CN1735696A - 监控高风险环境 - Google Patents

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Abstract

发明提供监控高风险环境的方法，通过检测样品中存在或缺乏cpn60标记来监控微生物的存在或缺乏。

Description

监控高风险环境
                     相关专利申请的参照
本专利申请要求2002年11月27日提交的美国序列号10/306,113和2003年3月18日提交的美国专利申请号10/392,041部分继续的优先权。
                          技术领域
本发明涉及监控高风险环境的微生物，包括微生物病原体，更具体涉及通过检测微生物标记来检测高风险环境中的微生物。
                            背景
从公共卫生观点，检测环境如食品加工设备和卫生保健机构中的微生物很重要，特别是微生物病原体。例如，超过卫生保健机构中病人正常预期一般2倍的医院内突发或传染性突发造成相关发病率、死亡率和卫生保健体系费用的难题，卫生保健体系已受到保险和卫生保健成本增长的严重影响。CDC报导医院内传染每年给美国增加近$50亿的健康花费。类似地，根据CDC全国医院监督系统，医院相关真菌感染的比率在1980和1990年间几乎翻了一番。在1997年，估计有240,000个人表现出地方性真菌病的临床症状，患全身性真菌感染的病人死亡率范围从30到100％，这取决于病原体。过分依赖抗生素导致抗生素抗性细菌菌株，它们本身通常来自医院。最后，环境中如食品加工厂和日间护理中心的病原体污染导致广泛分布的传染性突发，通常需要进行地方或全国水平的集中和昂贵的研究以确定和控制病原体的来源。因此，需要关于自然和特定环境中微生物病原体的知识以有效鉴定传染病源、控制疾病爆发和治疗。
微生物分布表示微生物群落内的单独菌株、微生物的亚种、种和/或属。一般，确定微生物分布包括分类学和/或系统发育鉴定群落中的微生物。微生物分布也可包括关于群落中1种或多种成员的定量信息。一旦鉴定了微生物群落中1种或多种微生物，微生物分布可示为例如微生物列表、微生物存在和/或数量的图或表格表示、或群落中微生物多样性和/或群体水平的任何其它适当表示。微生物分布用于鉴定生物和非生物样品(例如来自动物、环境或无生命物体的样品)中的致病和非致病微生物生物体。
微生物分布可用任何一些已知方法确定。例如，可培养样品中的微生物并鉴定和/或计数菌落。然而，估计培养一般仅回收样品中约0.1％微生物种类(以直接显微镜计数与回收的菌落形成单位间的比较为基础)。确定微生物分布的培养不依赖性方法可包括从样品中提取和分析微生物大分子。有用的靶分子通常包括在所有微生物中作为类别发现的分子，但它们的结构不同并因而反映微生物多样性。例如，多种以核酸为基础的测定可用于确定微生物分布。一些以核酸为基础的群体方法使用变性和重退火动力学以间接估计例如样品中DNA的鸟嘌呤和胞嘧啶(％G+C)含量。％G+C技术提供微生物群落的总观，但一般仅对群落构成的大变化敏感。
遗传指纹是另一种以核酸为基础的方法，可用于确定微生物分布。遗传指纹使用随机序列寡核苷酸引物，引物特别地与基因组中随机序列杂交。扩增产生许多产物，这些产物的分布称为遗传指纹。特定模式可与样品中的微生物群落相关。然而，遗传指纹缺乏结论性鉴定特异微生物种类的能力。
变性或温度梯度凝胶电泳(DGGE或TGGE)是另一种以核酸为基础的方法，可用于确定微生物分布。随着扩增产物以变性或温度增加的梯度电泳，双链分子解链且其迁移率下降。解链行为由核苷酸序列决定，独特序列会分解到单独带中。因此，D/TGGE凝胶产生具有微生物群落特征的遗传指纹，各带的相对强度反映对应微生物的丰度。另外的模式包括单链构象多态性(SSCP)。SSCP取决于和％G+C复性方法相同的物理基础，但相比这些方法有显著改善。
此外，微生物分布可用末端限制性片段长度多态性(TRFLP)确定。可分析扩增产物存在已知序列基序，使用在这些基序识别和切割双链核酸的限制性内切核酸酶。另外的方法包括“扩增核糖体DNA限制性分析(AADRA)”，其中考虑完整扩增产物，而不仅是末端片段。
确定微生物分布也能通过克隆生物和非生物样品(例如来自动物的生物样品)中存在的微生物核酸并测序。克隆单独核酸到大肠杆菌(Escherichia coli)并测序各核酸产生最高密度的信息，但需要最大的努力。尽管核酸测序自动化，通过从微生物克隆核酸并测序来常规监控动物的微生物分布变化仍需要大量时间和精力。
因此，尽管存在确定微生物分布的方法，仍需要能在高风险环境中检测和鉴定微生物的迅速、敏感和定量方法，特别是微生物病原体。
                            概述
发明是基于发现通过检测获得自高风险环境的样品中微生物标记(特别是cpn60标记)的存在和/或浓度，可迅速和敏感地确定高风险环境中微生物的存在或缺乏。侣伴蛋白60(cpn60)标记特定用于确定样品中微生物的存在和任选地确定样品的微生物分布。侣伴蛋白是体内多肽适当折叠所需的分子伴侣。cpn60在原核生物和真核细胞的细胞器中普遍发现，可用作种特异靶和/或鉴定和分类微生物的探针。此蛋白编码基因在细菌属之间和之内的序列多样性似乎大于16SrDNA序列，从而使cpn60成为高级靶序列，它比165rDNA序列在种水平的微生物鉴定的有更区别的能力。
因此，检测cpn60标记的存在和/或浓度能提供样品的微生物分布。可特别用包含检测cpn60标记的方法确定来自高风险环境的生物和非生物样品的微生物分布，包括cpn60特异核酸分子和cpn60特异多肽。
发明的方法迅速且敏感，可用于大体检测含cpn60的微生物的存在或缺乏，以及鉴定存在哪种微生物和存在量。使用cpn60引物、探针和抗体，发明方法可包括扩增cpn60特异核酸和检测扩增产物，使用技术如荧光共振能量转移(FRET)。其它检测和定量cpn60特异核酸的迅速且敏感的方法包括例如荧光原位杂交(FISH)。因此，发明提供检测含cpn60的微生物种类的引物和探针，以及使用这种引物和探针的方法和含这种引物和探针的试剂盒。类似地，发明也提供检测cpn60特异多肽的方法如酶联免疫测定(ELISAs)或其它多肽检测方法，包括表面胞质基因组共振技术、质谱和电泳方法。因此，本发明也考虑含cpn60特异抗体的试剂盒。
一方面，发明提供方法监控高风险环境中1种或多种微生物的存在或缺乏。这种方法包括提供获得自高风险环境的样品；检测样品中cpn60标记的存在或缺乏。一般，cpn60标记的存在表现出1种或多种微生物的存在。
在一个实施方案中，检测步骤能提供样品的微生物分布。通常，微生物分布包括鉴定样品中的1种或多种微生物，可进一步包括定量样品中1种或多种微生物的量。此外，可获得并比较在2个或更多点的高风险环境的微生物分布，例如时间点或位置点。此外，来自对照样品的对照微生物分布能从高风险环境中获得，它可与样品微生物分布相比较。
一般，cpn60标记是cpn60特异核酸或cpn60特异多肽。在一个实施方案中，cpn60特异核酸是例如染色体来源的cpn60蛋白的基因组核酸编码序列。在另一个实施方案中，cpn60特异核酸是微生物的cpn60编码序列的扩增序列。
通常，检测步骤可以是以核酸为基础的测定或以多肽为基础的测定。典型的以核酸为基础的测定包括PCR和FISH测定，而典型的以多肽为基础的测定包括免疫诊断测定(例如ELISA)、质谱技术和表面胞质基因组共振技术。
一般，可通过发明方法检测的微生物包括细菌、原生动物、立克次氏体和真菌。代表性细菌微生物包括葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、埃希氏菌(Escherichia)、杆菌(Bacillus)、布鲁氏菌(Brucella)、衣原体(Chlamydia)、梭菌(Clostridium)、志贺氏菌(Shigella)、分枝杆菌(Mycobacterium)、农杆菌(Agrobacterium)、巴尔通氏体(Bartonella)、疏螺旋体(Borellia)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、埃利希体(Ehrlichia)、嗜血杆菌(Haemophilus)、螺杆菌(Helicobacter)、阳光杆菌(Heliobacter)、乳杆菌(Lactobacillus)、奈瑟氏球菌(Neisseria)、根瘤菌(Rhizobium)、链霉菌(Streptomyces)、聚球蓝细菌(Synechococcus)、发酵单胞菌(Zymomonas)、集胞蓝细菌(Synechocyotis)、支原体(Mycoplasma)、耶尔森氏菌(Yersinia)、弧菌(Vibrio)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、弗朗西丝氏菌(Franciscella)、军团菌(Legionella)、沙门氏菌(Salmonella)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、肠球菌(Enterococcus)、肠杆菌(Enterobacter)、柠檬酸杆菌(Citrobacter)、拟杆菌(Bacteroide)、普雷沃尔氏菌(Prevotella)、黄单胞菌(Xanthomonas)、木杆菌(Xylella)和弯曲杆菌(Campyiobacter)属。代表性原生动物微生物包括棘阿米巴虫(Acanthamoeba)、隐孢子虫(Cryptosporidium)和四膜虫(Tetrahymena)属。代表性真菌微生物包括曲霉菌(Aspergillus)、刺盘孢霉菌(Colletrotrichum)、旋孢腔菌(Cochliobolus)、长蠕孢菌(Helminthosporium)、微环菌(Microcyclus)、柄锈菌(Puccinia)、梨孢(Pyricularia)、次茎点霉菌(Deuterophoma)、丝梗孢(Monilia)、假丝酵母(Candida)和酵母(Saccharomyces)。代表性立克次氏体微生物包括伯氏考克斯氏体(Coxiellaburnetti)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、五日热罗卡利马氏体菌(Rochlimea Quintana)、五日热立克次氏体(Rickettsia Quintana)、普氏立克次氏体(Rickettsiap rowasecki)和立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)。
高风险环境的例子包括零售食品式工业设施、学校、医学环境、水设备、住宅、食品运输设备、加工设施或研究设施。例如，零售食品业设施可以是屠宰店、杂货店、餐馆、自助餐厅、娱乐场所(例如剧场、公园、动物园、溜冰场、表演场地、市中心区、博物馆或体育场)或便利店；医学环境可以是医院、医师办公室、牙科办公室、门诊部、疗养院、门诊病人设施、物理治疗设施、矿泉疗养地、手术室或医学诊断实验室；水设备可以是废水处理厂、饮用水设备、脱盐设备、再循环水设备、水产养殖设备、空调装置、增湿器、储水罐、喷水池、消防栓、浴盆、热浴、桑拿浴、蒸汽浴或水龙头；食品运输设备可以是卡车、机动有轨车或船；加工设施可以是食品加工设施(例如屠宰场、包装设备、纯化工厂或发酵容器)、化学加工设施或生物加工设施。
在一个实施方案中，样品是组织样品。组织样品可以是活检样品，或可取自动物的拭子。代表性动物包括人、母牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫、鸟、猴、鱼、蛤、牡蛎、贻贝、龙虾、小虾和螃蟹。来自这类动物的代表性组织样品包括眼、舌、颊、蹄、喙、口鼻部、足、手、嘴、乳头、胃肠道、羽毛、耳、鼻、粘膜、鳞、壳、软毛和皮肤。
