CN114470094A - 一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的中药组合物及其制备方法 - Google Patents

一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的中药组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗肝纤维化技术领域，特别涉及一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的药物组合物及其制备方法。本发明提供的中药组合物，其原料包括如下重量份的组分：君：生地黄20‑60份；臣：枸杞12‑25份、沙参9‑18份、麦冬9‑18份、黄芪10‑30份；佐：当归9‑24份、水蛭1‑3份、鳖甲12‑18份；使：柴胡6‑12份。该中药组合物针对肝纤维化的病因和病机，利用多种中药的活性成分的相互协同作用，发挥化瘀养阴益气、补肾填精、保肝护肝的功效，同时通过促进骨髓间充质干细胞向肝脏迁移，并增殖分化等方式，提高干细胞抗肝纤维化的作用，且疗效显著。

Description

一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的中药组合物及其制 备方法
技术领域
本发明涉及抗肝纤维化技术领域，特别涉及一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的药物组合物及其制备方法。
背景技术
肝纤维化是一种创伤愈合性反应，临床上病毒性肝炎、酒精性肝炎、脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎以及胆汁淤积型肝炎等肝脏疾病均可引起肝纤维化。临床上肝纤维化常出现胁部胀痛、黄疸、胁下积块等症状。
目前，西医抗肝纤维化的方法包括：药物治疗(a干扰素、拉米夫定和阿德福韦)、基因靶向治疗和干细胞疗法。
在药物治疗过程中，药物副作用仍是一个不容忽视的问题，如秋水仙碱；基因治疗存在的靶向性不可控、表达效率不足、可调控性及安全性不足等问题，因此通过基因治疗，逆转或治愈肝纤维化或许还需要一个较长的过程；当前，干细胞研究已经愈发深入，应用干细胞来治疗多种心脏、肝脏、骨关节等疾病已取得多方面的成果。
干细胞是指在动物胚胎或成体组织中能进行自我更新的未分化细胞，具有分裂能力。骨髓间充质干细胞是骨髓基质干细胞，是一种具有分化形成骨、软骨、脂肪、神经及成肌细胞的多种分化潜能的细胞亚群，是目前临床应用最多的干细胞。通过移植骨髓间充质干细胞，可促成组织再生和修复，改善脏器功能，是目前治疗肝纤维化的新思路。然而，骨髓间充质干细胞在人体内向肝脏迁移并增殖分化的作用并不显著，因而降低了通过移植干细胞抗肝纤维化的治疗效果。
与此同时，目前中医药治疗肝纤维化方面也取得了较大的成就，也显示出较为明显的优势。中医理论认为，肝纤维化的形成与“正虚”相关。初期肝木受病，继则肝病传脾，脾气虚弱、正气亏虚，续而久病及肾。因此在治疗上，滋阴益气养精、化瘀益髓，结合辨证论治原则，扶正固本为抗肝纤维化的基本治法。
目前治疗肝纤维化的单味中药主要有地黄、丹参、柴胡、白藜芦、苦参等，其中主要化学成分包括白藜芦醇、白芍总苷、丹参酚酸A、葫芦素B、甘草次酸等化合物；复方中药有扶正化瘀胶囊、安络化纤丸、肝爽颗粒、强肝胶囊等。然而，这些中成药在治疗相应证型的肝纤维化病变效果虽可观，但局限性较大、价格昂贵，且无明确的靶标，普适性较差。
现有医学研究还提出，可通过中医、中药诱导干细胞增殖分化、进而提高干细胞移植治疗效果的思路，其具有相当广阔的应用前景。例如，CN105079172A公开了一种治疗急、慢性乙肝及肝硬化的中药组合物，由以下重量配比的原料配伍组成：茵陈20-30份、红花15-20份、桃仁10-12份、莲子15-20份、茯苓8-10份、黄芪20-25份、白芍15-20份、酸枣仁10-15份，制成胶囊剂内服。该复方制剂，疗效确切；该组方能活血化瘀、软坚散结，同时兼顾驱邪扶正、益气健脾、疏肝理气，故治疗取得显效；该药方中总多糖≥15％，多糖具有免疫调节功能、抗病毒、抗感染、抗氧化等多种药效成分，能有效改善肝功能、抗肝纤维化、减轻干细胞的变形坏死、促进干细胞的再生。然而，该中药组合物并不能有效促进骨髓间充质干细胞在人体内向肝脏迁移，因而无法显著提高干细胞抗肝纤维化的治疗效果。
