醛包括下列：

结构III-A

结构IV-A

结构III-C

结构IV-C，

其中PEG是聚(乙二醇)，b和g各自独立地是0到20，a是0-6，和剩余变量如前面所定义。优选的是其中b和g是在1-8范围或另外是在1-约6范围的结构。虽然z’是1-约21，但是优选的是其中z’是2-6，例如，是3或4，的那些结构。

下面提供了其中变量“a”(如在紧接着以上的结构中所示)是零的两种聚合物链烷醛的结构示意图。

结构III-B。

或

结构IV-B。

示例性聚合物丁醛具有以下结构：

结构III-D。

对应于以上结构III-D的特别优选的PEG包括Z-(CH₂CH₂O)_n-或

根据本发明的另外的支化结构如下，其中b典型地是0到20，a典型地是0到6，和d是1，2或3，

结构VI-A

或

结构VI-B

在以上结构VI-A和B中，PEG能够是成形或支化的。优选地，R¹和R²在各情况下是H，和z’是3到12，和更优选是3，4，5，或6。作为一个例子，根据结构VI-B的聚合物满足以下条件的一种：

PEG对应于以下结构：

其中Z是如前面所定义的封端基或官能团。

本发明的另一示例性支化聚合物链烷醛具有下面所示的结构：

结构XIV

在上述实施方案中，聚合物链烷醛也具有分叉结构和适合以共价键连接于两个生物活性剂上。以上结构含有，在从-CH-分支点延伸的部分中，包含低聚-(CH₂CH₂O)-链段的连接基，其中在各部分中此类链段的数量是3。在以上结构中此类低聚链段的数量能够根据以上提供的通用化叙述来改变。

其它示例性聚合物链烷醛结构包括下列这些，其中变量如前面所定义：

结构VII

结构VII-A

结构VIII。

优选，以上结构中的任何一种作为具有一个或多个独特的组成特征的组合物来提供，下面更详细地描述。

所形成的聚合物链烷醛组合物的特征和制备方法

本发明的聚合物链烷醛具有与先前制备的聚合物醛相比的几个优点。首先，聚合物链烷醛以很高的产率制得，部分地归因于所使用的合成方法的简单性，特别对于有氧作为该连接基结构部分的链烷醛类。另外，在考察本发明的丁醛的稳定性时，发现这些类型的链烷醛在碱性条件下比先前已知的聚合物醛衍生物(例如丙醛，乙醛)更稳定，并且是在没有较大量或甚至没有可检测量的逆Michael型反应副产物的情况下形成的。例如，如在实施例3中所说明，在碱性条件下，mPEG丙醛经历逆Michael型反应，产生较大量的mPEG-OH和消去产物(丙烯醛)(在室温和pH8下24小时过后，几乎40％的PEG-丙醛已经分解)。相反，mPEG丁醛在碱性条件下显著地更稳定，说明在所使用的条件下基本上没有这一类型的分解。

此外，本发明的丁醛聚合物衍生物在水中以其相应水合物在约50％水合物下达到平衡，远远低于由丙醛显示出的70％水合物平衡和由乙醛显示出的100％水合物。本发明的聚合物衍生物的较低反应活性也可通过在碱性条件下本发明的衍生物的显著更大的稳定性来证明(参见下面的实施例3)。在本发明的醛衍生物和蛋白质或其它分子之间在碱性pH下的接合反应中没有观察到丙烯醛副产物。本发明的醛衍生物的较低反应活性说明本发明的衍生物更具选择性，意味着本发明的衍生物能够以更大的选择性或特异性与在蛋白质或肽上的特定氨基，尤其N-末端氨基进行反应，这与在蛋白质或肽分子上的许多氨基之间的无选择性的或随机的反应相反。在许多应用中，聚合物骨架的选择性N-末端连接可以更好地保持蛋白质构象和生物活性。

另外，本发明的聚合物链烷醛在温和的酸性条件下，即在不如PEG乙醛或PEG丙醛所需要的苛刻的酸性条件下，由水解作用从相应的缩醛前体形成。如果需要，这一温和条件允许本发明的聚合物衍生物与蛋白质，肽，或其它分子靶物的直接原位接合，无需中间的分离步骤。此外，由于所使用的合成方法，本发明的聚合物链烷醛也能够以高纯度提供，常常不存在含碘的物质或能够促进聚合物链段的分解的物质。

归因于所使用的合成方法的温和性，和进一步归因于在这里提供的结构的稳定性质，本发明的聚合物链烷醛另外作为基本上不存在逆Michael型反应产物的组合物而获得。因此，在这里提供的聚合物链烷醛组合物尤其是贮存稳定的，显示出非常有限量(如果有的话)的聚合物分解。作为一个例子，以随时间推移所收集到的稳定性数据为基础，本发明的聚合物链烷醛被发现当在40℃下贮存15天时显示出聚合物醛基低于约10％的降解。这一百分数降解率是由NMR分析测定的。另外，所提供的是基本上不含相应PEG-二链烷醛(即，由于在mPEG-OH原料中一定量PEG-二醇的存在而产生的同类双官能化PEG杂质)的本发明的线形mPEG聚合物链烷醛。

现在更具体地描述制造本发明的聚合物链烷醛的方法，聚合物链烷醛一般通过具有至少一个反应活性基团Y的水溶性聚合物与适合被Y替代或者与Y反应的含有反应活性基团K的受保护的链烷醛试剂之间在有效形成被保护形式的水溶性聚合物链烷醛的条件下进行反应来制备。一般，被保护的链烷醛试剂将具有约2-约20个碳原子。所形成的被保护形式的水溶性聚合物链烷醛然后典型地例如在碱性条件下水解形成所需要的水溶性聚合物链烷醛。

典型地，偶联反应(即，反应性聚合物和被保护的链烷醛试剂的偶联)是在有机溶剂如甲苯，氯仿，二氯甲烷，乙腈，丙酮，二噁烷，甲醇，和乙醇中进行的。反应优选在惰性气氛下，在约20℃到约150℃的温度下进行的。水解形成所需链烷醛的过程典型地由酸来促进，并且是在低于7.0的pH下来进行的，其中优选的pH是约3到约6.5。水解能够在约3，4，5或6的pH下进行，其中在3左右的较低pH是优选的。

以上给出的合成方法的详细实例在实施例1，2，5，和17中提供。

最典型地，聚合物链段偶联到被保护的链烷醛试剂上是经由Williamson醚合成来进行的。更具体地说，聚合物的反应活性基团Y是羟基(它在强碱存在下转化成它的相应阴离子或烷氧基形式)，且在被保护的链烷醛试剂缩醛上的反应活性基团K是良好的离去基团如卤素(优选Cl-或Br-)或甲基硫酸根(磺酸酯)，它们能够容易地被位于聚合物末端上的氧阴离子所置换。所形成的优选的连接键是将POLY连接到链烷醛上的醚连接键(O-)。

在连接到POLY上之后，被保护的链烷醛在酸性pH下水解形成相应醛或链烷醛官能团。如上所指出，链烷醛缩醛如丁醛缩醛在比相应丙醛或乙醛缩醛更温和的条件下水解。例如，当z’是3或更大的时，本发明的链烷醛缩醛能够在约3或4或更高的pH下水解，尤其当R¹和R²在全部情况下是H时。如在实施例2和4中所表明，其中描述的丁醛乙缩醛基在pH3下在约3小时的时间中水解。在温和酸性条件下形成这一链烷醛官能团的能力是有利的，因为它能够在含有聚合物链烷醛的溶液中和到适合于接合的pH(典型地约5到约10的pH)之后使得醛官能化的聚合物原位用于接合到蛋白质或其它生物活性分子上。相反，线形聚合物丙醛需要在接合之前的分离，这归因于为了中和低pH溶液所需要的碱的量和在该中和步骤中产生的相应较大量的盐。

在所使用的方法中，被保护的链烷醛试剂典型地是缩醛如二甲基缩醛，二乙基缩醛，二异丙基缩醛，二苄基缩醛，2，2，2-三氯乙基缩醛，双(2-硝基苄基)缩醛，S，S’-二甲基缩醛，和S，S’-二乙基缩醛。另外地，该缩醛可以是环状缩醛或环状硫代缩醛。

更具体地说，被保护的链烷醛通常具有如下结构：

结构XI-D。

在这一结构中，z’是1到约21的整数。对于以上提供的聚合物醛，R¹在各情况下独立地是H或选自烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、炔基、取代的炔基、芳基和取代的芳基中的有机基团；和R²，在各情况下，独立地是H或选自烷基，取代的烷基，链烯基，取代的链烯基，炔基，取代的炔基，芳基，和取代的芳基中的有机基团。其中W^a和W^b各自独立地是O或S，以及R³和R⁴各自独立地是H，或选自甲基，乙基，异丙基，苄基，1，1，1-三氯乙基，和硝基苄基中的有机基团，或当连接在一起时，是-(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-，当与W^a、C₁和W^b一起考虑时形成5员或6员环。

优选，K是下列反应活性基团中的一个：

在这一方法中，处于被保护形式的聚合物链烷醛典型地以大于约85％产率，和甚至更优选以大于约90-95％产率形成。

在水解获得所需的醛官能化聚合物之后，如果需要的话该产物可以通过中和反应混合物，例如升高pH至约6.0到约7.5，随后将聚合物链烷醛萃取到有机溶剂中，和通过例如旋转蒸发，冷冻干燥，或蒸馏除去溶剂而分离。

由于既不使用直接的氧化方法又不使用含有碘的物质来得到所需醛官能团的这一方法的简单性，所形成的产物是高纯度的，表现出与其它已知聚合物醛相比的提高的贮存稳定性，和具有低的多分散性(低于约1.5，优选低于约1.2，和典型地低于约1.1，1.08，1.05，1.04，和1.3的多分散性)。因此制备了具有低到1.03，1.02和1.01的多分散性的聚合物。

本发明的所分离的聚合物链烷醛优选具有至少约95％的纯度，基于聚合物污染物。

实施例1和2说明了mPEG聚合物链烷醛的形成。对于聚合物起始原料是PEG-二醇的情况，PEG羟基中的一个一般在与被保护的链烷醛试剂反应之前加以保护，随后在偶联之后去保护。所形成的全部示例性的聚合物保护链烷醛由下面的结构XI-E来表示。

结构XI-E。

如果需要，PEG的羟基末端能够支化成官能团，得到同类双官能化的或非同类双官能化的保护链烷醛。合适的官能团包括氨基，酯，碳酸酯，醛，链烯基，丙烯酸酯，甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，砜，硫醇，羧酸，异氰酸酯，酰肼，异硫氰酸酯，马来酰亚胺，乙烯基砜，二硫代吡啶，乙烯基吡啶，碘乙酰胺，和硅烷。优选的是官能团如N-羟基琥珀酰亚胺基酯，苯并三唑基碳酸酯，胺，乙烯基砜，和马来酰亚胺，N-琥珀酰亚胺基碳酸酯，酰肼，琥珀酰亚胺基丙酸酯，琥珀酰亚胺基丁酸酯，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯，琥珀酰亚胺基酯，缩水甘油醚，氧基羰基咪唑，对-硝基苯基碳酸酯，醛，邻吡啶基(orthopyridyl)-二硫化物，和丙烯酰基。

