CN1727003A - 致癌物的解毒方法与解毒成分 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能在体内和特定致癌物接合的蛋白质成分，可应用于药品、食品和化妆品；特别是在药品或食品或化妆品中加入此蛋白质成分来接合benzo(a)pyrene(苯并芘)；此外，这个发明也包括使用此蛋白质成分来治疗或预防癌症的方法，更包括加入此蛋白质作为治疗药物。

Description

致癌物的解毒方法与解毒成份

技术领域

本发明涉及一种能在体内和特定致癌物接合的蛋白质成份，可应用于药品、食品和化妆品；特别是在药品或食品或化妆品中加入此蛋白质成份来接合benzo(a)pyrene(苯并芘)。此外，这个发明也包括使用此蛋白质成份来治疗或预防癌症的方法，更包括加入此蛋白质作为治疗药物。

背景技术

Benzo(a)pyrene(苯并芘)，简称BaP，是一种致癌物，具有下列分子式：

BaP是后经由燃烧有机物质而产生；在炼油厂，钢铁厂工作的工人及从事炼铝材工作的人有很高的致癌机率，这和长期暴露于各种含有BaP的多环芳香碳水化合物(polycyclic aromatic hydrocarhons)(PAHs)的环境有关[1]，BaP经由扩散进入细胞接在芳香族羟基碳水化合物的接受器(aryl hydrocarbon receptor)(AhR)，再转进到细胞核使CYP1A1基因活化[2-4]，已知的一种BaP代谢产物名为BPDE(7，8-dihydrodiol-9，10-epoxide)能使去氧核醣核酸形成并拢结构(DNAadducts)而导致基因突变[5]，甘氨酸甲基转移脢(Glycin n-methyltransferase)(GNMT，EC2.1.1.20)，是具有多种功能的蛋白质，能通过a)调节SAM变成顺式腺甘高胱铵酸S-adenosylhomocystine(SAH)和b)接合叶酸[6，7]，来影响基因的稳定性，发明人先前就有提出GNMT在肝癌细胞株及肿瘤组织中表现量减少的报告[8，9]，在先前的科研计划中已提出GNMT基因存在染色体的6p12位置并具有多态性的特性[10，11]，对几个人类GNMT基因进行多态性的基因型分析，结果显示在肝癌组织中有36～47％的异型性基因标记遗失现象[11]。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足于缺陷，提供一种可添加于药物、食品和化妆品的成份，用此成份来治疗或预防癌症，尤其是哺乳动物的肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、脑癌、乳癌及肾癌，包含人类。

本发明的另一目的在于提供一种新颖的GNMT用途，用于当作人类或动物的治疗药物。

本发明的还有一目的在于提供一种预防或治疗BaP导致癌症的方法，特别是哺乳动物的肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、脑癌、乳癌及肾癌，包含人类。

这些目的的解释和主张专利权相同；能和Benzo(a)pyrene接合的活性蛋白质成份及媒介物质所组成的药物、食品和化妆品，通过蛋白质是依靠SAM的甲基转移脢或是保有此相同功能的变形或片段的理论，达成和专一性的和Benzo(a)pyrene接合在SAM的接合位置。据此发明中所说的甲基转移脢成分，比较好是GNMT，Hhal-DNA MTase，Haelll-DNA MTase或Pvull-DNA MTase，此甲基转移脢成分最好是GNMT(Chen YM，Chen LY，Wong FH，Lee CM，Chang TJ，Yang-FengTL.Genomics.2000May 15；66(1)：43-7.PMID：10843803[PubMed-indexed for MEDLINE])，GNMT具有下列胺基酸序列：

1-MVDSVYRTRSLGVAAEGLPDQYADGEAARVWQLYIGDTRSRTAEYKAWLL-50

51-GLLRQHGCQRVLDVACGTGVDSIMLVEEGFSVTSVDASDKMLKYALKERW-100

101-NRRHEPAFDKWVIEEANWMTLDKDVPQSAEGGFDAVICLGNSFAHLPDCK-150

151-GDQSEHRLALKNIASMVRAGGLLVIDHRNYDHILSTGCAPPGKNIYYKSD-200

201-LTKDVTTSVLIVNNKAHMVTLDYTVQVPGAGQDGSPGLSKFRLSYYPHCL-250

251-ASFTELLQAAFGGKCQHSVLGDFKPYKPGQTYIPCYFIHVLKRTD-295SEQ ID No.：1

GNMT胺基酸序列已寄存于EMBL/Gene Bank数据库，登录号码为AF101475，此发明是基于确认GNMT是甲基转移胞家族中的一特殊成员能参予至癌物BaP的解毒路径，特别是基于确认BaP能在活体内经由SAM的接合位置被GNMT及其它依靠SAM的甲基转移脢(MTases)接合，利用胞嘧啶的量作为指针显示BaP能快速的和DNA甲基转移脢接合；当基因转殖鼠的GNMT过度表现时给予BaP，只有30％的基因转殖鼠产生肝癌；但没有过度表现GNMT的正常鼠，在相同处理下有67％的正常鼠产生肝癌，由此得知，GNMT能在活体内接合BaP，防止癌症产生。

本发明也提供依靠SAM的甲基转移脢的使用方法，或是保有此相同功能的变形或片段的理论能和Benzo(a)pyrene接合在SAM的接合位置，用于生产药剂来治疗或预防癌症，尤其是哺乳动物的肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、脑癌、乳癌及肾癌，包含人类。此成分可能口服或局部给予或非口服的方式给予；此发明中所说的甲基转移脢成分，比较好是GNMT，Hhal-DNA MTase，Haelll-DNA MTase或Pvull-DNA MTase，此甲基转移脢成分最好是GNMT。

本发明的还有一目的在于提供一种预防或治疗BaP导致癌症的方法，通过给予个体有效剂量的依靠SAM的甲基转移脢或是保有此相同功能的变形物或利用片段的理论产生能和Benzo(a)pyrene接合在SAM的接合位置的物质，达成专一性的和Benzo(a)pyrene接合在SAM的接合位置。直接将此依靠SAM的甲基转移脢或是保有此相同功能的变形物或利用片段的理论产生能和Benzo(a)pyrene接合在SAM的接合位置的物质给予个体，或通过载体带有此蛋白质密码进入体内表现此蛋白质成分。

附图说明

图1为细胞经由BaP处理后GNMT改变在细胞核的位置。其中：

图A和图B：在转殖pGNMT基因的HA22T/VGH细胞上进行双重免疫萤光染色来侦测GNMT，图A：加抗GNMT的抗体；图B：加抗flag的小鼠抗体；图C至F：在转殖pGNMT基因的Huh 7细胞进行免疫萤光染色(C和D加入DMSO溶剂)，(E和F加入BaP)，先加抗flag的抗体反应在由带有Rhodamine的山羊抗体(A)或带有FITC的山羊抗体产生萤光(B-F)再使用Hoechst H33258将细胞核染色。

图2为GNMT对BPDE-DNA形成并折结构的影响。其中：

(A)利用³²P标定及薄膜色层分析定出BPDE-DNA并折结构的总数；Lane 1，加DMSO溶剂控制组；lane 2，空白组；lane 3，转殖40μg控制载体(pFLAG-CMV-5)的细胞；lane 4，转殖40μg pGNMT载体的细胞；lane 5，转殖40μg pGNMT-antisense载体的细胞；lane 6，转殖20μg pGNMT载体和20μg pGNMT-antisense载体的细胞，经由10⁸核苷酸将DNA并折结构定量(DNA并折结构的相对量，RAL)，：lane 1，0；lane 2，1031.7；lane 3，1092.4；lane 4，719.8；lane 5，1411.3；lane6，1079.7。

(B)利用西方点墨法分析GNMT在Hep G2细胞的表现量；(lane 1)转殖控制载体(pFLAG-CMV-5)的细胞，(lane 2)转殖pGNMT，(lane3)转殖pGNMT-antisense，(lane 4)转殖pGNMT/pGNMT-antisense.下面一排是四种条件下肌动蛋白的表现量。

