发明内容
本发明以清热、化瘀、消积为主,兼以健脾益气为治疗法则,使肝胆湿热之邪得清,瘀血癓积得消,脾胃功能恢复,气顺则脾运,以达保护肝脏的目的。本发明人经过大量的动物和临床试验,筛选得到了疗效肯定的中药组方,即清肝化瘀药物组合物,从而完成了本发明。
本发明的首要目的是提供一种治疗肝纤维化的药物,其次是提供该中药组合物的制备方法。
本发明一种治疗肝纤维化的药物,亦称清肝化瘀药物,主要含有龙胆、莪术、黄芩、三棱(醋制)、丹参、白术、黄芪,它们的重量份数是:龙胆10~30份、莪术(醋制)20~40份、黄芩30~50份、三棱15~35份、丹参25~45份、白术15~35份、黄芪10~30份。
治疗肝纤维化的药物还可含有陈皮、虎杖,它们的重量份数是:陈皮10~30份、虎杖10~30份。
治疗肝纤维化的药物还可含有甘草,其重量份数是:5~15份。
本发明药物可以采用中药制剂的常规方法制备成任何常规的口服制剂,但是为了使该药物中的中药材发挥更好的药效,有必要对药材进行活性组分的提取。
当治疗肝纤维化的药物至少含有龙胆、莪术、黄芩、三棱(醋制)、丹参、白术、黄芪时,其制备方法如下:
a、莪术(醋制)、白术用水蒸汽蒸馏法提取,收集挥发油,备用,挥发油也可以用β-环糊精包合后备用,蒸馏后的水溶液另器收集;
b、黄芩、三棱(醋制)、黄芪、丹参加水回流提取,合并提取液,滤过,滤液与步骤a收集的水溶液合并,浓缩,加乙醇,冷藏过夜,滤过,上清液备用;
c、龙胆用乙醇加热回流,提取液滤过,滤液与步骤b制备的上清液合并,回收乙醇至无醇味,并浓缩成清膏,喷雾干燥成干浸膏粉;
d、将步骤a制备的的挥发油或挥发油的β-环糊精包合物和步骤c制备的干浸膏粉合并,即制得本发明的治疗肝纤维化药物。
当治疗肝纤维化的药物中还含有陈皮、虎杖时,其制备方法如下:
a、莪术(醋制)、白术与陈皮用水蒸汽蒸馏法提取,收集挥发油,备用,挥发油也可以用β-环糊精包合后备用,蒸馏后的水溶液另器收集;
b、黄芩、三棱(醋制)、虎杖、黄芪、丹参加水回流提取,合并提取液,滤过,滤液与步骤a收集的水溶液合并,浓缩,加乙醇,冷藏过夜,滤过,上清液备用;
c、龙胆用乙醇加热回流,提取液滤过,滤液与步骤b制备的上清液合并,回收乙醇至无醇味,并浓缩成清膏,喷雾干燥成干浸膏粉;
d、将步骤a制备的挥发油或挥发油的β-环糊精包合物和步骤c制备的干浸膏粉合并,即制得本发明的治疗肝纤维化药物。
当治疗肝纤维化药物中还含有甘草时,其制备方法如下:
a、莪术(醋制)、白术与陈皮用水蒸汽蒸馏法提取,收集挥发油,备用,挥发油也可以用β-环糊精包合后备用,蒸馏后的水溶液另器收集;
b、黄芩、三棱(醋制)、虎杖、黄芪、丹参、甘草加水回流提取,合并提取液,滤过,滤液与步骤a收集的水溶液合并,浓缩,加乙醇,冷藏过夜,滤过,上清液备用;
c、龙胆用乙醇加热回流,提取液滤过,滤液与步骤b制备的上清液合并,回收乙醇至无醇味,并浓缩成清膏,喷雾干燥成干浸膏粉;
d、将步骤a制备的的挥发油或挥发油的β-环糊精包合物和步骤c制备的干浸膏粉合并,即制得本发明的治疗肝纤维化药物。
在本发明的治疗肝纤维化药物中,可以加入制备不同剂型所需的各种常规辅料,如崩解剂、润滑剂、粘合剂等,以常规的中药制剂方法制备成任何一种常用口服剂型,如丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液等。
处方分析:本方以龙胆、莪术为君药,前者清肝胆湿热,后者破血行气消积,“为肝经血分之药,能破气中之血”。二药合用即达清肝化瘀之效。以黄芩辅龙胆草清肝燥湿、三棱助莪术以化瘀消积;配丹参活血化瘀通络,有“破瘀血,生新血”之妙;用黄芪、白术健脾益气,扶正培本,以利君药之祛邪且不伤正,以上五味共为臣药,与君药相配清肝化瘀,祛邪扶正。虎杖可佐君臣之药,一能清热利湿,二可活血化瘀;陈皮以其健脾和胃之功可使君药“祛邪而不伤正”,以其理气燥湿之效,使臣药黄芪、白术“扶正而不敛邪”,二者共为佐药。使以甘草之缓,和君药祛邪之峻,协臣药扶正之功,又可调和诸药。全方配伍严谨,君臣佐使有序,共奏清肝除湿、活血化瘀、健脾益气之功。湿热去,则疏泄畅;瘀血通,则痞块消;脾胃健,则运化强。对于肝硬化出现的神疲体倦,面色晦暗,目黄身黄,肝脾肿大,脘腹疲胀或两肋胀痛,口苦纳呆等症,必能起到治疗康复作用。