其它代表性链烷醛试剂由下面结构来描述：

结构XI-F

结构XI-G。

在又一个途径中，本发明的聚合物链烷醛有利地从色谱分离法提纯的POLY-Y制备。这样，如果存在的聚合物杂质，和尤其来源于PEG-二醇的双官能的杂质被除去，使得形成了如前面所述的极纯的聚合物链烷醛产物。这一方法在实施例5中举例来说明。所使用的总体合成方法的概述、它的优点、它对这里所述一般方法的适用性、以及所进行的反应的细节都提供于实施例5中。

虽然任何色谱分离方法都可以使用，但是特别优选的是离子交换色谱法，其中在POLY-Y中的Y是可电离的基团或是可电离的基团如羧酸，活性酯，胺等的衍生物。

本发明的示例性聚合物链烷醛缩醛可具有下列结构中的任何一个，其中变量已经在前面进行了描述：

结构IX

或

结构IX-A

在制备本发明的聚合物链烷醛的又一个途径中，聚合物链烷醛能够通过将聚合物链段POLY直接构造在缩醛前体上，例如，通过直接聚合来制备的。更具体地说，在这一方法中，首先提供具有适合于引发聚合的至少一个活性阴离子部位的缩醛前体。缩醛前体的阴离子部位然后与能够聚合的反应活性单体相接触，由此引发该反应活性单体聚合到缩醛前体之上，作为该接触步骤的结果，将另外的反应活性单体加成到该缩醛前体中以形成聚合物链，该接触继续进行到达到了所希望的聚合物链长度为止，随后终止反应得到本发明的聚合物醛前体。

如果需要，所形成的聚合物醛前体能够进一步水解成如以上所述的相应链烷醛。最优选，反应活性单体是环氧乙烷和含在缩醛前体之内的反应活性阴离子部位是醇盐阴离子(O-)，优选伴有碱金属或其它合适的抗衡离子。在缩醛前体中存在的醇盐端基对于环氧乙烷的阴离子开环聚合形成本发明的聚合物链烷醛而言是有活性的。

更具体地说，该缩醛前体一般具有对应于下式的结构：

其中变量具有如上所述的值，例外的是X’是以氧阴离子或O-(例如，在它的中性形式X’典型地以羟基或-OH终端，和在强碱存在下转化成相应醇盐)。合适的抗衡离子包括Na⁺，K⁺，Li⁺和Cs⁺。该终止步骤一般包括中和该反应，例如，通过添加酸。任选地，聚合物链段可以通过烷基化试剂或适合提供非反应活性末端的其它试剂的添加来封端。

在以上方法的一个具体的实施方案中，POLY-Y对应于结构Z-(CH₂CH₂O)_nH，其中n是约10-约4000，和Z选自-OCH₃，-OCH₂CH₃和-OCH₂(C₆H₅)。在另一实施方案中，POLY-Y对应于结构Z-(CH₂CH₂O)nCH₂CH₂O^-M⁺，其中POLY-Y是通过环氧乙烷的阴离子开环聚合到封端的醇盐如Z-CH₂CH₂O^-M⁺(由强碱使Z-CH₂CH₂OH的末端-OH基团金属取代而制得)上所制备的。M⁺表示金属抗衡离子如Na₊，K⁺，Li⁺，Cs⁺，Rb⁺。所制备的POLY-Y适合与如上所述的受保护的链烷醛试剂反应。

概括这一方法的通用化反应历程在这里作为图1来提供，并且进行该反应或系列反应的条件被提供在实施例15中。

聚合物链烷醛试剂的贮存

优选地，本发明的聚合物链烷醛是在惰性气氛下，如在氩气或在氮气下贮存的，因为醛官能团能够与大气氧反应产生相应的羧酸。由于该分子的醛部分与水的反应的潜力(例如，暴露于水分形成相应水合物)，还优选的是最大程度减少本发明的聚合物链烷醛对水分的暴露。因此，优选的贮存条件是在低于约-15℃的温度下在干氩气或其它干燥惰性气体下。在低温条件下的贮存会减少聚合物醛水解成相应水合物形式的速率。另外，对于聚合物链烷醛的聚合物链段是PEG的情况，该链烷醛的PEG部分与氧缓慢地反应从而沿着该分子的PEG部分形成过氧化物。过氧化物的形成能够最终导致链断裂，因此提高了PEG链烷醛试剂的多分散性。考虑到以上情况，另外优选的是将本发明的PEG链烷醛在黑暗中贮存。

生物活性接合物

偶联化学性质

接合到蛋白质上-随机的和N-末端选择性

上述聚合物链烷醛可用于接合到生物活性剂或带有至少一个供反应用的氨基的表面上。典型地，本发明的PEG醛通过还原性胺化作用偶联到氨基上，导致在聚合物链段与表面或生物活性剂之间仲胺连接键的形成。在本发明的聚合物链烷醛与含氨基的生物活性剂或表面接合时，聚合物链烷醛与靶含氨基分子在合适的溶剂中反应形成相应的亚胺连接的中间体，它然后被还原而在聚合物与生物活性剂或表面之间形成仲胺连接键。亚胺还原成相应胺是通过还原剂的添加来实现的。示例性的还原剂包括氰基硼氢化钠，硼氢化钠，氢化锂铝，等等。

一般，本发明的聚合物醛能够用于有选择地瞄准在某些条件下N-末端的改性，这些条件可以分化在N-末端氨基酸上的α胺的反应性。本发明的某些聚合物链烷醛似乎表明比先前已知的醛衍生物更大的选择性，因此更适合于需要选择性N-末端蛋白质改性的应用。制备N-末端改性蛋白质或肽的反应条件包括(i)将需要改性的蛋白质或肽溶解在不含胺的缓冲剂(例如，在约4-约6.5，优选约5-6.5的pH下，最优选在约5-5.5的pH下)中，(ii)在该蛋白质或肽溶液中添加本发明的聚合物链烷醛，(iii)让蛋白质或肽和聚合物链烷醛反应形成亚胺-偶联的聚合物接合物，随后(iv)添加还原剂，形成相应仲胺偶联的聚合物接合物。聚合物链烷醛的随机连接的反应条件基本上等同于如上所述的那些，不同的是pH多少更高一些(将在下面更详细讨论)。

为了有利于N-末端改性，约5-5.5的pH是最优选的，因为由于在N-末端氨基酸的氨基和赖氨酸的氨基的pKa值上的差异，而据信促进选择性N-末端改性。一般而言，有利于N-末端选择性的条件包括低于7，和典型地不低于约4的pH。促进N-末端选择性的最有利的pH能够由本领域中的技术人员来确定，并取决于需要改性的具体蛋白质。进行接合的合适的缓冲剂包括磷酸钠，乙酸钠，碳酸钠，和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。典型地，聚合物链烷醛是以与靶蛋白质等摩尔量或相对于靶蛋白质摩尔过量被添加到含有蛋白质的溶液中。聚合物链烷醛被添加到该靶蛋白质中，按照约1∶1(聚合物链烷醛∶蛋白质)，1.5∶1，2∶1，3∶1，4∶1，5∶1，6∶1，8∶1，或10∶1的摩尔比率。PEG-链烷醛相对于靶蛋白质的摩尔过量典型地是在约2至5之间。该还原性胺化反应典型地在等于或低于约室温(25℃)的温度下进行，虽然温度可以是约-15℃-100℃，更优选约4℃-37℃，大约一个到二十四个小时。该还原剂也典型地以过量添加，也就是说，以相对于聚合物-蛋白质接合物的约2倍至30倍摩尔过量的用量。优选的是以相对于聚合物-蛋白质接合物的10倍至20倍摩尔过量添加还原剂。准确的反应时间是通过检测随时间的推移该反应的进程来确定的。反应的进程典型地通过在各个时间点从反应混合物中取出等分试样并由SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱分析法或任何其它合适的分析方法分析来检测。所形成的PEG化的接合物进一步通过使用诸如MALDI，毛细管电泳，凝胶电泳，和/或色谱分析之类的分析方法来表征。

更具体地说，为了将醛聚合物衍生物偶联到蛋白质或肽上，可以使用许多不同的方法。一个方法(即，随机的PEG化方法)是以共价键将PEG连接于有表面可供使用的任何数量的赖氨酸残基上。为了进行此类反应，蛋白质或肽(如下面提供的那些示例性质的生物分子)典型地与本发明的聚合物链烷醛在不合胺的缓冲剂中在一般约5-8的温和pH下进行反应。(不含胺的缓冲剂是优选的，因为在缓冲剂中的氨基与蛋白质氨基竞争偶联于聚合物链烷醛上)。合适的不含胺的缓冲剂在选择时要求具有合适的pK，以便有所需的pH范围来进行该接合化学过程。偶联反应一般是在数分钟到几个小时(例如，从5分钟到24小时或更长时间)之间进行，平均起来偶联在约0.2和4小时之间进行以形成亚胺偶联的接合物。然后向反应混合物中添加如上所述的许多合适还原剂中的任何一种(例如，氰基硼氢化钠)。所形成的混合物然后在低温到环境温度条件下，例如4℃到37℃下进行大约一个小时到48小时。优选，该还原反应在低于约24小时内完成。随机偶联在7到7.5左右的pH下受到促进，而在N-末端上的偶联在低pH(例如，在5.5左右)下受到促进。

为了提高改性的程度，即，为了促进以共价键在有效位点上连接于靶分子上的PEG的数量的提高，上述条件中的任何一个或多个(例如，聚合物链烷醛与蛋白质或肽的摩尔比率、温度、反应时间、pH等)能够单独或同时提高。不管所使用的PEG链烷醛的分子量，所形成的产物混合物优选地但必进行提纯以分离出过量的试剂、未PEG化蛋白质(或任何靶分子)、多PEG化的接合物、和游离或未反应的PEG链烷醛。

示例性蛋白质的随机PEG化已提供于实施例4和6中。示例性蛋白质的位点选择性PEG化描述在实施例7到13中。

PEG-链节(MER)的表征/任选的分离

任选地，由本发明的PEG醛与生物活性剂反应所生产的接合物被提纯而获得/分离出不同的PEG化物质。或者，对于较低分子量PEG，例如具有低于约20千道尔顿，优选小于或等于约10千道尔顿的分子量，更优选地，该产物混合物能够提纯而获得某些数量的PEG/蛋白质分子附近的一种分布。例如，产物混合物能够提纯而获得一个到五个PEG/蛋白质的平均值，典型地约3个PEG/蛋白质的平均值。最终的接合反应混合物的提纯的策略将取决于多个因素-所使用的聚合物的分子量、具体的蛋白质、所需的剂量用法、和各接合物质的残留活性和活体内性能。

如果需要，具有不同分子量的PEG接合物能够使用凝胶过滤色谱法来分离。也就是说，凝胶过滤色谱法用来分级不同的PEG-链节(1-链节，2-链节，3-链节，等等)，基于它们的不同分子量(其中该差异主要对应于PEG链的平均分子量)。例如，在其中100kDa蛋白质无规接合到具有约20kDa的分子量的PEG链烷醛上的示例性反应中，所形成的反应混合物很可能含有未改性的蛋白质(Mw 100kDa)，单-PEG化的蛋白质(Mw 120kDa)，二-PEG化的蛋白质(Mw 140kDa)，等等。尽管这一方法能够用于分离具有不同分子量的PEG接合物，但是这一方法一般对于分离在蛋白质内具有不同PEG化位点的位置异构物却是效率低的。例如，凝胶过滤色谱法可用于从PEG 1-链节，2-链节，3-链节等的混合物中彼此分离，虽然所回收的PEG-链节组合物的每一种可以含有连接于在蛋白质内的不同反应活性氨基(例如，赖氨酸残基)上的PEG。