(C)在经由1或10μM BaP处理后的Hep G2，SCG2-1-1及SCG2-1-11细胞中BPDE-DNA并折结构的总数；Lanes 1和4：HepG2细胞经由1或10μM BaP处理；lanes 2和5：SCG2-1-1细胞经由1或10μM BaP处理；lanes 3和6：SCG2-1-11细胞经由1或10μM BaP处理；经由10⁸核苷酸将DNA并折结构定量(RAL)：lane1，161.9；lane 2，26.4；lane 3，55.2；lane 4，682.1；lane 5，354.9；lane 6，506.5。

(D)利用西方点墨法分析GNMT在Hep G2细胞的表现量(lane 1)，在SCG2-1-1细胞的表现量(lane 2)and在SCG2-1-11细胞的表现量(lane 3).胶体电泳时每种细胞加入20μg细胞均质液，下面一排是不同种条件下肌动蛋白的表现量。

图3为在转殖Ad-GFP和不同量Ad-GNMT基因的Hep G2细胞中GNMT对BPDE-DNA形成并折结构的影响。其中：

(A)lane 1.转殖Ad-GFP的细胞，经由DMSO溶剂处理；lane 2，转殖Ad-GFP的细胞，经由BaP处理；lane 3，转殖100MOIs的Ad-GNMT的细胞，经由BaP处理；lane 4，转殖250MOIs的Ad-GNMT Ad-GFP的细胞，经由BaP溶剂处理；lane 5，转殖1,000MOIsof Ad-GNMT的细胞，经由BaP处理；.经由10⁸核苷酸将DNA并折结构定量(DNA并折结构的相对量，RAL)，lane 1，0；lane 2，638.9；lane 3，514.2；lane 4，405.3；lane 5，224.3。

(B)利用西方点墨法分析在相同实验条件下细胞GNMT的表现量；Lane 1，Ad-GFP控制组；lane 2，Ad-GNMT(100MOIs)；lane 3，Ad-GNMT(250MOIs)；lane 4，Ad-GNMT(1,000MOIs)。

图4为利用芳香族碳水化合物氢氧脢(AHH)方法分析在SCG2-neg和SCG2-1-1细胞中BaP诱导的细胞色素p450 1A1(CYP1A1)酵素活性。其中Lanes 1-4，在SCG2-neg细胞中CYP1 A1酵素活性；lanes5-8，在SCG2-1-1细胞中CYP1A1酵素活性。处理方式：lanes 1和5，DMSO溶剂处理；lanes 2和6，3μM BaP；lanes 3 and 7，6μM BaP；lanes 4and 8，9μM BaP。CYP1A1酵素活性平均值(pmol/mg/min)和标准差：lane 1，14.5(0.27)；lane 2，24.47(0.14)；lane 3，41.5(1.42)；lane 4，71.3(1.75)；lane 5，16.2(3.6)；lane 6，20.1(1.5)；lane 7，27.7(1.2)；lane 8，36.2(1.7)。

图5为利用Lamarckian基因算法作出BaP和双体及四联体GNMT接合的模型。

BaP(红色)和四联体的大鼠GNMT(cyan，1D2H)接在合SAH(白色).(B)BaP(红色)和双联体的大鼠GNMT(yellow，1D2C).(C)双联体的GNMT(yellow)叠加在四联体的GNMT(cyan).GNMT铵基酸支炼(Ile34，Thr37，Gly137，His142，Leu240在一个双联体和Glu15在另一个双联体)指出几个接进BaP碳原子的位置1D2C和接合的模型。

图6为BaP抑制GNMT酵素活性。DMSO溶剂处理后GNMT酵素活性为2810.8±73.7nmol/hr/μg；10μM BaP处理后GNMT酵素活性为1563.3±127.4nmol/hr/μg  ；50μM BaP处理后GNMT酵素活性为1069.5±124.210μM；100μM BaP处理后GNMT酵素活性为1083.3±175.9nmol/hr/μg.每个反应都做作三重复。

图7为pPEPCKex-flGNMT质体架构.pPEPCKex(载体)和pSK-flGNMT(崁入片段)经由Not I和Xho I处理及接合形成pPEPCKex-flGNMT架构。

图8为正常鼠和基因转殖鼠的北方点墨法结果。

图9为正常鼠和基因转殖鼠的西方点墨法结果。

图10为给予BaP 78周的GNMT基因转殖鼠(A)和正常鼠(B)肺脏病理切片。

具体实施方式

本发明用于防治人体疾病的配方，其成分和方法多与苯并芘(BaP)诱发的致癌物质有关。配方中所含的治疗和预防疾病的成分至少包括一个依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的转甲基酶或一个功能内敛的变体或片断，并具有一个专与苯并芘结合的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)。该配方成分中所含的转甲基酶蛋白质可能是一种分离的、纯化的蛋白质，基本上不含其它任何种类的蛋白质或杂质。转甲基酶蛋白质也可以以一种混合物的形式包含在该配方的成分中，这种混合物从一种天然源中提取，比如，当作一种提取物。如果成分中包含一种取自天然源的混合物，那么该配方成分中所含的转甲基酶蛋白质(存在于浓缩物中)的浓度高于天然源中的转甲基酶的浓度。浓缩物中所含转甲基酶的浓度比天然源中转甲基酶的浓度最好至少高两倍，高出3到1000倍则更好。

依据该配方的成分能够治疗或预防癌症(carcinogenesis)，只要将该成分用于某种治疗方案下的病人。该配方的成分和方法可能会被用来治疗与苯并芘(BaP)致癌物质和其中的衍生物相关的疾病。在案例中所描述的活体试验证明了可将甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)用作转甲基酶的某特定基类的一种成分，来成功防治癌症。该基类的特点是具有一个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域，可同时选择性地结合苯并芘(BaP)。

根据这一配方，“蛋白质”指的是一个确定的氨基酸残基序列，该序列最好由大约不超过1000个的氨基酸残基组成，并且至少由大约50个氨基酸残基组成，最好由至少大约100个氨基酸残基组成，更好的情况是由大约至少150个氨基酸残基组成，以满足长度方面的要求。同时，当氨基酸残基如果是从某转甲基酶中衍生出来，则和整个转甲基酶的氨基酸序列中所含的氨基酸残基数量相同，或者前者少于后者，而且在某个特定的形体中，不多于整个蛋白质中氨基酸残基数量的95％，但是包括一个有效的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域。依照本配方的要求所使用的蛋白质中至少有一个S-腺苷甲硫氨酸结合结构域。

在活体试验中，S-腺苷甲硫氨酸结合结构域是识别苯并芘(BaP)和结合苯并芘(BaP)所必需的最基本成分或最小单位。通常认为在活体试验中，S-腺苷甲硫氨酸结合结构域与苯并芘(BaP)结合，从而避免苯并芘(BaP)扩散到细胞中，与芳香碳氢化合物受体(AhR)结合，置换进入细胞核，或反式激活细胞色素氧化酶基因(CYP1A1)。因此，依赖S-腺苷甲硫氨酸的转甲基酶或功能内敛性变体或片断，并具有一个专与苯并芘结合的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)，对防治癌症是有益的。根据本配方，首选的蛋白质是甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)。在对接模型中的甘氨酸N-甲基转移酶GNMT(物理数据库：1D2C)和苯并芘(BaP)的接触距离如参考表1所示，以此说明甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)的一个结合袋。

参考表1：

GNMT...BaP接位(Contact)	Distance距离(A)
		A19(Met)CE    C6	3.72
A37(Thr)OG1   C11	3.38
		A37(Thr)OG2   C9	3.43
A137(Gly)O    C16	3.05
		A137(Gly)O    C1	3.38
A 142(His)NE2 C4	3.22
		A 142(His)NE2 C2	3.40
A191(Asn)ND2  C14	3.24
		A283(Tyr)OH   C15	3.74
B15(Glu)OE2   C7	3.38
		B15(Glu)OE1   C7	3.58

依照此配方(可以预防或延缓苯并芘(BaP)所诱发的疾病症状的开始)制定的治疗/预防性治疗方案包括注入本配方中的某种成分，其中包括至少一个依赖S-腺苷甲硫氨酸的转甲基酶或功能内敛性变体或片断，并具有一个专与苯并芘结合的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)。使用本配方中的某成分可以是：

