CN1726220B - 亚磷酸酯化试剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了化合物R1-Y1-P(NR2R3)2的制备方法。该方法包括使化合物PX3与化合物HNR2R3反应生成化合物X-P(NR2R3)2；然后使化合物X-P(NR2R3)2与化合物R1-Y1-H在烃溶剂存在下反应生成化合物R1-Y1-P(NR2R3)2。R1表示磷保护基团；R2和R3各自独立地表示烷基，优选C1-6烷基基团，或者R2和R3相连与它们所连接的N共同形成5-7元环；Y1表示O或S，优选O；和X表示卤素，优选Cl。优选溶剂是甲苯。

Description

亚磷酸酯化试剂的制备方法
本发明涉及一种亚磷酸酯化(phosphitylation)试剂的制备方法。
合成低聚核苷酸是用于检测遗传疾病和病毒疾病的重要诊断工具。另外，低聚核苷酸和改性低聚核苷酸有作为抑制基因表达或蛋白质功能的治疗候选药物的可能。由于美国食品与药物管理局(FDA)批准低聚核苷酸衍生物用于细胞肥大病毒(CMV)的治疗，因此用作治疗候选药物的低聚核苷酸的大规模合成已变得日益重要，并且若干其它低聚核苷酸衍生物目前正处在临床试验阶段。各个临床试验均需要以千克计的纯化低聚核苷酸衍生物。
当前用于低聚核苷酸制备的主要方法是亚磷酰胺法。对更大量低聚核苷酸日益增加的需求已相应增加了对亚磷酰胺化合物的需要。亚磷酰胺化合物通常由核苷与亚磷酸酯化试剂在活化剂的存在下经由亚磷酸酯化制备。所以，相应增加了对亚磷酸酯化试剂的需求。因此，需要制备亚磷酸酯化试剂的改进或候选方法。
本发明提供了化合物R1-Y1-P(NR2R3)2的制备方法，其包括：
a)使化合物PX3与化合物HNR2R3反应生成化合物X-P(NR2R3)2；和
b)使化合物X-P(NR2R3)2与化合物R1-Y1-H在溶剂存在下反应生成化合物R1-Y1-P(NR2R3)2，
其中
R1表示磷(phosphorus)保护基团；
R2和R3各自独立地表示烷基，优选C1-6烷基基团，或者R2和R3相连与它们所连接的N共同形成5-7元环；
Y1表示O或S，优选O；
和X表示卤素，优选Cl；
其特征在于用于反应b)的溶剂是烃熔剂。
由R1表示的磷保护基团通常为用于低聚核苷酸合成中的可离去磷保护基团，例如取代或未取代脂族基，例如甲基，-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5，-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3，-CH2CH2-C6H4-NO2，优选-CH2CH2CN基团；或者取代或未取代芳基，如苯基或取代苯基，例如4-氯苯基，2-氯苯基，2-硝基苯基或4-硝基苯基。
化合物R1-Y1-H优选根据所要制备的化合物的性质来选择。特别优选的化合物R1-Y1-H是2-氰基乙醇。
在由本发明方法制备的化合物中，优选的是R2和R3相同。特别优选的是R2和R3都是-CH(CH3)2基团。特别优选的是Y1是O以及R1是-CH2CH2CN。
可由本发明方法制备的化合物例子包括O-β-氰乙基-N，N，N’，N’-四异丙基亚磷二酰胺(phosphorodiamidite)，(通称“四磷酸盐(tetraphos)”)，O-β-氰乙基-N，N，N’，N’-四甲基亚磷二酰胺，O-β-氰乙基-N，N，N’，N’-四乙基亚磷二酰胺，双(N，N-二异丙基氨基)-2-甲基三氟乙酰氨基-乙氧基膦，双(N，N-二异丙基氨基)-2-二苯基甲基甲硅烷基乙氧基膦和O-β-氰乙基-双(N-吗啉代)亚磷二酰胺。