适合于进行这一类型的分离的凝胶过滤柱包括从AmershamBiosciences商购的Superdex^TM和Sephadex^TM柱。具体柱的选择将取决于所希望的分级范围。洗脱一般通过使用非胺型缓冲剂如磷酸盐，乙酸盐等来进行。所收集的级分可以通过多种不同的方法来分析，例如(i)对于蛋白质含量的在280nm下的OD，(ii)BSA蛋白质分析，(iii)对于PEG含量的碘试验(Sims G.E.C.等人，Anal.Biochem，107，60-63，1980)，或者，(iv)通过运行SDS PAGE凝胶，随后用碘化钡染色。

位置异构物的分离通过使用RP-HPLC C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)的反转相色谱分析法或通过使用离子交换柱例如可从Amersham Biosciences商购的Sepharose离子交换柱的离子交换色谱法来进行。任一种方法可用于分离具有相同分子量的PEG-生物分子异构体(位置异构物)。

贮存

取决于所形成的PEG-接合物的预定用途，在接合和任选的附加分离步骤之后，接合物混合物可以浓缩，无菌过滤，并在约-20℃到约-80℃的低温下贮存。或者，该接合物可以冻干，有或没有残留缓冲剂并作为冻干粉末来贮存。在一些情况下，优选的是将用于接合的缓冲剂如乙酸钠交换成挥发性缓冲剂如碳酸铵或乙酸铵，它们在冷冻干燥过程中容易被除去，因此冻干的蛋白质接合物粉末配制剂不存在残留缓冲剂。或者，缓冲剂交换步骤可以使用配制剂缓冲剂来应用，因此，冻干的接合物处于这样一种形式，该形式适合于重新组成为配制剂缓冲剂和最终给哺乳动物给药。

小分子接合

本发明的PEG-链烷醛接合到小分子如两性霉素B上一般按照在实施例14中所述来进行，虽然准确的反应条件将根据需要改性的小分子来变化。典型地，该接合是通过使用相对于小分子而言稍微摩尔过量的PEG试剂来进行的，例如约1.2-1.5倍到约5-10倍摩尔过量。在一些情况下，取决于该分子，该小分子药物实际上可以过量使用，如当PEG-小分子接合物沉淀在反应溶剂例如醚中，而未反应的药物保留在溶液中时。

靶分子和表面

本发明的反应性聚合物链烷醛可以以共价键或非共价键连接于许多实体上，其中包括膜、化学分离和提纯表面、固体载体、金属/金属氧化物表面如金，钛，钽，铌，铝，钢，和它们的氧化物、二氧化硅、高分子、和小分子。另外，本发明的聚合物也可用于生物化学传感器，生物电子开关，和栅门。本发明的聚合物链烷醛也可用作肽合成的载体，用于聚合物涂敷的表面和聚合物接枝体的制备，制备供亲合力分配用的聚合物-配位体接合物，制备交联或未交联的水凝胶，和制备用于生物反应器的聚合物-辅因子加合物。

用于偶联到本发明的聚合物上的生物活性剂可以是下列当中的任何一种或多种。合适的试剂可以选自，例如，安眠药和镇静剂，精神兴奋药，镇定剂，呼吸道药物，抗惊厥药，肌肉松弛药，抗帕金森症试剂(多巴胺拮抗剂)，镇痛药，抗发炎剂，抗焦虑药(抗焦虑抑制药)，食欲抑制剂，抗偏头痛试剂，肌肉收缩剂，抗感染剂(抗生素，抗病毒剂，抗真菌剂，疫苗)，抗关节炎药，抗疟药，止吐药，anepileptics，支气管扩张药，细胞活素，生长因子，抗癌试剂，抗血栓形成的试剂，抗高血压药，心血管药物，抗心律失常药，antioxicants，抗哮喘试剂，激素试剂，其中包括避孕药，拟交感神经药，利尿药，类脂调节剂，抗雄激素药，抗寄生虫药，抗凝血剂，抗肿瘤形成药，抗肿瘤药，治疗血糖过低的药，营养剂和补充剂，生长补充剂，抗肠炎试剂，疫苗，抗体，诊断剂，和造影剂。

更具体地说，该活化剂可以落入多个结构等级中的一个之中，包括但不限于小分子(优选不溶性的小分子)，肽，多肽，蛋白质，多糖，甾类，核苷酸，低聚核苷酸，多核苷酸，脂肪，电解质，等等。优选地，偶联到本发明的聚合物链烷醛上的活化剂具有自然的氨基，或者，经过改性含有适合于偶联到本发明的聚合物链烷醛上的至少一个反应活性氨基。

适合于以共价键连接于本发明的聚合物上的活性剂的特定例子包括但不限于门冬酰胺酶，amdoxovir(DAPD)，抗排卵肽，becaplermin，降血钙素，cyanovirin，denileukin diftitox，红细胞生成素(EPO)，EPO激动剂(例如，如在WO96/40749中描述的约10-4O个氨基酸长度并包括特殊芯序列的肽)，链球菌DNA酶α，红细胞生成刺激蛋白质(NESP)，凝血因子如凝血因子V，凝血因子VII，凝血因子VIIa，凝血因子VIII，凝血因子IX，凝血因子X，凝血因子XII，凝血因子XIII，von Willebrand因子，ceredase，cerezyme，α-葡糖苷酶，胶原，环孢子菌素，α防卫素，β防卫素，exedin-4，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，血小板生成素(TPO)，α-1蛋白酶抑制因子，elcatonin，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)，血纤蛋白原，filgrastim，生长激素人生长激素(hGH)，生长激素释放激素(GHRH)，GRO-β，GRO-β抗体，骨形貌生成蛋白质如骨形貌生成蛋白质-2，骨形貌生成蛋白质-6，OP-1；酸性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子，CD-40配体，肝素，人血清白蛋白，低分子量肝素(LMWH)，干扰素如干扰素α，干扰素β，干扰素γ，干扰素Ω，干扰素τ，consensus干扰素；白细胞介素和白细胞介素受体如白细胞介素-1受体，白细胞介素-2，白细胞介素-2融合蛋白质，白细胞介素-1受体拮抗剂，白细胞介素-3，白细胞介素-4，白细胞介素-4受体，白细胞介素-6，白细胞介素-8，白细胞介素-12，白细胞介素-13受体，白细胞介素-17受体；乳铁蛋白和乳铁蛋白片段，黄体激素释放激素(LHRH)，胰岛素，前胰岛素，胰岛素类似物(例如，单酰化的胰岛素，如在US专利No.5,922,675中所述)，糊精，C-肽，生长激素释放抑制激素，生长激素释放抑制激素类似物，其中包括奥曲肽，血管升压素，促卵泡激素(FSH)，流感疫苗，胰岛素样生长因子(IGF)，insulintropin，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，血纤维蛋白溶解酶原活化剂如alteplase，尿激酶，reteplase，链激酶，pamiteplase，lanoteplase，和teneteplase；神经生长因子(NGF)，osteoprotegerin，血小板衍生生长因子，组织生长因子，转化生长因于-1，血管内皮细胞生长因子，白血病抑制因子，角质形成细胞生长因子(KGF)，胶质细胞生长因子(GGF)，T细胞受体，CD分子/抗原，肿瘤坏死因子(TNF)，单核细胞趋化蛋白-1，内皮生长因子，甲状旁腺激素(PTH)，胰高血糖素样肽，促生长激素，胸腺素α1，胸腺素α1 IIb/IIIa抑制剂，胸腺素β10，胸腺素β9，胸腺素β4，α-1抗胰蛋白酶，磷酸二酯酶(PDE)化合物，VLA-4(非常晚期抗原-4)，VLA-4抑制剂，bisphosponates，呼吸道合胞病毒抗体，囊性纤维化跨膜传导调节剂(CFTR)基因，脱氧核糖核酸酶(Dnase)，杀菌/渗透性增大蛋白质(BPI)，和抗-CMV抗体。示例性的单克隆抗体包括etanercept(由连接到IgGI的Fc部分上的人75kD TNF受体的细胞外配体-结合部分组成的二聚融合蛋白质)，abciximab，afeliomomab，basiliximab，daclizumab，infliximab，ibritumomabtiuexetan，mitumomab，muromonab-CD3，碘131 tositumomab接合物，olizumab，rituximab，和trastuzumab(herceptin)。

适合以共价键连接于本发明的聚合物上的附加试剂包括但不限于阿米斯丁，胺碘酮，氨基己酸，氨基马尿酸盐钠，氨鲁导眠能，氨基酮戊酸，氨基水杨酸，安吖啶，阿那格雷，蒽环类药，天冬酰胺酶，anthracyclines，bexarotene，bicalutamide，博来霉素，布舍瑞林，白消安，卡麦角林，capecitabine，卡铂，卡氮芥，苯丁酸氮芥，西司他丁钠，顺铂，克拉立平，氯屈膦酸盐，环磷酰胺，环丙孕酮，阿糖胞苷，喜树碱，13-反视黄酸，全反式视黄酸；达卡巴嗪，更生霉素，柔红霉素，去铁繁，地塞米松，双氯芬酸，己烯雌酚，docetaxel，阿霉素，表阿霉素，雌氮芥，依托泊甙，依西美坦，fexofenadine，氟达拉滨，氟氢可的松，氟尿嘧啶，氟甲睾酮，氟利坦，gemcitabine，肾上腺素，左旋多巴，羟基脲，去甲氧柔红霉素，异环磷酰胺，imatinib，irinotecan，依他康唑，性瑞林，letrozole，亚叶酸，左旋四咪唑，赖诺普利，lovothyroxine钠，环己亚硝脲，氮芥，甲羟基孕酮，甲地孕酮，苯丙氨酸氮芥，巯基嘌呤，酒石酸间羟胺，甲氨喋呤，甲氧氯普胺，美西律，丝裂霉素，米托坦，米托蒽醌，纳洛酮，烟碱，尼鲁米特，善得定，奥沙利铂，氨羟二磷酸二钠，喷司他丁，pilcamycin，porfimer，泼尼松，甲基苄肼，丙氯拉，奥丹西隆，raltitrexed，sirolimus，链脲霉素，藤霉素，他莫昔芬，替莫唑胺，鬼臼噻吩糖苷，睾丸激素，四氢大麻酚，酞胺哌啶酮，硫鸟嘌呤，噻替派，托泊替堪，维A酸，valrubicin，长春碱，长春新碱，长春地辛，维诺利宾，dolasetron，谷尼色创；福莫特罗，氟地松，高丙瑞林，咪达唑仑，阿普唑仑，两性霉素B，鬼臼毒素，核苷抗病毒素，芳酰基腙，舒马曲坦；大环内酯类如红霉素，竹桃霉素，三乙酰竹桃霉素，罗力得，clarithromycin，davercin，阿齐红霉素，氟力索霉素，地红霉素，交沙霉素，螺旋霉素，麦迪霉素，白霉素，麦白霉素，丙酰白霉素，andazithromycin，并且swinolidea；fluoroquinolones比如环丙沙星，氧氟沙星，左氟沙星，trovafloxacin，alatrofloxacin，moxifloxicin，诺氟沙星，依诺沙星，格雷沙星，gatifloxacin，洛美沙星，西洛沙星，替马氟沙星，培氟沙星，氨氟沙星，氟罗沙星，托氟沙星，prulifloxacin，依洛沙星，pazufloxacin，克林沙星，和sitafloxacin；氨基糖苷类如庆大霉素，萘替米星，草履虫素，妥布霉素，阿木卡星，卡那霉素，新霉素，和链霉素，去甲万古霉素，替考拉宁，雷莫拉宁，mideplanin，粘菌素，daptomycin，短杆菌肽，粘菌素；多粘菌素如多粘菌素B，卷曲霉素，杆菌肽，penems；青霉素包括青霉素酶-敏感性试剂象青霉素G，青霉素V；耐青霉素酶的试剂象甲氧苯青霉素，苯唑西林，氯唑西林，双氯青霉素，氟氯青霉素，乙氧萘青霉素；革兰氏阴性微生物活性剂象氨苄西林，阿莫西林，并且海他西林，cillin，和galampicillin；antipseudomonal青霉素如羧苄青霉素，羧噻吩青霉素，阿诺西林，美洛西林，和哌拉西林；头孢菌素如头孢泊肟，cefprozil，头孢布坦，头孢唑肟，头孢曲松，头孢噻吩，头孢吡硫，头孢氨苄，头孢拉定，头孢西丁，头孢孟多，头孢唑啉，头孢噻啶，头孢克洛，头孢羟氨苄，头孢来星，头孢呋辛，头孢雷特，头孢噻肟，头孢三嗪，头孢乙腈，头孢吡肟，头孢克肟，头孢尼西，头孢哌酮，头孢替坦，头孢美唑，头孢他啶，loracarbef，和拉氧头孢，单菌霉素如氨曲南；和carbapenems如亚胺培南，美罗匹宁，戊烷脒β-羟乙磺酸盐，硫酸舒喘灵，利多卡因，硫酸异丙喘宁，倍氯美松双丙酸酯，氟醋酸曲安缩松，布地缩松丙酮化合物，氟地松，异丙阿托品，氟尼缩松，色甘酸二钠，和酒石酸麦角胺；taxanes如紫杉醇；SN-38，和酪氨酸磷酸化抑制剂。