在另一个实施方案中，样品是污染物或来耗于高风险环境中存在的污染物。
在又一个实施方案中，样品是食物样品，如配制的食物样品、生食物样品、熟食样品或易腐食物样品。代表性食物样品包括牛肉、猪肉、家禽、海鲜、奶制品(牛奶、蛋或干酪)、水果、蔬菜、种子、坚果和真菌状物。此外，样品可以是液体样品，如水样品、血液样品、尿样品、泪样品、汗样品、唾液样品、淋巴样品和脑脊液样品。
另一方面，发明提供制造产品。发明的制造产品包括至少1种cpn60抗体，其中cpn60抗体附着于固体支持物；以及指示分子。制造产品也能包括使用cpn60抗体检测含cpn60分子的说明。代表性固体支持物是测深尺。
除非另有说明，本文所用全部技术和科学术语与发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明，合适的方法和材料描述于下。此外，材料、方法和例子仅用于阐述而不想要限制。本文所示全部出版物、专利申请、专利和其它参考文献全部纳入供参考。如果冲突，本说明书包括定义会控制。
发明的一个或多个实施方案的细节在下面的附图和描述中列出。发明的其它特征、目的和优点通过图、详细描述和权利要求而显而易见。
                          附图的描述
图1是来自产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的cpn60基因序列(SEQID NO：1；GenBank登录号NC_003366)。本文所述通用cpn60引物可杂交的序列(或其互补物)加下划线。
图2是来自大肠杆菌的cpn60基因序列(SEQ ID NO：2；GenBank登录号NC_000913)。本文所述通用cpn60引物可杂交的序列(或其互补物)加下划线。
图3是来自天蓝色葡萄球菌(Staphylococcus coelicolor)的cpn60基因序列(SEQID NO：3；GenBank登录号AL939121)。本文所述通用cpn60引物可杂交的序列(或其互补物)加下划线。
图4是来自空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的cpn60基因序列(SEQ IDNO：4；GenBank登录号NC_002163)。本文所述通用cpn60引物可杂交的序列(或其互补物)加下划线。
图5是来自肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)的cpn60基因序列(SEQ IDNO：5；GenBank登录号NC_003198)。本文所述通用cpn60引物可杂交的序列(或其互补物)加下划线。
不同图中的相似参考符号表示相似元件。
                            详细描述
本发明提供监控高风险环境存在或缺乏1种或多种微生物的方法。微生物可以是病原体。特别通过检测获得自高风险环境的样品中微生物标记的(特别是cpn60标记)存在和/或浓度可迅速且敏感地确定高风险环境中微生物的存在或缺乏。
高风险环境
如本文所用，高风险环境是被1种或多种微生物污染的风险环境，这是由于其中所进行活动的性质或由于环境是微生物的潜在来源。高风险环境包括但不限于下列：零售食品式工业设施、学校、医学环境、水设备、住宅、易腐食品或不适当保存的食品、运输设备、加工设施和研究设施。例如，零售食品业传统上是严重的传染性爆发源，且是一种高风险环境类型的例子。零售食品业场所包括地方如屠宰店、杂货店、餐馆、自助餐厅、娱乐场所和便利店。
娱乐设施包括地方如剧场、图书馆、室内购物中心、公园、动物园、溜冰场、表演场地、市中心区、博物馆、露天游乐场、娱乐中心、体育场和区域、会堂、会议室和运动场。娱乐设备可以是高风险环境，因为例如食品现场加工、制备和出售以及因为在这种场所可能移入大量人。
医学环境也是高风险环境的例子。医学环境一般使许多病人与多种疾病紧密相联，他们中许多人已处于免疫减弱状态。在这种环境中交叉感染、医院内爆发和产生抗生素抗性菌株的可能性高。医学环境的非限制性例子包括医院、医师办公室、牙科办公室、门诊部、疗养院、门诊病人设施、物理治疗设施、矿泉疗养地、手术室和医学诊断实验室。
水设备是另外的高风险环境例子。例如，污水处理厂自然面对待处理水中的多种病原体。水产养殖设施如鱼场、牡蛎养殖场等也易受传染性爆发。在军团病爆发后，空调装置作为传染剂源面对增多的详细检查。热浴近来涉及作为常使用它们的人中鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)感染(“热浴肺病”)的来源。其它水设备的例子包括饮用水设备、脱盐设备、水坝、再循环水设备、增湿器、储水罐、饮用水储存器(例如水冷却器)、喷水池、消防栓、浴盆、桑拿浴、蒸汽浴和水龙头。
运输设备是另一种高风险环境例子。运输设备可能高风险，因为它用于例如运输食品。例如，食品运输设备如运输大量食品的铁路车辆、卡车、罐车和运输船可能需要在装载前和卸载后监控。另外，运输设备可以是高风险环境，因为微生物可能经这类设备携带。非限制性例子包括小汽车、公共汽车、飞机、火车、自行车、摩托车、船、机场、公共汽车终点站、火车终点站、港口、海关检查站和移民检查站。例如，污染食品(如水果)可经移民检查站携带。
加工设施是其它高风险环境的例子，包括食品、化学和生物加工设施。食品加工设施已在控制加工食品微生物污染的渐增压力下，如要求实行危害分析和临界控制点计划(HACCP)及抗微生物干扰技术。食品加工设施包括屠宰场、包装设备、纯化(例如辐射、巴氏杀菌、烟熏)设备、存储场所(例如筒仓、容器、槽)和发酵容器。化学和生物加工设施可包括分析实验室、生产工厂、中试工厂和纯化工厂。
食品也是高风险环境例子，特别是易腐食品和不适当保存、储藏或处理的食品。易腐食品包括例如牛奶、蛋、干酪、面包、自助餐桌菜单项目、外卖食品菜单项目、蔬菜和水果。不适当保存食品包括商业保存(例如由商业食品源罐装、密封、瓶装、袋装)或自己保存(例如家庭装罐等)的食品。食品可在例如餐馆或家庭厨房中配制。这种制备食物样品可以是煮过或生的(例如色拉、果汁、水果)。另外，食品可以未加工。典型的食物产品包括牛肉、猪肉、家禽、海鲜、奶制品、水果、蔬菜、种子、坚果、真菌状物和谷物。乳品样品包括牛奶、蛋、黄油和干酪以及从这些乳品制备的调味品和沙司(例如蛋黄酱、蒜泥蛋黄酱、奶油沙司、荷兰沙司等)。
样品类型和取样方法
本文所述方法能检测微生物的存在或缺乏以及任选检测微生物分布，以获得自高风险环境的样品中cpn60标记的存在为基础。可确定生物或非生物样品的微生物分布。
如本文所用，“生物样品”指从受试动物或对照动物直接或间接获得的任何样品。可获得自动物的代表性生物样品包括或获得自生物组织、生物液体和生物排出产物(例如粪)。生物组织可包括活检样品或感兴趣的生物组织的拭子，例如鼻腔拭子、咽喉拭子、皮肤拭子。组织可以是来自动物的任何适当组织，如人、母牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫、鸟、猴、鱼、蛤、牡蛎、贻贝、龙虾、小虾和螃蟹。取决于微生物和高风险环境类型，待取样(如通过活检或拭子)的感兴趣组织可以是眼、舌、颊、蹄、喙、口鼻部、足、手、嘴、乳头、胃肠道、羽毛、耳、鼻、粘膜、鳞、壳、软毛和皮肤。
生物液体可包括体液(例如尿、乳、泪液、玻璃体液、痰、脑脊液、汗、淋巴、唾液、精液、血液、或来源于血的血清或血浆)；灌洗如乳管灌洗、肺灌洗、胃灌洗、直肠或结肠灌洗、或阴道灌洗；抽吸物如奶嘴或乳头抽吸物；流体如细胞培养物或来自细胞培养物的上清；以及流体如用于获得或重悬浮样品的缓冲液，例如用于在拭子取样步骤中洗涤或湿润拭子。使用本领域已知方法和技术可从动物中获得生物样品。参见例如《诊断分子生物学：原理和应用》(Diagnostic MolecularMicrobiology：Principles and Applications)(Persing等(编辑)，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C)。
生物样品也能获得自环境(例如空气、水或土壤)。从这种环境中提取生物样品(如细胞)的方法已知。另外，适用于发明方法的生物样品可以是1种或多种动物接触的物质。例如，来自水浴、冷冻槽、烫洗槽或其它受试者或对照动物所接触其它水环境的水样品可用于发明方法以评估微生物分布。1种或多种受试者或对照动物接触的土壤样品或动物沉积粪便或其它生物物质的土壤也可用于发明方法。例如，用本领域已知方法和技术可从这种生物样品中分离核酸。参见例如《诊断分子生物学：原理和应用》(Persing等(编辑)，1993，American Society forMicrobiology，Washington D.C)。
本发明方法也可用于检测非生物样品中或上面的微生物和/或微生物病原体的存在。例如，可取样高风险环境中存在的污染物以检测微生物的存在或缺乏。污染物是用于从动物到动物传播或能传播传染剂如微生物病原体的物理(无生命的)对象。(应指出无生命体如食品、空气和液体不认为是污染物，而认为是传染“载体”、或常规吸入身体的媒介。)确实，一项评估不同屠宰场污染物上沙门氏菌属、李斯特氏菌属和耶尔森氏菌属致病微生物存在的研究在11.1％切肉刀、6.25％工作台和5.6％地板上检测到沙门氏菌；从13.3％冷室地板拭子和7.1％洗手盆中分离到单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)。参见Kathryn Cooper，Guelph Food Technology Centre，“植物环境计算：通过环境取样保护你的产品”(The Plant Environment Counts：Protect your Product through EnvironmentalSampling)，Meat & Poultry，1999年5月。污染物的非限制性例子包括用具、刀、饮水玻璃杯、食品加工设备、切割表面、切肉板、地板、天花板、墙壁、排水沟、架空线路、通风系统、废物收集器(waste traps)、水槽、机器、玩具、存储箱、抽水马桶座圈、门手把、衣服、手套、寝具、梳子、鞋、变换桌(例如用于尿布)、尿布箱、玩具箱、食物准备桌、食品运输工具(例如机动有轨车和运输船)、大门、坡道、地板垫、机动车的脚踏板、洗涤槽、洗涤设备、淋浴、浴盆、自动餐桌、手术设备和仪器、分析仪器和设备。
微生物可留作为污染物上的剩余物。在这种情况中，精确检测污染物上的病原体存在对预防病原体传播是重要的。例如，已知微生物以可变但不能培养的形式存在于污染物上，或所选不能培养的细菌种类能在某些条件下复苏到可培养状态。通常，这种不能培养的细菌存在于污染物上的生物膜。因此，取决于可培养形式的检测方法可显著低估污染物上的微生物污染。本发明方法包括基于PCR的方法，可通过扩增和检测cpn60特异核酸序列协助检测微生物，特别是不能培养的形式。
来自高风险环境的样品也可以是食物样品。例如，样品可以是来自例如餐馆的配制食物样品。这种配制食物样品可以是煮过或生的(例如色拉、果汁、水果)。在其它实施方案中，食物样品可未加工和/或是生的，例如在屠宰之前或之后来自屠宰场的动物组织样品。食物样品可易腐。通常，食物样品取自食物产品如牛肉、猪肉、家禽、海鲜、奶制品、水果、蔬菜、种子、坚果、真菌状的和谷物。乳品样品包括牛奶、蛋、黄油和干酪以及从中制备的调味品和沙司。