可用于本发明所述方法的烃溶剂包括脂肪族和芳香族烃。脂肪族烃的实例包括戊烷，己烷和石油醚。芳香族烃的实例包括苯，甲苯，二甲苯和1，3，5-三甲基苯。甲苯是最优选的溶剂。
在许多优选实施方案中，反应a)在与反应b)所用溶剂相同的溶剂的存在下进行，尤其是存在甲苯的情况下。
化合物X-P(NR2R3)2与化合物R1-Y1-H之间的反应优选在碱的存在下进行。可用的碱包括无机碱如碳酸钠和有机碱。优选有机碱。有机碱的实例包括芳香胺如吡啶，和无机胺如烷基胺，优选三烷基胺如三(C1-4烷基)胺，最优选三乙胺。
在步骤a)中，化合物PX3与化合物HNR2R3的摩尔比通常选自约1∶1-约10∶1，优选约3∶1-约6∶1。
在步骤b)中，化合物X-P(NR2R3)2与化合物R1-Y1-H的摩尔比通常选自约1∶1-约5∶1，特别优选的是1∶1-1.5∶1。
当使用碱时，碱与化合物X-P(NR2R3)2的摩尔比通常为约0.75∶1-约2∶1，优选的是约1∶1-1.3∶1。
根据本发明方法的步骤a)的反应温度范围通常是在室温如约15-约30℃，直到所用溶剂的回流温度如约50-约120℃。
根据本发明方法的步骤b)的反应温度范围通常是在-25℃到室温如约15-约30℃，例如约-20℃-约0℃。尤其优选的温度为-20℃--10℃。
有利的是采用基本上无水的反应条件。
在大量实施方案中，本发明方法在惰性气氛下进行，如氮或氩气氛。
化合物R1-Y1-P(NR2R3)2有利地通过蒸馏法从反应混合物中分离，优选通过刮板式薄膜蒸馏法。
本发明特别优选的实施方案包括{[(CH3)2CH]2N}2-P-O-CH2CH2CN的制备方法，其包括a)将PCl3与[(CH3)2CH]2N-H在甲苯中反应生成{[(CH3)2CH]2N}2-P-Cl；和b)将{[(CH3)2CH]2N}2-P-Cl与HO-CH2CH2CN在甲苯中反应生成{[(CH3)2CH]2N}2-P-O-CH2CH2CN。
本发明通过如下实施例举例说明，但不限于此。
实施例
步骤a)
将二异丙基胺(383g)、甲苯(1087g)和氢化钙(10g)装入氮气吹扫过的2L圆底烧瓶中，该烧瓶装有磁性搅拌器和连接到N2鼓泡装置(bubble)上的指形冷凝蒸馏设备(cold-finger distillation head)，然后将混合物在充分回流(98℃)下加热2小时以除去所有的微量水分。将无水胺/甲苯混合物蒸馏进入烘干的氮气吹扫过的3L 4颈圆底烧瓶中，该烧瓶配有加在N2扩散器上的机械搅拌器、100ml等压加料漏斗、温度计套管和连接到N2鼓泡装置上的冷凝器，并冷却至室温(大约17℃)。在大约30min内由加料漏斗加入三氯化磷(99.999％，100g)。测出的混合物温度升至大约25℃。混合物加热至回流(100-110℃)并搅拌24小时；混合物随着二异丙基胺盐酸盐的沉淀变得很浓。混合物在氮气中冷却至室温并加压过滤以便除去胺盐，所有设备在使用前由烘箱烘干。滤饼用217g甲苯洗涤，并且将合并后的滤液和洗涤液真空蒸馏以除去大部分甲苯，混合物与固体沉淀物一样变成泥浆状。当甲苯不再蒸馏出来时，真空随着氮气的引入被破坏，蒸馏装置经由冷阱直接连接到真空泵。残留甲苯被抽出直至固体产物{[(CH3)2CH]2N}2-P-Cl达到恒重。经过31P NMR测量具有96-97面积％活性的该原料未经进一步纯化而用于步骤b)。