本发明清肝化瘀药物组合物之功能为清肝化瘀、健脾益气。
适应范围:用于治疗肝纤维化及早期肝硬化,症见肝胆湿热、肝血瘀滞、脾弱气虚所致面色晦暗、目黄身黄、脘腹痞胀或两胁胀痛、食后加重,口苦纳呆、神疲体倦、小便黄赤、舌暗紫有瘀电或瘀斑、舌苔黄、脉弦细或弦滑。
具体实施方式
以下通过实施例进一步阐述本发明药物的制备方法
实施例一:制备治疗肝纤维化药物(清肝化瘀药物)
1、处方:龙胆20份、莪术(醋制)30份、黄芩40份、三棱(醋制)25份、丹参35份、白术25份、黄芪20份、陈皮20份、虎杖20份、甘草10份。
2、制备方法:
a、莪术(醋制)、白术与陈皮加8倍量水,用水蒸汽蒸馏法提取6小时,收集挥发油,用β-环糊精包合后备用,蒸馏后的水溶液另器收集;
b、黄芩、三棱(醋制)、虎杖、黄芪、丹参、甘草加10倍量水回流提取三次(每次2小时),合并提取液,滤过,滤液与步骤a收集的水溶液合并,减压浓缩至1∶1,加乙醇使含醇量达60%,冷藏过夜,滤过,上清液备用;
c、龙胆用70%乙醇加热回流三次(每次1小时),合并提取液,滤过,滤液与步骤b制备的上清液合并,回收乙醇至无醇味,并浓缩成清膏,喷雾干燥成干浸膏粉;
d、将步骤a制备的挥发油的β-环糊精包合物和步骤c制备的干浸膏粉合并,即制得本发明的治疗肝纤维化药物。
实施例二:制备治疗肝纤维化药物的硬胶囊
在实施例一的基础上进行胶囊制剂的制备
治疗肝纤维化药物 387g
微粉硅胶 10g
硬脂酸镁 2g
将上述处方中各部分混匀,灌装,制成1000粒胶囊,即得。每粒0.4g,每日服15粒。
实施例三:制备治疗肝纤维化药物的软胶囊
在实施例一的基础上进行胶囊制剂的制备
治疗肝纤维化药物 383g
药用大豆油 258g
单硬脂酸甘油酯 0.4g
取明胶1份、加水1份、甘油0.6份,70-80℃融胶后,移入保温罐中55-65℃保温待用,取药用豆油、单硬脂酸甘油酯适量,加热,70℃使混溶,放冷,将上述清肝化瘀药物之活性组分加入,搅拌混匀,用胶体磨研磨,使其形成均一的混悬液。将配好的药液加入供料箱中进行压丸,制成1000粒。软胶囊在25℃、相对湿度30%的条件下定形20小时后,移入干燥机中进行干燥,干燥条件为30℃,相对湿度为20%,风速为0.6m/s,时间为8h。干燥后的软胶囊,洗丸、拣洗,检验后即得。每粒0.65g,每日服12粒。
实施例四:制备治疗肝纤维化药物(清肝化瘀药物)
1、处方:龙胆26份、莪术(醋制)32份、黄芩32份、三棱(醋制)25份、丹参35份、白术25份、黄芪20份。
2、制备方法
a、莪术(醋制)、白术加8倍量水,用水蒸汽蒸馏法提取6小时,收集挥发油,用β-环糊精包合后备用,蒸馏后的水溶液另器收集;
b、黄芩、三棱(醋制)、黄芪、丹参加10倍量水回流提取三次(每次2小时),合并提取液,滤过,滤液与步骤a收集的水溶液合并,减压浓缩至1∶1,加乙醇使含醇量达60%,冷藏过夜,滤过,上清液备用;
c、龙胆用70%乙醇加热回流三次(每次1小时),合并提取液,滤过,滤液与步骤b制备的上清液合并,回收乙醇至无醇味,并浓缩成清膏,喷雾干燥成干浸膏粉;
d、将步骤a制备的挥发油的β-环糊精包合物和步骤c制备的干浸膏粉合并,得本发明的清肝化瘀药物。
实施例五:制备治疗肝纤维化药物硬胶囊
在实施例四的基础上进行胶囊制剂的制备
清肝化瘀药物 356g
乳糖 30g
微粉硅胶 12g
硬脂酸镁 2g
将上述处方中各部分混匀,灌装,制成1000粒胶囊,即得。每粒0.4g,每日服15粒。
实施例六:制备治疗肝纤维化药物(清肝化瘀药物)
1、处方:龙胆30份、莪术(醋炙)40份、黄芩40份、三棱(醋炙)30份、丹参40份、白术25份、黄芪25份、陈皮25份、虎杖25份。
2、制备方法
a、莪术(醋制)、白术与陈皮加8倍量水,用水蒸汽蒸馏法提取6小时,收集挥发油,用β-环糊精包合后备用,蒸馏后的水溶液另器收集;
b、黄芩、三棱(醋制)、虎杖、黄芪、丹参加10倍量水回流提取三次(每次2小时),合并提取液,滤过,滤液与步骤a收集的水溶液合并,减压浓缩至1∶1,加乙醇使含醇量达60%,冷藏过夜,滤过,上清液备用;