(a)结合固体或液体食物或流体(如烟或水蒸气)中所存在的苯并芘(BaP)或其中的衍生物，人们在将苯并芘(BaP)吞入体内前就暴露在那些环境下。

(b)结合人体内的苯并芘(BaP)或衍生物。

本配方的成分和方法对治疗哺乳动物包括人类体内的癌症是有效的，如肝细胞瘤、肺癌、膀胱瘤、前列腺癌、结肠癌、脑瘤、乳癌及肾癌。

具有一条确定的氨基酸残基序列的蛋白质可能包含一条已知转甲基酶的氨基酸序列，如甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)有一条氨基酸序列，如序列身份号1号所示。同时，上述的氨基酸残基包括至少一个依赖S-腺苷甲硫氨酸的转甲基酶(具有一个专与苯并芘结合的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域)或功能内敛性变体。

另外，具有确定氨基酸组成成分并且由至少一个会专门结合某个依赖S-腺苷甲硫氨酸的转甲基酶或其中功能内敛性片断或变体的苯并芘(BaP)的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域的蛋白质可能会因其中任何已知的转甲基酶，包括甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)而被识别出。一种用来提供功能内敛性片断的方法包括将该蛋白质按照所希望的长度分为不相重叠或相重叠的缩氨酸，并合成、纯化和测试那些缩氨酸，以确定这些缩氨酸是否由至少一个会专门结合苯并芘(BaP)及其中的衍生物的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域组成。另一种方法运用一个运算法则来预测那些可能包括一个会专门结合苯并芘(BaP)的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域的缩氨酸，然后在细胞化验中合成、纯化和测试运算法则所预测的这些缩氨酸，例如，如现在的例子所描述的那样，以确定是否这些预测的缩氨酸会专门与苯并芘(BaP)结合。蛋白质与甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)相比最好具有同等或更强的结合苯并芘(BaP)的能力。依照本配方，首选有用的蛋白质片断包括至少一个会专门结合苯并芘(BaP)的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域。

也可依照本配方的要求改变上述的任何蛋白质的结构，将其用作一个功能内敛性变体，以达到如下目的，如：增加溶解度(如果将要注射该成分，这种方法则尤为可取)，提高治疗或预防的功效或稳定性(如活化试验前的保存期限及活化试验中对蛋白水解降解的抵抗力)。功能内敛性变体可以在氨基酸序列被改变的情况下产生，氨基酸序列与母体蛋白质序列相比较发生了变化，而氨基酸序列是从蛋白质序列中衍生出来的，或者与蛋白质片断相比较也发生了变化，蛋白质片断可通过如下方式改变，氨基酸置换、删除或增加，来改变苯并芘(BaP)的结合能力，或在片断上增加一种成分，以达到相同的目的。

根据本配方，该成分可基于一种混合物进行准备，该混合物中包含一种取自某天然源的转甲基酶蛋白质。含取白天然源的转甲基酶蛋白质可通过任何适当的手段获取，如从某一合适的原材料中提取。合适的天然源可能要基于微生物或动物。在本配方中，转甲基酶不一定非要提纯隔离，只要混合物中所含的转甲基酶是活性酶，可以结合苯并芘(BaP)。因此，可以照这样使用混合物，只要转甲基酶呈现的浓度足够高，可以提供必要的活性。

依照本配方，含甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)的混合物可以基于某种微生物提取，特别是从微生物中抽取酵母或混合物。

依照本配方，含甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)的混合物可基于动物的某个器官提取。可选择的合适的动物包括猪、牛或兔。可选择的合适的动物器官包括肝脏、胰腺或前列腺。

本配方所需的蛋白质可以从某自然源中提取获得，成为提取物，可使用标准手段或方法提取，如用某种适当的溶剂接触材料以准备获得一种酊剂，或使用其它任何常规的手段或方法，如二氧化碳提取、冷冻干燥或喷洒-烘干(见杰纳洛AR：雷明顿，《配药科学与实践》，马克出版公司，宾西法尼亚州伊斯顿市，1995年和《美国药典》(第22版)以及《国家处方一览表》(NF)(第17版)，美国专利大会，马里兰州洛克维尔市，1990年。)

可利用微生物或其中的同源物质，动物器官或其中的同源物质准备提取物。上述所有物质或物体中均包含本配方所需的蛋白质。还需使用一种溶剂，可能是水，如蒸馏水，水溶剂，如磷酸缓冲剂、食盐水或与其它溶剂相混合的水，可能是有机溶剂，如二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)或酒精，如乙醇(ethanol)或异丙醇(isopropanol)，或其中的任何组合。由此产生的提取物基本上是由一种湿润的或液体成分和一种固体成分组成。

不含其它任何多肽和污染物质的并具有一个确定的氨基酸残基序列的高纯缩氨酸包括至少一个会专门结合苯并芘(BaP)的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域。这些缩氨酸可通过标准的方法化学合成。已知的化学合成缩氨酸的方法各种各样，包括固相合成，在这种方法下蛋白质被稳定到一个聚合体支撑上(固相合成)或通过常规的同质化学反应(溶解合成)。接着，利用蛋白质纯化相关的文献中所列的方法可以将合成的缩氨酸纯化到同质的程度(即至少90％，更好的是至少95％，甚者至少是97％的纯度)，可随意除去其它任何多肽和污染物质。

依照某产生高纯度同质缩氨酸成分的形体，通过化学合成手段制造的蛋白质可以通过准备性的反相色谱法(chromatography)提纯。按照这种方法，天然状态的合成缩氨酸溶解于适当的溶剂中(一般是水缓冲剂)并涂到一个隔离柱上(一般是一个反相硅土基于的培养基，另外，基于聚合体或碳的培养基也可以使用)。缩氨酸从柱子上洗提，方法是增加水缓冲剂(一般是三氟乙酸(TFA)、三乙胺磷酸盐(triethylamine phosphate)、醋酸盐(acetate)或类似的缓冲剂(similarbuffer))中有机成分(一般是氰化甲烷或甲醇)的浓度。洗出液成分会通过适当的分析方法(一般是反相高性能液体色谱或毛细管区域电泳法色谱法)收集和分析。具有必需同质的那些成分将集中在一起。其中存在的抗衡离子可以通过另外的反相色谱法在精选的盐中改变或通过离子交换树脂改变。接着，缩氨酸可能以醋酸盐或其它适当的盐类形式分离开。接着，过滤缩氨酸，除去其中的水分(一般是通过栋干法)以获得一种同质的缩氨酸成分，其中包含至少90％，更好的是至少95％，甚至至少97％的必需的缩氨酸成分。也可以选择采用亲和色谱法、离子交换法、分子排阻法、反向电流或正常的相位分离系统或任意组合这些方法，与上述的反相高性能液体色谱法一起完成纯化过程。还可以进一步浓缩缩氨酸，方法包括超滤、旋转蒸发、沉淀、透析或其它类似的方法。

高纯同质缩氨酸成分可能是通过任何以下方法或方法的组合形成的：a)质谱分析法，通过确定分子量来检查缩氨酸的同构型；b)氨基酸分析法，通过氨基酸组成成分检查缩氨酸的同构型；c)氨基酸序列法(利用自动蛋白质序列分析仪或手动分析)，确认氨基酸残基的确定序列；d)高性能液体色谱法(如果需要的话使用多系统)，检查缩氨酸的同构型和纯度(如识别缩氨酸中的杂质)；e)水成分法，确定缩氨酸成分中的水浓度；f)离子成分，确定缩氨酸成分中盐类的存在；g)剩余有机物，检查剩余有机试剂、原材料和/或有机污染物的存在。

此发明配方中的合成缩氨酸的长度大约为50个氨基酸残基的长度，更好的情况是由大约30个氨基酸残基组成，这样的缩氨酸尤为理想，因为缩氨酸长度越长，缩氨酸合成的困难就越大。更长的缩氨酸可通过下述的重组去氧核糖核酸方法产生。