此外，CN107970274A公开了葛根促进骨髓间充质干细胞迁移的用途，但其仅限于治疗溃疡性结肠炎，由于肝脏与肠道机制不同，无法将葛根用于促进骨髓间充质干细胞向肝脏迁移。
发明内容
第一方面，本发明提供一种抗肝纤维化的中药组合物。该中药组合物针对肝纤维化的病因和病机，利用多种中药的活性成分的相互协同作用，发挥化瘀养阴益气、补肾填精、保肝护肝的功效，同时通过促进骨髓间充质干细胞向肝脏迁移，并增殖分化等方式，提高干细胞抗肝纤维化的作用，且疗效显著。
本发明提供的中药组合物，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20-60份；
臣：枸杞12-25份、沙参9-18份、麦冬9-18份、黄芪10-30份；
佐：当归9-24份、水蛭1-3份、鳖甲12-18份；
使：柴胡6-12份。
本发明通过对现有保肝、护肝的各类药味深入研究后，筛选以生地黄为君药，具有清热养阴，填精益髓的功效，辅以枸杞、沙参、麦冬、黄芪扶正固本、补气养阴；当归、水蛭、鳖甲活血软坚；柴胡引药入肝；各组分共奏化瘀养阴益气、补肾填精功效，不仅具有明显的保肝、护肝，降低转氨酶的作用，而且还可促进骨髓间充质干细胞向肝脏迁移及其增殖分化，从而显著提高干细胞抗肝纤维化的作用。通过两种机制途径的相互配合，能够有效地抑制肝脏组织的纤维化，进一步提高抗肝纤维化的治疗效果。
具体来讲，生地黄归心、肝、肾经，可镇静催眠，降压，强心，增强造血功能；具有扩张冠状血管、增强耐缺氧能力、保肝、抗氧化、降血糖、免疫调节、抗炎、抗真菌、抗肿瘤等功效。生地黄的化学成分以甙类为主，其中又以环烯醚萜甙类为主，兼具糖类、氨基酸以及葡萄糖胺等物质，其中益母草甙(leonuride)，桃叶珊瑚甙(aucubin)，梓醇，D-葡萄糖(D-glucose)，D-半乳糖(D-galactose)等在生地黄中具有较多含量。
现代药理研究表明，地黄水提取物明显促进抗绵羊红细胞(SRBC)抗体-溶血素生成，减少外周血液T淋巴细胞；实验研究发现地黄提取物可明显提高小鼠骨髓粒单系祖细胞集落形成单位产率；地黄多糖对环磷酰胺作用后小鼠骨髓粒系祖细胞有促进其恢复作用，并对放射损伤有一定的保护和促进恢复作用。
枸杞善滋补肝肾，益精明目，归肝、肾经，具有拟胆碱，降压，增强造血功能，增强耐缺氧能力，降血脂，保肝，延缓衰老，降血糖，免疫调节，抗肿瘤，抗突变，抗应激等方面的药理作用。枸杞中含有含生物碱、内脂、香豆精类、黄酮类、甾醇、有机酸、多糖、蛋白质及氨基酸类等。并含有约1％的甜菜碱及酸桨果红素。
枸杞可降低大鼠血中胆固醇。长期(75d)食用含枸杞水提物(0.5％与1％)的食物对四氯化碳引起的肝损害有保护作用，能抑制四氯化碳引起的血清及肝中的脂质，缩短硫喷妥钠睡眠时间，减少酚四溴[酉夫]钠(BSP)潴留，降低天冬氨酸转氨酶。研究发现枸杞水浸液对四氯化碳引起的肝损害有轻微的抑制脂肪在肝细胞内沉积和促进肝细胞新生的作用，对四氯化碳导致的肝脂质过氧化损伤亦起到明显的保护作用。
学者研究表明，枸杞提取液明显抑制肝匀浆过氧化脂质(LPO)的生成作用，并呈剂量反应关系；枸杞提取液可明显抑制肝LPO生成，并使血中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力和红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力增高。
沙参为桔梗科植物沙参、杏叶沙参、轮叶沙参、云南沙参、泡沙参及其同属数种植物的根，味甘、微苦，性微寒，归肺、胃经，具有补肺气，润肺化痰，生津止渴，补阴，健胃，清热的功效。沙参的主要化学成分有二十八(烷)酸、β-谷甾醇3-O-β-D-吡喃葡萄糖甙、苍耳甙、胡萝卜(甾醇)甙、刺五加甙、β-谷甾醇葡萄糖甙、胡萝卜甙、蒲公英赛酮等物质。
现代药理研究表明，北沙参可提高机体细胞免疫和非特异性免疫，抑制体液免疫，调节免疫平衡、提高淋巴细胞转换率。沙参水浸剂在试管内对奥杜盎小芽胞癣菌、羊毛样小芽胞癣菌等皮肤真菌有不同程度的抑制作用。
麦冬为百合科植物麦冬或沿阶草的块根，味甘、微苦，性微寒；归肺、胃、心经，有润肺、生津止渴、补阴、除烦、健胃、清心等功效；具有抗心律失常、抗心肌缺血、增强耐缺氧能力、降血脂、抑制平滑肌、抗氧化、延缓衰老、免疫调节、抗细菌等方面作用。麦冬主要含沿阶草苷、甾体皂苷、生物碱、谷甾醇、葡萄糖、氨基酸、维生素等有效成分。药理作用主要体现在保护心肌、增强免疫、降血糖、清除自由基及延缓衰老、促胃肠运动等方面。