c、龙胆用70%乙醇加热回流二次(每次1小时),合并提取液,滤过,滤液与步骤b制备的上清液合并,回收乙醇至无醇味,并浓缩成清膏,喷雾干燥成干浸膏粉;
d、将步骤a制备的挥发油的β-环糊精包合物和步骤c制备的干浸膏粉合并,得本发明的清肝化瘀药物。
为说明本发明治疗肝纤维化药物对肝损伤的作用,通过建立动物模型,考察了对肝纤维化的治疗作用。
试验一、清肝化瘀胶囊(治疗肝纤维化药物)对大鼠免疫损伤性
肝纤维化的作用
1试验目的
采用静脉注射牛血清白蛋白复制大鼠免疫损伤性肝纤维化模型,观察清肝化瘀胶囊的治疗作用。
2试验材料
2.1药物
按实施例二制备的清肝化瘀硬胶囊,即本发明治疗肝纤维化药物,药粉为红棕色,用0.5%CMC配成合适浓度的混悬液使用。
复方鳖甲软肝片:市售,批号20021010,用0.5%CMC配成合适浓度的混悬液使用。
秋水仙碱:Serva公司产品,批号C9754,用重蒸馏水配成合适浓度的溶液使用。
2.2试剂
牛血清白蛋白(BSA):天津市灏洋生物制品有限公司,批号A-7030
羊毛脂:上海嘉定华亭羊毛脂厂,批号000917
液体石蜡:天津市化学试剂二厂产品,批号980425
弗氏不完全佐剂:羊毛脂120g加入液体石蜡240ml,在65℃水浴搅拌混匀,高压消毒后置4℃冰箱保存备用。
考马斯亮兰蛋白测定试剂盒:南京建成生物工程研究所,批号20030715
羟脯氨酸测定试剂盒:南京建生物工程研究所,批号20030715
唾液酸测定试剂盒:南京建生物工程研究所,批号20030707
2.3动物
大鼠:Wistar种,二级动物,由军科院四所提供,合格证号:军医动字B98014
饲养条件:分笼饲养,每笼5-6只,自由饮水、摄食,室温由中央空调控制在24±2℃,湿度为50±15%,光照12小时亮,12小时暗(上午六点亮,下午六点暗)。
3试验方法
3.1模型复制
选用健康Wistar种大鼠100只,体重130-150g,雌雄各半,除正常对照组(雌雄各5只)外,其余90只大鼠均以9mg/ml BSA弗氏不完全佐剂混悬液每次0.5ml/只,进行多点皮下注射以致敏动物,连续5次。第1、2次间隔2周,其余各次均间隔1周。末次致敏后1周,所有动物均眼眶静脉取血,用毛细管法测定血清BSA抗体。取抗体阳性的动物尾静脉攻击注射不同浓度的BSA生理盐水溶液0.4ml/只,每周2次,剂量从2.0mg/0.4ml/只,逐次递增至3.0mg/0.4ml/只(每次递增0.1mg),第12次为3.4mg/0.4ml/只,以后每次递增0.2mg至4.0mg/0.4ml/只,共15次,正常组大鼠用生理盐水代替BSA进行尾静脉注射。末次攻击注射后3天,取血测定ALT、AST、TP、ALB、A/G(白蛋白/球蛋白)比例、唾液酸;取部分肝脏,匀浆后测定羟脯氨酸含量;另取部分肝脏用10%福尔马林固定,进行HE染色及Masson染色,光镜下观察肝纤维化程度。
3.1.2分组方法
除正常对照组外,其余动物均于攻击注射4次后,按体重随机分为6组,模型对照组、清肝化瘀胶囊0.9、1.8、3.6g药粉/kg剂量组、阳性药复方鳖甲软肝片2g药粉/kg剂量组、阳性药秋水仙碱0.25mg/kg剂量组,加上正常对照组,共7个组。
3.1.3给药时间
各组动物均于攻击注射4次后,按1ml/100g体重的灌胃容积进行灌胃给药,正常对照组、模型对照组灌胃给予等容量0.5%CMC混悬液,每天1次,每周7次,连续6周。
3.1.4数据统计
试验数据以
x±SD表示,两组均数采用统计分析-t值法,有等级关系的采用秩和检验进行统计分析。
4试验结果
4.1一般情况
致敏5次后,血清BSA抗体阳性的大鼠共87只(有3只雄性大鼠不符合试验要求),当攻击注射后,大鼠发生不同程度的过敏休克样反应,呼吸急促、走路不稳、俯卧不起,甚至死亡,死亡动物立即解剖,肉眼观察各脏器未发现明显异常,存活动物约30分钟恢复正常。死亡动物大部分出现在攻击注射第1-3次,从攻击注射第4次开始,偶有动物发生过敏休克样反应。攻击注射4次后,共死亡16只(雌雄10只、雄6只),存活动物71只,存活动物按体重随机分为6组,模型对照组、清肝化瘀0.9g药粉/kg剂量组、清肝化瘀1.8g药粉/kg剂量组、清肝化瘀药粉3.6g药粉/kg剂量组、复方鳖甲软肝片2g药粉/kg剂量组均每组12只(雌、雄各6只),秋水仙碱0.25mg/kg剂量组11只(雌5只、雄6只),加上正常对照组10只(雌、雄各5只),共7组(81只),进行灌胃给药,连续6周。在试验过程中,灌胃给药误入气管致大鼠死亡1只(雌性清肝化瘀3.6g药粉/kg),因造型死亡的大鼠为7只,其中:模型对照组2只(雌性1只、雄性1只)、清肝化瘀0.9g药粉/kg剂量组2只(雌、雄各1只)、清肝化瘀1.8g药粉/kg剂量组1只(雌性)、复方鳖甲软肝片2g药粉/kg剂量组1只(雌性)、秋水仙碱0.25mg/kg剂量组1只(雄性)。