对本配方的方法有用的蛋白质可以通过运用重组去氧核糖核酸(DNA)的方法在接受体细胞中制造，通过为这样的缩氨酸设定核酸序列编码进行改变。在用重组方法制造蛋白质，用核酸编码的方法改变接受体细胞时，所需要的缩氨酸被培养在一个适合细胞的培养基中，而隔离的缩氨酸可从细胞培养基、接受体细胞或两者中得到纯化，所用的方法是已知的纯化缩氨酸和蛋白质的方法，包括离子交换色谱法、超滤、电泳或免疫净化法，带有针对所需缩氨酸的抗体。

还可以通过化学或酶分解高纯全长或天然蛋白质的方式制造蛋白质，其中化学消化或酶分解的场所已预先确定，由此发生的消化过程是可再生的。分解可以通过酶消化至少一个蛋白酶或其它活生物体内的合适的酶来完成。蛋白酶可以在国际生物化学与分子生物学联盟属下的税则分类委员会所提供的列表上选择，网址是http://www.chem.qmw.ac.uk/iumbmb/enzvme/EC34，还可供选择的地点包括蛋白酶数据库列表，网址是 http://www.merops.co.uk及罗琳斯ND和巴勒尔AJ蛋白酶数据库：肽酶数据库；核酸查找28323-325(1998)，以及巴勒尔AJ、罗琳斯ND和沃森尔JF(编)，《蛋白质水解酶手册》，伦敦学术出版社，1998年。具有确定氨基酸序列的蛋白质可以有高纯度和隔离，在酶消化或化学消化中不含其它任何多肽或污染物，无论用上述的任何程序都是如此，都可获得高纯而隔离的合成或重组制造的缩氨酸。

根据本配方，隔离的纯蛋白质含蛋白质的混合物可以包含在所配方的药物、食物或化妆品成分中，以便于预防或治疗包括人类在内的哺乳动物体内的疾病。

本配方中治疗或预防疾病的成分是用于口头或肠胃外投药或局部滴旋的成分。这些成分最好通过口服或局部滴旋的方法施用。

此类配方中的药物成分可能是以常规的药物口服剂型的形式呈现，如药片、颗粒、粉末、胶囊、凝胶体、糊、糖浆、饮剂、气溶胶、眼药水或喷雾。药物成分也可能包含在香烟的过滤嘴中，该成分可在人体吸入烟气前结合苯并芘(BaP)。食物中的成分通常是以常规的功能食物食品或食物补充物的形成出现，如糖果、其它糖果原料、饮料。化妆品中的成分通常以面霜、油膏、洗发香波、染发剂或香膏的形式呈现。

除一个依赖S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的转甲基酶或其中的一个功能内敛性变体或片断，其中包含一个专与苯并芘结合的S-腺苷甲硫氨酸结合结构域(SAM-binding domain)以外，配方的成分中还包含一个载体。该载体可能是一种常规的药物、食物或化妆品载体。这种载体可能以任何种类的形式呈现，如粉末、凝胶体、糊、药片、胶囊、口香糖、止咳糖、气溶胶和流体。例如，这种载体可能是糖果、可咀嚼的口香糖或是香烟的过滤嘴。载体中可能包括一种添加剂，以便于在口腔中的使用，如肌理增强剂、咀嚼增强剂、增稠剂和粘性增强剂。载体中可能也包括调味料，如甜料(食糖、糖醇、糖精或阿斯巴甜糖等)，天然或人造调味料或油类，如水果、香料或草药香料或油类(桂皮、薄荷糖或丁香油等)等等，叶绿素和/或色素，如任何适合的常规着色剂。

在口服药时，可能需要在含本配方中蛋白质的成分表面涂上一层材料，或与该材料共同服用，来防止蛋白质的钝化或增强其吸收和生物药效率。例如，蛋白质药物成分可以与酶抑制剂或放在脂质体中一道服用。酶抑制剂中包括二异丙基(DEP)、胰岛素抑制剂和抑制酶(trasvlol)。脂质体中包括水-油-水亲水型有机硅织物整理(CGF)乳剂以及常规的脂质体(比较斯特勒安等人，(1984年)J.《神经免疫学》，7：27)。当蛋白质获得适当的保护时，可以口服该蛋白质，例如，带有一种惰性稀释剂或一个可同化食用的载体。蛋白质和其它成分也可以包含在坚硬或柔软壳状凝胶胶囊中，压缩成药片或直接纳入个人的饮食中。

如果配方中的治疗成分将通过注射(即皮下注射)施入体内，那么高纯蛋白质最好可溶解于水溶液中，水溶液的pH值在药学上是可接受的(即pH值范围大约在4-9的间)，这样成分就是流体，因此容易注入。成分中最好还包括一个药学上可接受的载体。这里所用的“药学上可接受的载体”包括任何以及所有的赋型剂、溶剂、缓冲剂、吸收延缓或增强剂、表面活化剂和胶态离子形成剂、油脂、脂质体和液体合成形成剂、稳定剂等等。在药物活性物质上使用此类媒介和剂在医药科学中是已知的。除非任何常规的媒介或药剂与活性化合物不兼容，这样使用治疗成分都是在预料中的。附加的活性化合物也可以被纳入进成分中。

本配方中的治疗成分也可以无菌水溶解的形式形成，水溶液的准备方式是将活性化合物(即上述的一种或多种高纯隔离蛋白质)按照所需量置于一个适当的媒介中，并按照要求加入上面或下面所列举的一种成分或成分的组合，然后是过滤杀菌。理想的药物可接受的载体包括至少一种赋型剂，如无菌水、磷酸钠(sodium phosphate)、甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)或氯化钠(sodium cloride)或其中的任意组合物。其中可能合适的药物可接受的载体包括溶剂或驱散媒介，例如，含水、乙醇(ethanol)、多羟基化合物(polyol)(如甘油(glycerol)、丙二醇(propylene glycol)和液态聚乙二醇(liquidpolyethylene glycol)等等)，其中合适的混合物及植物油。可通过多种方法维持适当的流质，如使用诸如蛋黄素(lecithin)的涂层，如果是驱散就维持必需的颗粒大小以及使用表面活化剂(surfactants)。要防止微生物的活动也可以通过施用各种抗菌和抗真菌剂实现，如对苯类(parabens)、氯丁醇(chlorobutanol)、苯酸(phenol)、抗坏血酸维生素C(ascorbic acid)、thirmerosol等。延长可注射成分吸收的方法有：在成分中包括进一种延缓吸收的药剂，如单硬脂酸铝和白明胶。

在生产、储藏、配送和使用的过程中，此发明的治疗性化合物应保持无菌且稳定，并且应保存于可防止如细菌和霉菌等微生物污染的环境中。此发明的治疗性化合物的制作方法期能保持化合物的纯净，如防止污染和延长保存期限等；设计蛋白质和药学上可接受的载体的结构，让化合物可呈一种冻干的粉末形式。此种粉末重新组成后，在如无菌水等药学上可接受的载体中使用。在无菌血管注射剂配方中的无菌粉的情形下，较合适的调配方式有：真空干燥、冷冻干燥或旋转干燥。旋转法会产生一种活性物质的粉末，还有其它的前无菌过滤后，药剂中所欲留的物质。专利的治疗性化合物的详细配方，将于之后的

实施例部分加以描述。

在许多情况下，此发明的治疗性化合物会由一种以上的分离蛋白质组成。适合施用在人体药品的多蛋白组成的治疗性化合物，可能适于数种活性蛋白的应用。此多蛋白配方包含，二种或更多种有清晰氨基酸序列的分离蛋白质。在调制多蛋白的配方时，需要特别注意的事项包含：在物理学上可接受的酸碱值下，维持水溶液中所有的配方里，蛋白的溶解度和稳定度。如此一来便需要一种或是多种药学上可以接受的溶剂和赋形剂，它们必须在此多蛋白配方中与所有的蛋白并存。举例来说，适用的赋形剂包括无菌水、mannitol以及磷酸钠(sodiumphosphate)，或是兼用mannitol和sodium phosphate。另一个多蛋白配方注意事项是，在必要时，应预防蛋白质的双聚体化(dimerization)。多蛋白的配方中可加入防止双聚体化(dimerization)的媒介，例如EDTA或其它物质，也可能使用其它可以防止双聚体化(dimerization)的程序。