偶联于本发明的聚合物链烷醛上的优选小分子是具有至少一个氨基的那些。优选的分子包括氨基马尿酸钠，两性霉素B，阿霉素，氨基己酸，氨基乙酰丙酸，氨基水杨酸，酒石酸间羟胺，氨羟二磷酸二钠，柔红霉素，甲状腺素钠，赖诺普利，西司他丁钠，美西律，头孢氨苄，去铁敏，和阿米斯丁。

偶联于本发明的聚合物链烷醛上的优选的肽或蛋白质包括EPo，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，consensus IFN，凝血因子VII，凝血因子VIII，凝血因子IX，IL-2，remicade(infliximab)，Rituxan(ritux imab)，Enbrel(etanercept)，Synagis(palivizumab)，Reopro(abciximab)，Herceptin(trastuzimab)，tPA，Cerizyme(imiglucerase)，Hepatitus-B疫苗，rDNAse，α-1蛋白酶抑制因子，GCSF，GMCSF，hGH，胰岛素，FSH和PTH。

以上示例性的生物活性剂希望包括，如果适用的话，类似物，兴奋剂，拮抗剂，抑制剂，异构体，和它们的可药用盐形式。关于肽和蛋白质，本发明希望包括合成的，重组的，天然的，糖基化的，和非糖基化的形式，以及它们的生物活性片段。以上生物活性蛋白质另外希望包括有一个或多个氨基酸取代的、缺失的等等的变体，只要所形成的变体蛋白质具有母体(自然)蛋白质的活性的至少一些。

药物组合物

本发明还包括药物制剂，后者包括这里所提供的接合物和药物赋形剂。一般，该接合物本身是固体形式(例如，沉淀物)，它能够与固体或液体形式的合适的药物赋形剂相混合。

示例性的赋形剂包括，但不限于，选自碳水化合物，无机盐，抗微生物剂，抗氧化剂，表面活性剂，缓冲剂，酸，碱和它们的结合物中的那些。

碳水化合物如糖，衍生化糖如糖醇，醛糖酸，酯化的糖，和/或糖聚合物可以作为赋形剂来列举。特定的碳水化合物赋形剂包括，例如：单糖类，如果糖，麦芽糖，半乳糖，葡萄糖，D-甘露糖，山梨糖，等等；二糖，如乳糖，蔗糖，海藻糖，纤维二糖，等等；多糖，如棉子糖，松三糖，麦芽糖糊精，葡聚糖，淀粉，等等；和糖醇，如甘露糖醇，木糖醇，麦芽糖酸，乳糖醇，木糖醇，山梨糖醇(葡糖醇)，吡喃糖基山梨糖醇，肌醇，等等。

该赋形剂还可以包括无机盐或缓冲剂，如柠檬酸，氯化钠，氯化钾，硫酸钠，硝酸钾，磷酸一钠，磷酸氢二钠，和它们的结合物。

该制剂还可以包括用于防止或制止微生物生长的抗微生物剂。适合于本发明的抗微生物剂的非限制性例子包括氯其烷铵，苯索氯铵，苄醇，十六烷基氯化吡啶鎓，氯丁醇，苯酚，苯乙醇，硝酸苯汞，硫柳汞，和它们的结合物。

抗氧化剂同样能够存在于该制剂中。抗氧化剂用于防止氧化，由此防止该制剂的接合物或其它组分的退化。用于本发明的合适抗氧化剂包括，例如，棕榈酸抗坏血酸酯，丁基化羟基苯甲醚，丁基化羟基甲苯，次磷酸，单硫代甘油，棓酸丙酯，亚硫酸氢钠，甲醛合次硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，和它们的结合物。

表面活性剂可以作为赋形剂而存在。示例性的表面活性剂包括：聚山梨醇酯(polysorbates)，如“Tween 20”和“Tween 80”，和Pluronic如F68和F88(两者从BASF，Mount Ollve，New Jersey商购)；脱水山梨糖醇酯；类脂，如磷脂类如卵磷脂和其它磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺(虽然优选不呈现脂质体形式)，脂肪酸和脂肪酸酯；甾类，如胆固醇；和螯合剂，如EDTA，锌和其它此类合适的阳离子。

酸或碱可以作为赋形剂存在于该制剂中。能够使用的酸的非限制性例子包括选自氢氯酸，乙酸，磷酸，柠檬酸，苹果酸，乳酸，甲酸，三氯乙酸，硝酸，高氯酸，磷酸，硫酸，富马酸，和它们的结合物中的那些酸。合适的碱的例子包括，没有限制，选自氢氧化钠，乙酸钠，氢氧化铵，氢氧化钾，乙酸铵，乙酸钾，磷酸钠，磷酸钾，柠檬酸钠，甲酸钠，硫酸钠，硫酸钾，富马酸钾，和它们的结合物中的碱。

该药物制剂包括所有类型的配制剂和尤其适合注射的那些，例如能够重配的粉末以及悬浮液和溶液。接合物(即，在活性剂和这里描述的聚合物之间形成的接合物)在组合物中的量将根据多个因素来变化，但(当组合物在单位剂量容器(例如小瓶)中贮存时最佳是治疗有效量。另外，该药物制剂能够装入注射器中。治疗有效量能够在实验上通过渐增量的接合物的反复给药以确定产生所需临床终点效果的量来确定。

任何单个赋形剂在组合物中的量将取决于赋形剂的活性和组合物的具体需要来变化。典型地，任何单个赋形剂的最佳量通过常规实验来确定，即，通过制备含有不同量的赋形剂(从低到高)的组合物，考察稳定性和其它参数，然后测定达到最佳性能但没有显著的不利影响的用量范围。

然而，一般来说，赋形剂是以约1％-约99％(重量)，优选约5％-98％(重量)，更优选约15-95％(重量)的赋形剂的量存在于组合物中，其中低于30％(重量)的浓度是最优选的。

这些前述的药物赋形剂与其它赋形剂一起已描述在“Remington：The Science & Practice of Pharmacy”，第十九版，Williams &Williams(1995)，“Physician′s Desk Reference”，第52版，Medical Economics，Montvale，NJ(1998)，和Kibbe，A.H.，Handbookof Pharmaceutical Excipients，第三版，American PharmaceuticalAssociation，Washington，D.C.，2000。

本发明的药物制剂典型地，虽然不必经注射途径给药，因此在给药之前一般是液体溶液或悬浮液。该药物制剂也可以采取其它形式如糖浆剂，霜剂，软膏，药片，粉末，等等。其它模式的给药也包括在内，如经肺，经直肠，经皮，经粘膜，口服，鞘内，皮下，动脉内等等。

如前面所述，该接合物能够通过静脉注射由肠胃外途径注入，或不太优选地通过肌注或皮下注射。肠胃外投药的合适配制剂类型包括即用的注射溶液，在使用之前与溶剂混合的干燥粉，注射用的悬浮液，在使用之前与媒介物混合的干燥不溶性组合物，和在施用之前需要稀释的乳液和液体浓缩物，等等。

给药的方法

本发明还提供了将这里提供的接合物给药于患有对用接合物的治疗有响应的一种症状的患者的方法。方法包括，一般经由注射，给药治疗有效量的接合物(优选作为药物制剂的一部分提供)。给药的方法可用于治疗可由特定接合物的给药来医治或防止的任何症状。本领域的技术人员会认识到特定的接合物能够有效地治疗哪些症状。被给药的实际剂量将取决于主体的年龄、体重和一般状况以及所治疗的症状的严重性，护理专业人员的判断，和所给药的接合物来变化。治疗有效量是本领域的技术人员所已知的和/或描述在相关的参考教科书和文献中。一般，治疗有效量是约0.001mg-100mg，优选按0.01mg/天到75mg/天的剂量，和更优选按0.10mg/天到50mg/天的剂量。

任何给定的接合物(还是优选作为药物制剂的一部分提供)的单位剂量能够以各种剂量给药程序来施用，这取决于临床医生的判断、患者的需要，等等。特定的剂量给药程序是本领域中技术人员已知的或通过使用常规方法经过实验来确定。示例性的剂量给药程序包括，但不限于，一天给药五次，一天四次，一天三次，一天两次，每天一次，一周三次，一周两次，一周一次，一月两次，一月一次，和它们的任何结合。一旦临床终点效果已经实现，组合物的剂量给药则停止。

本发明给药的接合物的一个优点是各个水溶性聚合物部分能够断裂。当因为聚合物尺寸而使得从体内清除是潜在性问题时，这一结果是理想的。最佳地，各水溶性聚合物部分的断裂可通过使用生理可分裂的和/或酶促可降解的连接键如脲烷，酰胺，碳酸酯或含酯的连接键来促进。这样，接合物的清除(经由各个水溶性聚合物部分的断裂)能够通过选择聚合物分子大小和提供所需清除性能的官能团类型来调整。本领域中的技术人员能够确定聚合物的合适分子大小以及可分裂的官能团。例如，本领域中的技术人员，使用常规的实验能够通过首先制备具有不同聚合物分子量和可断裂的官能团的各种聚合物衍生物，然后通过将聚合物衍生物给药于患者和获取周期性的血和/或尿样品获得清除曲线(例如通过血或尿的周期取样)，来确定合适的分子大小和可断裂的官能团。一旦获得一系列的对于各试验的接合物的清除曲线，能够确定合适的接合物。

这里提及的全部文章、书籍、专利、专利出版物和其它出版物以它们的全部内容被引入这里供参考。

实施例

需要理解的是，尽管已经结合本发明的某些优选的特定实施方案描述了本发明，但是前面的叙述以及后面的实施例用于说明但不限制本发明的范围。在本发明范围内的其它方面、优点和改性对于本发明所涉及的技术领域的技术人员是显而易见的。