收集和储存生物和非生物样品的方法一般对本领域技术人员已知。例如，国际分析协会(AOAC International)公布和确认了测试食品和农产品微生物污染的取样技术。也参见WO 9832020(PCT/WO 97US04289)和美国专利号5,624,8l0，它们列出从空气、液体或表面收集和浓缩微生物的方法和装置。WO 9832020也提供取出某些样品中以不同水平存在的体细胞或动物体细胞的方法。
在本文所述方法的特定实施方案中，从样品其它成分分离任何存在的微生物或浓缩微生物到足以迅速检测的量可能需要分离和/或浓缩步骤。例如，怀疑含生物微生物的样品需要选择性富集微生物(例如通过在适当培养基中培养，如培养4-96小时或更长)，然后使用本文所述检测方法。另外，适当过滤和/或免疫磁性分离可浓缩微生物而不需要延长生长阶段。例如，特异于cpn60特异多肽的抗体可附着于磁珠和/或粒子。也可考虑使用2种或多种浓缩方法的多重分离，例如离心、膜过滤、电泳、离子交换、亲和层析和免疫磁性分离。
可能需要浓缩某些空气或水样品。例如，某些空气取样方法需要预定体积的空气经过滤器以捕获任何微生物，接着分离到缓冲液或液体培养物中。另外，聚集的空气经过平板(例如琼脂)培养基以使任何微生物生长。
用拭子取样组织或污染物的方法对本领域技术人员已知。一般，拭子水合的(例如用适当缓冲液，如Cary-Blair培养基、Stuart培养基、Amie培养基、PBS、缓冲甘油盐水或水)并用于取样微生物的合适表面(污染物或组织)。随后从拭子回收任何存在的微生物，如从拭子离心掉水合液体，取出上清，离心物重悬浮于适当缓冲液，或用另外的稀释液或缓冲液洗条拭子。如此回收的样品随后可根据本文所述方法分析微生物的存在。另外，拭子可用于培养液体或平板(例如琼脂)培养基以促进稍候测试的任何微生物的生长。合适的拭子包括棉和海绵拭子；参见例如Tecra提供的拭子，如Tecra ENVIROSWAB。
来自高风险环境的样品可“照现在的样子”使用或可能需要处理，然后应用于本文所用检测方法。例如，可加工样品(如通过核酸或蛋白提取方法和/或本领域已知的试剂盒)以释放核酸或蛋白。在其它情况中，生物样品可直接接触PCR反应成分和适当寡核苷酸引物和探针。
检测cpn60标记
本文提供的方法用于确定高风险环境中1种或多种微生物和/或微生物病原体的存在且任选提供高风险环境的微生物分布。如本文所用，“微生物”指细菌、原生动物、立克次氏体和真菌。可产生微生物分布的微生物群落可包括但不限于下列原核生物属的例子：葡萄球菌、链球菌、假单胞菌、埃希氏菌、杆菌、布鲁氏菌、衣原体、梭菌、志贺氏菌、分枝杆菌、农杆菌、巴尔通氏体、疏螺旋体、慢生根瘤菌、埃利希体、嗜血杆菌、阳光杆菌、螺杆菌、乳杆菌、奈瑟球菌、根瘤菌、链霉菌、聚球蓝细菌、发酵单胞菌、集胞蓝细菌、支原体、耶尔森氏菌、弧菌、伯克霍尔德氏菌、弗朗西丝氏菌、军团菌、沙门氏菌、双歧杆菌、肠球菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、拟杆菌、普雷沃尔氏菌、黄单胞菌、木杆菌和弯曲杆菌；下列原生动物属的例子：棘阿米巴虫、隐孢子虫和四膜虫；下列真菌属的例子：曲霉菌、刺盘孢霉菌、旋孢腔菌、长蠕孢菌、微环菌、柄锈菌、梨孢、次茎点霉菌、丛梗孢菌、假丝酵母和酵母；下列立克次氏体微生物：伯氏考克斯氏体、五日热巴尔通体、五日热罗卡利马氏体菌、五日热立克次氏体、普氏立克次氏体和立氏立克次氏体。
检测获得自高风险环境的样品(例如生物样品或非生物样品)中的微生物或微生物分布可用包含检测cpn60标记的方法确定。cpn60标记包括cpn60特异核酸和cpn60特异多肽。如本文所用，cpn60特异核酸是包括与所有或部分基因组cpn60核酸序列互补或特异性杂交的核酸。通常，cpn60特异核酸参考外显子定义，尽管与cpn60编码序列相关的内含子和调节序列也在本发明范围内。如本文所用，术语“核酸”涵盖RNA和DNA，包括基因组DNA。核酸可以是双链或单链。核酸可包含1个或多个限制性位点。
一般，cpn60特异核酸标记是所有或部分的cpn60蛋白的基因组核酸编码序列。cpn60特异核酸可特异于特定微生物种类或可通用的。种特异cpn60特异核酸序列是在适当测定条件下优先杂交来自特定种类的cpn60核酸序列的cpn60核酸序列。本领域技术人员可设计探针检测这类种特异cpn60特异核酸序列，通过例如排列cpn60核酸编码序列和寻找可变区如在适当测定条件下不与来自其它种类的cpn60核酸序列交叉杂交的序列。另外，本领域技术人员意识到可变区如证明与来自另外种类的cpn60特异核酸序列相似性不大于99％序列相似性(例如不大于85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％和98％序列相似性)的可变区可用作种特异cpn60特异核酸。在本文所述方法中使用这类特异探针可鉴别检测样品中的特定种类。
在计算百分比序列同一性时，排列2种序列并确定2种序列间相同核苷酸或氨基酸残基匹配数。相同匹配数除以排列区长度(即排列的核苷酸或氨基酸残基数)并乘以100以获得百分比序列同一性值。要理解排列区长度可以是1种或2种序列部分，多至全长大小的最短序列。应理解单一序列可与其它序列不同排列并因而可在各排列区具有不同百分比序列同一性。要指出百分比同一性值通常四舍五入成最接近的整数。例如，把78.1％、78.2％、78.3％和78.4％下舍为78％，而把78.5％、78.6％、78.7％、78.8％和78.9％上入为79％。也指出排列区长度总是整数。
排列2种或更多序列以确定百分比序列同一性是用Altschul等(1997，NucleicAcids Res.，25：3389-3402)所述算法进行，纳入BLAST(基本局部排列搜索工具)程序，此程序可获得自 http://www.ncbi.nlm.nih.gov。BLAST搜索能确定一种生物体的cpn60特异核酸序列与另一种生物体的cpn60特异核酸序列间的百分比序列同一性，用Altschul等的算法排列。BLASTN是用于排列和比较核酸序列间同一性的程序，而BLASTP是用于排列和比较氨基酸序列间同一性的程序。使用BLAST程序计算cpn60序列间百分比同一性时，使用各程序的默认参数。
如本文所用，“通用”cpn60特异核酸是cpn60核酸序列，能在适当测定条件下杂交1种或多种来自其它微生物的cpn60核酸编码序列。当然，这种序列在相同测定条件下不杂交非cpn60核酸。本领域技术人员意识到能以多种方式操作杂交测定条件以增加或减小严紧性，例如通过盐、温度、缓冲液选择等。参见例如Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning；A LaboratoryManual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989。另外，本领域技术人员认识到证明与至少第2种cpn60核酸序列序列相似性大于75％、80％、85％、90％或95％的核酸序列可用作通用cpn60特异核酸。例如，来自特定细菌属(如葡萄球菌)的cpn60编码序列或从中获得的序列可在适当测定条件下与属或跨属成员内的1种或多种cpn60编码序列交叉杂交或有足够类似序列。如本领域技术人员所意识到且如下更详细解释，随后可设计“通用”探针，探针能检测样品中的2种或多种这类相似序列。例如，本领域技术人员可排列cpn60编码序列(如来自特定属)并寻找有序列同一性的序列；因此这些序列能与该属的2种或多种成员交叉杂交。此外，可测试不同杂交严紧性以确定交叉杂交的最佳条件。检测这种通用cpn60特异核酸可检测样品中的2种或多种微生物，例如检测所有属的成员，如前所述。
如本文所用，cpn60特异多肽标记是包括所有或部分cpn60蛋白的多肽。用cpn60特异核酸，cpn60特异多肽标记可特异于特定微生物种类或通用。种特异cpn60特异多肽标记是所有或部分特定种的cpn60蛋白。在本发明方法中，检测标记的探针或分析方法应该能区分特定cpn60特异多肽与所有其它cpn60特异多肽，例如通过质谱应用中的质量或抗体测定中的特定抗原表位。例如，如下面更详细描述，本领域技术人员意识到能获得识别抗原表位的抗体，特别是单克隆抗体，抗原表位特异于特定种的cpn60蛋白。因此，在本文所述方法中使用这类特异抗体可差别检测样品中的特定种类。
在其它实施方案中，cpn60特异多肽标记可以是通用的。例如，“通用”cpn60特异多肽标记可以是2种或多种cpn60蛋白中的普通结构(构象)抗原表位。如下面更详细描述，可筛选抗cpn60蛋白或多肽的抗体，特别是单克隆抗体，筛选它们对来自2种或多种微生物的cpn60特异多肽上普通抗原表位的交叉反应性。
以核酸为基础的测定
实时PCR测定
以核酸为基础、用于鉴定和/或定量样品中微生物学的方法可包括扩增cpn60核酸。扩增方法如PCR是增加特定核酸序列量的有效方法。确定样品中微生物的存在或缺乏也可包括核酸杂交。用种特异杂交探针的探测扩增产物是可用于确定分布的最有力分析工具之一。杂交的物理基质可以是尼龙膜(例如大阵列)或微阵列(例如微芯片)，将1种或多种杂交探针掺入扩增反应(例如TaqMan或Molecular Beacon技术)、以溶液为基础的方法(例如ORIGEN技术)、或任意一种许多设计用于临床诊断的方法。如上所讨论，能设计探针优先杂交来自单独种的扩增产物或区分特异种。
美国专利号4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188公开了常规PCR技术。PCR通常使用2个结合所选核酸模板(如DNA或RNA)的寡核苷酸引物。用于本发明的引物包括寡核苷酸引物，它能作为cpn60序列内或相邻的核酸合成起始点(见下)。引物能通过常规方法从限制性消化中纯化，或可合成产生。引物通常是单链以在扩增中效率最高，但引物可以是双链。双链引物首先变性(例如热处理)以在用于扩增前分开链。能设计引物从特定微生物种类中扩增核苷酸序列，或能设计用于从大于1个种类中扩增序列。可用于从大于1个种类中扩增核苷酸序列的引物在本文称为“通用引物”。
PCR测定可使用核酸如DNA或RNA，包括信使RNA(mRNA)。模板核酸不需纯化；它可以是复合混合物的较小部分，如动物细胞所含的微生物核酸。模板DNA或RNA可提取自生物或非生物样品，使用常规技术如《诊断分子生物学：原理和应用》(Persing等(编辑)，1993，American Society for Microbiology，Washington D.C)所述。核酸可获得自任意一些来源，包括质粒、细菌、酵母、细胞器、高等生物体如植物和动物。产生PCR产物的标准条件在本领域熟知(参见例如《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer：A Laboratory Manual)，Dieffenbach和Dveksler(编辑)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995)。
一旦产生PCR扩增产物，可通过例如用FRET技术杂交来检测产物。FRET技术(参见例如美国专利号4,996,143、5,565,322、5,849,489和6,162,603)是基于当供体荧光部分和对应受体荧光部分彼此位于一定距离内时，2个荧光部分间发生的能量转移可目测或另外检测和定量。2个各含荧光部分的寡核苷酸探针可在特定位置杂交扩增产物，通过寡核苷酸探针与靶核酸序列的互补性确定。寡核苷酸探针与扩增产物在适当位置杂交时，产生FRET信号。杂交温度和时间范围可从约35℃到约65℃，约10秒到约1分钟。检测FRET可实时发生，从而检测到PCR测定各循环后的扩增产物增加，且在一些实施方案中定量。