4.2肝脏、脾脏脏器系数的测定
末次给药后,大鼠禁食15小时,称量体重,取出肝脏、脾脏,称量湿重,以100g体重的肝重、脾重作为脏器系数,比较各剂量组的差异,结果见表1。
表1清肝化瘀胶囊对免疫损伤性肝纤维化大鼠脏器系数的影响(
x±SD)
组别 |
剂量(g药粉/kg) |
动物数(只) | 肝脏系数 | 脾脏系数 |
正常对照组模型对照组清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊复方鳖甲软肝片秋水仙碱 | 0.91.83.62.00.25mg |
10101011111110 |
2.776±0.2423.744±0.631##3.348±0.4063.224±0.370*3.187±0.303*3.645±0.4913.217±0.414* |
0.253±0.0350.366±0.037##0.318±0.0690.321v0.057*0.309±0.046**0.327±0.047*0.317±0.050* |
##:p<0.01(与正常对照组比较)
*:p<0.05 **p<0.01(与模型对照组比较)
表1结果表明,与正常对照组比较,模型对照组大鼠的肝脏、脾脏脏器系数明显增加;与模型对照组比较,清肝化瘀胶囊1.8、3.6g药粉/kg剂量组肝脏、脾脏脏器系数明显减小,阳性药亦有相似作用。
4.3血液生化学指标测定
对禁食后的大鼠,用戊巴比妥钠腹腔麻醉,腹主动脉取血,离心后吸取上清液,在Olympus Au640全自动生化分析仪上测定ALT、AST、TP、ALB、G、A/G,按南京建成生物工程研究所生产的唾液酸(SA)测定试剂盒说明书,测定血清唾液酸含量,比较各剂量组的差异,结果见表2。
表2清肝化瘀胶囊对免疫损伤性肝纤维化大鼠血液生化指标的影响(
x±SD,n)
组别 |
剂量(g药粉/kg) | ALT(U/L) | AST(U/L) | TP(g/L) | ALB(g/L) | G(g/L) | A/G | SA(mmol/L) |
正常对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊复方鳖甲软肝片秋水仙碱 | 0.91.83.62.00.25mg |
34.9±7.2237.1±8.8256.9±39.140.2±13.734.7±12.244.5±19.845.2±22.3 |
105.9±28.9123.4±26.4155.3±57.2107.8±54.9109.8±33.9124.9±43.1126.2±35.9 |
59.0±3.3958.6±3.2459.3±3.1960.7±2.4459.3±2.3059.8±3.0661.2±2.71 |
30.2±2.6529.0±2.8529.4±1.8030.3±1.8029.9±1.7929.8±2.1430.6±1.92 |
28.8±1.5829.6±2.1729.8±2.6930.3±2.942.66±30.030.0±2.0330.6±2.97 |
1.05±0.070.99±0.130.99±0.121.01±0.141.03±0.131.0±0.091.01±0.14 |
3.34±0.383.79±0.47#3.63±0.413.62±0.693.40±0.403.46±0.503.55±0.68 |
#:p<0.05(与正常对照组比较)*:p<0.05(与模型对照组比较)
n:动物数,同表1。
表2结果表明:与正常对照组比较,模型对照组大鼠的血清唾液酸含量明显升高,其余各项指标无明显差异。与模型对照组比较,清肝化瘀胶囊3.6g药粉/kg剂量组血清唾液酸含量明显降低,其余各项指标均无明显差异。