经研究发现，小鼠腹腔注射麦冬注射液50g(生药)/kg，连续3d、能明显减轻长时间游泳后心肌细胞缺氧性损害、麦冬总皂甙10mg/kg静注可有效地预防或对抗由氯仿-肾上腺素、氯化钡、乌头碱所诱发的大鼠或兔心律失常，并使结扎犬冠状动脉24h后的室性心律失常发生率降低。
实验研究发现，麦冬注射液腹腔注射能明显提高皮下注射异丙肾上腺素小鼠在低压缺氧条件下的耐缺氧能力；显著增加小鼠的碳粒廓清作用和对抗环磷酰胺引起的小鼠白细胞数下降、小鼠的脾脏重量，显著增强小鼠的碳粒廓清作用，刺激小鼠血清中溶血素的产生，增强兔红细胞凝集率；游泳实验证明，麦冬总氨基酸口服能明显延长小鼠游泳持续时间。
黄芪是豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，性微温，味甘，归肺、脾经，具有补气固表、止汗、托毒、生肌、利尿退肿等功效。黄芪中主要含香豆业、黄酮类化合物、皂甙、微量叶酸、胆碱、甜菜碱、氨基酸、槲皮素、异鼠李素、鼠李果素、β－谷甾醇、亚油酸、亚麻酸，以及几种结晶成分、21种氨基酸和D－β－天冬素，以及黄芪多糖等有效成分。
黄芪主要药理作用包括降压、强心、增强造血功能、抗心肌缺血、扩张外周血管、增强耐缺氧能力、保肝、抗氧化、延缓衰老、改善肾功能、免疫调节、抗病毒、抗肿瘤、抗突变、抗应激、促进合成代谢等作用。
腹腔注射黄芪注射液，连续6d，能防治环磷酰胺所致大鼠外周血白细胞、网织细胞和血小板数以及骨髓巨核细胞数的降低。年老大鼠(16月龄)主动脉和肺中胶原含量明显高于年轻大鼠(8月龄)，服黄芪煎剂10g/kg，连服8星期，可明显降低年老大鼠主动脉和肺的胶原含量而与年轻大鼠无明显差别。提示其对预防老年性动脉硬化、改善衰老的肺功能有一定意义。体外实验发现，多代培养的人胎肺二倍体成纤维细胞会随代龄增加，细胞的增殖能力、超氧化物歧化酶(SOD)含量和每代的存活时间均明显下降，但同一代龄，给药组细胞的增殖能力、SOD含量和一代存活时间均高于对照组，且随代龄增加，这种差距更加明显，从超微结构观察，细胞器之衰老改变也较轻。黄芪煎剂可使失血性贫血和乙酰苯肼所致溶血性贫血的外周血红细胞和血红蛋白增加，对环磷酰胺所致白细胞和血小板减少有促进其恢复的作用，能增加网织红细胞数和骨髓有核细胞数。
当归为伞形科多年生草本植物当归的根；性甘、辛、温；归肝、心、脾经。有补血、活血、调经止痛、润燥滑肠等功效。当归主要成分含挥发油和非挥发性成分两类。挥发油中中性油占总油的88％。主要有α－蒎烯、月桂烯、β－罗勒烯、藁本内酯、新当归内酯、维生素B12等，其中藁本内酯为主要成分；其次是酚性油，主要有香荆芥酚、苯酚、对甲苯酚；酸性油主要有邻苯二甲酸、癸二酸等。非挥发性化学成分有新当归内酯、阿魏酸等18种，另外，当归中还含有多种氨基酸和多种微量元素。
当归的主要药理作用包括镇静催眠、镇痛、抗心律失常、解热、降压、抗血小板聚集、增强造血功能、扩张冠状血管、抗心肌缺血、扩张外周血管、增强耐缺氧能力、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗血栓、抑制平滑肌、止泻、利胆、保肝、抗氧化、平喘、利尿、抗炎等方面。
当归水煎剂对二甲基亚砜在碱性有氧条件下产生超氧阴离子自由基猝灭率达96％；当归在体外对人血SOD有十分显著的激活作用。当归水煎液对多种致炎剂引起的急、慢性炎症均有显著的抑制作用，摘除双侧肾上腺后其抗炎作用仍然存在；并能降低大鼠炎症组织PGE-2的释放量，降低豚鼠补体旁路溶血活性。当归对保护肝细胞和恢复肝脏某些功能有一定效果。对四氯化碳引起的大鼠急性肝损伤，可使炎症反应明显减轻，血清转氨酶稍下降；对引起的肝硬变，可使肝组织胶原量减少，硬化程度减轻。对部分肝切除大鼠，当归能增高肝组织核分裂相指数，故具有一定促进肝再生作用。当归对D-氨基半乳糖造成大鼠急性肝损伤的肝细胞损害(5‘-核苷酸酶和ATP酶活性降低)、肝细胞线粒体损伤(琥珀酸脱氢酶活性降低)均有明显的保护作用；对肝细胞内质网损害(葡萄糖-6-磷酸酶活性增高)的组织化学变化有改善作用；对肝糖原含量减少有拮抗作用。
水蛭是中国传统特种要用水生生物，咸、苦，平；有小毒；归肝经。具有破血通经，逐瘀消症。用于血瘀经闭，症瘕痞块，中风偏瘫，跌扑损伤等功效。水蛭的主要成分是包括蛋白质、多肽、微量元和脂肪酸素等多种物质。水蛭具有抗凝、抗血栓、增加血流量、保护缺氧组织、改善微循环、抗肿瘤等作用。研究发现，中药复方水蛭桃仁汤对二甲基亚硝胺诱导的实验性大鼠肝纤维化具有良好的防治作用、且可抑制血吸虫病小鼠的肝纤维化。