可完成荧光分析和定量，使用例如光子计数落射荧光显微镜系统(含适当分色镜和滤器用于监控特定波长范围中的荧光放射)、光子计数光电倍增器系统或荧光计。完成起始能量转移的激发可用氩离子激光器、高强度水银弧光灯、纤维光学光源或另外适当过滤所需范围中激发的高强度光源。
荧光部分可以是例如供体部分和对应受体部分。如本文关于供体和对应受体荧光部分所用，“对应”指受体荧光部分具有重叠供体荧光部分的激光光谱的发射光谱。受体荧光部分的放射光谱的最大波长一般应比供体荧光部分的激发光谱的最大波长高至少100nm，从而可在其间产生有效的非辐射能量转移。
荧光供体和对应受体部分一般选择(a)高效Frster能量转移；(b)大的终斯托克司频移(＞100nm)；(c)放射频移尽可能远到可见光谱的红色部分(＞600nm)；(d)放射频移到更高波长，高于在供体激发波长激发产生的拉曼水荧光放射。例如，可选择最大激发接近激光线(例如氦-镉442nm或氩448nm)、高消光系数、高量子产量、荧光放射与对应受体荧光部分的激发光谱良好重叠的供体荧光部分。可选择有高消光系数、高量子产量、激发与供体荧光部分的放射良好重叠且在可见光谱红色部分(＞600nm)发射的对应受体荧光部分。
在FRET技术中能与不同受体荧光部分一起使用的代表性供体荧光部分包括荧光素、荧光黄、B-藻红蛋白、9-吖啶异硫氰酸盐、荧光黄VS、4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸二苯乙烯-2，2’-二磺酸、7-二乙基氨基-3-(4’-异硫氰酸苯基)(isothiocyanatophenyl)-4-甲基香豆素、琥珀酰亚胺基1-芘丁酸盐(pyrenebutyrate)和4-乙酰氨基-4’-异硫氰酸二苯乙烯-2，2’-二磺酸衍生物。取决于所用供体荧光部分，代表性受体荧光部分包括LCTM-Red640、LCTM-Red705、Cy5、Cy5.5、丽丝胺若丹明B磺酰氯、四甲基若丹明异硫氰酸盐、若丹明x异硫氰酸盐、赤藓红异硫氰酸盐、荧光素、二乙烯三胺五乙酸盐、和镧系元素离子(如铕或铽)的其它螯合物。供体和受体荧光部分可获得自例如Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)或Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。
供体和受体荧光部分可经接头臂附着于探针寡核苷酸。各接头臂长度是重要的，因为接头臂会影响供体和受体荧光部分间的距离。用于本发明目的的接头臂长度是从核苷酸碱基到荧光部分的埃()距离。一般，接头臂长度从约10到约25。接头臂可以是例如WO 84/03285所述种类。WO 84/03285也描述使接头臂附着于特定核苷酸碱基的方法以及使荧光部分附着于接头臂的方法。
受体荧光部分如LCTM-Red 640-NHS-酯可结合C6-亚磷酰胺(获得自ABI(Foster City，CA)或Glen Research(Sterling，VA))以产生例如LCTM-Red 640-亚磷酰胺。常用于偶联供体荧光部分如荧光素到寡核苷酸的接头包括硫脲接头，例如来自Glen Research或ChemGene(Ashland，MA)下ITC衍生的荧光素-CPG)、酰胺接头，如来自BioGenex(San Ramon，CA)荧光素-NHS-酯衍生的荧光素-CPG)或在寡核苷酸合成后需要偶联荧光素-NHS-酯的3’-氨基-CPG。
使用可商业购买的实时PCR仪器(例如LightCyclerTM，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)，PCR扩增、检测和定量扩增产物可结合循环时间大幅减少的单一密封小池。由于检测和定量与扩增同时发生，实时PCR方法排除操作扩增产物的需要且减小扩增产物间交叉污染的风险。实时PCR大幅降低周转时间且在临床实验室、护理领域和护理点中是常规PCR技术的有吸引力的替换物。
结合FTET技术的常规PCR方法可用于实践发明方法。在一个实施方案中，使用LightCyclerTM仪器。关于LightCyclerTM系统及实时和在线监控PCR的详细描述可发现于Roche网站。下列专利申请描述用于LightCyclerTM技术的实时PCR：WO 97/46707、WO 97/46714和WO 97/46712。LightCyclerTM仪器是迅速的热循环仪，结合利用高光学质量的微体积荧光计。此迅速热循环技术使用薄玻璃小池作为反应容器。反应室的加热和冷却受交替的热和环境空气控制。由于空气质量低且表面积与小池体积的比例高，能在LightCyclerTM热室内达到很迅速的温度交换速度。加入所选荧光染料到反应组分允许实时和在线监控PCR。此外，小池用作光学元件，用于信号收集(类似于光学玻璃纤维)，在小池顶部集中信号。效果是有效照明和荧光监控微体积样品。
放置小池的LightCyclerTM转盘能从仪器中取出。因此，样品可装载在仪器外(例如在PCR清洁室中)。此外，此特征使样品转盘易清洁和消毒。作为部分LightCyclerTM设备的荧光计放置光源。过滤放射光并通过落射光透镜聚焦于池顶部。随后，从样品放射的荧光通过相同透镜聚焦，通过分色镜，适当过滤，聚焦于收集数据的光混杂物(photohybrids)上。目前用于LightCyclerTM仪器(RocheMolecular Biochemicals，目录号2011 468)的光学单元包括三带通滤过器(530nm、640nm和710nm)，提供三色检测和一些荧光获得选择。数据收集选择包括每循环步骤一次监控，用于解链曲线分析的充分连续单一样品获得，连续取样(其中取样频率取决于样品数)和/或在确定温度间隔后逐步测量所有样品。
可运转LightCyclerTM并用PC工作站和Windows操作系统取回数据。随着机器将毛细管连续置于光学单元上，获得来自样品的信号。软件能立即实时展示各测量后荧光信号的存在和量。荧光获得时间是10-100毫秒(msec)。各循环步骤后，可连续更新所有样品的荧光相对循环数的定量展示。可保存产生的数据用于进一步分析。
实时PCR方法包括多个循环步骤，各步骤包含扩增步骤和杂交步骤。此外，各循环步骤通常后跟FRET检测步骤，以检测1种或多种探针与扩增产物的杂交。扩增产物的存在表明1种或多种含cpn60种类的存在。如本文所用，“含cpn60的种类”指含cpn60核酸序列的微生物。一般，存在FRET表明样品中存在1种或多种含cpn60的种类，缺乏FRET表明样品中没有含cpn60的种类。通常，在例如20、25、30、35、40或45个循环步骤内检测FRET表明含cpn60种类的存在。
如本文所述，可用标记的杂交探针检测cpn60扩增产物，利用FRET技术。普通FRET技术模式使用2个杂交探针，一般设计探针用于彼此极邻近杂交，其中一个探针用供体荧光部分标记且另一个用对应受体荧光部分标记。因此，可使用2个cpn60探针，一个用供体荧光团标记且另一个用对应受体荧光团标记。在cpn60探针与cpn60扩增产物杂交时检测第1个cpn60探针的供体荧光部分与第2个cpn60探针的对应受体荧光部分之间的FRET存在。例如，供体荧光部分如荧光素由LightCyclerTM仪器的光源在470nm处激发。在FRET期间，荧光素转移其能量到受体荧光部分如LightCyclerTM-Red 640(LCTM-Red 640)或LightCyclerTM-Red705(LCTM-Red 705)。受体荧光部分随后放射更长波长的光，光通过LightCyclerTM仪器的光探测系统检测。仅当荧光部分处于直接局部邻近和当供体荧光部分的放射光谱与受体荧光部分的吸收光谱重叠时，发生效率高的FRET。放射信号的强度可与原始靶DNA分子数(例如cpn60的拷贝数)相关联。
另一种FRET模式可包括使用TaqMan技术检测cpn60扩增产物的存在或缺乏，并因而检测含cpn60种类的存在或缺乏。TaqMan技术使用1个单链杂交探针，用2个荧光部分标记。当第1个荧光部分用适当波长的光激发时，吸收的能量根据FRET原理转移到第2个荧光部分。第2个荧光部分一般是淬灭分子。在PCR反应的退火步骤期间，标记的杂交探针结合靶DNA(即cpn60扩增产物)且在随后的延伸期期间通过Taq聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性降解。结果，激发的荧光部分和淬灭部分彼此空间分离。由于在淬灭剂缺乏时激发第1个荧光部分，可检测来自第1个荧光部分的荧光放射。例如，ABI PRISM7700序列检测系统(AppliedBiosystems，Foster City，CA)使用TaqMan技术，适合执行本文所述方法以检测含cpn60的种类。关于PCR扩增和用ABI PRISM770系统检测的信息可发现于Applied Biosystems网站(在万维网appliedbiosystems.com/products)。
结合FRET的分子信标可用于检测cpn60扩增产物的存在，使用发明的实时PCR方法。分子信标技术使用杂交探针，探针用第1个荧光部分和第2个荧光部分标记。第2个荧光部分一般是淬灭剂，荧光标记通常位于探针的各末端。分子信标技术使用寡核苷酸探针，其具有的序列允许二级结构形成(例如发夹)。由于探针内形成二级结构，探针在溶液中时2个荧光部分空间接近。与靶cpn60扩增产物杂交后，探针的二级结构受到破坏且荧光部分彼此分开，从而用适当波长光激发后能检测第1个荧光部分的放射。
FRET的量对应于扩增产物的量，扩增产物量依次对应于样品中存在的模板核酸的量。类似地，模板核酸的量对应于样品中存在的微生物生物体的量。因此，当扩增获得自生物样品的核酸时，产生的FRET量可与微生物的量相关联。通常，通过与产生自扩增核酸的FRET量相比较，可定量样品中的微生物量，核酸获得自已知量的微生物(例如标准曲线)。精确定量需要测量FRET的量，同时扩增线性地增加。此外，反应中必须有过量探针。而且，在用于比较目的的已知样品中产生的FRET量可对特定反应条件标准化，从而不一定从各微生物中分离和扩增样品用于比较目的。
除了FRET外，可用例如荧光DNA结合染料(如SYBRGreenI或SYBRGold(Molecular Probes))检测cpn60扩增产物。与扩增产物相互作用时，这类DNA结合染料在用适当波长光激发后发出荧光信号。也可使用双链DNA结合染料如核酸嵌入染料。当使用双链DNA结合染料时，通常进行解链曲线分析以确认扩增产物的存在。
解链曲线分析是可包括于循环分布的另外步骤。解链曲线分析基于核酸序列在特征温度(Tm)解链，Tm定义为一半DNA双螺旋分成单链的温度。DNA分子的解链温度主要取决于其核苷酸组成。富含G和C核苷酸的DNA分子的Tm高于A和T核苷酸丰富的DNA分子。失去FRET信号的温度与探针从扩增产物解链的温度相关联。类似地，产生信号的温度与探针和扩增产物退火的温度相关联。cpn60探针从扩增产物解链的温度可确认样品中含cpn60种类的存在或缺乏，且可用于定量含特定cpn60种类的量。例如，与cpn60内可变区杂交的通用探针的Tm取决于与其杂交的序列。因此，当与产生自1种微生物生物体的cpn60扩增产物杂交时，通用探针可具有70℃的Tm，但当与产生自第2种微生物生物体的cpn60扩增产物杂交时，通用探针具有65℃的Tm。观察到样品的荧光随着加热发生温度依赖性、逐步减少，可鉴定样品中含特定cpn60的种类并可确定样品中种类的相对量。
在各热循环仪运转中，对照样品也能循环。正对照样品可扩增核酸对照模板(如不同于cpn60的核酸)，使用例如对照引物和对照探针。正对照样品也能扩增例如含cpn60核酸分子的质粒构建物。这种质粒对照可内部扩增(例如在样品内)或在与测试样品并列的单独样品运转中扩增。各热循环仪运转也应包括负对照，例如缺乏cpn60模板DNA的负对照。这种对照指示扩增、杂交和/或FRET反应的成功或失败。因此，对照反应易确定例如引物序列特异性退火和起始延伸的能力以及探针序列特异性杂交和FRET产生的能力。