下列是利用此发明，可能组成的药物成份配方

GNMT：                           0.75mg protein

Buffer(缓冲剂)：                 saline(0.9％NaCl)(盐类)

Bulking agent(溶剂)：            glycerin(甘油)

Stabilizer(稳定剂)：             phospholipids(0.1％)(磷脂质)

其中缓冲剂也可能是100mM phosphate(磷酸盐)，溶剂也可能是mannitol(甘露蜜醇)and dextrose(葡萄糖)。

如上所述的治疗性化合物应用在临床时，可以通过给药时的已知程序执行，并且持续一段时间，以产生预防效果或者对人体的癌化治疗发生效用。

本发明的治疗性化合物所产生的效用，会因个人年龄、性别和体重的差异而有所不同。其中的治疗性化合物施用可能经由口服、注射(皮下、静脉等)、舌下、吸入、皮肤渗透、通过直肠或其它常见的治疗性施用媒介。本发明中一种或是更多的的治疗性化合物，在临床使用的治疗效果，可能会是同时或接续施用者所欲见。如上述，每一个这种同时或接续施用的化合物，可能个别由单一或多种蛋白构造组成。

对于非口服施用本发明一种或更多的化合物，每施用单位中的建议每种活性元素(蛋白)用量在0.01μg-500mg，并且最好是从0.3μg-50mg。对于口服施用本发明中一种或更多的化合物，每施用单位中的建议每种活性元素(蛋白)用量在0.01μg-500mg，并且最好是0.3μg-50mg，并且最好是从0.3μg-50mg。为了施用与下药统一，配制单位用药形式的非口服或口服化合物，是更有助益的。所谓单位用药形式是指完全分离的单位，刚好适合接受治疗的人体所需的单一剂量；每一单位含有预先决定的活性蛋白量，此量值的计算是要配合选出的药用载体，产生预期的治疗效果。此种新式的单位用药形式的细节，是由以下项目侦测并直接靠它们决定：1.)活性化合物的特点与欲达成的特定治疗效果。2.)在混合以人体为治疗对象的活性化合物时，所产生的限制。

为了达到最佳的治疗成效，给药方式可能会有调整。例如在数天、数周、数月或数年的疗程中，可能为有几种分别的用药方式，或者按照治疗情形所需的迫切需要，药物的比例可能会因之后的注射有所增减。在建议的给药方式中，治疗性化合物的皮下注射应在一到三周的期间内，每周施行一次。每次给药的药量维持一致，或者依每次随后的用药增减。

以下的非限制性实施例，将进一步说明本发明：

举例说明

举例1(活体内测试)

1.方法与材料

1.1细胞株与培养。此次实验选用Huh 7(13)和HA22T/VGH(14)两株肝癌细胞株及Hep G2)肝胚胎癌细胞株，细胞培养液为Dulbecco′smodified Eagle′s medium(DMEM，GIBCO BRL，Grand Island，NY)加入10％加热去活处理后的小牛血清(HyClone，Logan，Utah)，penicillin抗生素(100IU/ml)，streptomycin抗生素(100μg/ml)，非必需铵基酸(0.1mM)，fungizone(2.5mg/ml)and L-glutamine(2mM)培养于5％CO₂湿式培养箱为。

1.2pGNMT，pGNMT-antisense及pGNMT-His-short的质体架构。为了架构含有CMV激活子及GNMT cDNA的pGNMT质体，我们使用pFLAG-CMV-5(Kodak，Rochester，NY)作为载体，以及pBluescript-GNMT-9-1-2嗜菌体质体(8)当作DNA聚合脢炼锁反应的模版来产生插入片段，然后大量作出一个含有GNMT cDNA及两端酵素切位的0.9kb DNA片段。所有的DNA聚合脢炼锁反应都按照制造厂的建议执行(Perkin Elmer，Norwalk，CT)只有两个条件例外：2mM的MgCl₂和150nM的引子.使用Perkin Elmer的AmplitaqGold Taq DNA聚合脢及DNA温度循环机执行二十个放大循环，每一个DNA聚合脢炼锁反应限定引子炼合步骤必须在60℃执行30秒而且延伸步骤必须在72℃执行30秒，上游的引子(5′-gcggaattcATGGTGGACAGCGTGTAC-3′)包含一个3碱基对的″夹钳″(gcg)在5′端尾随一个酵素切位(EcoRI)和GNMT cDNA序列，下游的引子(5′-gcggaattcGTCTGTCCTCTTGAGCAC-3′)含有一个和上游引子相同的中心部份，然而其有一个GNMT cDNA终止端的反向序列。在放大后直接将SDS(0.1％)和EDTA(5mM)加到DNA聚合脢炼锁反应中；用2.5M ammonium acetate和70％ethanol将DNA沉降，经由EcoRl酵素的切割后，DNA片段进行洋菜胶纯化并接到EcoRI酵素的切割后的pFLAG-CMV-5上。

两个引子(F1，5′-gcggaattcATGGTGGACAGCGTGTAC-3和R1，5°-gcggaattcTGTACTCGGCGGTGCGGC-3)被接到antisense-GNMT(pGNMT-antisense)质体上用来从pBluescript-GNMT-9-1-2嗜菌体质体上扩增136-bp的DNA片段(8).这个片段包含一个跨越GNMT转译起始点和两个尾端酵素剪切位(EcoRI和BamHI)的反向序列，克隆的步骤和pGNMT相似，为了在大肠杆菌表现GNMT基因转殖蛋白质(RP)我们建构了pGNMT-His-short质体，使用EcoR I和Nde I限制酶(Stratagene，La Jolla，CA，USA)将large S-tag的DNA片段从pGNMT-His中切除(9)；产生的DNA质体经由Klenow反应再接合质体DNA的序列使用尾端染剂循环定序试剂经由定序仪确认序列(Applied Biosystems Model 373A，Version 1.0.2，Foster City，CA)。

1.3GNMT基因转殖蛋白质的表现与纯化。将pGNMT-His-short转殖到BL21大肠杆菌使用IPTG诱导(诱导时间，3小时；菌体培养的最佳浓度[OD]，0.6-0.7).GNMT基因转殖蛋白质使用镍离子接合的histidine亲和树脂管柱依生产厂(Novagen，Madison，WI)操作规范进行纯化，基因转殖蛋白质浓度使用BCA蛋白质定量法(Pierce，Rockford，IL)量测；通过12.5％SDS-polyacrylamide迷你电泳胶(Bio-RadLaboratories，Richmond，CA)进行纯度测试。

1.4基因转殖。所有DNA质体标本都用Qiagen mega试剂组(Hilden，Germany)制备.使用标准磷酸钙法(16)用来转殖个各种DNA质体到多种的肝癌细胞株，转殖58小时后的细胞再加入不同浓度(1 to10μM)溶于DMSO(Nacalaitesque，Osaka，Japan)的BaP(Sigma-Aldrich，Steinheim，Germany)作用16小时，作用后的细胞主要作免疫萤光染色或³²p标定，在培养的细胞中加入0.1％DMSO作为负向对照组。

1.5建立稳定的克隆表现GNMT。使用标准磷酸钙法转殖pGNMT和pTK-Hyg(Clontech，Palo Alto，CA)质体到Hep G2细胞中，将细胞放在含有hygromycin(300μg/mL)的选择性培养基(17)。筛选出多于12个克隆的细胞，并用西方点墨法(WB)分析每个克隆的均质液中GNMT蛋白质的表现量，在这些克隆中SCG21-1和1-11被选来作进一步的研究，因为他们有好的GNMT的表现量。SCG2-neg是转殖pFLAG-CMV-5和pTK-Hyg质体的稳定克隆的Hep G2细胞。

1.6间接免疫萤光抗体染色(IFA)。将培养的HA22T/VGH或Huh7细胞放在玻片上加10μM BaP或0.1％DMSO处理后，用溶液I(4％paraformaldehyde，400mM sucrose in PBS)在37℃下作用30分钟，再用溶液II(溶液I  加0.5％Triton X-100)在室温下作用15分钟，之后加遮避溶液(0.5％BSA in PBS)在室温下作用1小时，经由磷酸缓冲液清洗后，玻片和不同的抗体在4℃下作用隔夜。两种不同的抗体分别稀释；anti-Flag monoclonal(Kodak，Rochester，NY)稀释1∶500，rabbit anti-GNMT antiserum-R4(12)稀释1∶200；FITC-conjugated anti-mouse IgG和TRITC-conjugated anti-rabbit IgG(Sigma-Aldrich)用来当作二级抗体、经由4次磷酸缓冲液清洗后，玻片封片后用共轭焦萤光显微镜(TCS-NT，Hilden，Germany)观察，为了观察细胞核的位置DNA用Hoechst H33258(Sigma-Aldrich)加以染色。