4.4肝脏羟脯氨酸含量测定
取约1g的肝脏组织,加入9倍的生理盐水进行匀浆,匀浆后3500转/分离心10分钟,取上清液按南京建成生物工程研究所生产的羟脯氨酸试剂盒说明书,测定肝脏羟脯氨酸含量,比较各剂量组的差异,结果见表3。
表3清肝化瘀胶囊对免疫损伤性肝纤维化大鼠肝脏羟脯氨酸含量的影响(
x±SD)
组别 |
剂量(g药粉/kg) |
动物数(只) |
羟脯氨酸(μg/mgprot) |
正常对照组模型对照组清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊复方鳖甲软肝片秋水仙碱 | 0.91.83.620.25mg |
10101011111110 |
0.609±0.1510.903±0.121##0.767±0.1900.726±0.163*0.689±0.131**0.732±0.153*0.727±0.158* |
##:p<0.001(与正常对照组比较)
*:p<0.05 **p<0.01(与模型对照组比较)
表3结果表明:与正常对照组比较,模型对照组肝脏羟脯氨酸含量明显升高,表明已形成肝纤维化。与模型对照组比较,清肝化瘀胶囊1.8、3.6g药粉/kg剂量组明显降低羟脯氨酸含量,并随剂量增加,作用增强,表明对肝纤维化有明显的防治作用,阳性对照药复方鳖甲软肝片、秋水仙碱亦有相似作用。
4.5病理组织学检查
取肝脏,用10%福尔马林固定,常规取材后,酒精梯度脱水,FisherModel 266Mp自动石蜡包埋机包埋,Leica RM2135切片机制片,HE、Masson二种染色,Olympus显微镜下按以下分级标准进行组织病理学观察并照相,比较各剂量组的差异。
分级标准:参考文献,肝纤维化程度分成四级:
“-”:肝组织正常,无纤维化组织增生
“+”:汇管区及窦隙有纤维组织增生。
“++”:肝小叶结构有破坏,纤维组织增生形成纤维间隔,有少量假小叶形成趋势。
“+++”:肝小叶结构破坏,纤维组织增生明显,假小叶广泛形成。
结果见表4、表5。
表4清肝化瘀胶囊对免疫损伤性肝纤维化大鼠肝纤维化程度的影响(HE染色)
组别 |
剂量(g生药/kg) |
动物数(只) |
HE染色,肝纤维化程度 | p |
- |
+ |
++ |
+++ |
正常对照组模型对照组清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊复方鳖甲软肝片秋水仙碱 | 0.91.83.620.25mg |
10101011111110 |
10137854 |
0311123 |
0111032 |
0552211 | <0.01>0.05<0.05<0.05<0.05<0.05 |
注:不同肝纤维化程度下的数为各剂量组达到此程度的动物数,表5同表4
表5清肝化瘀胶囊对免疫损伤性肝纤维化大鼠肝纤维化程度的影响(Masson染色)
组别 |
剂量(g生药/kg) |
动物数(只) |
Masson染色,肝纤维化程度 | p |
- |
+ |
++ |
+++ |
正常对照组模型对照组清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊复方鳖甲软肝片秋水仙碱 | 0.91.83.620.25mg |
10101011111110 |
10137854 |
0311123 |
0111032 |
0552211 | <0.01>0.05<0.05<0.05<0.05<0.05 |
表4、表5表明:与正常对照组比较,模型对照组肝纤维化程度明显增高,表明造模成功。与模型对照组比较,清肝化瘀胶囊1.8、3.6g药粉/kg剂量组肝纤维化程度明显减轻,表明对肝纤维化有明显的防治作用,并随剂量增加,作用增强。阳性对照药复方鳖甲软肝片、秋水仙碱亦有明显作用。
5试验结论
采用静注牛血清白蛋白复制大鼠免疫损伤性肝纤维化模型,结果显示,与正常对照组比较,模型对照组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显增高,明显增生的纤维组织将肝组织分成广泛的假小叶;清肝化瘀胶囊1.8、3.6g药粉/kg剂量组肝脏羟脯氨酸含量明显减少,肝纤维化程度明显减轻,并随剂量增加,作用增强,表明清肝化瘀胶囊对免疫性肝纤维化有明显的防治作用。