鳖甲为鳖科动物鳖的背甲，味咸，性微寒，归肝、肾经。具有滋阴潜阳，退热除蒸，软坚散结等功效。鳖甲的主要成分为动物胶，角蛋白，碘质，维生素D及其他矿物质。其主要药理作用为补血作用和抗肿瘤作用。
实验研究发现，连续11日灌胃鳖甲胶(20％)0.5ml/只，可使小鼠血红蛋白含量明显增加。对接种人肠癌细胞的裸鼠每日按800mg/kg剂量口服鳖甲粉，治疗35d后与对照组比较，抑瘤率为92.15％，肿瘤坏死面积达67％，与5-氟尿嘧啶(5-Fu)组比较其优点是不引起宿主白细胞数下降，表明鳖甲粉不仅对人肠癌有抑制作用，且副反应小，对骨髓的抑制远比5-Fu轻。
柴胡为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根，味辛、苦，性微寒；归肝、胆、肺经。具有和解表里，疏肝解郁，升阳举陷，退热截疟功效。柴胡中主要有效物质为柴胡皂甙，其次是植物甾醇、侧金盏花醇，以及少量挥发油等。主要药理作用包含镇静催眠、抗惊厥、镇痛、解热、降温、降压、降血脂、镇咳、抗胃损伤、抗溃疡、利胆、保肝、溶血、增强肾上腺皮质功能、升血糖、免疫调节、抗炎、抗细菌、抗病毒、抗钩端螺旋体、抗疟、抗肿瘤、抗辐射等作用。
研究发现，醋炙柴胡和醋拌柴胡能显著降低四氯化碳中毒小鼠的血清丙氨酸转氨酶(ALT)，有轻度减轻肝脏损伤的作用。柴胡对伤寒菌苗、乙醇、四氯化碳、D-半乳糖胺等所致的肝损害有明显的抗损伤和促进胆汁的分泌作用。柴胡皂甙能抑制D-半乳糖胺、四氯化碳及α-萘硫氰酸酯所致的实验性肝损害。柴胡皂甙20mg/kg腹腔注射能抑制D-半乳糖胺等所致的肝损害。柴胡皂甙20mg/kg腹腔注射能抑制D-半乳糖胺引起的大鼠肝损害，显著降低血清天冬氨酸转氨酶(AST)、ALT活性。柴胡皂甙及柴胡皂甙a、b～1、b～2、c、d对实验性肝损害有显著抑制作用，柴胡皂甙d并对四氯化碳造成的慢性肝炎也有显著效果。柴胡皂甙a能降低四氯化碳引起的实验性肝损伤小鼠血清中ALT的含量，降低肝脏中过氧化脂质的三酰甘油的含量，增高肝脏中还原型谷胱甘肽(GSH)的含量。柴胡皂甙d可抑制四氯化碳引起的肝细胞微粒体酶系中葡萄糖-6-磷酸酶活性的降低以及5’-核苷酸酶活性的增加，从而减轻了四氯化碳引起的实验性肝损伤作用。小鼠腹腔注射柴胡多糖100mg/kg，可显著增加脾系数、腹腔巨噬细胞吞噬百分数及吞噬指数和流感病毒血清中和抗体滴度，但不影响脾细胞分泌溶血素，柴胡多糖对正常小鼠迟发超敏反应无作用，但可以完全及部分恢复环磷酰胺或流感病毒对小鼠迟发超敏反应的抑制。
本领域技术人员知晓，药物配伍与常规组合物调配不同，两种药材即便在某一方面均有功效，但组合后并不一定产生叠加效果或协同效果，也有可能存在作用抵消的情况；而目前本领域还未掌握保肝护肝药材之间的作用规律，因而难以确定合适的药材，使其配伍后产生协同增效的作用。因此如何从现有众多保肝护肝药材中筛选合适的组分配伍，使其产生协同作用，避免彼此之间作用抵消拮抗，是本发明的技术难点之一。
同时，根据现有研究结果可知，目前本领域中药组合物的作用较为单一，或单独从中药机制保肝护肝，或者协同干细胞仅用于其增殖分化，或者仅用于引导干细胞向部分器官迁移，但还未见兼具保肝、护肝、促进干细胞增殖分化及促进干细胞向肝脏迁移的具有多重功效的中药组合物。因此，本发明所述的中药组合物对现有抗肝纤维化治疗作出了十分重要的贡献。
优选地，所述中药组合物，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20-30份；
臣：枸杞12-18份、沙参9-12份、麦冬9-15份、黄芪15-30份；
佐：当归9-12份、水蛭1-3份、鳖甲12-15份；
使：柴胡6-9份。
特别优选地，所述中药组合物，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20份；
臣：枸杞12份、沙参9份、麦冬9份、黄芪20份；
佐：当归9份、水蛭3份、鳖甲12份；
使：柴胡6份。
第二方面，本发明还提供上述抗肝纤维化的中药组合物冻干粉的制备方法，包括：先制成汤剂，再浓缩，醇提，加入甘露醇冻干。
具体操作如下：
(1)将各组分混合，冷水浸泡后煮沸；滤除首次药液后，加水煎煮，取前后2次滤液合并，得到合并液；
(2)将合并液蒸发至原体积的50％，得到浓缩液；
(3)将浓缩液醇提，再加入甘露醇冷存后冻干，粉碎。
其中，所述冻干条件为：于-75～-85℃条件下冻存4-4.5h，通过冻存作用蒸干药液中的剩余水分；并控制在此条件冻存，更有利于最大程度保留药物制剂中的有效成分。