1.7产生带有GNMT cDNA(Ad-GNMT)的腺病毒。为了架构含有CMV激活子及GNMT基因的腺病毒，pGEX-GNMT(9)被设计带有XhoI(filled-in)和Bam HI在插入片段于pBluescript SK(-)(Stratagene).上的的XbaI和BamHl接位的前，GNMT cDNA也克隆到pAdElCMV/pA上的Hindlll和NotI接位(18)(一个小片段的载体带有病毒留下的基因片段)来产生pXCMV-GNMT，把pXCMV-GNMT和pJM17(18)共同转殖到2937细胞7到12天可产生基因重组的腺病毒，每个克隆的病毒都经过腺病毒专一性的引子的DNA聚合脢炼锁反应确认(18)，也包括插入片段的两端(18)及GNMT cDNA(8)用菌斑试验定出病毒量(18)。

1.8³²P标定和5度空间的薄膜色层分析用于BPDE-DNA并折结构的定量。转殖pGNMT plasmid DNA到SCG2细胞和肝癌细胞株通常要48小时，经由10μM BaP或0.1％DMSO(控制组)处理后的细胞分离出DNA加入球状菌的核内酵素作用16小时(19)和脾脏phosphodiesterase酵素在succinate缓冲液(20mM sodium succinatoand 10mM CaCl₂)中37℃作用3小时，得到的3′端核苷酸再用butanol溶液洗两次并用T4kinase在38℃下作用30分钟标定³²p-ATP，用5D-TLC来分出标定的DNA并折结构(20)。相对的并折结构含量(RAL)计算表示成：并折结构cpm/(所有核苷酸cpm x稀释倍数)。

1.9Aryl hydrocarbon hydroxylase(AHH)芳香族碳水化合物氢氧脢分析方法。为了量测细胞色素p4501A1的酵素活性，将接近100μg的细胞均质液加入反应容液(100mM HEPES，0.4mM NADPH，1mMMgCl₂，and 20μM BaP)在37℃作用10分钟。上清液的蛋白质浓度使用Bio-Rad试剂(Hercules，California)定量，加入丙酮停止反应；使用hexane和1N NaOH进行萃取反应，NaOH层萃取液用分光机(Hitahi Instrument，F4500，Japan)分析，激发光和散射光波长分别是396nm和522nm，反应产物(3-hydroxy-BaP)浓度经由和标准品比对计算出来，操作步骤在之前资料中(21)。

1.10西方点墨分析方法。西方点墨法用来侦测在转殖细胞或SCG2克隆细胞的GNMT，抗GNMT单株抗体14-1用来侦测(9)西方点墨法的操作方法。细节(22)。

1.11Lamarckian基因算法的接合位。LGA通常用来说明BaP和不同型态GNMT的反应位置.Autodock 3.0软件通常用来确认最可能的结合反应位置，凡德瓦尔力(Van der Waals′)、氢氧键结、疏水性力，静电力和自由的能量都经由经验判断产生蛋白接合的能力(23)，因大鼠GNMT作X光结晶绕射的数据有91％和人类GNMT相似，通常用来判段断结合结合位置(24，25)。BaP和甲基转移酶1之间的反应位置VID(26)，1 HMY(27)，2 ADM(28)，1 DCT(29)，1 BOO(30)，2DPM(31).1EG2(32)，和1G55(33)被分析出来，分析的参数如下：10次；族群大小50；测试终结标准最大27,000世代或2.5×10⁵能量估算，无论那个先到达，构形群rmsd最大允许度0.5A是可能从接合位结晶学的条件，操作方法。细节在(34)。

1.12GNMT酵素活性分析。GNMT  基因转殖蛋白质经由镍离子接合的histidine亲合树脂纯化后用来作酵素活性分析.GNMT  基因转殖蛋白质(10mg)和10，50，or 100μM BaP或DMSO溶剂(控制组)混合在室温下作用60分钟，再和下列成份作用：100μL的100mM Tris缓冲液(pH 7.4)含有50mM glycine，0.23mM SAM，and2.16μM S-adenosyl-_L-[methyl-³H]-methionine(76.4Ci/mmol)，之后在37℃下作用30分钟，最后加入50μL的10％三氯乙烯酸和5％活性碳混合液终止各别反应，每个反应重复三次，Cook和Wagner有发表作法。细节(35)。

2.结果

2.1在HA22T/VGH和Huh 7细胞BaP皆诱导GNMT在细胞核的位置改变。GNMT在基因转殖到HA22T/VGH细胞48小时后表现在细胞质，(用兔子anti-GNMT抗体血清和小鼠anti-Flag单株抗体作双重免疫萤光染色)(图1A和B)。类似的结果显现在在用DMSO溶剂处里控制组的Huh 7细胞(图1C和D).比对后GNMT蛋白质只有部份改变在细胞核的位置当Huh 7细胞加入10μM BaP作用16小时后(图1E，和F)，用Hoechst H33258将DNA以观察细胞的位置(图1D和F)。

2.2GNMT对于形成BPDE-DNA并折结构的抑制作用。³²P标定和5度空间的薄膜色层分析用于BPDE-DNA并折结构形成的定量，接着加入10M BaP作用16小时，BPDE-DNA并折结构形成在Hep G2，Huh 7，和HA22T/VGH细胞因转殖pGNMT DNA，和只有转殖载体的细胞相比，相对的分别下降52.8，13.5and 20.7％o(表1)。因为在Hep G2细胞中GNMT能强力抑制的并折结构的形成，我们选则这个细胞作为后续实验的目标，细胞转殖的效益约为30％，此外，再建构一个有GNMT反向序列的质体来确认GNMT的功用，发现pGNMT转殖的细胞和转殖控制载体的细胞相比能减少34.1％的BPDE-DNA并折结构形成(图8A，第3和4排).比较后Hep G2转殖pGNMT-antisense后增加29.2％的BPDE-DNA并折结构形成(第5排)。比较BPDE-DNA并折结构在细胞形成的总量，当细胞转殖等量的pGNMT and反向pGNMT质体(20μg)时，和只转殖控制载体的细胞相比几乎相同(第6排)。在不同质体转殖的实验中，GNMT的表现量和反向GNMT cDNA质体(pGNMT antisense)的影响，都用西方点墨法中的单株抗体来证实，如同图2B，第4排GNMT当细胞转殖等量的pGNMT and反向pGNMT质体时，均质液中测不出GNMT有表现。

表1.GNMT对于肝癌细胞形成BPDE-DNA并折结构的影响

BPDE-DNA adducts(RAL)in^a

                   Hep G2             Huh 7            HA22TNGH

^bCells transfected with

pGNMT              261.4(47.2％)      70.9(86.5％)     86.6(79.3％)

pCMV vector        553.5(100％)       82.0(100％)      109.1(100％)

no transfection    625.0              NT               161.7

a：相对的并折结构含量(RAL)每10⁸个核苷酸；使用32p标定方法量测。

b：转殖效率：Hep G2，30％；Huh 7，45％；HA22T/VGH，60％。

两个转殖pGNMT稳定的克隆(SCG2-1-1和SCG2-1-11)来自于Hep G2细胞pGNMT用来作上述相同的实验，北方点墨法的结果指出在SCG2-1-1和SCG2-1-11细胞中GNMT cDNA的套数分别为3和1(资料未呈现)，西方点墨法的结果显示GNMT在SCG2-1-1细胞的蛋白质的表现量几乎是SCG2-1-11细胞的3倍(图2D，第2和3排)，对SCG2-1-1和SCG2-1-11细胞给予1或10μM BaP处理后，抑制BPDE-DNA并折结构在细胞形成的能力和GNMT在细胞的表现量几乎相等，在同样的处理条件下(图2C)。