试验二、清肝化瘀药物(治疗肝纤维化药物)对急性与慢性
肝损伤的防治作用
1.实验材料:
清肝化瘀胶囊:按实施例二制备的硬胶囊,即本发明治疗肝纤维化药物,内容物为红棕色粉末。
联苯双酯,北京协和药厂出品,批号970419。
动物:昆明种小鼠及SD大鼠,均由河北省实验动物中心提供,合格证号分别为04056及04057号,实验观察期间饲以该中心提供的固体饲料,自由饮水。
2.试验方法
2.1对小鼠四氯化碳急性肝损伤的影响
方法:取小鼠60只,雌雄各半,体重20-25g,随机分为6组,每组10只。空白对照组和模型对照组给予水;清肝化瘀胶囊分三个剂量组:0.9g、1.8g和3.6g/kg;联苯双酯0.2g/kg。以上各组均灌胃给药,容积0.2ml/10g体重,一天一次,连续7天。于给药第6天后,除空白对照组外均腹腔注射1%四氯化碳油溶液0.1ml/10g体重。
末次给药后1小时(给四氯化碳后20小时)各组小鼠均动脉取血,分离血清,赖氏法测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)。
然后将每只动物解剖,取同一叶、同一部位肝脏组织一小块,固定于10%福尔马林溶液,做病理切片进行组织学检查,按下列标准(刘廷快等,中药新药与临床药理1999;10(4):213-215)评价肝损伤程度:
-:正常肝细胞
+:肝细胞变性或点状坏死
++:肝细胞变性或灶性坏死,或病变的肝细胞小于肝小叶的1/3
+++:肝小叶1/3-2/3肝细胞坏死
++++:肝小叶超过2/3肝细胞坏死
观察空白对照组与模型对照组及模型对照组与各给药组ALT差别(t检验)以及肝损伤程度的差别(Ridit检验)。
结果:模型对照组的ALT极为显著地高于空白对照组(P<0.01),表明模型成功。清肝化瘀胶囊1.8g/kg可显著降低ALT(P<0.05),联苯双酯对ALT有极为显著的降低作用(P<0.01),实验结果见表1。
病理检查可见,模型组肝小叶1/3-2/3甚至超过2/3肝细胞坏死,清肝化瘀胶囊1.8和3.6g/kg组肝小叶细胞坏死较模型为轻(P>0.05),联苯双酯组的肝细胞坏死或变性,明显少于模型对照组(P<0.05),实验结果见表2。
表1:清肝化瘀胶囊对小鼠四氯化碳急性肝损伤模型转氨酶的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数(只) |
ALT(x±s)(u) |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.2 |
101010101010 |
48.8±38.5**293.9±9.6292.0±12.9285.3±7.0*288.7±11.6225.1±72.5** |
*P<0.05,**P<0.01与模型对照比
表2:清肝化瘀胶囊对小鼠四氯化碳急性肝损伤模型病理变化的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数(只) |
肝损伤程度 |
P值<0.01 |
- |
+ |
++ |
+++ |
++++ |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.2 |
81010101010 |
8 | 1225 | 99885 | 1 | | >0.05>0.05>0.05<0.05 |
2.2对小鼠D-半乳糖胺急性肝功能损伤的作用
方法:取小鼠60只,雌雄各半,体重20-25g,随机分为6组,每组10只。空白对照组和模型对照组给予水;清肝化瘀胶囊分三个剂量组:0.9g、1.8g和3.6g/kg;联苯双酯0.2g/kg。以上各组均灌胃给药,容积0.2ml/10g体重,一天一次,连续10天。
于末次给药后1小时,除空白对照组外,每鼠均腹腔注射D-半乳糖胺650mg/kg,20小时后动脉放血处死小鼠,收集血液分离血清,按赖氏法测定丙氨酸氨基转换酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转换酶(AST)含量。用t检验比较空白对照组及各给药组与模型对照组间差异的显著性。