在一个实施方案中，发明的方法包括避免污染的步骤。例如，使用尿嘧啶-DNA糖基化酶的酶方法描述于美国专利号5,035,996、5,683,896和5,945,313，且可用于减少或消除一个热循环仪运转与下一个之间的污染。此外，执行发明方法时需要标准实验室防范操作和程序。防范操作和程序包括但不限于方法的不同步骤的单独工作区、防护罩、阻挡滤片移液管尖和专用排气移液管。人员间一致的防范操作和程序对诊断实验室处理临床样品的的精确性是必要的。
应理解本发明不受1种或多种可商业购买仪器的配置的限制。
荧光原位杂交(FISH)
原位杂交方法如FISH也可用于确定微生物分布。一般，本文提供的原位杂交方法包括固定生物样品、杂交cpn60探针与固定生物样品内所含靶DNA、冲洗以去除非特异结合、检测杂交探针和定量杂交探针量的步骤。
通常，用标准技术从生物样品收集细胞。例如，收集细胞可通过离心生物样品和重悬浮沉淀细胞于例如磷酸缓冲盐水(PBS)。再离心细胞悬浮液以获得细胞沉淀后，细胞可固定于溶液如酸性醇溶液、酸性丙酮溶液、或者醛如甲醛、低聚甲醛或戊二醛。例如，分别含3∶l比例甲醇和冰乙酸的固定剂可用作固定剂。也可使用中性缓冲福尔马林溶液(例如溶液含约1％到10％的37-40％甲醛，在磷酸钠水溶液中)。制备含细胞的载玻片可通过取出大部分固定剂，留下浓缩细胞悬浮于仅一部分的溶液。
细胞悬浮液应用于载玻片，使细胞不在载玻片上重叠。细胞密度可通过光学或相差显微镜测量。例如，从20到l00ml尿样收集的细胞重悬浮于终体积约100到200Tl的固定剂。3体积的此悬浮液(例如3、10和30T1)随后滴入载玻片的6mm孔。然后，用相差显微镜评估这些孔中的细胞性(即细胞密度)。如果含最大体积的细胞悬浮液的孔没有足够细胞，细胞悬浮液可浓缩并置于另一孔中。
选择最大敏感度和特异性的探针用于FISH。使用一批探针(例如2个或多个cpn60探针)可提供敏感度和特异性大于使用任何1种探针。探针通常是约50到约2×103核苷酸长度(例如50、75、100、200、300、400、500、750、1000、1500或2000个核苷酸长度)。更长的探针可包括约100到约500个核苷酸长度的更小片段。与位点特异性DNA杂交的探针可商业购自例如Vysis，Inc.(DownersGrove，IL)、Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)或来自Cytocell(Oxfordshire，UK)。另外，可通过标准技术从染色体或基因组DNA非商业制成探针。例如，可使用的DNA来源包括基因组DNA、克隆的DNA序列、含1种或部分1种人染色体与宿主的正常染色体互补物一起的体细胞杂合物、通过流式细胞仪或显微解剖纯化的染色体。通过克隆或经PCR的位点特异性扩增可分离感兴趣的区域。参见例如Nath和Johnson，Biotechnic Histochem.，1998，73(1)：6-22、Wheeless等，Cytometry，1994，17：319-326和美国专利号5,491,224。
用于FISH的探针通常直接用荧光部分(也称为荧光团)、有机分子标记，有机分子在吸收低波长/高能量后发荧光。荧光部分能使探针显现而不需第2个检测分子。共价附着荧光团于核苷酸后，核苷酸可直接掺入探针，使用标准技术如缺口翻译、随机引发和PCR标记。另外，探针内的脱氧胞苷核苷酸可用接头转氨。荧光团随后可共价附着于转氨的脱氧胞苷核苷酸。参见美国专利号5,491,224。掺入探针的荧光团量可以已知或确定，此值转而可用于确定结合探针的核酸量。结合分析含已知数量微生物生物体的样品(例如连续稀释样品)，可确定生物或非生物样品中的微生物生物体的数量。
当使用超过1种探针时，可选择不同颜色的荧光部分，从而该批中的各个探针可清楚显现和定量。例如，可使用下列荧光团的组合：7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、Texas RedTM(Molecular Probes，Inc.)、5-(和-6)-羧基-X-若丹明、丽丝胺若丹明B、5-(和-6)-羧基荧光素、荧光素-5-异硫氰酸盐(FITC)、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、四甲基若丹明-5-(和-6)-异硫氰酸盐、5-(和-6)-羧基四甲基若丹明、7-羟基香豆素-3-羧酸、6-[荧光素5-(和-6)-羧氨基]己酸、N-(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a重氮-3-茚满苯并丙酸、曙红-5-异硫氰酸盐、赤藓红-5-异硫氰酸盐和CascadeTM蓝乙酰叠氮化物(Molecular Probes，Inc.)。可用荧光显微镜和各荧光团的适当滤片观察探针，或用双或三通带滤光器装置以观察多种荧光团。参见例如美国专利号5,776,688。另外，技术如流式细胞仪可用于检测和定量探针的杂交模式。
探针也可用生物素或地高辛配基间接标记，或用放射性同位素如32P和3H标记，尽管随后需要二级检测分子或进一步处理以显现探针和定量杂交量。例如，用生物素间接标记的探针可用抗生物素蛋白检测和定量，抗生物素蛋白缀合可检测的酶标记如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。酶标记能在标准比色反应中检测和定量，使用该酶的底物和/或催化剂。碱性磷酸酶的催化剂包括5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氮蓝四唑。二氨基苯甲酸酯可用作辣根过氧化物酶的催化剂。
原位杂交前，变性细胞内所含探针和染色体DNA。变性一般通过孵育进行，孵育时存在高pH、热(例如从约70℃到约95℃的温度)、有机溶剂如甲酰胺和四烷基卤化铵或其组合。例如，变性染色体DNA可通过高于70℃的温度(例如约73℃)与变性缓冲液的组合，缓冲液含70％甲酰胺和2X SSC(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠)。一般确定变性条件，从而保护细胞形态。探针可通过热变性(例如通过加热到约73℃，或约5分钟)。
去除变性化学品或条件后，探针在杂交条件下退火成染色体DNA。“杂交条件”是促进探针与靶染色体DNA间退火的条件。杂交条件可变化，取决于浓度、碱基组成、复杂性、探针长度以及盐浓度、温度和孵育长度。探针浓度越高，形成杂合体的可能性越高。例如，原位杂交通常在杂交缓冲液中进行，缓冲液含1-2X SSC、50％甲酰胺和抑制非特异杂交的封闭DNA。一般，如上所述，杂交条件包括约25℃到约55℃的温度、约0.5小时到约96小时的孵育时间。更具体地说，杂交可在约32℃到约40℃进行约2到约16小时。
探针与靶区域外DNA的非特异性结合可通过一系列洗涤去除。各洗涤中的温度和盐浓度取决于所需严紧性。例如，对于高严紧性条件，洗涤可在约65℃到约80℃完成，使用0.2X到约2X SSC，约0.1％到约1％非离子型去垢剂如Nonidet P-40(NP40)。降低严紧性可通过减小洗涤的温度或增加洗涤中的盐浓度。
以mRNA为基础的测定
另外，为测试样品如含细胞的样品中cpn60特异mRNA的存在或缺乏或者测量其水平，可裂解细胞并通过多种本领域已知方法从裂解物中纯化或半纯化总RNA。检测或测量特定mRNA转录物的方法也对本领域技术人员熟悉。这些测定无限制地包括使用可检测标记的cpn60特异核酸(DNA或RNA)探针的杂交测定和用适当cpn60寡核苷酸引物的定量或半定量RT-PCR方法。定量细胞裂解物中mRNA的另外方法包括RNA保护测定和系列分析基因表达(SAGE)。另外，能完成定性、定量或半定量原位杂交测定，使用例如样品如组织切片或未裂解细胞悬浮液、可检测(例如荧光、同位素或酶)标记的DNA或RNA探针。
以肽为基础的测定
发明也以肽为基础的测定为特色。cpn60蛋白或cpn60特异多肽可用作通用靶以确定1种或多种微生物的存在或缺乏，更可用作种特异靶和/或用于鉴定和分类特定微生物的探针。这些测定能独立使用或结合其它程序(例如以核酸为基础的测定)以监控高风险环境。
在发明的测定中，检测cpn60特异多肽的存在或缺乏和/或测量其水平。可测量液体样品中cpn60特异多肽的存在，如体液(例如尿、乳、泪液、玻璃体液、痰、脑脊液、汗、淋巴、唾液、精液、血液、或来源于血的血清或血浆)；灌洗如乳管灌洗、肺灌洗、胃灌洗、直肠或结肠灌洗、或阴道灌洗；抽吸物如奶嘴或乳头抽吸物；流体如细胞培养物或来自细胞培养物的上清；流体如用于从例如污染物获得样品的缓冲液，如用于在拭子取样过程中洗涤或湿润拭子的缓冲液；水样品。此外，任何能溶解的样品也可用于本发明方法。
检测或测量细胞中的感兴趣蛋白(例如cpn60蛋白或cpn60特异多肽)的水平的方法在本领域已知。许多这类方法使用特异性结合蛋白的抗体(例如多克隆抗体或mAbs)。
抗体和以抗体为基础的测定
对cpn60蛋白或cpn60特异多肽有特异结合亲和性的抗体可通过标准方法产生。如本文所用，术语“抗体”或“几种抗体”包括完整分子以及其能结合cpn60特异多肽的抗原表位决定簇的片段。术语“抗原表位”指抗原上结合抗体互补位的抗原性决定簇。抗原表位决定簇通常由化学活性表面分子集合组成，如氨基酸或糖侧链，一般有特定三维结构特征以及特定电荷特征。抗原表位一般有至少5个毗连氨基酸(连续抗原表位)，或另外可以是一批定义特定结构(例如构象抗原表位)的非毗连氨基酸。术语“抗体”或“几种抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链Fv抗体片段、Fab片段和F(ab)2片段。
抗体可特异于特定cpn60特异多肽，例如产气荚膜梭菌微生物的cpn60蛋白。另外，它们可与2种或多种cpn60特异多肽交叉反应，例如交叉反应或结合2种或多种cpn60蛋白。例如，这种抗体可结合2种或多种cpn60蛋白或cpn60特异多肽中存在的普通抗原表位。如本文所用，这些对2种或多种cpn60特异多肽有特异性的抗体称为“通用”抗体。例如，某些抗体能结合所有cpn60特异多肽中存在的普通抗原表位。因此，某些这种抗体可称为能检测样品中任何微生物的存在或缺乏。
在本文所述方法的某些实施方案中，取决于高风险环境和监控目的，足以简单确定是否存在任何微生物，任选确定微生物的相对浓度或量。这种检测可通过例如使用1种或多种“通用”cpn60抗体，如结合2种或多种cpn60特异多肽或证明对其有特异性的抗体(例如与特定属的所有cpn60蛋白交叉反应或有全部细菌cpn60蛋白)，如上所述。
在其它实施方案中，优选鉴定特定微生物。因此，可使用特异于特定cpn60特异多肽的抗体，单独或结合通用抗体，这种抗体在本文称为“特异”抗体。通用和特异抗体可同时或连续使用。例如，通用抗体可用作确定cpn60特异多肽存在或缺乏的第1道筛选。随后，可使用特异抗体，如特异于特定微生物例如空肠弯曲杆菌的cpn60特异多肽的抗体。在这些测定中，单克隆抗体可特别地用于(例如敏感)鉴定特定微生物的cpn60特异多肽。