原料和方法。

在所附实施例中的全部PEG试剂都可以商购，除非另有说明。全部NMR数据由Bruker制造的300MHz核磁共振波谱仪来获得。

溶菌酶由Sigma获得。

实施例1

_MPEG(2K)-丁醛的合成

A.mPEG(2KDa)-丁醛，二乙基缩醛的制备

mPEG(2KDa)(2.0g)和甲苯(30ml)的混合物在减压下通过蒸馏出甲苯来进行共沸干燥。将干燥的mPEG(分子量，2千道尔顿)溶于无水甲苯(15ml)中，在其中添加叔丁醇钾在叔丁醇中的1.0M溶液(4.0ml，0.004摩尔)和4-氯丁醛二乙基缩醛(0.5g，0.00277摩尔)(AlfaAesar)。混合物在100-105℃下在氩气氛中搅拌一夜。在冷却到室温之后，混合物被过滤和添加到处于0-5℃下的150ml乙基醚中。沉淀的产物被滤出并在减压下干燥。产量：1.6g。反应基本按定量的产率来进行。就是说，基本上全部的mPEG起始原料转化成相应二乙基缩醛，这点基于不存在¹H NMR测得的对应于mPEG-OH起始原料的羟基质子。

NMR(d₆-DMSO)：1.09ppm(t，CH₃-C-)1.52ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，3.24ppm(s，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.46ppm(t，-CH，缩醛)。

B.mPEG(2KD)-丁醛的制备

来自以上A.的mPEG(2K Da)丁醛，二乙基缩醛(1.0g)，去离子水(20ml)，和调节pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室温下搅拌3小时。向该混合物中添加氯化钠(1.0g)和通过添加0.1M氢氧化钠将pH调节到6.8。该产物，mPEG(2D)丁醛用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥和在减压下蒸馏出溶剂而得到了离析形式的mPEG丁醛产物。产量：0.72g。

反应基本按定量的产率来进行。就是说，基本上全部的mPEG丁醛二乙基缩醛转化成相应的醛，这点基于不存在1H NMR测得的对应于mPEG-OH起始原料的羟基质子和对应于二乙基缩醛的羟基质子。

NMR(d₆-DMSO)：1.75ppm(p，-CH₂-CH₂-CHO-)2.44ppm(dt，-CH₂-CHO)，3.24ppm(s，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)，9.66ppm(t，-CHO)。

实施例2

mPEG(30kD)-丁醛的合成

A.mPEG(30KDa)-丁醛，二乙基缩醛的制备

mPEG_30K-O-CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₃)₂

mPEG(30kD)(在甲苯中60％溶液，3.30g)，甲苯(30ml)和BHT(丁基化羟基甲苯，0.004g)的混合物通过在减压下馏出溶剂来进行共沸干燥。将干燥的mPEG 30K溶于无水甲苯(15ml)中，向该溶液中添加叔丁醇钾在叔丁醇中的1.0M溶液(4.0ml，0.004摩尔)，4-氯丁醛二乙基缩醛(0.5g，0.00277摩尔)(Alfa Aesar)和溴化钾(0.05g)。所形成的混合物在105℃下在氩气氛中搅拌一夜。混合物进行过滤，在减压下浓缩到干燥为止，和将粗产物溶于20ml的二氯甲烷中。

将该含有产物的溶液添加到在室温下的乙基醚(300ml)中以沉淀产物。沉淀的产物通过过滤来分离和在减压下干燥。产量：1.92g。

NMR(d₆-DMSO)：1.09ppm(t，CH₃-C-)1.52ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，3.24ppm(s，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.46(t，-CH，缩醛)。

以产物的产量和分析为基础，缩醛试剂在mPEG-OH试剂的羟基末端上的取代在非常高的效率下进行，那就是说基本上100％取代。以高纯度生产出产物(无需进一步提纯)，没有可检测的或显著的量的未反应的mPEG-OH。典型地，本发明的链烷醛或缩醛聚合物以高纯度生产-就是说，典型地，所需的链烷醛产物以至少85％纯度，优选至少90％纯度，和更优选至少95％纯度的存在于最终组合物中。

B.mPEG(30K Da)-丁醛的制备

mPEG_30K-O-CH₂(CH₂)₂-C(O)H

来自以上A.的mPEG(30K Da)丁醛，二乙基缩醛(1.0g)，去离子水(20ml)，和调节pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室温下搅拌3小时。向该混合物中添加氯化钠(1.0g)和通过添加0.1M氢氧化钠将pH调节到6.8。该产物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥和蒸馏除去溶剂。湿产物在减压下干燥。产量：0.82g。

取代度：～100％。

转化成相应醛的过程基本上按定量的产率来进行。

实施例3

在碱性pH下mPEG-丙醛和mPEG-丁醛的对比稳定性

甲氧基-PEG-丙醛和mPEG-丁醛各自以较长时间暴露于高pH条件下以对比各聚合物在碱性pH条件下的相对稳定性。如下面所说明，较大量的丙醛PEG在这些条件下反应形成mPEG-OH和释放出丙烯醛(由于逆Michael型反应)然而没有检测到PEG丁醛化合物的损失。这一实验的细节在下面提供。

A.在碱性pH下mPEG(2K Da)-丁醛的稳定性

将mPEG(2K Da)-丁醛(来自实施例1)(0.5g)溶于10ml 5mM磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)和所形成的溶液在室温下搅拌24h。添加NaCl(0.5g)，产物用二氯甲烷(3×10ml)萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥和在减压下于25℃馏出溶剂。

以¹H NMR分析为基础，该产物是无变化的。就是说，没有检测到PEG-丁醛的分解，即使在这些碱性pH条件下经过较长时间之后。

B.在碱性pH下mPEG(5K Da)-丙醛的稳定性

将mPEG(5KDa)-丙醛(Shearwater Corporation，醛取代度82％)(0.5g)溶于10ml 5mM磷酸盐缓冲液(pH＝8.0)中。所形成的溶液在室温下搅拌24h。气相色谱法顶部空间气体分析表明，溶液含有从在碱性条件(如典型用于蛋白质接合的那些)下的消去反应所产生的丙烯醛(CH₂＝CH-CHO)。添加NaCl(0.5g)，产物用二氯甲烷(3×10ml)萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥和在减压下于25℃馏出溶剂。

以1H NMR分析为基础，mPEG(5k Da)丙醛的取代度降至62％(就是说，38％的PEG-丙醛已经分解)，且该产物含有较大量的mPEG-OH，从与PEG-丙醛的丙醛部分对应的C-3链段的损失得出。

实施例4

溶菌酶的PEG化

(“溶菌酶-NH₂”是指具有一个的所示反应活性氨基的溶菌酶分子)。

A.使用2KD PEG链烷醛的无规PEG化。

模型蛋白质，溶菌酶，129氨基酸分泌酶，用于说明本发明的链烷醛聚合物与示例性蛋白质的偶联。溶菌酶含有六个赖氨酸残基作为PEG化的潜在部位。

将溶菌酶(2.1mg)溶于1ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)中，在其中添加mPEG(2kD)-丁醛(来自实施例1，1.5mg)。向该溶液中添加还原剂NaCNBH₃(氰基硼氢化钠)，溶液在室温下搅拌24小时。所形成的溶菌酶接合物具有由中间的-(CH₂)₄-链偶联于溶菌酶氨基上的PEG链。

反应产物通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法进行分析并显示出了与在质量相差大约2000Da的16208Da、18422Da和20520Da(对应于PEG丁醛试剂的尺寸)下溶菌酶的三种PEG化物质对应的峰。未改性(天然)溶菌酶的质量由MALDI-TOF测得是14153。因此，所形成的接合物其实是单PEG化蛋白质，二PEG化蛋白质，和三PEG化蛋白质(1-链节，2-链节和3-链节)的混合物。

以上说明了本发明的示例性蛋白质的无规PEG化，得到PEG化产物的分布。如果需要，反应混合物能够进一步分离以离析出各PEG接合物，即连接了一个PEG分子的溶菌酶，连接两个PEG分子的溶菌酶，和连接三个PEG分子的溶菌酶。在如上所述的接合物组合物的每一种之内(1-链节，2-链节，3-链节)，该PEG分子可以连接于在溶菌酶分子内的不同的反应活性氨基位点上。

B.使用5KD PEG链烷醛，mPEG-2-甲基丁醛，的PEG化。

模型蛋白质(溶菌酶)的接合通过使用α支化PEG试剂，mPEG_5kD-2-甲基丁醛来重复。将溶菌酶(3mg)溶于大约1mL的在约5.5到7.5的pH下的磷酸钠缓冲剂中。将两至五倍摩尔过量的PEG试剂，mPEG_5kD-2-甲基丁醛，添加到溶菌酶溶液中，所形成的溶液被放置在旋转混合器上和在室温下进行反应。在大约15分钟后，添加20倍摩尔过量的NaCNBH₃和让反应继续进行。在各个时间间隔(4小时，8小时，12小时，16小时等)取出等分试样和由SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱分析法监测反应进程。

在反应完成之后，所形成的接合物混合物被浓缩，无菌过滤，和在低温条件(-20℃到-80℃)下贮存，直至进一步使用为止。

实施例5

支化PEG 2(40.3KDA)-丁醛的制备

下面提供了具有支化PEG链段的示例性聚合物链烷醛的制备方法。

概述。整个合成包括首先四(乙二醇)间隔剂偶联到反应活性链烷醛前体，4-氯丁醛二乙基缩醛上。低聚乙二醇间隔剂的引入可通过延长在反应活性醛(或缩醛)基团和包含在连接基结构部分x’中的反应活性基团之间的链长度来为所形成的产物提供更高的稳定性，因此最大程度地减少了潜在副反应的发生和改进产率。

低聚间隔剂如四甘醇的使用也提供了能够转化(如果需要的话)的反应活性官能团(在这一情况下为羟基)以便偶联于已经通过色谱分离法提纯而除去聚合物杂质如PEG-二醇，mPEG-OH等的聚合物链段上。用这种方法，在PEG链段偶联于链烷醛前体上得到最终产物即基本上不含聚合物杂质的水溶性聚合物链烷醛之前，从PEG链段中除去不希望有的官能化聚合物杂质如PEG-二醛(由PEG二醇产生)等。

下面转换到具体的反应，四(乙二醇)间隔剂偶联于4-氯丁醛二乙基缩醛上会导致被二链烷醛产物和起始四(乙二醇)污染的所需单-链烷醛产物的形成。然而，利用在反应混合物中全部组分的溶解度差异的直接后处理使得可以实现高纯度单链烷醛产物(即具有在四(乙二醇)分子的反应活性羟基的仅仅一个上取代的链烷醛(缩醛)官能团)的容易制备。(反应A.)。来自反应A的产物然后通过与甲烷磺酰氯的反应被转化成相应甲烷磺酸酯，即，四(乙二醇)的游离羟基首先转化成甲磺酸酯(反应B)，随后甲磺酸酯转化成伯氨基(反应C)。缩醛试剂的反应活性氨基然后偶联到具有适合与缩醛试剂的氨基反应的反应活性羰基碳的示例性支化聚合物骨架链段上。PEG反应物的前体，mPEG-二取代的赖氨酸，在转化成相应的活化酯之前由离子交换色谱法提纯以除去聚合物杂质。mPEG-二取代赖氨酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯然后与氨基链烷醛缩醛反应，经由酰胺键的形成，形成支化PEG-间隔剂-链烷醛缩醛。该缩醛然后在酸催化的反应中容易地水解形成相应的链烷醛，尤其2-分支支化PEG(40KDa)丁醛。