结果:模型组的ALT及AST含量均较空白对照组显著增高,表明模型成功。清肝化瘀胶囊0.9g、1.8g和3.6g/kg组ALT含量均较模型对照组显著为低(P<0.05);1.8g/kg尚可显著降低AST含量(P<0.05)。联苯双酯组ALT含量亦显著较模型对照组为低(P<0.05,表3)。
表3:清肝化瘀胶囊对小鼠D-半乳糖胺急性肝功能损伤的作用
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数(只) |
ALT(x±s)(u) |
AST(x±s)(u) |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.2 |
101010101010 |
55±17**233±53188±40*183±47*180±49*190±24* |
355±51**605±196519±52462±58*473±86603±69 |
*P<0.05,**P<0.01与模型对照比
2.3对大鼠四氯化碳慢性肝损伤的影响
方法:取SD大鼠,雄性110只,体重225-349g,随机分为6组,除空白对照组10只外,其余每组均20只。空白对照组和模型组给予水;清肝化瘀胶囊分三个剂量组:0.9g、1.8g和3.6g/kg;阳性对照药联苯双酯0.1g/kg。均灌胃给药,容积1ml/100g体重。每天1次,连续10周。除空白对照外,每周2次皮下注射40%四氯化碳花生油溶液3ml/kg,连续10周。
于末次给药后次日,取血,按赖氏法测定天门冬氨酸氨基转换酶(AST)和丙氨酸氨基转换酶(ALT),双缩脲法测定总蛋白(TP),溴甲酚绿法测定白蛋白(ALB)并计算白蛋白/球蛋白比值(A/G)。然后处死动物,取肝脏一小块,测定肝羟脯氨酸含量,最后用甲醛固定肝脏,石蜡包埋,Masson染色,根据以下病理组织学分级标准打分(王宝恩等:肝脏病杂志,1993:1:69-72)。
0级:肝组织正常
I级:胶原纤维从汇管区或中心静脉向外延伸
II级:胶原纤维明显延伸,但尚未相互连接包绕整个肝小叶
III级:胶原纤维延伸连接,包绕整个肝小叶
IV级:胶原纤维包绕分割肝小叶,使正常肝小叶结构破坏,假小叶形成,但以大、方形假小叶为主
V级:肝内布满小园形假小叶,形成大方形及小园形假小叶各占50%
VI级:肝内布满小园形假小叶,假小叶间有粗大增生胶原纤维
病理分级用Ridit检验,其它指标均用t检验,比较各给药组与模型对照组差别的显著性。
结果:1、存活大鼠及体重:首次注射40%四氯化碳3ml/kg,采用的是腹腔注射,3日后出现大鼠死亡,后改为皮下注射,仍有部分死亡,以模型对照组死亡最多,中剂量组死亡较少。体重变化:大剂量组体重较空白对照组轻(P<0.05),与模型对照组无区别。见表4。
表4、清肝化瘀胶囊对大鼠给予四氯化碳存活数及体重的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
原始动物数(只) |
10周后动物数(只) |
原始体重(g) |
10周后体重(g) |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.1 |
102020202020 |
101012151313 |
281±28289±28286±27290±25287±25285±31 |
358±38339±42338±35347±26325±26331±31 |
*P<0.05与空白对照比
2、对转换酶的影响:清肝化瘀胶囊1.8g和3.6g/kg均可使四氯化碳升高的AST降低(P<0.05)。3.6g/kg可显著降低ALT(P<0.05),联苯双酯可使AST和ALT显著降低(P<0.01)。实验结果见表5。
表5、清肝化瘀胶囊对大鼠四氯化碳慢性肝损伤血清转换酶的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数(只) |
ALT(x±s)(u) |