利用腺病毒带GNMT cDNA(Ad-GNMT)的相同的实验，发现感染Ad-GNMT的量和抑制BPDE-DNA并折结构在细胞形成的能力有正向直线的关系(图3)，感染Ad-GNMT的量和Ad-GFP-控制组感染细胞比较，当Ad-GNMT MOIs从100增加到250再到1,000而BPDE-DNA并折结构的形成的减少比率，从19.5，到36.6，再到61.8％(图3A).在感染100MOIs的Ad-GFP控制组，100,250和1,000MOIsAd-GNMT的Hep G2细胞，GNMT蛋白质的表现量使用西方点墨法分析结果在图3B，第1至4排。

2.3GNMT对于BaP导至细胞色素CYP1A1酵素活性下降的影响。SCG2-1-1和SCG2-neg细胞加入不同浓度的BaP处理16小时后，使用芳香族碳水化合物氢氧脢(AHH)分析方法量测CYP1A1的酵素活性，SCG2-neg细胞加入3，6和9μM BaP处理后，细胞中CYP1A1的酵素活性分别为24.5，41.5和71.3pmol/mg/min，SCG2-1-1细胞中CYPlA1的酵素活性分别为20.1，27.7和36.2pmol/mg/min(图4)，和SCG2-neg细胞比较，细胞加入9μM BaP处理后，有表现GNMT的细胞比其它细胞(如SCG2-1-1)减少45％CYP1A1的酵素活性的下降。

2.4模拟GNMT和BaP交互作用。LGA是用来预测GNMT和BaP交互作用，因为人类和大鼠的GNMT在蛋白质结晶分析有91％的相似度，所以使用大鼠的GNMT蛋白质作BaP接合位的实验，如图5A和5B，我们发现BaP和GNMT的双体(黄色)和四联体接合(青绿色)，但比较喜欢和双体接合(蛋白质数据库PDB号码；1D2C)。这个接合位群落在SAM-和SAH-接合的位置(表2和图5B)。双体GNMT和BaP之间的弱键结(-9.10Kcal/mole)显示BaP可能取代SAM接合的位置；四联体和BaP之间的强键结(254.9Kcal/mole)因有一个GNMT双体已经接住SAM(蛋白质数据库PDB号码：1XVA)显示BaP可能竞争和GNMT接合(表2)。因此几个1GNMT的铵基酸残基(包括Thr37，Gly137和单体结构次单元的His142及另一次单元的Glu15)都紧邻BaP(图5C)。

表2，GNMT蛋白质和BaP分子在Lamarckian基因算法的接合位

PDBcodea	Smallmolecule	Clusternumber	Clusterpopulation	MeanEnergy(Kcal/mol)	Number ofevaluations	Protein details
							1D2Cb	BaP	1	10	-7.38	2.5×105	Apo GNMTDimer
1D2Gb	BaP	1	10	-7.53	2.5×105	R175K mutantDimer
							1D2Hb	BaP	3	5	-3.22	2.5×105	R175K+SAHTetramer
1XVAc	BaP	5	5	+254.9	2.5×105	+SAMDimer
							1XVAd	BaP	2	8	-9.10	2.5×105	-SAMDimer
1XVAe	SAM	2	5	-9.85	2.5×105	-SAMDimer

^a.PDB：蛋白质数据库(http://www.resb.org/pdb)；

^b.接合群座落在SAM和SAH交互作用的位置；

^c.不好的位置是距离SAM～2A以上，须要给予很高的能阶很难形成复合物；

^d.BaP取代SAM的位置；

^e.RMSD＝2.70A.RMSD为0.68A第二接合群r(n＝5)和蛋白质结晶结构一致平均能量为-8.80Kcal/mol.注意：这个位置有一个醋酸盐可能可以稳定第二接合群。

2.4  BaP所导的GNMT酵活动抑止：因为BaP和GNMT可能会结合造成干扰，通过建构出plasmid-pGNMT-His-Short以在大肠杆菌中释出His-tag-GNMT RP BaP，对GNMT酵活动的潜在影响加以研究。我们的分析研究中所使用的是，从Ni²⁺-charged histidine-binding resincolumn中粹取的GNMT RP。如图6所示，对照使用DMSO控制，在含有10和50μM BaP的反应中，GNMT酵活动分别减少了44％和62％，IFA会指出BaP诱导GNMT的细胞核移位的效用。我们的结果显示GNMT不但制止BPDE-DNA加合物的形成并且逐步减少CYP1A1酵活动；相反地，BaP也制止GNMT酵活动。最后，我们利用docking实验，显示BaP-GNMT交互作用的精确位置。这些结果显示一项新发现，也就是一种细胞组成的防卫机制，以对抗可能具破坏性的暴露形式。我们确认了GNMT通过短暂转染、稳定细胞株筛选和腺病毒感染系统，制止BPDE-DNA加合物形成，全程的结果前后一致。使用GNMTcDNA的anti-sense结构，凸显交互影响的的明确性(图2A)，并也使用WB化验来监看在不同的基因转移实验组中，GNMT的释出等级。用药相关的GNMT对BPDE-DNA加合物形成的制止效果更为复杂，因为还有Hep G2稳定细胞株和带有重组腺病毒的GNMT cDNA(图2C和3A)。

通过芳香族羟基的碳氢化合物接受器(AhR)相关路径(37)，许多PAH会导致P-450细胞色素的释出。在扩散至细胞里后，BaP和AhR结合并且转位到细胞核，在这里，BaP-AhR异聚体与Ah受体细胞核传送器(Arnt)蛋白质形成复合物(2)。BaP-AhR-Arnt复合物就通过与其在促进剂区的异质物反应元素(38)的交互反应，反活化(transactivate)CYP1A1基因。除了制止BPDE-DNA加合物的形成，我们的结果显示，GNMT可以降低受到BaP诱导的CYP1A1酵活动(图4)。Foussat et al.(39)利用遗传上AhR不足的老鼠阐明GNMT并非CYP1A1基因(39)的一个转录性的活化体(transcriptional activator)。我们的实时PCR分析初步资料中显示，在以BaP治疗后，在SCG2-1-1细胞中的CYP1A1基因表现和在Hep G2细胞中比起来，减少了大约20％。

先前的研究显示，老鼠GNMT的四聚体形式作用如同酵，并显示老鼠GNMT的二聚体形式可以与PAH结合(40)。在目前的发明中，利用LGA和计分功能来估测结合相关自由能量交换，以找到BaP和各种形式GNMT交互作用的可能位置；老鼠GNMT的X光结晶学资料的用途就在此。结果显示：1.)BaP结合的范围在基质(SAM)结合的位置；2.)BaP较常与GNMT二聚体形式结合。利用GNMT四聚体的R175K突变形，阐明虽然R/K残余的位置接近结合点(距离SAM位置-5A)，其对GNMT-BaP群的形成几乎没有影响(表2)。相对来看，醋酸根离子(acetate ion)的存在，有益于在1XVA结晶构造里GNMT-SAM结合中，另一种想要的族群形成(表2，最后一项)。已经证实在各种找寻方式中，LGA是最有可能找到结晶学结构的方法(23)。大量聚集的丛集通常会符合由结晶学决定的位置，这些位置显示与晶体结构有0.2-0.8A RMS的差异。对大部分的配体来说，我们的docking模拟在1.0A RMSD内，预测出符合结晶学上结合模式的单一结合模式(23)。这显示，LGA是预测配体与其微分子目标的结合型态的可靠方法。BaP和GNMT的交互作用也在一项功能性化验中确认，此化验显示GNMT酵活动在有BaP的情况下，减少了将近50％(图6)。