所述甘露醇添加量为所述原料总质量的9-11％。甘露醇添加比例不当，会影响冻干粉的结晶状态、影响冻干粉存储。为此，本发明优化调整甘露醇的添加比例，起到促凝、促进药物析出的作用。
第三方面，本发明还提供一种中药制剂，其含有上述中药组合物和药剂学上可接受的辅料。所用的药物辅料可以是淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维、明胶、蔗糖、硬脂酸镁等。
所述中药制剂可制成临床可以接受的口服剂型；如胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液等。临床上需要长期用药，制成固体制剂贮存方便，患者服用便利，也更适应市场需求。优选的剂型是胶囊剂、颗粒剂、片剂。
第四方面，本发明还提供上述中药组合物及中药制剂在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。
优选地，本发明所述的中药组合物或中药制剂可作为预防和/或治疗肝纤维化药物的治疗药物、与预防药物(如活血药、补益药)，具体可根据实际需要调整剂量。
本发明的有益效果如下：
1、本发明所述的中药组合物，配伍科学，疗效确切，安全性高，质量可控。
2、本发明所述的中药组合物，具有化瘀养阴益气、补肾填精的功效，可促进骨髓间充质干细胞向肝脏迁移发挥抗肝纤维化作用，能有效延缓肝纤维化进程。
3、本发明所述的中药组合物，作用途径多，药物作用靶点多，作用机制独特，药物针对关键病理环节，药物抗肝纤维化的疗效显著。
4、本发明所述的中药组合物，用药量低，成本低廉。
附图说明
图1为H-E染色后光镜下各组大鼠肝组织的病理改变情况。
图2为采用Masson染色后肝组织内纤维化程度。
图中：A、正常组；B、模型组；C、阳性药组；D、给药组(高剂量)；E、给药组(中剂量)；F、给药组(低剂量)；G、给药组(活血药)；H、给药组(补益药)；I、干细胞组；J、给药加干细胞组。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的药物组合物，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20份；
臣：枸杞12份、沙参9份、麦冬9份、黄芪20份；
佐：当归9份、水蛭3份、鳖甲12份；
使：柴胡6份。
本实施例还提供上述中药组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备汤剂
先取适宜煎煮容器，放入上述各与原料药材。取药材量7倍的冷水浸泡1h；随后加热煮沸，保持20min，随后滤出首次药液。
滤除首次药液后，加入原药材3倍量的水煎煮，煮沸后保持30min，取前后2次滤液合并。
(2)制备浓缩液
取步骤(1)合并所得的药液置于蒸发容器内，对药液进行加热蒸发，将药液蒸发至原体积的50％，得到浓缩液，封存。
(3)制备冻干粉
将步骤(2)中所得的浓缩液加入无水乙醇至70％，待析出沉淀后，过滤，旋转蒸发至无醇味，加入10％甘露醇，于-80℃条件下冻存4h。放入冷冻干燥机冻干48h以上，待水分全部冻干后，研磨粉碎。
药效试验
试验例1实施例1所得中药组合物对四氯化碳致大鼠肝纤维化的质量作用
试验材料：
实施例1所得中药组合物冻干粉；
秋水仙碱：西双版纳药业有限责任公司，批号：200101；
50％CCl4溶液：取橄榄油、CCl4按1：1配制；
试验方法：
取清洁级雄性SD大鼠60只，体重180-220g，全雄；其中10只大鼠作为正常组(不造模)，其余50只大鼠采用四氯化碳制备大鼠肝纤维化模型。
正常组10只大鼠注射等量的橄榄油溶液。
其余50只大鼠构建CCl4诱导的肝纤维化模型：
初始两周腹腔注射50％CCl4溶液，注射量为0.2mL/100g，每周2次；
随后两周注射量为0.1mL/100g，每周2次；
最后两周注射量为0.05mL/100g，每周2次。
造模8周后随机处死2只大鼠，取肝脏做病理组织学检查，证实已造成肝纤维化模型。
将造模成功的大鼠随机分为5组，即模型组、阳性药组、给药组(高剂量)、给药组(中剂量)、给药组(低剂量)、给药组(活血药)、给药组(补益药)、干细胞组、给药加干细胞组，停止造模并开始干预。
干预处理如下：
所有大鼠灌胃容积均为0.5ml/100g；
正常组：灌胃给予等容积的生理盐水；
模型组：灌胃给予等容积的生理盐水；
阳性药组：灌胃给予0.25mg/kg的秋水仙碱；
给药组(高剂量)：灌胃给予实施例1所得中药组合物，每日一次，生药0.4g/100g；