这一合成方法，即，不局限于支化聚合物链段而可以用于具有任何这里所述几何结构的聚合物链段。

总体合成的概述：

A.四(乙二醇)单-丁醛，二乙基缩醛

HO-(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂O-CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

四(乙二醇)(97.1g，0.500摩尔)和甲苯(200ml)的混合物通过在减压(旋转蒸发器)下馏出甲苯进行共沸干燥。将干燥的四(乙二醇)溶于无水甲苯(180ml)并添加叔丁醇钾在叔丁醇的1.0M溶液(120.0ml，0.120摩尔)中和4-氯丁醛二乙基缩醛(18.1g，0.100摩尔)(AlfaAesar)。混合物在95-100℃下在氩气氛中搅拌一夜。在冷却到室温之后，混合物进行过滤和在减压下馏出溶剂。将粗产物溶于1000ml去离子水中并且所形成的溶液经活性炭过滤。添加氯化钠(10g)并且该产物用二氯甲烷(250，200和150ml)萃取。干燥萃取液(在MgSO₄上)和在减压(由旋转蒸发)下馏出溶剂。

将粗产物溶于300ml 10％磷酸盐缓冲液(pH＝7.5)中，用乙酸乙酯(2×50ml)萃取出杂质。该产物用二氯甲烷(200，150，和100ml)萃取。干燥萃取液(在MgSO₄上)和在减压(由旋转蒸发)下馏出溶剂。

产量：20.3g。NMR(d₆-DMSO)：1.10ppm(t，CH₃-C-)1.51ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，3.49ppm(bm，-OCH₂CH₂O-)，4.46ppm(t，-CH，缩醛)，4.58ppm(t，-OH)。

纯度：～100％(没有未反应起始原料的迹象)。

B.四(乙二醇)-α-甲磺酸酯-ω-丁醛，二乙基缩醛，CH₃-S(O)₂-O-(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂O-CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

四(乙二醇)单-丁醛，二乙基缩醛(12.5g，0.037摩尔)和甲苯(120ml)的混合物通过在减压(旋转蒸发器)下馏出甲苯进行共沸干燥。将干燥的四(乙二醇)单-丁醛，二乙基缩醛溶于无水甲苯(100ml)中。向溶液中添加20ml的无水二氯甲烷和5.7ml的三乙胺(0.041摩尔)。然后滴加4.5g的甲磺酰氯(0.039摩尔)。溶液在室温下在氮气氛中搅拌一夜。接着添加碳酸钠(5g)，混合物搅拌1小时。然后过滤溶液和在减压(旋转蒸发器)下馏出溶剂。

1.10ppm(t，CH₃-C-)1.51ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，3.17ppm(s，CH₃-甲烷磺酸酯)，3.49ppm(bm，-OCH₂CH₂O-)，4.30ppm(m，-CH₂-甲烷磺酸酯)，4.46ppm(t，-CH，缩醛)。

纯度：～100％。

C.四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基缩醛

H₂N-(CH₂CH₂O)₄CH₂CH₂O-CH₂(CH₂)₂-CH(OCH₂CH₂)₂

四(乙二醇)-α-甲磺酸酯-ω-丁醛，二乙基缩醛(14.0g)，浓氢氧化铵(650ml)，和乙醇(60ml)的混合物在室温下搅拌42小时。接着在减压下馏出全部挥发性物质。将粗产物溶于150ml去离子水中，溶液的pH用1.0M NaOH调节到12。该产物用二氯甲烷(3×100ml)萃取。干燥萃取液(在MgSO₄上)和在减压(旋转蒸发器)下馏出溶剂。

产量：10.6g。NMR(D₂O)：1.09ppm(t，CH₃-C-)1.56ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，2.69ppm(t，CH₂-N)，3.56ppm(bm，-OCH₂CH₂O-)，4.56ppm(t，-CH，缩醛)。纯度：～100％。

D.支化PEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基缩醛

从相应的PEG2-赖氨酸制备PEG2(40KDa)-N-羟基琥珀酰亚胺(如在US专利No.5,932,462(Harris，J.等人)中所述的。前体PEG-2赖氨酸，一种具有可电离的羧基的支化PEG，通过离子交换色谱法提纯，也如在US专利No.5,932,462中所述。

向PEG2(40KDa)-N-羟基琥珀酰亚胺(5.0g，0.000125摩尔)(Shearwater Corporation)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中添加四(乙二醇)-α-氨基-ω-丁醛，二乙基缩醛(0.50g，0.000148摩尔)和三乙胺(0.035ml)，反应混合物在室温下在氩气氛中搅拌一夜。溶剂通过使用旋转蒸发器蒸发至干燥。将粗产物溶于二氯甲烷中并用异丙醇沉淀。湿产物在减压下干燥。产量：4.8g。

NMR(d₆-DMSO)：1.10ppm(t，CH₃-C)，1.51ppm(m，C-CH₂-CH₂-)，3.24ppm(s，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)，4.46ppm(t，-CH-，缩醛)。取代度：～100％。

E.支化PEG2(40.3KDa)-丁醛

将支化PEG2(40.3KDa)-丁醛，二乙基缩醛(4.8g)溶于100ml水中并且溶液的pH用稀磷酸调节至3。溶液在室温下搅拌3小时，随后添加0.5M氢氧化钠足以调节溶液的pH到约7。该产物用二氯甲烷萃取，且萃取液用无水硫酸镁干燥。溶剂被减压馏出。

产量：4.2g。NMR(d₆-DMSO)：1.75ppm(p，-CH₂-CH₂-CHO-)，2.44ppm(dt，-CH₂-CHO)，3.24ppm(s，-OCH₃)，3.51ppm(s，PEG骨架)，9.66ppm(t，-CHO)。

取代度：～100％。

以上举例说明本发明的又一个实施方案——代表性支化PEG链烷醛的制备。以上也举例说明了本发明的实施方案，其中聚合物链烷醛含有短的低聚基团，在这种情况下为插入在聚合物骨架和该分子的链烷醛链段之间的四甘醇。此外，这一实施例举例说明了含有可电离基团的前体聚合物链段的使用，使得该聚合物链段在偶联于链烷醛-缩醛试剂上之前能够由离子交换色谱法提纯，从而在反应历程的早些时候有效地除去聚合物杂质。在这一情况下，所形成的产物不存在双官能的聚合物杂质如从PEG-二醇，或mPEG，或单PEG化赖氨酸等的反应产生的那些，它们可能存在于mPEG2-赖氨酸前体中，但通过色谱分离法除去。

实施例6

聚合物-链烷醛蛋白质接合物的制备

EPO的无规PEG化

重组EPO(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)或另一种微生物源)偶联于mPEG-丁醛30kDa(如在实施例2中所述制得)。

将EPO(～2mg)溶于1ml的50mM磷酸盐缓冲液(pH7.6)并且mPEG(30kDa)-丁醛以5倍于EPO摩尔浓度的量被添加进去。添加还原剂NaCNBH₃，溶液在室温下搅拌24小时将PEG-丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应混合物由SDS-PAGE分析测定PEG化程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节等的证实通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的物质的所显示峰相差约30,000Da。所形成的反应混合物含有天然的和单PEG化的蛋白质的混合物。提高PEG试剂与蛋白质的比率可以提高多PEG化的程度，即，2-链节，3-链节等的形成。

分子量大于约20kDa的高分子量PEG链烷醛的使用有利于单-PEG化物质的形成。较小分子量PEG链烷醛，当偶联于蛋白质上时，在这些条件下更倾向于多-PEG化物质的形成。

以上说明了本发明的示例性蛋白质的无规PEG化，得到PEG化EPO产物的分布。如果需要，反应混合物能够进一步分离以离析出各异构体，如下所述。

具有不同分子量的PEG接合物然后通过凝胶过滤色谱法分离。不同的PEG接合物(1-链节，2-链节，3-链节等)以它们的不同分子量为基础来分级(在这种情况下，变化大约30kDa)。具体地说，该分离通过使用适合于在所观察的分子量范围内有效分离产物的系列柱系统，例如，Superdex^TM200柱(Amersham Biosciences)来进行。该产物用10ml乙酸盐缓冲剂在1.5ml/min的流速下进行洗脱。所收集的级分(1ml)由在280nm下OD分析蛋白质含量和使用碘试验分析PEG含量(Sims G.E.C.等，Anal.Biochem，107，60-63，1980)。或者，通过运转SDS PAGE凝胶，随后用碘化钡染色来显现结果。收集与洗脱峰对应的级分，通过使用10-30kD截止薄膜进行浓缩，并冻干。这一方法导致了具有相同分子量的接合物的分离/提纯，但无法实现具有相同分子量但具有不同PEG化位点的接合物(即，位置异构物)的分离。

位置异构物的分离通过使用RP-HPLC C18柱(AmershamBiosciences或Vydac)由反相色谱分析法来进行的。这一程序可以有效地分离具有相同分子量(位置异构物)的PEG-生物分子异构体。该反相色谱法通过使用RP-HPLC C18制备柱来进行的并用水/0.05％TFA(洗脱剂A)和乙腈/0.05％TFA(洗脱剂B)的梯度来洗脱。

收集与洗脱峰对应的级分，蒸发除去乙腈和TFA，随后除去溶剂而分离出各PEG-位置异构体。

实施例7

聚合物-链烷醛蛋白质接合物的制备

EPO的N-末端PEG化

重组EPO(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞，但不限于它)或另一种微生物源)偶联于mPEG-丁醛30kDa(实施例2)。

将EPO(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸钠(pH5)和mPEG(30kDa)-丁醛(来自实施例2)以5倍于EPO摩尔浓度的量被添加进去。添加还原剂NaCNBH3，溶液在4℃下搅拌24小时将PEG-丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应混合物由SDS-PAGE分析测定PEG化程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节等的证实进行通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的物质的所显示峰相差约30,000Da。所形成的反应混合物主要含有天然的和单PEG化的蛋白质的混合物。单PEG化物质由柱色谱法提纯以除去游离EPO和更高分子量物质。

N-末端PEG化的证实是通过作肽图来进行的。提高PEG与蛋白质的比率可以提高PEG化的程度，得到多-PEG化蛋白质。

以上说明了本发明的示例性蛋白质的PEG化，得到主要N-末端单PEG化蛋白质。

实施例8

GCSF的N-末端PEG化

重组GCSF(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(如CHO细胞)或其它微生物源)偶联于mPEG-丁醛(30kDa)上。

将GCSF(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸钠(pH5)中并且mPEG(30kDa)-丁醛(来自实施例2)以5倍于GCSF摩尔浓度的量被添加进去。添加还原剂NaCNBH₃，溶液在4℃下搅拌24小时将PEG-丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应混合物由SDS-PAGE分析测定PEG化程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节等的证实进行通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的物质的所显示峰相差约30,000Da。所形成的反应混合物主要含有天然的和单PEG化的GCSF的混合物。单PEG化物质由柱色谱法提纯以除去游离GCSF和更高分子量物质。N-末端PEG化的证实是通过作肽图来进行的。提高PEG与蛋白质的比率可以提高PEG化的程度，得到多-PEG化蛋白质。

实施例9

干扰素α的N-末端PEG化

重组体IFN-α(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞，但不限于它)或其它微生物源)偶联于mPEG-丁醛(30kDa)上。