一般，重组产生感兴趣的蛋白(例如人们想要相对其制备抗体的cpn60蛋白)，通过化学合成或纯化天然蛋白，并随后用于免疫动物。如本文所用，可使用完整cpn60蛋白，或可使用cpn60特异多肽，只要cpn60特异多肽能产生所需免疫反应。参见例如WO 200265129中抗原表位序列的例子，序列结合抗沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的人抗体；这种抗原表位序列可用于产生本发明所用抗衣原体属的抗体。也参见例如美国专利号6,497,880，它列出特异于烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)和光滑念珠菌(Candida glabrata)的核酸序列、氨基酸序列、表达载体、纯化蛋白、抗体等。纯化的烟曲霉菌和光滑念珠菌cpn60蛋白或其蛋白水解或合成产生的片段可用于免疫动物以产生本发明方法中所用抗体。最后，参见WO 200257784，它公开了大体纯化的衣原体hsp60(cpn60)多肽。这种多肽也可用于产生本发明方法中所用抗体。
如前所讨论，人们想要制备cpn60蛋白或多肽的通用或特异抗体。例如，如果cpn60特异多肽维持为至少2种cpn60蛋白所共有的抗原表位或例如对人们想要检测的所有cpn60蛋白(如弯曲菌属的cpn60蛋白)所共有的抗原表位，cpn60特异多肽可用于产生通用抗体。另外，cpn60蛋白或cpn60特异多肽可用于产生抗体，抗体特异于特定微生物例如仅空肠弯曲菌中存在的特定cpn60蛋白或多肽。
通过注射感兴趣蛋白可免疫不同宿主动物，包括例如兔、鸡、小鼠、豚鼠和大鼠。佐剂可用于增加免疫学反应，这取决于宿主种类，佐剂包括弗氏佐剂(完全或不完全)、无机凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白(KLH)和二硝基酚。多克隆抗体是特异于特定抗原的异源抗体分子群，它们包含于免疫动物的血清中。单克隆抗体是抗原内所含特定抗原表位的同源抗体群，可用标准杂交瘤技术制备。获得单克隆抗体可特定通过生成抗体分子的任何技术，包括连续培养细胞系的技术如Kohler，G.等，Nature，1975，256：495所述、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，ImmunologyToday，1983，4：72；Cole等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80：2026)和EBV-杂交瘤技术(Cole等，“单克隆抗体和癌症治疗”(Monoclonal Antibodies andCancer Therapy)，Alan R.Liss，Inc.，1983，第77-96页)。这种抗体可以是任何免疫球蛋白种类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任意亚类。生成发明单克隆抗体的杂交瘤可在体外或体内培养。
嵌合抗体是一种分子，其中不同部分获得自不同动物种类，如具有获得自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区。嵌合抗体可通过标准技术产生。
对cpn60特异多肽有特异结合亲和性的抗体片段可通过已知技术产生。例如，这类片段包括但不限于能通过胃蛋白酶消化抗体分子生成的F(ab’)2片段、可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab片段。另外，可构建Fab表达文库。参见例如Huse等，1989，Science，246：1275。形成单链Fv抗体片段可通过经氨基酸桥(例如15到18个氨基酸)连接Fv区的重和轻链片段，产生单链多肽。单链Fv抗体片段能通过标准技术产生。参见例如美国专利号4,946,778。
一旦产生，测试抗体或其片段对cpn60蛋白或cpn60特异多肽的识别，通过标准免疫测定方法，包括例如ELISA技术、对流免疫电泳(CIEP)、放射性免疫测定(RIA)、放射免疫沉淀、点印迹、抑制或竞争测定、三明治测定、免疫粘着(immunostick)(纤维素试纸)测定、免疫层析测定、免疫过滤测定、乳胶打击凝集测定、免疫荧光测定、生物传感器测定。参见《精编分子生物学实验指南》(Short Protocols in Molecular Biology)，第11章，Green Publishing Associatesand John Wiley & Sons，Ausubel，F.M等编，1992；《抗体：实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，Harlow和Lane(编辑)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988；美国专利号4,376,110；4,486,530和6,497,880。也可测试抗体或其片段反应的能力，例如与2种或多种cpn60蛋白或cpn60特异多肽如cpn60蛋白或多肽亚群(例如来自细菌属如梭菌的cpn60蛋白)普遍反应，或与特定cpn60蛋白(例如产气荚膜梭菌的cpn60蛋白)特异反应。
在抗体测定中，抗体本身或与其结合的二抗能可检测地标记。另外，抗体可缀合生物素，可检测地标记的抗生物素蛋白(结合生物素的蛋白)可用于检测生物素酰化抗体的存在。这些方法(包括“多层”测定)的组合对本领域技术人员熟悉，可用于提高测定的敏感性。这些测定中的一些(例如免疫组织学方法或荧光流式细胞仪)可应用于组织学切片或未裂解的细胞悬浮液。下述检测液体样品中cpn60特异多肽的方法也可用于检测细胞裂解物中的cpn60特异多肽。
检测液体样品中cpn60特异多肽的方法一般包括使感兴趣样品接触结合cpn60特异多肽的抗体并测试抗体与样品组分的结合。在这种测定中，抗体不需可检测地标记且能无第2种抗体使用，第2种抗体结合cpn60特异多肽。例如，特异于cpn60特异多肽的抗体可结合适当固体底物并随后暴露于样品。cpn60特异多肽与固体底物上抗体的结合可利用表面胞质基因组共振的现象检测，在结合时产生可由适当仪器定性或定量检测的表面胞质基因组共振强度的变化，例如Biacore设备(Biacore International AB，Rapsgatan，Sweden)。
此外，检测液体样品中cpn60特异多肽的测定可包括使用例如：(a)可检测地标记特异于cpn60特异多肽的单一抗体；(b)特异于cpn60特异多肽的未标记抗体和可检测地标记的二抗；或(c)特异于cpn60特异多肽的生物素酰化抗体和可检测地标记的抗生物素蛋白。此外，这些方法(包括“多层”测定)的组合对本领域技术人员熟悉，可用于提高测定的敏感性。在这些测定中，怀疑含微生物的样品或等分样品可固定于固体底物，如尼龙或硝化纤维膜，通过例如“点”等分液体样品或进行样品或等分样品电泳分离的电泳凝胶印迹。然后测定固体底物上cpn60特异多肽的存在或量，使用任何上述形式的cpn60特异多肽特异抗体，需要时可用适当可检测地标记的二抗或抗生物素蛋白。
发明特征也以“三明治”测定为特色。在这些三明治测定中，样品中可存在的任何cpn60特异多肽能固定于固体底物，而不是通过上述方法固定样品于固体底物，然后使固体底物暴露于样品，通过本领域已知的各种方法缀合特异于cpn60特异多肽的第2种(“捕获”)抗体(多克隆或mAb)与固体底物。在使样品暴露于结合特异于cpn60特异多肽的第二种抗体的固体底物时，样品(或等分样品)中的任何cpn60特异多肽会结合固体底物上的第2种抗体。随后测定与缀合的第2种抗体结合的cpn60特异多肽的存在或量，使用特异于cpn60特异多肽的“检测”抗体，方法基本与上述用特异于cpn60特异多肽的单一抗体方法相同。应理解在这些三明治测定中，捕获抗体不应结合与检测抗体相同的抗原表位(或在多克隆抗体的情况中是一定范围的抗原表位)。因此，如果mAb用作捕获抗体，检测抗体可以是：(a)另一种结合抗原表位的mAb，此抗原表位与捕获mAb结合抗原表位完全物理分离或仅部分重叠；或(b)结合抗原表位的多克隆抗体，此抗原表位不同于或除了捕获mAb结合的之外。另一方面，如果多克隆抗体用作捕获抗体，检测抗体可以是：(a)结合抗原表位的mAb，此抗原表位与捕获多克隆抗体结合任何抗原表位完全物理分离或仅部分重叠；或(b)结合抗原表位的多克隆抗体，此抗原表位不同于或除了捕获多克隆抗体结合的之外。包含使用捕获和检测抗体的测定包括三明治ELISA测定、三明治蛋白质印迹测定和三明治免疫磁性检测测定。
能结合捕获抗体的合适固体底物无限制地包括微量滴定板孔的塑料底和侧面、膜如尼龙或硝化纤维膜、聚合(无限制地例如琼脂糖、纤维素或聚丙烯酰胺)珠或粒子。应指出结合这种珠或粒子的抗体也可用于免疫亲和纯化cpn60特异多肽。纤维素试纸/免疫粘着模式可使用固相如聚苯乙烯、桨或纤维素试纸。
检测或定量可检测标记的方法取决于标记性质且在本领域已知。适当标记无限制地包括放射性核素(例如125I、131I、35S、3H、32P、33P或14C)、荧光部分(例如荧光素、若丹明或藻红蛋白)、发光部分(例如Quantum Dot Corporation，Palo Alto，CA提供的QdotTM纳米粒)、吸收确定波长光的化合物或酶(例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)。由适当酶催化的反应产物可以无限制地是荧光、发光或放射性，或它们能吸收可见光或紫外线。探测器例子可无限制地包括X光胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、比色计、荧光计、发光计和光密度。
本发明方法可使用对照样品。在检测微生物存在或缺乏的测定中，在例如怀疑受微生物污染或有污染风险的食物样品中的cpn60特异多肽浓度可与对照样品例如已知没有感染的食物样品相比较。对照样品可取自相同的高风险环境，例如在已知未污染的不同位置，或可以是取自非高风险环境的对照样品。另外，对照样品能取自相同高风险环境位置，但在已知位置未污染的更早或更晚时间点。怀疑样品相对对照样品显著更高浓度的cpn60特异多肽表明微生物的存在。
应理解尽管上面诊断测定的描述指对食物样品或体液样品的测定，测定也可在本文所列任何其它流体或溶解样品上完成，如水样品或缓冲液样品(例如用于从污染物中提取样品的缓冲液)。
其它多肽检测测定
本发明也考虑使用其它分析技术用于检测cpn60特异多肽。近来，在蛋白质组学研究方面出现的分析仪器和方法学进展可应用于本发明方法。一般参见PRJungblut，“细菌病原体的蛋白质组分析”(Proteome Analysis of BacterialPathogens)，Microbes & Infection 3(2001)：831-840；G MacBeath和SLSchreiber，“印制蛋白质作为微阵列用于高通量功能确定”(Printing Proteins asMicroarrays for High-Throughput Function Determination)，Science 289(2000)：1760-1763；J Madoz-Gdrpide，H Wang和DE Misek，“以蛋白质为基础的微阵列：探测癌细胞和组织的蛋白质组的工具”(Protein-Based Microarrays：A Tool for Probing the Proteome of Cancer Cells and Tissues)，Proteomics1(2001)：1279-1287；S Patterson，“质谱和蛋白质组”(Mass Spectrometry andProteomics)，Physiological Genomics 2(2000)：59-65；A Schevchenko等，“Maldi四极飞行时间质谱：蛋白质组研究的有力工具”(Maldi QuadrupoleTime-of-Flight Mass Spectrometry：A Powerful Tool for Proteomic Research)，Analytical Chemistry 72(2000)：2132-2141。