给药组(中剂量)灌胃给予实施例1所得中药组合物，每日一次，生药0.2g/100g；
给药组(低剂量)灌胃给予实施例1所得中药组合物，每日一次，生药0.1g/100g；
活血药组灌胃给予活血药，每日一次，生药0.22g/100g；所述活血药的成分为：柴胡6份、当归9份、水蛭3份、鳖甲12份。相比实施例，缺少生地黄、枸杞、沙参、麦冬、黄芪。
补益药组灌胃给予补益药，每日一次，生药0.28g/100g；所述补益药的成分为：生地黄20份、枸杞12份、沙参9份、麦冬9份、黄芪20份。相比实施例，缺少当归、水蛭、鳖甲、柴胡。
干细胞组：静脉注射干细胞；0.1mL/100g的BMSCs(浓度为5×106mmol/L),造模后尾静脉注射。
给药加干细胞组：灌胃给药组同等剂量的中药组合物，及静脉注射干细胞组同等剂量的干细胞；其具体给药剂量为每日一次，0.2g/100g；0.1mL/100g的BMSCs尾静脉注射。
(1)连续灌胃给药8周，每天观察动物一般情况，于末次给药后次日空腹采血，分离血清，以全自动生化分析仪检测血清中AST、ALT指标，如表1所示。
表1对四氯化碳所致肝纤维化大鼠肝功能的影响
Figure BDA0003524905490000121
组别 n ALT(U/L) AST(U/L)
正常组 10 46.37±19.30 104.50±31.61
模型组 10 58.10±27.80 177.65±114.12
阳性药组 10 34.00±6.15<sup>*</sup> 95.72±13.08<sup>*</sup>
给药组(高剂量)0.4g/100g 10 38.3±6.22<sup>*</sup> 104.40±18.06<sup>*</sup>
给药组(中剂量)0.2g/100g 10 34.3±3.23<sup>*</sup> 94.33±14.05<sup>*</sup>
给药组(低剂量)0.1g/100g 10 43.3±6.52<sup>*</sup> 112.43±14.46<sup>*</sup>
干细胞组 10 43.58±4.94<sup>*</sup> 171.58±89.94<sup>*</sup>
给药加干细胞组，0.2g/100g 10 39.00±13.37<sup>*#</sup> 88.00±11.90<sup>*#</sup>
给药组(活血药)0.22g/100g 10 56.3±9.22<sup>&amp;</sup> 132.43±34.16<sup>&amp;</sup>
给药组(补益药)0.28g/100g 10 58.3±6.24<sup>&amp;</sup> 122.43±24.41<sup>&amp;</sup>
注：与模型组比较，*P＜0.05；与干细胞组比较，#P＜0.05；与给药组(中剂量)比较，&P＜0.05。
表1检测结果说明：
由四氯化碳所诱导的肝纤维化模型大鼠的肝功能有明显损伤，模型组大鼠血清AST、ALT均极显著地高于正常组(P＜0.05)。
给药组(高、中、低剂量)、给药加干细胞组的大鼠血清AST、ALT水平与模型组相比均有显著降低(*P＜0.05)，说明本发明中药组合物治疗效果显著，大鼠肝功能明显恢复。
其中，与模型组相比，高中低剂量组对应的肝组织内纤维化程度均明显减轻，肝组织改变与正常组基本相似，但高剂量与低剂量对肝功能的改善程度低于中剂量。根据结果可知，本例药物同组分，故具有同样保肝护肝的功效，但因给药剂量的不同，其抗纤维化效果存在差异，其中给药组(中剂量)的效果最优。
给药加干细胞组的大鼠血清AST、ALT水平与干细胞组相比均有显著降低(#P＜0.05)，说明本发明中药组合物能够促进干细胞改善四氯化碳所诱导的肝纤维化模型大鼠的肝功能。
同时，给药组(活血药)、给药组(补益药)的大鼠血清AST、ALT水平与给药组(中剂量)相比显著升高，说明补益药物和活血药物的治疗并不对证，所以二者对肝脏的保护作用弱于实施例1方剂。
以放免法检测血清中肝纤维化指标HA、PCIII，如表2所示。
表2对四氯化碳所致肝纤维化模型大鼠血清中肝纤维化指标的影响
Figure BDA0003524905490000131
Figure BDA0003524905490000132
Figure BDA0003524905490000141
注：与模型组比较，*P＜0.05；与干细胞组比较，#P＜0.05；与给药组(中剂量)比较，&P＜0.05。
由表2结果可见：