AST(x±s)(u) |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.1 |
101012151313 |
380±55**589±49545±71525±74*530±47*506±49** |
44±9**138±34146±43149±52109±21*66±12** |
*P<0.05,**P<0.01与模型对照比
3、对血清蛋白质含量的影响:各剂量清肝化瘀胶囊及联苯双酯对血清总蛋白(TP)含量均无明显影响(P>0.05);3.6g/kg显著升高白蛋白含量(P<0.01),A/G比值亦明显升高(P<0.05),联苯双酯对ALB和A/G比值无影响,实验结果见表6。
表6、清肝化瘀胶囊对大鼠四氯化碳慢性肝损伤蛋白质含量的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数(只) |
TP(g/l) |
ALB(g/l) |
A/G比值 |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.1 |
102012151313 |
69.1±5.869.6±7.862.8±8.464.9±9.669.3±6.268.1±8.8 |
44.1±2.742.3±2.641.9±4.244.7±4.347.5±2.2**41.6±1.7 |
1.84±0.411.61±0.462.59±1.682.33±1.502.40±0.91*1.84±1.13 |
*P<0.05,**P<0.01与模型对照比
4、对肝组织羟脯氨酸含量的影响:清肝化瘀胶囊3.6g/kg可显著减少被四氯化碳增高的肝组织羟脯氨酸含量(P<0.05),联苯双酯亦可显著降低肝羟脯氨酸含量(P<0.05),实验结果见表7。
表7、清肝化瘀胶囊对大鼠四氯化碳慢性肝损伤肝羟脯氨酸含量的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数(只) |
肝羟脯氨酸含量(x±s)(μg/kg) |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.2 |
101012151313 |
34±8**66±1858±1656±1752±13*50±12* |
*P<0.05,**P<0.01与模型对照比
5、肝组织病理检查:模型对照组可见肝小叶结构完全破坏,形成大方形及园形假小叶约各占一半。清肝化瘀胶囊1.8g和3.6g/kg组可见肝胶原纤维延伸,尚未或已相互接连包绕整个肝小叶,有的胶原纤维包绕分割肝小叶,使正常肝小叶结构破坏,形成假小叶。按组织学分级标准打分,并按Ridit检验其显著性。与模型对照相比,空白对照组、1.8g及3.6g/kg具有统计学显著性(P<0.05和0.01),实验结果见表8。
表8、清肝化瘀胶囊对大鼠四氯化碳损伤肝脏病理学分级的影响
组别 |
剂量(g/kg) |
动物数(只) |
病理学分级 |
P值 |
0 |
I |
II |
III |
IV |
V |
VI |
空白对照模型对照清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊清肝化瘀胶囊联苯双酯 |
--0.91.83.60.1 |
1012151313 |
10 | 31 | 2321 | 1442 | 27456 | 64114 | |
<0.01>0.05<0.05<0.05>0.05 |
2.4结论:对小鼠四氯化碳急性肝功能损伤,清肝化瘀胶囊1.8g/kg可降低ALT(P<0.05),对肝组织损伤略有减轻作用。对D-半乳糖胺小鼠急性肝功能损伤,清肝化瘀胶囊0.9g、1.8g和3.6g/kg可降低ALT(P<0.05);1.8g/kg可降低AST(P<0.05)。对大鼠四氯化碳慢性肝功能损伤,清肝化瘀胶囊1.8g和3.6g/kg可降低AST(P<0.05),3.6g/kg可降低ALT(P<0.05);清肝化瘀胶囊3.6g/kg可提高血清ALB含量(P<0.05)及A/G比值(P<0.05);降低肝组织羟脯氨酸含量(P<0.05);对肝脏病理学分级,清肝化瘀胶囊1.8g和3.6g/kg可明显减轻病变程度(P<0.05)。