质谱技术越来越多地用于检测和定量低水平的蛋白和蛋白片段，例如fmol或pmol。质谱成为蛋白质和蛋白质组学研究的主要分析工具，因为用于生物分子电离、电喷射电离(ESI)和基质辅助激光解吸-电离(MALDI)的仪器进展。MALDI通常结合飞行时间(TOF)质量分析仪。一般，含1-10pmol蛋白或肽的0.5μl样品混合等体积的饱和基质溶液并干燥，使分析物与基质共结晶。使用的基质化合物包括芥子酸和α-羟基肉桂酸。靶平板上的共结晶物质用氮激光脉冲辐射，例如在337nm的波长，用于挥发和电离蛋白或肽分子。打开强加速场，电离分子沿飞行管下移到探测器。到达探测器所需时间量与质量对电荷比例相关。当结合搜索蛋白和蛋白片段数据库时，蛋白水解质量图谱和随机质谱也可用于检测和定量cpn60特异多肽。参见例如Devin M.Downard，“质谱对结构免疫学的贡献”(Contributions of mass spectrometry to structural immunology)，J.Mass.Spectrom.35：493-503(2000)。
生物分子相互作用分析质谱(BIA-MS)是另一种检测cpn60特异多核苷酸与cpn60抗体间相互作用的合适技术。此技术检测结合配基的分子，配基共价附着于表面。由于表面上生物物质的密度增加，溶液或表面界面上的折射率出现变化。此折射率变化通过表面吸收入射光的角度或波长改变来检测。角度或波长差异与表面上结合的物质量成比例，产生称为表面胞质基因组共振(SPR)的信号，如前所讨论。参见例如RW Nelson等，“直接来自大肠杆菌裂解物的抗原表位标记肽的BIA/MS：在低fmol到亚fmol水平的多重检测和蛋白鉴定”(BIA/MS ofEpitope-Tagged Peptides Directly from E.coli Lysate：Multiplex Detectionand Protein Identification at Low-Femtomole to Subfemtomole Levels)，Analytical Chemistry 71(1999)：2858-2865；也参见D Nedelkov和RW Nelson，“通过生物分子相互作用分析质谱(BIA/MS)分析来自生物流体的天然蛋白：确定检测界限，鉴定非特异结合和检测多蛋白复合体”(Analysis of Native Proteinsfrom Biologicai Fluids by Biomolecular Interaction Analysis MassSpectrometry(BIA/MS)：Exploring the Limit of Detection，Identificationof Non-Specific Binding and Detection of Multiprotein Complexes)，Biosensors and Bioelectronics 16(2001)：1071-1078。
SPR生物传感技术结合MALDI-TOF质谱用于解吸和鉴定生物分子。在基于芯片的BIA/MS方法中，一种配基如cpn60抗体共价固定于芯片表面。来自样品的溶解蛋白的胰蛋白酶消化液送到芯片上，相关肽如cpn60特异多肽由配基结合。洗涤步骤后，洗脱的肽通过MALDI-TOF质谱分析。系统可以是全自动方法且能用于在低到亚fmol水平检测复杂生物流体和细胞提取物中存在的蛋白并鉴定蛋白。
用于这种应用的质谱仪可获得自Applied Biosystems(Foster City，CA)；Bruker Daltronics(Billerica，MA)和Amersham Pharmacia(Sunnyvale，CA)。
其它用于本发明的合适技术包括“多维蛋白鉴定技术”。细胞分部溶解和消化，例如连续用内切蛋白酶Lys-C和固定胰蛋白酶。样品随后进行多维蛋白鉴定技术(MUDPIT)分析，包括通过在线二相微毛细管层析(例如强离子交换，然后C-18分离)连续分离肽片段，接着是随机质谱(MS-MS)。参见例如MP Washburn，D Wolter和JR Yates，“通过多维蛋白鉴定技术大规模分析酵母蛋白质组”(Large-ScaleAnalysis of the Yeast Proteome by Multidimensional Protein IdentificationTechnology)，Nature Biotechnology 19(2001)：242-247。
制造的产品
发明也提供制造的产品。制造的产品可包括至少1种cpn60寡核苷酸引物以及使用cpn60寡核苷酸鉴定和定量生物或非生物样品中1种或多种微生物生物体量的说明。
在一个实施方案中，cpn60寡核苷酸附着于微阵列(例如GeneChip，Affymetrix，Santa Clara，CA)。在另一个实施方案中，制造的产品可包括1种或多种cpn60寡核苷酸引物和1种或多种cpn60寡核苷酸探针。这种cpn60引物和探针可用于例如实时扩增反应以扩增和同时检测cpn60扩增产物。
合适的寡核苷酸引物包括与cpn60的高度保守区互补和在可变区侧翼的寡核苷酸引物。这种通用cpn60产物可用于特异扩增这些可变区，从而提供鉴定微生物的序列。cpn60寡核苷酸引物的例子包括下列：
5’-GAIIIIGCIGGIGA(T/C)G6IACIACIAC-3’(SEQ ID NO：6)和
5’-(T/C)(T/G)I(T/C)(T/G)ITCICC(A/G)AAICCIGGIGC(T/C)TT-3’(SEQ IDNO：7)。
合适的寡核苷酸引物也包括与种特异cpn60序列互补的寡核苷酸引物，因而仅若样品中存在特定种类时产生扩增产物。
与cpn60寡核苷酸引物类似，cpn60寡核苷酸探针一般与cpn60序列互补。能设计cpn60寡核苷酸探针与cpn60序列普遍杂交，或能设计用于种特异杂交cpn60序列的可变区。
发明的制造产品可进一步包括另外成分，用于完成扩增反应和/或例如在微阵列上的反应。用于PCR反应的制造产品可包括三磷酸核苷酸、适当缓冲液和聚合酶。发明的制造产品也可包括用于检测扩增产物的合适试剂。例如，制造的产品可包括1种或多种限制性酶用于区分来自不同微生物种类的扩增产物，或可包括荧光团标记的寡核苷酸探针用于实时检测扩增产物。
本领域普通技术人员理解不同制造产品能提供评估不同高风险环境类型中的微生物。例如，医院具有的微生物群落不同于餐馆。因此，设计用于评估医院中微生物的制造产品可具有和设计餐馆所用不同的对照设置或不同种特异杂交探针设置。另外，更通用的制造产品能用于评估一些不同高风险环境中的微生物。
制造的产品也可包括至少1种cpn60抗体以及使用抗体检测生物或非生物样品中微生物存在的说明，任选用于评估微生物分布。
在一个实施方案中，1种或多种cpn60抗体附着于微阵列(例如96微孔板)。例如，微阵列模式可包括多种通用和特异cpn60捕获抗体；通用和特异抗体可各位于不同孔位置。制造的产品也可包括适当检测抗体，如果需要，包括用于检测cpn60特异多肽与1种或多种捕获抗体结合的合适试剂(例如酶、底物、缓冲液和对照)。
在另一个实施方案中，制造的产品可包括1种或多种附着于纤维素试纸的cpn60抗体。这种纤维素试纸可用于例如检测液体样品中的cpn60特异多肽。
                          实施例
          实施例1-用通用引物和通用探针定量微生物生物体
从家禽GIT获得生物样品并使用标准方法提取基因组DNA(《诊断分子生物学：原理和应用》(同上))。进行实时PCR，使用的通用cpn60引物具有SEQ ID NO：6和SEQID NO：7所列核苷酸序列，通用cpn60探针具有序列5’-GACAAAGTCGGTAAAGAAGGCGTTATCA-3’(SEQ ID NO：8)，其5’末端用荧光素(荧光团；Molecular Probes，Inc.)标记且3’末端用dabcyl(淬灭剂；(4-(4’-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸)琥珀酰亚胺酯；Molecular Probes，Inc.)。此探针结合来自多种微生物种类的cpn60基因的可变区；因此来自扩增产物的探针的Tm可变化，取决于探针杂交的扩增产物内的核苷酸序列。
PCR反应包含3TL提取的DNA、lTM各通用cpn60引物、340nM通用cpn60探针、2.5单位Amplitaq Gold DNA聚合酶(Perkin Elmer)、0.25mM各脱氧核糖核苷酸、3.5mM MgCl2、50mM KCl和10mM Tris-HCl，pH8.0，总反应体积为50TL。PCR条件包括95℃10分钟的初始孵育，用于激活Amplitaq Gold DNA聚合酶，接着是40个循环的95℃30秒、50℃60秒和72℃30秒。监控40个循环中50℃退火步骤期间的荧光。循环步骤完成后，分析通用探针从扩增产物解链的温度。随着温度增加，通用探针在特定温度从扩增产物中释放，扩增产物来自各种类的cpn60序列，特定温度对应于通用探针和特定种类的cpn60序列的Tm。在特定温度逐步失去荧光用于鉴定存在的特定种类，与总荧光量相比，各步骤的荧光损失与各微生物的相对量关联。
         实施例2-用通用引物和种特异探针定量微生物生物体
从家禽GIT获得生物样品并使用标准方法提取基因组DNA(《诊断分子生物学：原理和应用》(同上))。进行实时PCR，使用的通用cpn60引物具有SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所列核苷酸序列，种特异探针具有核苷酸序列：
5’-AGCCGTTGCAAAAGCAGGCAAACCGC-3’(SEQ ID NO：9)；
5’-TTGAGCAAATAGTTCAAGCAGGTAA-3’(SEQ ID NO：10)；
5’-GCAACTCTGGTTGTTAACACCATGC-3’(SEQ ID NO：11)；
5’-TGGAGAAGGTCATCCAGGCCAACGC-3’(SEQ ID NO：12)；和
5’-TAGAACAAATTCAAAAAACAGGCAA-3’(SEQ ID NO：13)。
这些种特异探针分别与来自肠道沙门氏菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌、天蓝色葡萄球菌和空肠弯曲杆菌的cpn60核苷酸序列杂交。通过排列来自5种生物体的cpn60 cDNA序列鉴定探针序列并鉴别特异于各特定生物体的序列(即在其它生物体中没有发现的序列)。每个种特异探针用不同荧光部分标记以允许差异检测不同种类。
PCR反应包含3TL提取的DNA、1TM各通用cpn60引物、340nM通用cpn60探针、2.5单位Amplitaq Gold DNA聚合酶(Perkin Elmer)、0.25mM各脱氧核糖核苷酸、3.5nM MgCl2、50mM KCl和10mM Tris-HCl，pH8.0，总反应体积为50TL。PCR条件包括95℃10分钟的初始孵育，用于激活Amplitaq Gold DNA聚合酶，接着是40个循环的95℃30秒、50℃60秒和72℃30秒。监控40个循环中50℃退火步骤期间的荧光，波长对应于探针上的特定部分。在各监控波长检测到的荧光量与各cpn60扩增产物的量相关联。随后，每个种-特异扩增产物的量与各微生物种类的量相关联，这是通过与产生自样品的扩增产物的量相比较，样品包含从已知量的各微生物种类分离的核酸。
              实施例3-用于链球菌的纤维素试纸ELISA测定