将干扰素-α(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸钠(pH5)中并且mPEG(30kDa)-丁醛(来自实施例2)以5倍于IFN摩尔浓度的量被添加进去。添加还原剂NaCNBH₃，溶液在4℃下搅拌24小时将PEG-丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应混合物由SDS-PAGE分析测定PEG化程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节等的证实进行通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的物质的所显示峰相差约30,000Da。所形成的反应混合物主要含有天然的和单PEG化的蛋白质的混合物。单PEG化物质由柱色谱法提纯以除去游离干扰素α和更高分子量物质。N-末端PEG化的证实是通过作肽图来进行的。提高PEG与蛋白质的比率可以提高PEG化的程度，得到多-PEG化IFN。

蛋白质hGH，IFN-β，和FSH接合到另一种示例性PEG-链烷醛(mPEG-2-甲基丁醛，20kDa)上基本上按照在上述实施例中所述的方法来进行。

实施例10

人生长激素的N-末端PEG化

重组人生长激素(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(如CHO，但不限于它)或另一种微生物源)偶联于mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)上。

将人生长激素(～2mg)溶于1ml的0.1mm乙酸钠(pH5)中并且mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)以5倍于hGH摩尔浓度的量添加。添加5-20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，溶液在4℃下搅拌24小时以使PEG-α甲基丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应的进程SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱分析法分析，以测定PEG化的程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节等的证实进行通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的和其它的物质的所显示峰相差约20,000Da。所形成的反应混合物主要含有天然的和单PEG化的蛋白质的混合物。单PEG化物质由柱色谱法提纯以除去游离hGH和更高分子量物质。N-末端PEG化的证实是通过作肽图来进行的。提高PEG醛与蛋白质的比率可提高PEG化的程度，得到多PEG化hGH的群。

实施例11

干扰素-β的N-末端PEG化

重组干扰素-β(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(例如，CHO细胞，但不限于它)或另一种微生物源)偶联于mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)上。

将干扰素-β(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸钠(pH5)中并且mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)以5倍于IFN-β摩尔浓度的量添加。添加5-20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，溶液在4℃下搅拌24小时以使PEG-α甲基丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应的进程是由SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱分析法分析，以测定PEG化的程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节等的证实进行通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的和其它的物质的所显示峰相差约20,000Da。所形成的反应混合物主要含有天然的和单PEG化的蛋白质的混合物。单PEG化物质由柱色谱法提纯以除去游离IFN-β和更高分子量物质。N-末端PEG化的证实是通过作肽图来进行的。提高PEG醛与蛋白质的比率可提高PEG化的程度，得到多PEG化IFN-β的群。

实施例12

FSH的N-末端PEG化

重组促卵泡激素(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(如CHO，但不限于它)或另一种微生物源)偶联于mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)上。

将促卵泡激素，FSH(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸钠(pH5)中并且mPEG-2-甲基丁醛(20kDa)以5倍于FSH摩尔浓度的量添加。添加5-20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，溶液在4℃下搅拌24小时以使PEG-α甲基丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应的进程是由SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱分析法分析，以测定PEG化的程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节等的证实进行通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的和其它的物质的所显示峰相差约20,000Da。所形成的反应混合物主要含有天然的和单PEG化的蛋白质的混合物。单PEG化物质由柱色谱法提纯以除去游离FSH和更高分子量物质。N-末端PEG化的证实是通过作肽图来进行的。提高PEG醛与蛋白质的比率可提高PEG化的程度，得到多PEG化FSH的群。

实施例13

人生长激素的N-末端PEG化

重组hGH(在大肠杆菌中产生，哺乳动物细胞(如CHO，但不限于它)或另一种微生物源)以共价键连接于支化PEG2(40.3kDa)-丁醛(实施例5E)上。

将人生长激素(～2mg)溶于1ml的0.1mM乙酸钠(pH5)中并且支化PEG2(40.3KDa)-丁醛以5倍于hGH摩尔浓度的量添加。添加5-20倍摩尔过量的还原剂NaCNBH₃，溶液在4℃下搅拌24小时以使支化PEG2(40.3KDa)-丁醛试剂经由胺键偶联于蛋白质上。

反应的进程是由SDS-PAGE或MALDI-TOF质谱分析法分析，以测定PEG化的程度。PEG化的程度，1-链节，2-链节(如果有的话)等的证实进行通过基质辅助的激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析法来进行。对于天然的和单PEG化的和其它的物质的所显示峰相差约40,000Da。所形成的反应混合物主要含有天然的和单PEG化的蛋白质的混合物，尤其由于支化PEG链烷醛试剂的尺寸和几何结构。单PEG化物质由柱色谱法提纯以除去游离hGH和更高分子量物质。N-末端PEG化的证实是通过作肽图来进行的。

实施例14

两性霉素B的PEG化

小分子两性霉素B的氨基通过聚合物链烷醛的连接来改性。

向两性霉素B.HCl在去离子水中的溶液中添加2倍摩尔过量的已溶于pH6.5的0.1M磷酸盐缓冲液中的mPEG_2k-丁醛(实施例1)。向该混合物中添加NaCNBH₃(以1.5-10倍摩尔过量)在pH6.5的磷酸盐缓冲液中的溶液，所形成的溶液在室温下在氩气氛中搅拌一夜。反应混合物的等分试样在各个时间间隔取出，由1H NMR监测反应的进程。一旦完成，反应混合物通过添加水来进一步稀释，并添加NaCl达到饱和。该产物然后用二氯甲烷萃取，且合并的有机萃取物在无水硫酸钠上干燥，过滤除去干燥剂，并由旋转蒸发方法蒸发溶剂。产物然后通过二乙醚的添加来沉淀，在真空下干燥一夜。回收的产物由凝胶渗透色谱法分析以测定接合的程度。

粗产物通过使用Poros 50 HS阳离子交换树脂(PerSeptiveBioSystems，Framingham，MA)由阳离子交换色层分离法提纯。在用去离子水洗涤色谱柱之后，产物用1N NaCl溶液洗脱。含有萃取液的接合物被合并，产物用二氯甲烷萃取。有机溶液在无水硫酸钠上干燥，过滤，并由旋转蒸发来蒸发溶剂。提纯的接合物通过二乙醚的添加来提纯。

如果需要，产物通过使用Betasil C18柱(Keystone Scientific)由反相HPLC色谱分离法进一步提纯。

实施例15

由环氧乙烷的阴离子开环聚合直接到阴离子缩醛前体上制备PEG(3500DA)-α-羟基-ω-丁醛的方法

在这一实施例中，具有适合于引发环氧乙烷的开环聚合的部位的缩醛前体通过4-氯丁醛二乙基缩醛与二醇(乙二醇)反应来制备。以这种方法，卤素-缩醛转化成羟基终端缩醛。羟基，当转化成相应醇盐阴离子时，提供了引发环氧乙烷(EO)的聚合的部位，从而形成聚合物链烷醛前体。聚合物链烷醛前体(缩醛)，在水解之后，转化成所需的聚合物链烷醛。

用于制备本发明的聚合物链烷醛的这一合成方法的通用化反应历程示于图1中。

A.2-(4，4-二乙氧基-丁氧基)乙醇(化合物15A)的制备。

无水乙二醇(120g，1.93摩尔)，叔丁醇钾在叔丁醇中的1.0M溶液(70ml，0.07摩尔)，和4-氯丁醛二乙基缩醛(11g，0.061摩尔)的混合物在100℃下在氩气氛中搅拌一夜。在冷却到室温之后，反应混合物被加入到600ml蒸馏水中。产物用二氯甲烷(150，125和125ml)萃取。合并的萃取液然后用无水硫酸镁干燥和在减压下于25℃馏出溶剂。接着让产物进行真空蒸馏(kugelrohr，t＝90-110℃，0.10毫米汞柱)。产量5.5g。

NMR(d₆-DMSO)：1.11ppm(t，6H)，1.53ppm(m，-CH₂CH，2H)，1.64ppm(m.-CH₂CH₂CH，2H)，3.37ppm(t，-O-CH₂CH₂CH₂CH，2H)，3.53ppm(t，HO-CH₂CH₂O-，2H)，3.62ppm(q，-CH₂CH₃，4H)，3.70ppm(t，HO-CH₂-，2H)，4.38ppm(t，-CH缩醛，1H)，4.54ppm(t，1H，-OH)。

B.PEG(3，500Da)-α-羟基-ω-丁醛二乙基缩醛的制备

化合物15A(0.51g，0.00247摩尔)，THF 200ml，和萘基钾(0.3mol/L-四氢呋喃溶液，20ml，0.006摩尔)被添加到玻璃反应器中并在氩气氛中搅拌3分钟。将环氧乙烷(8.8g 0.20摩尔)加入到该溶液中，反应混合物在室温下搅拌44小时。接着，混合物用氩气吹扫，添加0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝8，100ml)。分离THF层和废弃它。由乙醚萃取从溶液中除去萘。产物用二氯甲烷(3×50ml)从残留物中萃取出来。萃取液用无水硫酸钠干燥并浓缩到约30ml。接着添加乙醚(250ml)，混合物在0℃下搅拌15分钟。沉淀的产物被滤出并在减压下干燥。

产量7.2g。

NMR(d₆-DMSO)：1.09ppm(t，CH₃-，3H)1.52ppm(m，C-CH₂-CH₂-，4H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.46ppm(t，-CH，缩醛，1H)，4.57ppm(t-OH，1H)。

C.PEG(3,500Da)-α-羟基-ω-丁醛

PEG(3,500)-α-羟基-ω-丁醛二乙基缩醛(1.0g)，去离子水(20ml)，和调节pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室温下搅拌3小时。接着，添加氯化钠(1.0g)，通过添加0.1M氢氧化钠将pH调节到6.8。该产物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥和馏出溶剂。湿产物在减压下干燥。产量：0.82g。

NMR(d₆-DMSO)：1.75ppm(p，-CH₂-CH₂-CHO-)，2.44ppm(dt，-CH₂-CHO)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.57ppm(t，-OH)，9.66ppm(t，-CHO)。

实施例16

甲氧基-PEG(3500Da)丁醛的制备

这一实施例说明了从PEGα-羟基-ω-链烷醛缩醛制备示例性封端PEG-链烷醛的方法。

A.mPEG(3,500Da)-丁醛二乙基缩醛

PEG(3,500Da)-α-羟基-ω-丁醛二乙基缩醛(3.5g，0.001摩尔)，甲苯(50ml)，叔丁醇钾在叔丁醇中的1.0M溶液(5ml，0.005摩尔)和对-甲苯磺酸甲基酯(0.75g，0.004摩尔)的混合物在45℃下搅拌一夜。接着，在减压下馏出溶剂(旋转蒸发器)。将粗产物溶于二氯甲烷中和被添加到冷乙醚中。沉淀的产物被滤出并在减压下干燥。产量：3.1g。

NMR(d₆-DMSO)：1.09ppm(t，CH₃-，3H)1.52ppm(m，C-CH₂-CH₂-，4H)，3.24ppm(s，CH₃O-，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.46ppm(t，-CH，缩醛，1H)。

B.mPEG(3,500Da)-丁醛

mPEG(3,500)-丁醛二乙基缩醛(1.0g)，去离子水(20ml)，和调节pH到3.0的5％磷酸的混合物在室温下搅拌3小时。接着，添加氯化钠(1.0g)，通过添加0.1M氢氧化钠将pH调节到6.8。该产物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥和馏出溶剂。湿产物在减压下干燥。产量：0.85g。