既然BaP较常与GNMT的SAM结合域结合，LGA就用来研究BaP和其它八种SAM相关methyltransferases(MTases)间的交互作用，这些MTase为：catechol O-methyltransferase(COMT)，HhaI DNAMTase，TaqI DNA MTase，HaelIl DNA MTase，PvuII DNA MTase，DpnIIDNA MTase，RsrI DNA MTase，和DNMT2。我们的结果显示BaP可以与Hhal-，HaeIII-，Pvull-DNA MTases和DNMT2结合，但与COMT，TaqI-，DpnII-，和RsrI-DNA MTases不能结合(Table 3)。研究发现，所有亲BaP的DNA MTase的目标原子是胞嘧啶而不是腺嘌呤(41)。这是第一项证据能指出一个环境致癌物质如BaP，有可能与不同的DNA MTase交互作用。依证据显示，由all-trans-retinoic-acid的倒置的GNMT酵活动，造成在老鼠hepatocyte中基因低甲基化现象(DNAhypomethylation)(42)，另外显示BaP可能通过与DNMT和GNMT的交互作用影响DNA methylation，因而有助于致癌。

表3.用Lamarckian基因算法的一些依赖SAM的Methylfiransferases和BaP分子的结合位置

PDBcodeb	Smallmolecule	Numberofclusters	Clusterpopulation	MeanEnergyKcal/mol	Number ofevaluations	Protein details
							1VIDc	BaP	2	4	-2.18	2.5×105	COMTMonomer
1HMYd	BaP	3	8	-8.94	2.5×105	HhaIDNA-MTMonomer
							2ADMe	BaP	4	6	+47.19	2.5×105	TaqIDNA-MTDimer
1DCTf	BaP	3	8	9.69	2.5×105	HaeIIIDNA-MTDimer
							1BOOg	BaP	3	5	-8.69	2.5×105	PvuIIMonomer
2DPMh	BaP	4	5	+13.46	2.5×105	DpnIIDNA-MTMonomer
							1EG2i	BaP	4	2	+85.64	2.5×105	RsrIDNA-MTMonomer
1G55j	BaP	1	10	-8.70	2.5×105	DNMT2DNA-MTMonomer

在docking前，1VID，1HMY.2ADM和2DPMmethyltransferase微分子已经去除SAM分子。BaP分子试着移到先前SAM的位置。在docking之前，1BOO和1 G55 methyltransferase微分子已经去除SAH分子

^b.PDB蛋白质数据库：(http://www.resb.org/pdb)

^c.第二束(丛集量6/10)的能量是-0.32Kcal/mol；COMT没有与BaP在偏好的位置结合。

^d.第二束(丛集量1/10)的能量是-6.45 Kcal/mol；HhaI-DNA-MT与BaP在较低的能量偏好位置结合。

^e.高结合能量(+47.19Kcal/mol)显示TaqI DNA-MT与BaP不结合。

^f.第二束(丛集量1/10)的能量是-9.50Kcal/mol非常接近最低的能量束(丛集量8/10，能量-9.69Kcal/mol)；所以HaeIII DNA-MT与BaP在偏好位置强烈结合。

^g.高结合能量(-8.69Kcal/mol)显示PvuII与BaP会结合。其它两束的结合能量(-8.63Kcal/mol和-8.58Kcal/mol)非常接近最低能量束。

^h.+13.46Kcal/mol的结合能量显示DpnII DNA-MT与BaP不结合。

^i.+85.64Kcal/mol的结合能量显示RsrI DNA-MT与BaP不结合。

^j.-8.70Kcal/mol的结合能量显示DNMT2与BaP在偏好位置强烈结合。

3.概要

Glycine N-methyltransferase(GNMT)影响基因的稳定性的方式有：1，)干扰S-adenosylmethionine(SAM)到S-adenosylhomocystine的频率；2.)与folate结合。根据视GNMT为一种4S polyaromatichydrocarbon结合蛋白，利用肝癌细胞线，cDNA转染中短暂或稳定释出的GNMT，分析GNMT在BaP毒化途径中的角色。由非直接immunofluorescent抗体分析所示，GNMT在细胞质中的释出，是在BaP治疗前，并且在BaP治疗后转位到细胞核。和与vector plasmid转染的细胞比较，释出GNMT细胞中，BPDE-DNA加合物的数量大量减少。并且GNMT所产生的，用药相关的BPDE-DNA加合物生成抑止，可以见于与载有重组腺病毒GNMT cDNA的不同MOIs感染的Hep G2细胞中。根据AHH酵活动分析，GNMT抑止由BaP诱导的酵活动。BaP自动docking利用Lamarckian基因演算与GNMT X光结晶学，找出对GNMT二聚体形式对SAM结合范围的BaP偏好，这是一项关于细胞对潜在破坏性暴露防卫的新发现。另外对GNMT，docking实验的结果显示BaP会与其它所列DNA methyltransferases(MTases)结合：包括Hhal-，Haelll-，Pvull-MTases和人体DNMT2。所以显示BaP-DNMT和BaP-GNMT交互作用有助于致癌。

实施例2：活的有机体内致癌物质的BaP融合及预防以GNMT遗传工程老鼠模式为测试

pPEPCKex-flGNMT质体建构：pPEPCKex-flGNMT质体是利用pPEPCKex带菌者(最后以phosphoenolpyruvate carboxykinase促进剂(PEPCK，Valera et a1.，1994)及pSK-flGNMT(最后使用全程人类GNMT cDNA)质体准备而成)。两个质体皆以Not 1及Xho I消化。插入物捆于带菌者并转换为具能力的细胞(JM109)。复制物以氨比西林筛选出来，并以PCR审查勘验pPEPCKex-flGNMT质体(图1)。

遗传工程老鼠的繁殖：pPEPCKex-flGNMT质体是以Asc I扩大并消化成线状(4.3Kb)。而pPEPCKex-flGNMT线状基因，以pronuclei显微镜下注射法，被植入胚胎0.5天的FVB染色鼠。这些胚胎被植入其养母内(ICR品种老鼠)。于18-21天后，为堪验遗传工程老鼠，并以PCR繁殖并审查的。

遗传工程老鼠肝脏与肾脏内的人类GNMT表现度：为堪验PEPCK推动者的特定表现度器官，发明人利用北污点(图2)及西污点(图3)。人类GNMT为肝脏及肾脏内的特定表现度。遗传工程老鼠的GNMT表现度程度高过一般老鼠。

GNMT遗传工程老鼠及HBV-LargeS遗传工程老鼠的B(a)P处理：

在十五天期间内每天以IP注射375μg B(a)P/7g体重处理以下二组老鼠。

GNMT遗传工程老鼠

一般老鼠

以BaP处理的二组老鼠的肺脏病状，试验后78周后即牺牲掉这些老鼠。

结果与结论

当GNMT在B(a)P处理的遗传工程老鼠为过度表现时，仅30％老鼠产生肺肿瘤。B(a)P处理的一般老鼠(无GNMT过度表现度)，产生一肺肿瘤的速率为66.66％。依据此结果，GNMT可在活的有机物体内融合B(a)P，而因此有能力预防致癌物质。

Claims (9)

1.一种医药组合物、食品或化妆用品组合物，其特征在于，包括有：一媒介物及一有效量的苯并芘融合蛋白质，其中该蛋白质为一SAM依赖的甲基转移酶或一保守功能的变形或断片，且皆带有一个SAM-融合领域，专门来融合苯并芘。

2.如权利要求1所述的组合物，其中，医药组合物或食品组合物适合口服，或非口服用法。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，甲基转移酶选自包括下列的群组：GNMT，Hhal-DNA MTases，HaeIII-DNA MTases，及/或Pvull-DNA MTases。

4.如权利要求3所述的组合物，其中，甲基转移酶为GNMT。

5.如权利要求1所述的组合物，其中，SAM依赖的甲基转移酶保守功能的变形或断片包含有SEQ ID.NR.1的胺基酸序列。

6.如权利要求1所述的组合物，其为一微生物、或一由微生物取出的混合物、或动物的器官。

7.一种使用SAM依赖的甲基转移酶或其保守功能变形或断片，其特征在于，有着SAM接合带有领域特定接合苯并芘，用来药剂的制造为预防或治疗癌症之用。

8.如权利要求7所述的使用，其中，该癌症为哺乳类包括人类的肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠癌、脑肿瘤、乳癌及肾癌。

9.一种用来预防或治疗癌症的方法，其特征在于，包含服用一医药有效量的SAM依赖的甲基转移酶或是限制功能的变形或断片，其有着SAM接合且特别融合苯并芘e到个别人体。

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