构建含2条水平带的聚苯乙烯纤维素试纸：一条带由来自链球菌属的抗cpn60蛋白广泛反应、多克隆捕获抗体组成，而另一条带是内部对照，由辣根过氧化物酶组成。进行测定是通过连续稀释(1∶2、1∶5、1∶10等)取自高风险环境的液体样品(例如尿样或血样)，直接稀释到检测试剂中，在这些稀释度孵育湿润纤维素试纸5分钟，随后加入指示剂以检测cpn60蛋白与捕获(和检测)抗体的结合。检测试剂包括合适缓冲液和辣根过氧化物酶标记的cpn60链球菌检测二抗。指示剂可以是显色辣根过氧化物酶底物，如2，2’-连氮-双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸或ABTS。认为ABTS是安全、敏感的辣根过氧化物酶的底物，酶活性产生青绿颜色，能在450-410nm定量。在孵育和指示步骤结束时，用水(例如去离子水)冲洗纤维素试纸并通过目测来检测抗体带的染色。抗体带的染色显示样品中链球菌属的存在。内部对照带提供检查检测试剂的完整性。
                          其它实施方案
应理解尽管结合其详细描述对发明作了阐明，上面的描述旨在阐明而不是限制发明的范围，发明范围由所附权利要求的范围定义。其它方面、优点和修改都在下列权利要求的范围内。

Claims (53)

1.一种监控高风险环境有存在或缺乏1种或多种微生物的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)提供获得自所述高风险环境的样品；和
b)检测所述样品中cpn60标记的存在或缺乏，所述cpn60标记表明所述1种或多种微生物的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测步骤能提供所述样品的微生物分布。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物分布包括鉴定所述样品中的所述1种或多种微生物。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物分布包括定量所述样品中的所述1种或多种微生物的量。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在2个或更多点获得所述高风险环境的微生物分布。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述2个或更多点是时间点。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述2个或更多点是位置点。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括比较所述2个或更多点的所述微生物分布。
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括从所述高风险环境获得来自对照样品的对照微生物分布。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括比较所述对照样品微生物分布与所述样品微生物分布。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述cpn60标记是cpn60特异核酸或cpn60特异多肽。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述cpn60特异核酸是cpn60蛋白的基因组核酸编码序列。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述基因组核酸编码序列是染色体来源的。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述cpn60特异核酸是所述微生物的cpn60编码序列的扩增序列。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测步骤是以核酸为基础的测定。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述以核酸为基础的测定选自PCR和FISH测定。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测步骤的以多肽为基础的测定。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述以多肽为基础的测定是免疫诊断测定。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述免疫诊断测定是ELISA。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述以多肽为基础的测定包括质谱技术。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述以多肽为基础的测定包括表面胞质基因组共振技术。
22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自细菌、原生动物、立克次氏体和真菌。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述细菌微生物选自葡萄球菌、链球菌、假单胞菌、埃希氏菌、杆菌、布鲁氏菌、衣原体、梭菌、志贺氏菌、分枝杆菌、农杆菌、巴尔通氏体、疏螺旋体、慢生根瘤菌、埃利希体、嗜血杆菌、阳光杆菌、阳光杆菌、乳杆菌、奈瑟球菌、根瘤菌、链霉菌、聚球蓝细菌、发酵单胞菌、集胞蓝细菌、支原体、耶尔森氏菌、弧菌、伯克霍尔德氏菌、弗朗西丝氏菌、军团菌、沙门氏菌、双歧杆菌、肠球菌、肠杆菌、柠檬酸杆菌、拟杆菌、普雷沃尔氏菌、黄单胞菌、木杆菌和弯曲杆菌属。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述原生动物微生物选自棘阿米巴虫、隐孢子虫和四膜虫属。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述真菌微生物选自曲霉菌、剌盘孢霉菌、旋孢腔菌、长蠕孢菌、微环菌、柄锈菌、梨孢、次茎点霉菌、丛梗孢菌、假丝酵母和酵母。
26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述立克次氏体微生物选自伯氏考克斯氏体、五日热巴尔通体、五日热罗卡利马氏体菌、五日热立克次氏体、普氏立克次氏体和立氏立克次氏体。
27.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高风险环境例子选自零售食品式业设施、学校、医学环境、水设备、住宅、食品运输设备、加工设施或研究设施。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述零售食品业设施选自屠宰店、杂货店、餐馆、自助餐厅、娱乐场所和便利店。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述娱乐场所选自剧场、公园、动物园、溜冰场、表演场地、市中心区、博物馆和体育场。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述医学环境选自医院、医师办公室、牙科办公室、门诊部、疗养院、门诊病人设施、物理治疗设施、矿泉疗养地、手术室和医学诊断实验室。
31.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述水设备选自废水处理厂、饮用水设备、脱盐设备、再循环水设备、水产养殖设备、空调装置、增湿器、储水罐、喷水池、消防栓、浴盆、热浴、桑拿浴、蒸汽浴和水龙头。
32.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述食品运输设备选自卡车、机动有轨车和船。
33.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述加工设施选自食品加工设施、化学加工设施或生物加工设施。
34.如权利要求33所述的方法，其特征在于，所述食品加工设施选自屠宰场、包装设备、纯化工厂或发酵容器。
35.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是组织样品。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述组织样品是活检样品。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述组织样品取自动物擦的拭子。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述动物选自人、母牛、猪、马、山羊、绵羊、狗、猫、鸟、猴、鱼、蛤、牡蛎、贻贝、龙虾、小虾和螃蟹。
39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述组织样品选自眼、舌、颊、蹄、喙、口鼻部、足、手、嘴、乳头、胃肠道、羽毛、耳、鼻、粘膜、鳞、壳、软毛和皮肤。
40.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品包括污染物。
41.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品来源于所述高风险环境中存在的污染物。
42.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是食物样品。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述食物样品是配制的食物样品。
44.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述食物样品是生的。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述食物样品是煮过的。
46.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述食物样品是易腐的。
47.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述食物样品选自牛肉、猪肉、家禽、海鲜、奶制品、水果、蔬菜、种子、坚果和真菌状物类。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述乳品样品选自牛奶、蛋和干酪。
49.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样品是液体样品。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述液体样品选自水样品、血液样品、尿样品、泪样品、汗样品、唾液样品、淋巴样品和脑脊液样品。
51.一种制造的产品，其特征在于，所述产品包括：
至少1种cpn60抗体，其中所述cpn60抗体附着于固体支持物；和
指示分子。
52.如权利要求51所述的产品，其特征在于，所述产品进一步包括使用所述cpn60抗体检测含cpn60分子的说明。
53.如权利要求51所述的产品，其特征在于，所述固体支持物是纤维素试纸。
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