NMR(d₆-DMSO)：1.75ppm(p，-CH₂-CH₂-CHO-，2H)2.44ppm(dt，-CH₂-CHO，2H)，3.24ppm(s，-OCH₃，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，9.66ppm(t，-CHO，1H)。

实施例17

甲氧基-PEG(2kDA)₂-甲基丁醛的制备

这一实施例描述了本发明的示例性聚合物2-烷基取代的链烷醛的合成方法。这一聚合物，不是具有将醛碳与连接基分开的亚烷基直链，而是具有在C-2位置上的甲基取代基。

综述：保护的缩醛试剂，17-A是从商购的起始原料2-甲基-4-氯丁酸酯制备的，这通过首先将丁酸酯碳还原成相应的醇，随后氧化成丁醛来实现。该丁醛然后作为相应缩醛被保护，得到用于偶联于PEG上的保护缩醛试剂。在偶联于PEG上之后，所形成的聚合物缩醛在酸中水解得到所需聚合物链烷醛。

A.4-氯-2-甲基丁醛二乙基缩醛的制备

4-氯-2-甲基丁醇-1的制备

2-甲基-4-氯丁酸酯(TCI America)(22.0g，0146摩尔)在乙醚(80ml)中的溶液在30分钟内在氩气氛中被滴加到处于0℃下的氢化锂铝(4.55g，0.12摩尔)在乙醚(360ml)中的搅拌溶液中。接着经30分钟滴加甲醇(12ml)，然后经过20分钟时间滴加冰冷的2N HCl(420ml)。反应混合物被转移到分液漏斗中，并分离含有4-氯-2-甲基丁醇-1的醚层。另外的产物用乙醚从水层中萃取(3×200ml)。醚萃取液被合并，用无水硫酸镁干燥和在减压下馏出溶剂。产量18.6g。

NMR(d₆-DMSO)：0.84ppm(d，-CH₃，3H)，1.50ppm(m，-CH₂CH₂Cl，1H)，1.68ppm(m，-CH-，1H)，1.82ppm(m，-CH₂CH₂Cl，1H)3.26ppm(t，-CH₂OH，2H)，3.66ppm(m，-CH₂Cl，2H)，4.50ppm(t，-OH，1H)。

4-氯-2-甲基丁醛

将氯铬酸吡啶鎓(23.6g，0.110g)逐渐添加到4-氯-2-甲基丁醇-1(8.80g，0.078摩尔)在无水二氯甲烷(470ml)中的搅拌溶液中。混合物在室温下在氩气氛中搅拌一夜。添加干燥乙醚(820ml)；混合物搅拌20分钟，然后过滤除去多余的氧化剂。溶液然后经填充了400g Florisil的柱进行过滤，并在减压下馏出溶剂。产量6.0g。

NMR(d₆-DMSO)：1.06ppm(d，-CH₃，3H)，1.74ppm(m，-CH₂CH₂Cl，1H)，2.14ppm(m，-CH₂CH₂Cl，1H)，2.56ppm(m，-CH，1H)，3.69ppm(m，-CH₂Cl，2H)，9.60ppm(t，-CHO，1H)。

4-氯-2-甲基丁醛二乙基缩醛

4-氯-2-甲基丁醛(4.8g，0.040摩尔)，原甲酸三乙酯(6.48g，0.044摩尔)，乙醇(3.0g)，和对甲苯磺酸一水合物(0.0144g，0.000757摩尔)的混合物在45℃下在氩气氛中搅拌一夜。接着，在冷却到室温之后，添加Na₂CO₃(0.40g)并且混合物搅拌15分钟。反应混合物进行过滤并在减压下馏出乙醇和残留的原甲酸三乙酯。残留物进行真空分馏，得到3.2g的纯4-氯-2-甲基丁醛二乙基缩醛。

NMR(d₆-DMSO)：0.85ppm(d，-CH₃，3H)1.13ppm(m，-CH₃，6H)，1.52ppm(m，-CH-，1H)，1.87ppm(m，-CH₂CH₂Cl，2H)，3.35-3.75ppm(bm，-OCH₂CH₃，4H，和-CH₂Cl，2H)，4.22ppm(d，-CH缩醛，1H)。

B.mPEG(2K Da)-2-甲基丁醛，二乙基缩醛

mPEG(2K Da)(2.0g，0.001摩尔)和甲苯(30ml)的溶液在减压下通过蒸馏出甲苯来进行共沸干燥。干燥的mPEG 2K溶于无水甲苯(15ml)中和添加叔丁醇钾在叔丁醇中的1.0M溶液(4.0ml，0.004摩尔)和来自以上A的4-氯-2-甲基丁醛二乙基缩醛(0.5g，0.00277摩尔)。接着，添加溴化锂(0.05g)并且混合物在100℃下在氩气氛中搅拌一夜。在冷却到室温之后，混合物被过滤和添加到处于0-5℃下的150ml乙基醚中。沉淀的产物被滤出并在减压下干燥。产量：1.5g。

NMR(d₆-DMSO)：0.83ppm(d，-CH₃，3H)1.10ppm(m，-CH₃O，6H)，1.24ppm(m，-CH-，1H)，1.72ppm(m，PEG-O-CH₂-CH₂-，2H)，3.24ppm(s，-OCH₃，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，4.18ppm(d，-CH缩醛，1H)。

取代度：～100％。

C.mPEG(2K Da)-2-甲基丁醛

含有来自以上B的mPEG(2K Da)-2-甲基丁醛，二乙基缩醛(1.0g)，去离子水(20ml)，和调节pH到3.0的那一用量的5％磷酸的混合物在室温下搅拌3小时。接着，添加氯化钠(1.0g)，并通过添加0.1M氢氧化钠将pH调节到6.8。

该产物用二氯甲烷(3×20ml)萃取。萃取液用无水硫酸镁干燥并在减压下馏出溶剂。产量：0.83g。

NMR(d₆-DMSO)：1.01ppm(d，-CH₃，3H)1.56ppm(m，-CH，1H)，1.90ppm(m，PEG-O-CH₂-CH₂-，1H)，2.45ppm(m，PEG-O-CH₂-CH₂-，1H)，3.24ppm(s，-OCH₃，3H)，3.51ppm(s，聚合物骨架)，9.56ppm(d，-CH醛，1H)。

取代度：～100％。

Claims

1.具有以下结构的化合物：

其中hGH表示包含N-末端氨基酸的人生长激素；和

其中各mPEG表示具有大约18,000-大约22,000道尔顿分子量的甲氧基-聚乙二醇基团。

2.权利要求1的化合物，其中各mPEG具有大约20,000道尔顿的标称平均分子量。

3.权利要求2的化合物，其中该化合物除hGH外具有小于大约1.2的多分散性。

4.权利要求2的化合物，其中该化合物除hGH外具有小于大约1.1的多分散性。

5.权利要求2的化合物，其中该化合物除hGH外具有小于大约1.05的多分散性。

6.权利要求1，2，3，4，或5任一项的化合物，其中hGH通过仲胺共价键连接于hGH的N-末端氨基酸。

7.权利要求1，2，3，4，5或6任一项的化合物，其中该化合物是单PEG化物。

8.权利要求7的化合物，其中hGH主要在该hGH的N-末端氨基酸上单PEG化。

9.权利要求1，2，3，4，5，6，7或8任一项的化合物，其中该hGH是重组hGH。

10.权利要求9的化合物，其中该重组hGH在大肠杆菌中产生。

11.权利要求1，2，3，4，5，6，7，8，9或10任一项的化合物，其中该化合物是纯化合物。

12.权利要求11的化合物，其中该化合物通过色谱法提纯。

13.权利要求12的化合物，其中该化合物通过离子交换色谱法提纯。

14.通过聚合物与包含N-末端氨基酸的人生长激素(hGH)反应形成的接合物，其中该聚合物具有下式结构：

15.权利要求14的接合物，其中各mPEG具有大约20,000道尔顿的标称平均分子量。

16.权利要求14的接合物，其中该聚合物具有大约40,300道尔顿的标称平均分子量。

17.权利要求14，15或16任一项的接合物，其中该聚合物具有小于大约1.2的多分散性。

18.权利要求14，15或16任一项的接合物，其中该聚合物具有小于大约1.1的多分散性。

19.权利要求14，15或16任一项的接合物，其中该聚合物具有小于大约1.05的多分散性。

20.权利要求14，15，16，17，18或19任一项的接合物，其中该接合物主要是单PEG化的接合物。

21.权利要求20的接合物，其中该接合物主要在该hGH的N-末端氨基酸上单PEG化。

22.权利要求14-21任一项的接合物，其中该hGH是重组hGH。

23.权利要求23的接合物，其中该重组hGH在大肠杆菌中产生。

24.权利要求14，15，16，17，18，19，20，21，22或23任一项的接合物，其中该接合物通过在还原性胺化条件下由该聚合物与该hGH在反应混合物中反应形成。

25.权利要求24的接合物，其中该反应混合物中该聚合物与该hGH的初始摩尔比小于或等于大约5。

26.权利要求25的接合物，其中该接合物从反应混合物中分离。

27.权利要求26的接合物，其中该接合物从反应混合物中色谱分离。

28.权利要求25的接合物，其中该色谱分离通过离子交换实现。

29.组合物，包含权利要求1-13任一项的化合物，和药物赋形剂。

30.权利要求29的组合物，其中该药物赋形剂选自碳水化合物，无机盐，抗微生物剂，抗氧化剂，表面活性剂，缓冲剂，酸和碱。

31.权利要求29或30的组合物，其中该组合物是液体形式。

32.权利要求29或30的组合物，其中该组合物是固体形式。

33.权利要求32的组合物，其中该固体形式是冻干的粉末。

34.权利要求29，30，31，32或33任一项的组合物，其中该组合物为单位剂量形式。

35.权利要求34的组合物，其中该组合物储存于单位剂量容器中。

36.权利要求34的组合物，其中该容器是注射器。

37.权利要求1-13任一项的组合物用于制备治疗可通过hGH给药治疗的症状的药物的用途。

38.组合物，包含权利要求14-28任一项的接合物，和药物赋形剂。

39.权利要求38的组合物，其中该药物赋形剂选自碳水化合物，无机盐，抗微生物剂，抗氧化剂，表面活性剂，缓冲剂，酸和碱。

40.权利要求38或39的组合物，其中该组合物是液体形式。

41.权利要求38或39的组合物，其中该组合物是固体形式。

42.权利要求41的组合物，其中该固体形式是冻干的粉末。

43.权利要求38，39，40，41或42任一项的组合物，其中该组合物为单位剂量形式。

44.权利要求43的组合物，其中该组合物储存于单位剂量容器中。

45.权利要求44的组合物，其中该容器是注射器。

46.权利要求14-28任一项的接合物用于制备治疗可通过hGH给药治疗的症状的药物的用途。

47.权利要求14-28任一项的接合物用于治疗可通过hGH给药治疗的症状的用途。

48.权利要求1-13任一项的化合物用于治疗可通过hGH给药治疗的症状的用途。

49.制备权利要求14-28任一项的接合物的方法，包括下述步骤：在还原性胺化条件下使hGH与聚合物在反应混合物中反应；和任选地从该反应混合物中分离该接合物。

50.权利要求49的方法，其中该反应混合物具有大约5-大约8的pH值。

51.权利要求49的方法，其中该反应混合物具有大约7-大约7.5的pH值。