给药组(高、中、低剂量)、给药加干细胞组的大鼠血清中HA、PCIII指标及纤维化评分与模型组相比均有显著降低(*P＜0.05)，说明本发明中药组合物能明显降低血清HA和PCIII水平(*P＜0.05)。
给药加干细胞组的大鼠血清中HA、PCIII指标及纤维化评分与干细胞组相比均有显著降低(#P＜0.05)，说明本发明中药组合物能够明显促进骨髓间充质干细胞改善四氯化碳所致肝纤维化大鼠血清中相关肝纤维化指标(#P＜0.05)。
同时，给药组(活血药)、给药组(补益药)的大鼠血清HA、PCIII水平高于给药组(中剂量)(&P＜0.05)，说明单纯的补益药组和活血药组在治疗中并不符合本病的证型，故对肝纤维化的抑制作用并不显著；给药组(中剂量)将两组药物结合，其效果显著优于两组药物单独使用，由此说明本实验例1方剂并非简单的药物组合，而是将补益和活血巧妙结合的方剂，故才可取得良好的抗纤维化效果。
(2)病理组织学检查：
采血后处死动物并取肝脏组织，标本经常规10％福尔马林液固定，石蜡切片，H-E染色，光镜下观察各组大鼠肝组织的病理改变情况，并采用Masson染色观察肝组织内纤维化程度。如图1、图2所示。
正常组：大鼠肝脏颜色鲜红，表面光滑，边缘锐利，质地较软。
模型组：大鼠肝脏肿大，边缘钝，质地硬，颜色较浅，肝脏与周围器官粘连广泛，HE染色可见明显细胞肿胀、坏死，Masoon染色显示周围胶原纤维增生。
各给药组(阳性药组、给药组-高剂量、给药组-中剂量、给药组-低剂量、、给药组-化瘀药、给药组-补益药、干细胞组、给药加干细胞组)：大鼠肝脏形态与正常组接近，HE、Masson染色观察发现炎症程度和纤维化程度明显轻于模型组。
病理组织学检查结果表明：
正常组大鼠肝组织均未见明显的病理改变，肝小叶结构存在，肝板排列整齐，个别例结构稍紊乱，以中央静脉为中心向周围放射状排列，肝细胞多边形，浆丰富，核大而圆，少见双核，Masson染色见肝组织内除中心静脉及小胆管周围见环形的胶原纤维外，其余处未见胶原纤维。
而模型组大鼠病变非常显著，肝组织小叶结构被破坏，可见大量纤维组织增生、穿插，将肝组织分割为大小不等的圆形或椭圆形假小叶，Masson染色显示肝组织内大量纤维组织增生，由此提示大鼠肝纤维化模型造模成功。
本发明药物组各例与模型组相比，肝组织内纤维化程度均明显减轻，肝组织改变与正常组基本相似。
病理组织学检查结果表明，本发明中药组合物对肝纤维化大鼠肝纤维组织增生有显著的改善作用，说明本发明中药具有明显的治疗肝纤维化作用。本发明中药组合物对于骨髓间充质干细胞改善肝纤维化大鼠肝功能和肝纤维化指标均有显著的促进作用。
(3)干细胞迁移情况考察
表3对大鼠干细胞迁移到肝脏荧光面积的影响
Figure BDA0003524905490000151
组别 n 分布面积(平方微米)
正常组 10 0.00±0.00<sup>*</sup>
模型组 10 156.23±37.66
阳性药组 10 314.86±113.45
给药组(高剂量)0.4g/100g 10 487.68±285.99<sup>*</sup>
给药组(中剂量)0.2g/100g 10 427.32±266.59<sup>*</sup>
给药组(低剂量)0.1g/100g 10 387.68±155.35<sup>*</sup>
干细胞组 10 774.33±185.29<sup>*</sup>
给药加干细胞组，0.2g/100g 10 2344.55±334.56<sup>*#</sup>
给药组(活血药)0.22g/100g 10 237.68±115.74<sup>*</sup>
给药组(补益药)0.28g/100g 10 257.68±121.45<sup>*</sup>
注：与模型组比较，*P＜0.05；与干细胞组相比，#P＜0.05。
由表3结果可见，与模型组比较，给药组(高、中、低剂量)、干细胞组、给药加干细胞组、给药组(活血药、补益药)的荧光分布面积均显著性增大(*P＜0.05)；
特别是，与骨髓间充质干细胞组比较，给药加骨髓间充质细胞组的荧光面积更大(#P＜0.05)，由此说明本发明中药组合物能够显著促进骨髓间充质干细胞向肝脏迁移。
综上，通过上述药效试验结果可知，本发明中药组合物对于四氯化碳所诱导的肝纤维化大鼠的肝功能有明显的保护作用，能显著降低肝纤维化大鼠血清中AST、ALT水平(*P＜0.05)；显著降低肝纤维化大鼠血清中异常升高的HA和PCIII水平(*P＜0.05)。说明本发明药物对腹腔注射四氯化碳所引起的大鼠肝功能损伤有明显的防治作用。