步骤b)三乙胺(49.4g)，甲苯(649.5g)和氢化钙(5g)装入氮气吹扫过的1L圆底烧瓶中，该烧瓶配有磁性搅拌器和连接到N2鼓泡装置上的指形冷凝蒸馏设备，混合物在充分回流(98℃)下加热2小时以除去所有的微量水分。将无水混合物蒸馏进入烘干的氮气吹扫过的2L 3颈套层圆底烧瓶中，该烧瓶配有机械搅拌器、温度计套管和连接到N2鼓泡装置上的50ml等压加料漏斗，并且使用循环冷凝器将混合物冷却至低于-15℃的温度，冷凝器通过将乙二醇/水输送通过套层而起冷却作用，并加入步骤a)的产物(130.3g)。在大约30min内由加料漏斗加入纯的2-氰基乙醇(39.9g)，保持温度低于-10℃。混合物在氮气中以及-15至-18℃的温度下搅拌18小时以完成反应。混合物升温至室温并在氮气中加压过滤以除去三乙胺盐酸盐，所有设备在使用前由烘箱烘干。甲苯在旋转式汽化器汽提除去(浴温大约50℃)。真空随着氮气的引入被破坏，蒸馏装置经由冷阱直接连接到真空泵，除去残留甲苯得到139.5g粗产物。粗产物通过刮板式薄膜蒸发器(加热区域70℃，压力0.008mmHg)蒸馏1.5小时以上以获得115.9g产物。
如果需要，产物可经闪蒸色谱法进一步纯化，例如使用戊烷和无水碱性氧化铝以及附加的刮板式薄膜蒸馏(wiped-film distillations)。

Claims (12)

1.化合物R1-Y1-P(NR2R3)2的制备方法，其包括：
a)使化合物PX3与化合物HNR2R3在溶剂存在下反应生成化合物X-P(NR2R3)2；和
b)使化合物X-P(NR2R3)2与化合物R1-Y1-H在溶剂存在下反应生成化合物R1-Y1-P(NR2R3)2；
其中
R1表示甲基，-CH2CH2-Si(CH3)2C6H5，-CH2CH2-S(O)2-CH2CH3或-CH2CH2-C6H4-NO2，-CH2CH2CN或者苯基，4-氯苯基，2-氯苯基，2-硝基苯基或4-硝基苯基；
R2和R3各自独立地表示烷基，或者R2和R3相连与它们所连接的N共同形成5-7元环；
Y1表示O或S；和
X表示卤素；
其特征在于在反应a)和反应b)使用的溶剂是相同的，并且该溶剂是甲苯。
2.根据权利要求1的方法，其中R1表示-CH2CH2CN，Y1表示O。
3.根据权利要求1或2的方法，其中R2和R3各自独立地表示C1-6烷基。
4.根据权利要求3的方法，其中R2和R3表示异丙基。
5.根据权利要求1的方法，其中Y1表示O。
6.根据权利要求1的方法，其中X表示Cl。
7.根据权利要求1的方法，其中在步骤b)中化合物X-P(NR2R3)2与化合物R1-Y1-H之间的反应在碱的存在下进行。
8.根据权利要求7的方法，其中碱为三(C1-4烷基)胺。
9.根据权利要求4的方法，其中Y1表示O和X表示Cl。
10.{[(CH3)2CH]2N)2-P-O-CH2CH2CN的制备方法，其包括
a)使PCl3与[(CH3)2CH]2N-H在甲苯中反应生成{[(CH3)2CH]2N}2-P-Cl；和
b){[(CH3)2CH]2N}2-P-Cl与HO-CH2CH2CN在甲苯中反应生成{[(CH3)2CH]2N}2-P-O-CH2CH2CN。
11.根据权利要求1或10的方法，其中采用基本上无水的反应条件。
12.化合物R1-Y1-P(NR2R3)2的制备方法，其包括使化合物X-P(NR2R3)2与化合物R1-Y1-H在溶剂存在下反应生成化合物R1-Y1-P(NR2R3)2，
其中
R1表示NCCH2CH2-；
R2和R3各自表示异丙基；
Y1表示O；
X表示氯；并且
溶剂是甲苯。
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