通过组织学检查结果可知，本发明药物对四氯化碳所造成的肝纤维化大鼠的肝脏有明显的保护和预防作用，其肝脏组织病理学改变与模型组相比有显著的改善，说明本方具有明显的保肝作用。本发明中药组合物对于骨髓间充质干细胞改善肝纤维化的效果有显著的促进作用。
通过荧光面积可知，本发明中药组合物促进了骨髓间充质干细胞向肝脏迁移。
实施例2
本实施例提供一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的药物组合物，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄25份；
臣：枸杞15份、沙参9份、麦冬9份、黄芪20份；
佐：当归9份、水蛭3份、鳖甲12份；
使：柴胡6份。
实施例3
本实施例提供一种促进骨髓间充质干细胞抗肝纤维化的药物组合物，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20份；
臣：枸杞12份、沙参9份、麦冬9份、黄芪15份；
佐：当归12份、水蛭2份、鳖甲15份；
使：柴胡9份。
采用上述效果测试方法对实施例2和实施例3所得组合物进行药效试验，结果显示，实施例2和实施例3所得药物组合物的药效略差于实施例1，但药效整体趋势与实施例1相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种中药组合物，其特征在于，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20-60份；
臣：枸杞12-25份、沙参9-18份、麦冬9-18份、黄芪10-30份；
佐：当归9-24份、水蛭1-3份、鳖甲12-18份；
使：柴胡6-12份。
2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20-30份；
臣：枸杞12-18份、沙参9-12份、麦冬9-15份、黄芪15-30份；
佐：当归9-12份、水蛭1-3份、鳖甲12-15份；
使：柴胡6-9份。
3.根据权利要求2所述的中药组合物，其特征在于，其原料包括如下重量份的组分：
君：生地黄20份；
臣：枸杞12份、沙参9份、麦冬9份、黄芪20份；
佐：当归9份、水蛭3份、鳖甲12份；
使：柴胡6份。
4.权利要求1-3任一项所述中药组合物的制备方法，其特征在于，所述中药组合物为冻干粉；
所述制备方法包括：先制成汤剂，再浓缩，醇提，加入甘露醇冻干。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将各组分混合，冷水浸泡后煮沸；滤除首次药液后，加水煎煮，取前后2次滤液合并，得到合并液；
(2)将合并液蒸发至原体积的50％，得到浓缩液；
(3)将浓缩液醇提，再加入甘露醇冷存后冻干，粉碎。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述冻干条件为：于-75～-85℃条件下冻存4-4.5h。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述甘露醇添加量为所述原料总质量的9-11％。
8.一种中药制剂，其特征在于，包括：权利要求1-3任一项所述中药组合物和药剂学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的中药制剂，其特征在于，所述中药制剂的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、口服液。
10.权利要求1-3任一项所述中药组合物及权利要求8或9所述的中药制剂在制备预防和/或治疗肝纤维化药物中的应用。
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WO2006026926A1 (fr) * 2004-09-10 2006-03-16 Shijiazhuang Pharma. Group Zhongqi Pharmaceutical Technology (Shijiazhuang) Co., Ltd. Composition medicinale destinee au traitement de la cirrhose du foie, et preparation de la composition
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